MX2013000654A - Metodo para monitorizar proceso de esterilizacion. - Google Patents

Abstract

La invención descrita se refiere a un método para monitorizar un proceso de esterilización. El método comprende: (a) exponer un artículo que se va a esterilizar y un indicador biológico un medio de esterilización durante un proceso de esterilización, el indicador biológico que comprende una célula con una membrana de plasma; y (b) medir el potencial de membrana de las célula para detectar viabilidad de la célula.

Description

METODO PARA MONITORIZAR PROCESO DE ESTERILIZACION Campo de la Invención Esta invención se refiere a un método para monitorizar un proceso de esterilización de manera más! particular, esta invención se refiere a un método para monitorizar un proceso de esterilización en donde un indicador biológico que comprende una célula con una membrana de plasma se expone al medio de esterilización. Entonces se mide el potencial de membrana del indicador biológico para detectar la viabilidad de la célula.

Antecedentes de la Invención Es común emplear indicadores biológicos tal como bacterias en procesos de esterilización para determinar si el artículo que se va a esterilizar se ha expuesto a un nivel eficaz de los ingredientes activos del esterilizante. Se pueden usar indicadores biológicos para proporcionar certidumbre que se cumplen las condiciones de esterilización dentro del proceso o carga procesada misma. Se pueden usar indicadores biológicos para medir el peor caso del sistema de procesamiento al proporcionar un número extremadamente grande de organismos altamente resistentes a ese proceso particular dentro de o en el indicador. Frecuentemente se usan esporas como el organismo de lección para monitorizar estos procesos de esterilización. Típicamente, los usuarios de indicadores Ref . :237925 biológicos dependen de los efectos visibles que siguen la multiplicación de cualquier organismo viable sobreviviente para determinar la eficiencia del proceso de esterilización en el cual se emplean los indicadores biológicos . Este proceso puede tomar horas a días para producir un cambio visible tal como turbidez en un medio de incubación o cambio de color en un indicador de pH si se usa este indicador.

Se han propuesto indicadores biológicos que correlacionan la actividad de una enzima termoestable endógena (preexistente, internamente derivada) presente dentro de un revestimiento de esporas a la viabilidad real del organismo. Esto ha dado por resultado tiempos de lectura biológica que varían desde minutos a horas con un fluorómetro o colorímetro. Aunque estos indicadores biológicos proporcionan una correlación entre la actividad de la enzima y la viabilidad del organismo, los resultados reales obtenidos son debidos completamente a la actividad de la enzima y no tienen enlace directo a la viabilidad del organismo .

También se han propuesto indicadores biológicos que correlacionan la actividad de una enzima exógena (externamente derivada, no previamente existente) que se produce en la inducción química de un gen recombinante si hay organismos viables de prueba presentes después del evento de esterilización que se evalúa que tiene ese gen. Esto da tiempos de lectura biológica que varían desde minutos a horas con una lectura fluorométrica y proporciona un enlace directo a la viabilidad del organismo.

Breve Descripción de la Invención Ün problema con estas tecnologías anteriores se relaciona al hecho que la técnica anterior ha dependido principalmente del crecimiento y división de organismos o de la presencia de actividad enzimática para detectar la viabilidad. El crecimiento y división de organismos puede tomar horas \a días en detectarse. La actividad enzimática puede tomar minutos a horas para generar señales suficientemente altas para detectarse ya sea de forma fluorométrica o colorimétricamente . De esta manera, existe la necesidad de un método para lograr resultados rápidos · que sean tan definitivos como aquellos que se logran usando técnicas de crecimiento y división. La presente invención proporciona una solución a este problema.

Esta invención se refiere a un método, que comprende: (A) exponer tanto un artículo que se va a esterilizar como un indicador biológico a un medio de esterilización durante un proceso de esterilización, el indicador biológico que comprende células con membrana de plasma; y (B) medir el potencial de membrana de las células procesadas para detectar cualquier viabilidad restante dentro de la población de células después del término del proceso de esterilización. Esta viabilidad se puede ejemplificar pero no se limita a los cambios de potencial de membrana asociados a eventos de flujo iónico o la germinación de las esporas indicadoras.

La invención se refiere a un indicador de esterilización qµe comprende un material eléctricamente conductor colocado en un substrato, y un indicador biológico (por ejemplo, esporas) colocado en parte o todo el material eléctricamente conductor.

Esta invención se refiere a un método para producir un indicador de esterilización, que comprende: depositar un material eléctricamente conductor en un substrato (por ejemplo, usando ün método de impresión como se ejemplifica pero no limitado a impresión por inyección de tinta) y depositar un indicador biológico (por ejemplo, esporas) en parte o todo el material eléctricamente conductor usando, por ejemplo, una impresora de inyección de tinta.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 es una gráfica que muestra los cambios de potencial de membrana para las esporas probadas en el Ej emplo 1.

La Figura 2 es una ilustración esquemática de un polarización de fluorescencia.

La Figura 3 es una ilustración esquemática de un indicador biológico usado en unión con el monitoreo electrónico de germinación.

Las Figuras 4 y 5 son ilustraciones e indicadores biológicos alternativos para la evaluación del potencial de membrana a través de señales eléctricas .

Figura 6 es una representación esquemática del elemento de fondo de una modalidad eléctrica de un indicador de esterilización de acuerdo con la presente invención.

La Figura 7 es una representación esquemática del elemento superior de una modalidad eléctrica de un indicador de esterilización de acuerdo con la presente invención, tal como aquel de la Figura 6.

La Figura 8 es una vista en planta, superior, esquemática de una capa de sello superior para el uso con una modalidad de la presente invención, tal como aquellas de las Figuras 4-7.

La Figura 9 es una vista en planta, superior, esquemática de un elemento de fondo 700 de otra modalidad de la presente invención, que es una modalidad a base de fluorescencia de un indicador de esterilización.

La Figura 10 es una vista frontal esquemática de un lector para el uso con una versión de base electrónica de un indicador de esterilización de acuerdo con una modalidad de la presente invención, junto con vistas frontal y posterior de una tarjeta indicadora de esterilización, electrónica, de ejemplo.

Las Figuras 11A y 11B son vistas frontales esquemáticas de un lector para el uso con una versión a base de fluorescencia de un indicador de esterilización de acuerdo con una modalidad de la presente invención, en una posición cerrada y abierta, respectivamente.

La Figura 12 es una vista en perspectiva esquemática de componentes internos de un lector de fluorescencia tal como aquel de la Figura 11, junto con vistas frontal y posterior de una tarjeta indicadora de esterilización, a base de fluorescencia, de ejemplo.

La Figura 13 es una vista frontal esquemática de un lector para el uso con un indicador, biológico autocontenido de FABI.

Descripción Detallada de la Invención El término "esterilización" se refiere a volver a una sustancia incapaz de reproducción, metabolismo y/o crecimiento. En tanto que esto se toma frecuentemente que significa ausencia total de organismos vivos, el término se puede usar en la presente para referirse a una sustancia libre de organismos vivos a un grado previamente acordado o determinado como que es aceptable. A menos que se indique de otro modo, el término esterilización se puede usar en la presente para referirse también a métodos y procedimientos menor rigurosos que esterilización, por ejemplo, desinfección, higienización, y similares.

Los procesos y aparatos descritos en la presente se pueden usar en campos de cuidados de la saluda, campo científicos y similares. Estos se pueden usar en aplicaciones comerciales e industriales donde puede ser deséada la esterilización, desinfección, higienización, descontaminación, limpieza y similares. Las aplicaciones comerciales e industriales puede incluir procesos tal como procesamiento de alimentos, pasteurización, remediación de suelos, remediación de aguas, y similares.

El proceso de esterilización con el cual se puede usar el método inventivo puede comprender cualquier proceso de esterilización. El proceso de esterilización puede incluir procesos de esterilización en donde el medio de esterilización o esterilizante puede comprender vapor, calor seco, radiación, plasma, así como uno o más esterilizantes gaseosos, uno o más esterilizantes líquido y similares. Los procesos a base de radiación usados pueden comprender un haz de electrones o cualquier espectro electromagnético incluyendo radiación ionizante, luz blanco o ultravioleta de impulsos, microondas, y similares. La radicación puede comprender radiación gamma o beta. Los esterilizantes gaseosos pueden comprender óxido de etileno, peróxido de hidrógeno gaseoso y similares. Los esterilizantes líquidos pueden comprender formalina (gas formaldehído disuelto en agua y que contiene opcionalmente metanol para inhibir la formación de sustancias tóxicas) , glutaraldehído, ácido peracético, peróxido de hidrógeno líquido y similares. El indicador biológico se puede usar para examinar la letalidad de los esterilizantes contra cualquier microorganismo con menos resistencia al proceso de esterilización que el organismo de prueba provisto con el indicador biológico. Estos microorganismos pueden incluir bacterias tal como Escherichia coli, Legionell sp. , Campylobacter sp., y otras bacterias entéricas asi como las especies Staphylococcus y Streptococcus y otros microorganismos patógenos humanos ,tal como Cryptosporidium. El indicador biológico puede comprender uno ' o más organismos.de prueba. El organismo de prueba puede comprender cualquier célula con una membrana de plasma cuya resistencia al proceso propuesto de esterilización exceda a aquella de los otros organismos, para la destrucción de los cuales se diseña el proceso de esterilización. El tipo de organismo de prueba usado como el indicador biológico puede ser dependiente de una variedad de factores ejemplificados por, pero no limitado, el tipo de proceso de esterilización que se usa. El organismo de prueba puede ser un microorganismo. Las cepas que se pueden usar pueden ser aquellas que son las más resistentes al proceso usado para esterilización. El microorganismo de prueba puede comprender bacterias . Los microorganismos bacterianos pueden ser aquellos que forman endoesporas, es decir, esporas bacterianas . El organismo de prueba puede comprender bacterias de los géneros Bacillus o Clostridia. El organismo de prueba puede incluir Geobacillus stearothermophilus, Bacillus atrophaeus, Bacillus subtilis, Bacillus sphaericus, Bacillus anthracis, Bacillus pumilus, Bacillus coagulans, Clostridiu sporogenes, Clostridium difficile, Clostridium botulinum, Bacillus subtilis globigii, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Escherichia coli, o una mezcla de dos o más de los mismos.

El organismo de prueba puede comprender- hongos, micobacterias, protozoarios , bacterias vegetativas, células vegetativas y/o sus partes . constituyentes y similares. Los ejemplos de hongos que se pueden usar pueden incluir Aspergillus niger, Candida albicans, Trichophyton mentagrophytes, Wangiella dermatitis, y similares. Los ejemplos de micobacterias que se pueden usar pueden incluir Mycobacterium chelonae, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium terrae, y similares. Los ejemplos de protozoarios que se pueden usar pueden incluir Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum, y similares. Los ejemplos de bacterias vegetativas que se pueden usar pueden incluir Aero onas hydrophila, Enterococcus faecalis, Streptococcus faecalis, Enterococcus faeciu , Streptococcus pyroaenes . Escherichia coli, Klebsiella (pneumoniae) , Legionella pneumophila, Metilobacterium, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella choleraesuis, Helicobacter pylori, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Stenotrophomonas maltophilia, y similares. Los organismos tal como Geobacillus stearothermophilus, Bacillus atrophaeus, Bacillus subtilis, Bacillus coagulans, Clostridium sporogenes, y similares, se pueden usar para determinar la eficiencia de la esterilización térmica húmeda (autoclave) , con Geobacillus stearothermophilus que es especialmente útil.

El organismo de prueba puede comprender Aspergillus niger, Candida albicans, Trichophyton entagrophytes, Wangiella dermatitis, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium terrae, Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis, Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum, Aeromonas hydrophila, Enterococcus faecalis, Streptococcus faecalis, Enterococcus faecium, Streptococcus pyrogenes, Escherichia coli, Klebsiella (pneumoniae) , Legionella pneu ophila, Metilobácterium, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella choleraesuis, Helicobacter pylori, Micrococcus radiodurans, Deinococcus radiodurans, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Stenotrophomonas maltophilia, o una mezcla de dos o más de los mismos .

Además de los organismos de prueba seleccionados en base a sus aceptación como que representan el organismo más resistente (por ejemplo Geobacillus stearothermophilus y Bacillus atropheaus) , el indicador biológico puede comprender además agentes de bioterrorismo o guerra biológica, por ejemplo, Bacillus anthracis y similares. Estos organismos resistentes también pueden comprender cepas que han llegado a ser resistentes a medios anteriormente efectivos de tratamiento antibiótico o desinfección química debido a modificaciones naturales o hechas por el hombre. Los ejemplos del tipo anterior pueden incluir VRÉ (Vancomycin Resistant enterococci) , MSRA/ (Methicillin Resistant Staphylococcus aureus) , Mycobacterium cheloni, y similares. Estos organismos resistentes pueden ser deseables debido a que los VRE y MRSA han desarrollado recientemente resistencia a contramedidas terapéuticas (por ejemplo, resistencia a antibiótica) y M. cheloni ha desarrollado resistencia a algunos modos de desinfección (por ejemplo, resistencia a glutaraldehído) , y de este modo proporciona organismos adecuados de prueba como modelos del "peor caso" .

En organismos viables tal como bacterias, se desarrolla un potencial eléctrico a través de la membrana de plasma de la célula. Este potencial de membrana juega un papel vital en las fuerzas protón-motrices del organismo requeridas para actividades tal como la generación de adenosina-trifosfato (ATP) , quimiotaxis, transporte de glucosa, y supervivencia del organismo a pH bajo. El establecimiento de un potencial de membrana es uno de los primeros eventos que toma lugar conforme un organismo empieza a germinar o a reaccionar de otro modo a cambios en el ambiente. El establecimiento de un potencial de membrana permite que la célula intercambie material/información con su ambiente. De esta manera al medir el potencial de membrana, el método inventivo proporciona una lectura instantánea o rápida de la viabilidad celular.

El potencial de membrana en organismos viables, activamente metabolizantes puede ser alto y frecuentemente las células con alto potencial de membrana se refieren como energizadas o hiperpolarizadas . Los organismos no viables y los organismos aletargados pueden exhibir un bajo potencial de membrana o potencial cero de membrana y frecuentemente se refieren como desenergizados o desporalizados .

El método inventivo puede depender de los cambios en el potencial de membrana que se presentan en la germinación y crecimiento del organismo de prueba como un medio para detectar la viabilidad del organismo de prueba. Cuando un organismo viable se coloca en condiciones que favorecen la germinación y crecimiento, puede cambiar el potencial de membrana del organismo. Por otra parte, si el organismo no es viable, será incapaz de germinar y no habrá cambio en su potencial de membrana.

El indicador biológico puede comprender un indicador biológico genéticamente sometido a estudio técnico que puede comprender adicionalmente un gen indicador adecuado para mejorar el potencial de membrana tomado por un organismo de prueba (por ejemplo, un microorganismo bacteriano) usando un vehículo adecuado (por ejemplo, plásmido o virus). La expresión del gen indicador se puede bloquear de manera activa por un gen represor. La expresión del gen indicador puede permanecer bloqueada hasta que el gen represor se exponga a un inductor que puede estar presente en un medio de recuperación. El organismo de prueba para el uso en un indicador biológico genéricamente manejado puede comprender cualquiera de los organismos de prueba descritos anteriormente. En una modalidad, el organismo de prueba no se expondrá al inductor hasta después de que sea completado el proceso de esterilización, y de manera consecuente la enzima indicadora no existirá antes de o durante la esterilización. Lo que se puede exponer al proceso de esterilización son los varios y vitales mecanismos que usa el organismo de prueba para sobrevivir y crecer y que también se usan para la producción de la enzima indicadora. Estos pueden incluir las ADN-polimerasas usadas para crecimiento celular (y replicación del plásmido) , las ARN-polimerasas para transcripción de los requisitos metabólicos de los organismos de prueba (y el gen indicador transportado en virus o plásmido), y los polisomás ribosomales requeridos para la traducción de proteínas celulares (así como la expresión de la enzima indicadora y/o mecanismos de transporte iónico) .

Hay dos clases principales de tintes fluorescentes de potencial de membrana, cada clase que difiere en su método de unión a la célula. La primera clase de tintes de potencial de membrana, las carbocianinas , puede acumularse en las membranas hiperpolarizadas y se puede transcolocar a la bicapa lipídica.. Una carbociariina útil es yoduro de 3,3'-dihexiloxacarbocianina [DiOC6.(3)]. La segunda clase de tintes de potencial de membrana que se puede usar comprende los oxonoles. Los tintes de oxonoles pueden entrar a las células despolarizadas y Unirse a las proteínas o membranas intracelulares . Un tinte de oxonol útil es bis- (ácido 1,3-dibutilbarbitúrico) -trimetina oxonol [DiBAC4(3)]. Con los tintes de carbocianina, la fluorescencia puede incrementarse con el tiempo y el potencial de membrana, en tanto que con los tintes de oxonol, puede disminuir la fluorescencia con el tiempo y disminuir el potencial de membrana. La presencia o ausencia de un potencial de membrana entonces se puede asociar directamente con la fluorescencia con el paso del tiempo.

El medio de incubación se puede referir como un medio de crecimiento con un medio de recuperación. El medio de incubación puede estar en la forma de un sólido o un líquido. El medio de incubación puede comprender una solución acuosa amortiguada particular de modo que el indicador biológico puede ser más sensible a cambios de pH, potenciales de reducción-oxidación, actividad enzimática y similares.

El indicador de esterilización se puede usar en cualquier proceso en donde el indicador de esterilización se expone a un medio de esterilización durante un proceso de esterilización y luego a recuperación e inducción. El medio de incubación puede comprender una o más fuentes de nutrientes la fuente de nutrientes se puede usar para proporcionar energía para el crecimiento de cualesquiera de los organismos de prueba que pueden sobrevivir al proceso de esterilización. Los ejemplos de las fuentes de nutrientes pueden incluir digestión pancreática de caseína, digestión enzimática de comida de soja, sacarosa, dextrosa, extracto de levadura, L-cisteína, y mezclas de dos o más dé estos. Un indicador de crecimiento microbiano, que cambia el color o estado nativo, en la presencia de organismos viables de prueba se puede usar con el medio de incubación.

El medio de incubación (recuperación/inducción) puede contener por ejemplo un tinte de potencial de membrana o tinte sensible a voltaje. El uso de estos indicadores de crecimiento microbiano puede dar por resultado un cambio en la fluorescencia en respuesta a un fenómeno de crecimiento de microorganismo tal como cambios en el pH, potenciales de oxidación-reducción, actividad enzimática, así como otros indicadores de crecimiento.

El medio de incubación puede comprender adicionalmente uno o más amortiguadores de pH, uno o más neutralizadores, uno o más agentes para mantener equilibrio osmótico, o una mezcla .de dos o más de los mismos. Los amortiguadores de pH pueden incluir K2HP04, KH2P04/ (NH4)2HP04, 2.2-Bis (hidroximetil) -2 , 21 , 2' ' -nitrilotrietanol (Bis-Tris) , 1.3 -Bis [tris (hidroximetil) -metilamino] propano (Bis-Tris Propano) , " ácido 4- (2-Hidroxietil) iperazina-etanosulfónico (HEPES) , 2-Ámino-2- (hidroximetil) -1, 3 -propanodiol (Trizma, Tris base), IV- [Tris (hidroximetil) metil] glicina (Tricina) , Diglicina (Gly-Gly) , N, N-Bis (2-hidroxietil) glicina (Bicina) , ácido N-(2-15 Acetamido) iminodiacético (ADA), ácido 2V-(2-Acetamido) -2-aminoetanosulfónico (aces), ácido 1,4-Piperazinadietanosulfónico (PIPES) , ácido P-Hidroxi-4-morfolinapropanosulfónico (MOPSQ) , ácido N,N-Bis(2-hidroxietil) -2-aminoetanosulfónico (BES), ácido, 3-(N-Morfolino) propanosulfónico (MOPS) , ácido 2- [ (2-Hidroxi-l, 1-bis (hidroximetil) etil) amino] etanosulfónico (TES), ácido 3- [N, N-Bis (2-hidroxietil) amino] -2-hidroxi-l-propanosulfónico (DIPSO) , ácido 4- (N-Morfolino)butanosulfónico (MOBS) , ácido 2-Hidroxi-3- [tris (hidroximetil) metilamino] -1-propanosulfónico (TAPSO) , hidrato de ácido 4-(2-Hidroxietil) piperazina-1- (2-hidroxipropanosulfónico (HEPPSO) , dihidrato de Piperazina-1, 4 -bis (ácido 2-hidroxipropanosulfónico) (POPSO) , ácido 4- (2-25 Hidroxietil) -1-piperazina-propanosulfónico (EPPS) , N- (2-Hidroxietil) -piperazina^N' - (ácido 4-butanosulfónico) (HEPBS) , ácido [(2-Hidroxi-1, 1-bis (hidroximetil) etil) amino] -1-propanosulfónico (TAPS) , 2 -Amino-2 -metil-1, 3-propanodiol (A PD) , ácido N-tris (Hidroximetil) metil-4-aminobutanosulfónico (TABS) , ácido N- (1, l-Dimetil-2-hidroxietil) -3 -amino- 2 -hidroxipropanosulfónico (AMPSO) , ácido 2- (Ciclohexilamino) etanosulfónico (CHES), ácido 3- (Ciclohexilamino) -2-hidroxil-l-propanosulfónico (CAPSO) , 2-Amino-2-metil-l-propanol (AMP) , ácido 3- (Ciclohexilamino) -1-propanosulfónico (CAPS), ácido 4 - (Ciclohexilamino) -1-butanosulfónico (CABS) , hidrato de ácido 2 - ( N-Morfolino) etanosulfónico (MES), ácido N- (2-Acetamido) -2-aminoetanosulfónico (ACES) , y mezclas de dos o más de los mismos.

Los neutralizadores pueden incluir pero no . se limitan a tioglicolato de sodio, tiosulfato de sodio, catalasa, bisulfato de sodio, lecitina de bisulfito de sodio, polisorbato 20, polisorbato 80, bicarbonato de calcio, y mezcla de dos o más de estos.

Los agentes para mantener el equilibrio osmótico pueden incluir sal sódica, sales de potasio, sales de magnesio, sales de manganeso, sales de calcio, otras, por ejemplo, sales de metales de transición, cloruro de sodio, cloruro de potasio, sulfato de magnesio, cloruro de hierro y mezclas de dos o más de estos .

En una modalidad, el. medio de incubación comprende una composición acuosa que comprende: agua; de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 100 gramos por litro de agua (g/1) , y en una modalidad de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 50 g/1, de una o más fuentes de nutrientes; de aproximadamente l.OxlO"5 a aproximadamente 10 g/1, y en una modalidad de aproximadamente l.OxlO"4 a aproximadamente 1.0 g/1 de uno o más indicadores de crecimiento microbiano; hasta aproximadamente 5000 g/1, y en una modalidad de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 5000 g/1, y en una modalidad de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 1000 g/1, de uno o más amortiguadores de pH; hasta a aproximadamente 100 g/1, y en una modalidad de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 100 g/1, y en una modalidad de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 50 g/1, de uno o más neutralizadores; hasta aproximadamente 50 g/1, y en una modalidad de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 50 g/1, y en una modalidad de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 25 g/1, de uno o más agentes para mantener el equilibrio osmótico .

El medio de incubación puede comprender un caldo de nutriente, caldo neutralizante de D/E, medio mínimo de Davis, caldo de prueba de esterilidad, así como cualquier digestión de soja-caseína o medio basado en extracto de carne. Estos pueden incluir una solución acuosa de caldo de digestión de soja-caseína, tioglicolato fluido y Dextrosa-Triptona (Difco Laboratories, Inc.). Se puede usar una base de caldo de soja tríptico modificado, sin glucosa. También se puede adicionar un tinte de potencial de membrana o tinta de sensible a voltaje.

Un- ejemplo de una incubación que se puede usar es caldo de soja tríptico BactoMR que contiene digestión pancreático de caseína (17.0 g/1) , digestión enzimática de. comida de soja (3.0 g/1), cloruro de sodio (5.0 g/1), fosfato de dipotasio (2.5 g/1), y dextrosa (2.5 g/1). Estos ingredientes se pueden dispersar o disolver en agua. Las concentraciones expresadas en términos de g/1 se refieren a gramos de ingrediente por litro de agua. La digestión pancreática de caseína, la digestión enzimática de comida de soja, y la dextrosa proporciona fuentes de energía para el crecimiento de microorganismo. Estos se pueden referir como fuentes de nutrientes . Se puede usar cloruro de sodio para mantener un equilibrio osmótico en el. medio líquido. El fosfato de dipotasio puede actuar como un amortiguador de pH. Por ejemplo se puede adicionar (3 g/l) DiOC6(3), que es un tinte de potencial de membrana, a la formulación de Caldo de Soja Tríptico BactoMR.

El medio de incubación puede comprender una formulación muy básica que puede servir sólo para mejorar los eventos de flujo iónico y/o para iniciar la germinación de esporas. El medio puede incluir aminoácidos, sales y/o azúcares. Los ejemplos de aminoácidos incluyen L-alanina, L-leucina, L-cisteína, L-valina, L-lactato, L-treonina, ácido L-tartárico, ácido fólico, L-tirosina, L-prolina, y asparagina. Los ejemplos de sales son cloruro de sodio y cloruro de potasio. Los ejemplos de azucares incluyen glucosa, sacarosa, fructosa y xilosa. Los eventos adicionales de flujo iónico o eventos de germinación adicionales se pueden activar por los componentes encontrados en el sobrenadante de organismos en crecimiento tal como péptidoglicano y muropéptidos .

Los tintes de potencial de membrana son fluorescentes y por lo tanto el método de detección de elección debe tener la capacidad de distinguir entre la fluorescencia de las moléculas de tintes que están unidas dentro de la membrana versus la fluorescencia de las moléculas de tinte libres. Dos métodos particularmente adecuado para distinguir entre las emisiones de fluorescencia de estas dos fuentes son polarización de fluorescencia (también conocida como anisotropía de fluorescencia) y técnicas basadas en transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (basadas en FRET) , incluyendo FRET resuelta en tiempo .

La polarización de fluorescencia es un método de detección que depende de los cambios en el tamaño o pariente de una molécula fluorescente para la detección. Las mediciones de polarización se pueden basar en el principio de excitación selectiva de fluoróforos por la luz polarizada. Los fluoróforos tienen momentos de transición para absorción y emisión que están junto con orientaciones específicas con respecto a los ejes moleculares del fluoróforo y absorberán de manera preferencial fotones cuyos vectores eléctricos están alineados paralelos a estos momentos de transición. En una solución isotrópica, los fluoróforos pueden estar orientados de forma aleatoria. En la excitación con luz polarizada, estas moléculas de fluoróforo cuyo dipolo de transición de absorción está paralelo al vector eléctrico de la excitación se pueden excitar de manera preferencial. Esta excitación selectiva puede dar por resultado una población parcialmente orientada de fluoróforos y dar por resultado adicionalmente una emisión de fluorescencia parcialmente polarizada. La invención también puede presentarse con la luz polarizada a lo largo de un eje fijo en el fluoróforo. La polarización de fluorescencia puede excitar moléculas con luz polarizada en el plano. La luz emitida entonces se puede medir tanto en la posición inicial polarizada en plano como en la posición descentrada de la luz polarizada en plano, usualmente descentrada por 90°. Por ejemplo, si el vector eléctrico de la luz de excitación está verticalmente polarizado en plano, entonces la luz emitida se puede medir tanto en las posiciones vertical . como horizontal. Los fluoróforos que están "alineados" con el vector eléctrico de la luz de excitación absorberán preferencialmente la luz. La luz emitida entonces se puede medir tanto en la posición horizontalmente polarizada como en la posición verticalmente polarizada. La polarización se puede expresar como una relación de las intensidades de luz y es una medida del grado de rotación molecular durante el período entre la excitación y la emisión. Las moléculas pequeñas pueden girar más rápido y tendrán un menor valor de polarización intrínseca que las moléculas más grandes. Por otra parte, las moléculas más grandes pueden girar menos y por lo tanto tienen un mayor valor de polarización intrínseca. Al usar la polarización de fluorescencia, puede ser posible distinguir entre tintes unidos de potencial de membrana y tintes no unidos de potencial de membrana.

Una incubadora/lector a base de la polarización de fluorescencia se puede diseñar como se muestra en la Figura 2. La Figura 2 es una ilustración esquemática de un polarizador de fluorescencia. Con referencia a la Figura 2, la incubadora/lector 100, que proporciona la prueba de la muestra 110, incluye una fuente 120 de luz monocromática, el divisor de haz 130, y los polarizadores 140, 150 y 160. La luz monocromática de la fuente de luz monocromática 120 pasa a través del polarizador 140 dé modo que se polariza toda la luz de excitación. Esta luz polarizada entonces excita de manera preferencial sólo las moléculas en la muestra 110 que están en el mismo estado de polarización como el filtro. Conforme giran estas moléculas, se mueven hacia afuera de la posición polarizada en plano. La luz emitida se divide por el divisor de haz 130. El divisor de haz divide la luz y pasa aproximadamente la mitad de la luz a través del polarizador 150 orientado en el mismo plano como la luz de excitación y la otra mitad a través del polarizador 160 orientado a un ángulo a la luz de excitación inicial . La luz hecha pasar a través de cada polarizador 150 y 160 se mide y se compara.

La transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET, por sus siglas en inglés) es la transferencia de energía desde un fluoróforo donador inicialmente excitado a un fluoróforo aceptador. El fluoróforo donador emite típicamente a una más corta longitud de onda que se traslapa con el espectro de absorción del aceptador. La transferencia de energía de resonancia se presenta sin la apariencia de un fotón y es el resultado de interacciones dipolo-dipolo de intervalo largo entre los fluoróforos donador y aceptador.

Para monitorizar los cambios en el potencial de membrana con FRET, se requieren dos fluoróforos. El donador de FRET puede ser cualquier fluoróforo que proporcionará un suficiente espectro de absorción para el aceptador. El fluoróforo aceptador será el tinte de potencial de membrana. De manera preferente, el fluoróforo donador se unirá o se adherirá a la pared de la espora permitiendo proximidad cercana con el tinte de potencial de membrana. De otro modo, la opción de detección de fluorescencia (FRET) se monitorizará por el mismo tipo de fluorómetro descrito en otra parte de la presente y en los ejemplos proporcionados.

Además de los tintes de potencial de membrana, los tintes sensibles a voltaje pueden detectar los mismos cambios en el potencial de membrana de organismos usando aún otro conjunto de principios. El uso de tintes sensibles a voltaje para la detección del potencial de membrana se basa en el mecanismo físico conocido como electrocromismo . Los espectros tanto de excitación como de emisión de estos tintes exhiben cambios significativos debido a cambios de voltaje. Estos cambios en los espectros surgen de rearreglos de carga que reflejan los cambios de potencial de membrana. La clase más comúnmente usada de tintes sensibles a voltaje son los tintes de estirilo, los ejemplos específicos incluyen di-8-butil-amino-naftil-etilen-piridinio-propil-sulfonato (di-8-A EPPS) y di-4-butil-amino-naftil-etilen-piridinio-propil-sulfonato (di-4-ANEPPS) .

El uso de tintes sensibles a voltaje en combinación con una técnica tipo FRET permite la detección fácil de los cambios en el potencial de membrana. Por ejemplo, conforme se presentan los rearreglos de carga en la membrana de organismos en germinación tal como esporas, empezará a cambiar la longitud de onda de misión de los tintes sensibles a voltaje. Este cambio en la longitud de ondas de emisión entonces se puede detectar por un segundo fluoróforo localizado en el medio de cultivo. La emisión de esta segunda longitud de onda se puede detectar por el detector. Por ejemplo, el pico en los espectros de citación para di-8-A EPPS cambia entre 450 nm y 520 nm dependiendo de las características de voltaje/carga. Esto da por resultado un cambio pico correspondiente en los espectros de emisión desde 530 nm a 640 nm. El fluorómetro/incubadora se puede diseñar para excitar di-8-ANEPPS ya sea a 450 nm o 520 nm y entonces detectar un segundo fluoróforo que tiene un pico de excitación en el pico de emisión correspondiente del di-8-A EPPS.

Un método alternativo de detección para la detección de los cambios de potencial de membrana es el uso de señales electrónicas . Conforme los organismos tal como esporas empiezan a germinar, el potencial de membrana se incrementará permitiendo más flujo de corriente y mayores cargas de voltaje que dan por resultado un incremento en el transporte iónico, que se observa como un incremento en el flujo de corriente, del potencial incrementado de membrana.

Se pueden colocar conductores electrónicos en el medio o a través/dentro de una sustancia indicadora biológica para medir eléctricamente el potencial de membrana. Más adelante en las Figuras 3-5 se muestran tres diseños potenciales para indicadores biológicos, que miden señales eléctricas. Con referencia en la Figura 3, se coloca un indicador biológico 200 en el medio 202 que está contenido en un recipiente 204. Los conductores electrónicos 206 y 208 se colocan en el medio 202 y se usan para medir el potencial de membrana. Con referencia a la Figura 4, se usan conductores electrónicos 210 y 212 para medir el potencial de membrana a través de un indicador biológico 214. Con referencia á la Figura 5, se usan conductores electrónicos 220 y 222 para medir el potencial de membrana, dentro de un indicador biológico 22 .

El indicador de esterilización puede comprender un material eléctricamente conductor colocador en un substrato (por ejemplo, un material eléctricamente conductor tal como una circuitería de cobre formada en un substrato no conductor tal como silicios) y un indicador biológico (por ejemplo, esporas) colocadas en parte o todo el material conductor. Por ejemplo, el indicador biológico (por ejemplo, esporas) y una circuitería electrónico o patrón digital conductor que comprende un material conductor (por ejemplo, cobre) se puede depositar en un substrato no conductor (por ejemplo, un substrato de silicio) usando una impresora de inyección de tinta tal como la impresora Dimatix Materials DMP-2800 que está disponible de Fuji Film. La circuitería electrónica o patrón digital conductor se puede depositar en el substrato usando cualquier patrón deseado. El indicador biológico entonces se puede depositar en parte o toda la circuitería electrónica o patrón digital conductor usando la impresora de inyección de tinta. El indicador biológico se puede expresar en un medio o vehículo líquido (por ejemplo, agua) que entonces se puede depositar en parte o toda la circuitería electrónica o patrón digital con gotas tan pequeñas como aproximadamente 5 picolitros, o aproximadamente 10 picolitros. Los volúmenes típicos de esporas pueden ser de aproximadamente 3 picolitros por espora.

El indicador biológico se puede evaluar eléctricamente al monitorizar el voltaje (potencial) , flujo de corriente, resistencia y/o impedancia conforme los organismos viables (por ejemplo, esporas) empiezan a germinar. La elección del método de medición dictará el diseño electrónico. Una ventaja incluye una disminución en el tiempo requerido para leer el indicador biológico. Puesto que el método de detección depende de uno de los pasos anteriores en la cascada de eventos de germinación del organismo en lugar de la excrecencia o enzimas indicadoras específicas, se puede reducir en su mayor parte el tiempo de detección.

La Figura 6 es una representación esquemática del elemento de fondo 600 de una versión electrónica de un indicador de esterilización de acuerdo con una modalidad de la presente invención, tal como aquella mostrada en las Figuras 4 y 5. La Figura 6 muestra los elementos del elemento de fondo 600 del indicador de esterilización en más detalle. El elemento de fondo 600 incluye un material eléctricamente conductor 602, tal como una monocapa de poliacrilamida/polianilina, colocada en un substrato no conductor 604. El material eléctricamente conductor 602 puede incluir cualquier material adecuado en tanto que el material sea adecuado para el uso con las condiciones de esterilización con las cuales se usará el indicador de esterilización. El substrato no conductor 604 puede ser cualquier substrato impermeable a gas/líquido adecuado tal como PET u otro material adecuado que sea adecuado para el uso en las condiciones de esterilización con las cuales se Usará el indicador de esterilización. Como se muestra en la Figura 6, colocada entre el material conductor 602 y la capa 604 está a una subcapa conductora 606, , que está en comunicación eléctrica con el material conductor 602 y la circuitería de detección. La circuitería de detección incluye una serie de preamplificadores de transistores en serie 608, que se conectan eléctricamente a conectadores eléctricos 610 y el conectador de tierra 611. Los conectadores eléctricos 610 proporcionan · comunicación eléctrica desde el elementó de fondo 600 a un dispositivo lector, descrito más adelante. Los preamplificadores 608 proporcionan amplificación gradual de los cambios en la corriente eléctrica que pasa a través del indicador de esterilización, como se describe en más detalle más adelante. Al tener una serie de amplificadores, se puede amplificar de forma adecuada una señal de la . tarjeta de indicador biológico <sin la introducción de ruido excesivo. El circuito se completa por el conectador de tierra 611.

Como se muestra en la Figura 6, las esporas 612 de un organismo de prueba adecuado se pueden depositar en o incrustar en la monocapa conductora 602. Las esporas 612 se pueden depositar como esporas individuales o como múltiples esporas. Las esporas 612 se pueden depositar, por ejemplo, en una mezcla de poliacrilamida/amortiguador, caso en el cual la espora se considera que está dentro de una "burbuja" del material amortiguador, "burbuja" que se incrusta en una matriz tal como poliacrilamida . De manera alternativa, las esporas 612 se pueden incrustar directamente en una capa de, por ejemplo, polianilina.

Con referencia ahora a la Figura 7, que es una vista en planta superior de un elemento superior 614 para el indicador de esterilización, se muestran detalles adicionales de esta modalidad de la invención. El lado del elemento superior 614 mostrado en la Figura 7 es el lado que dará hacia estará en contacto con la capa superior de la estructura mostrada en la Figura 6. El elemento superior 614 incluye una membrana protectora impermeable a gas/líquido, removible 616, en la cual se forma una capa permeable a gas/vapor 618. Sobrepuesta a la capa permeable 618 está una capa conductora 620. Cuando se monta el indicador de esterilización, la capa conductora 620 estará en comunicación eléctrica con las esporas 612 y cualquier material conductor circundante tal como la monocapa conductora 602, y también estará en comunicación eléctrica con un conectador 622 mediante el conductor 626. Como se muestra en la Figura 7, el conectador 622 se coloca por debajo de una almohadilla aislante 624. El conectador 622, mediante el alambre 626, completará el circuito eléctrico formado por la capa conductora 620, las esporas 612, la subcapa conductora 606, los amplificadores 608 y los conectadores 610. Los cambios en el flujo de corriente a través de este circuito eléctrico se usarán para detectar si cualquier, organismo de prueba ha sobrevivido al proceso de esterilización en el cual se usará el indicador de esterilización 600. Como se muestra en la Figura 7, el elemento superior 614 incluye una línea adhesiva 628, por la que el elemento superior 614 se unirá de forma sellada al elemento de fondo 600, formando de este modo el indicador de esterilización de esta modalidad.

Antes del uso del indicador de esterilización, la membrana protectora, impermeable a gas/líquido 616 permanecerá en su lugar para proteger el indicador de esterilización 600 de la exposición al ambiente. Justo antes de que se use el indicador de esterilización en un proceso de esterilización, la membrana 616 se removerá para permitir que el medio de esterilización alcance las esporas 612 en el indicador de esterilización.

La Figura 8 es una vista en planta superior esquemática de una capa de sello superior 630 para el uso con una modalidad de la presente invención, tal como aquellas de las Figuras 4-7. En la modalidad mostrada en la Figura 8, el sello suprior 630 incluye una cámara sellada de fluido 632 que contiene un inductor térmicamente estable y medio para activar y soportar las esporas subyacentes 612. La cámara rellena de fluido 632 se conecta al resto de la capa de sello superior 630 por una zona separable frágil 634, por la cual se puede remover la cámara, del resto del sello superior 630. El sello superior 630 incluye además una ventana 636 que se comunica con la capa permeable a gas/líquido 618 del elemento superior 614. El sello superior 630 incluye además una soldadura térmica 638 y una zona de adhesivo desprendible 640, para unir el sello superior 630 al elemento superior 614. La soldadura térmica 638 une la cámara 632 al elemento superior 630.

La Figura 9 es una vista en planta superior esquemática de un elemento de fondo 700 de otra modalidad de la presente invención, que es una modalidad a base de fluorescencia de un indicador de esterilización. El. indicador de esterilización mostrado en la Figura 9 depende de la fluorescencia generada por esporas en crecimiento como la indicación de éxito o falla del proceso de esterilización.

En la modalidad mostrada en la Figura 9, el elemento de fondo 700 incluye un substrato de respaldo 702 en el cual se depositará los materiales o elementos suprayacentes . El substrato de respaldo 702 puede ser cualquier material adecuado impermeable a gas/líquido, tal como PET (por ejemplo, MylarMR) , polipropileno, metal u hoja con laca o cualquier poliolefina adecuada que se conozca que es útil con un indicador de esterilización, por los expertos en la técnica. Colocada en el substrato de respaldo 702 está una monocapa hidratante 704. La monocapa hidratante 704 puede ser por ejemplo poliacrilamida, y puede tener uniones adicionadas para esporas, o las esporas se pueden incrustar en la monocapa hidratante 704. El elemento de fondo 702 se convertirá por un sello transparente a longitud de onda de fluorescencia, permeable a gas/vapor (no mostrado) , que se adherirá o soldará al elemento de fondo 702. El sello transparente permitirá el ingreso del medio de esterilización a las esporas del organismo de prueba y permitirá el paso de las longitudes de onda de excitación y de fluorescencia usadas para leer el indicador de esterilización.

En la modalidad mostrada en la Figura 9, las esporas se aplican en rejillas de 10x10 706 de "puntos" de esporas. Cada punto puede contener, por ejemplo, de aproximadamente 150 a aproximadamente 300 esporas. En la modalidad de la Figura 9, hay un arreglo de 8x12 de rejillas de 10x10. Puesto que cada punto contiene de aproximadamente 150 a aproximadamente 300 esporas, hay 100 puntos en cada uno de los 96 elementos del arreglo, hay de aproximadamente 1.44 x 106 a aproximadamente 2.88 x 106 esporas presentes en el indicador de esterilización mostrado en la Figura 9.

La modalidad ilustrada en la Figura 9 incluye además una cámara rellena de fluido 708 que contiene, por ejemplo, inductor térmicamente estable y medio necesario para activara y soportar las esporas que generarán los eventos de fluorescencia que se van a detectar. El recipiente relleno de fluido 708 se une al resto del elemento de fondo 700 por una zona desprendible frágil 710. Cuando se rompe la zona desprendible frágil 710, se proporcionan los contenidos del recipiente 708 a las esporas en las rejillas 706.

El elemento de fondo 700 incluye además una línea de adhesivo de perímetro 712 por la cual la cubierta permeable a gas/vapor (no mostrada) se une de forma sellada al elemento de fondo.

La Figura 10 es una vista frontal esquemática de un lector electrónico 1000 para el uso con una versión de base electrónica de un indicador de esterilización de acuerdo con una modalidad de la presente invención, junto con las vistas frontal y posterior de una tarjeta de indicador de esterilización, electrónica, de ejemplo, tal como aquella de la Figura 6. El lector electrónico 1000 incluye un panel de visualización frontal 1002 para visualizar información pertinente obtenida de su lectura de la tarjeta de indicados biológico. El lector electrónico 1000 incluye además un panel de acceso frontal 1004 y una ranura 1006 para insertar una tarjeta de indicador biológico. La Figura 10 también incluye una representación de una versión electrónica de ejemplo de una tarjeta de indicador biológico 1008, que incluye los componentes biológicos y electrónicos tal como se describe anteriormente con respecto a la Figura 6, incluyendo los conectadores eléctricos 1010.

El lector electrónico 1000 incluye componentes electrónicos adecuados para ser contacto con los conectadores eléctricos 1010 de la tarjeta de indicador biológico 1008. El panel de acceso frontal 1004 puede incluir rodillos integrados o similar. Para activar un depósito de fluido y calentador para incubación.

La Figura 10 muestra tanto una vista frontal como una vista posterior de la tarjeta de indicador biológico, electrónica, de ejemplo 1008. Los componentes de la vista frontal se han descrito en general con respecto a la modalidad de la Figura 6. El lado posterior de la tarjeta de indicador 1008 puede incluir, por ejemplo, información pertinente al tipo específico de indicador biológico, el medio de esterilización, los parámetros del proceso del proceso de esterilización, el número de lote, la fecha y resultado de la prueba de indicador biológico. La información mostrada en la tarjeta de indicador 1008 no se limita a estos ejemplos específicos; otra información que se puede juzgar importante también se puede incluir, como se entenderá. La tarjeta de indicador 1008 puede incluir una tira magnética 1012 para facilitar la lectura automatizada y el almacenamiento de la información pertinente al proceso de esterilización, a los resultados de prueba, etc., como se entenderá.

Las Figuras 11A y 11B son vista frontales esquemáticas de un lector de fluorescencia 1100 para el uso con una versión a base de fluorescencia de un indicador de esterilización de acuerdo con una modalidad de la presente invención, en una posición cerrada y abierta, respectivamente. La Figura 11A muestra el lector de fluorescencia 1100 en la posición cerradas. El lector de fluorescencia 1100 incluye un panel de visualización frontal panel 1102 para visualizar información pertinente obtenida de su lectura de la tarjeta de indicador biológico. El lector de fluorescencia 1100 incluye además un panel de acceso frontal 1104, que puede abrirse, como se muestra en la Figura 11B.

Como se muestra en la Figura 11B, el panel de acceso frontal 1104 se abre hacia afuera, e incluye una ranura 1106 en la cual se puede insertar una tarjeta de indicador biológico a base de fluorescencia, tal como aquella descrita anteriormente con respecto a la Figura 9. Cuando se ha insertado una tarjeta de indicador en la ranura 1106, el panel.de acceso frontal 1104 se cierra, colocando la tarjeta de indicador en una cámara de lector 1108, que contienen los componentes para obtener información de la tarjeta de indicador en la ranura. Los componentes adecuados de ejemplo de la cámara de lector 1108 se describen con respecto a la Figura 12. El panel de acceso frontal 1104 puede incluir rodillos integrados o similar para activar un depósito de fluido y calentador para incubación.

La Figura 12 es una vista en perspectiva esquemática de los componentes internos de un lector de fluorescencia 1200 tal como aquel de la Figura 11, junto con vistas frontal y posterior de una tarjeta de indicador de esterilización, a base de fluorescencia, de ejemplo.

El lector de fluorescencia 1200 incluye componentes adecuados para la lectura de un indicador de esterilización a base de fluorescencia. Algunos componentes de ejemplo se ilustran en la Figura 12. El lector 1200 pueden incluir un dispositivo adecuado de lectura tal como una cámara CCD (dispositivo acoplado a carga) enfriada y procesador de imagen 1202, que incluye hardware adecuado y software adecuado para procesar los datos obtenidos de la cámara CCD. El lector 1200 puede incluir óptica adecuada 1204, tal como un excitador LED y un detector de fluorescencia. El lector 1200 puede incluir componentes mecánicos adecuados 1206, tal como una tarjeta de cámara, control LED interfaz de USB. El lector 1200 puede incluir además un aparato adecuado 1210 para retener la tarjeta de indicador biológico, para alinear la tarjeta y para retenerla en posición alineada para excitación, y lectura. El lector 1200 puede incluir además un puerto adecuado de exploración de imagen 1214.

La Figura 12 muestra tanto una vista frontal como una vista posterior de la tarjeta de indicador biológico, electrónica, de ejemplo 1208. Los componentes de la vista frontal se han descrito en general con respecto a la modalidad de la Figura 9. El lado posterior de la tarjeta de indicador 1208 incluye información variada pertinente al tipo» específico de indicador biológico, el esterilizante, el proceso de esterilización, el número de lote, la fecha, las condiciones de esterilización y el resultado de la prueba de indicador biológico. La información mostrada en la tarjeta de indicador 1208 no se limita a estos ejemplos específicos; también se puede incluir, como se entenderá otra información que se pueda juzgar importante. La tarjeta de indicador 1208 puede incluir una tira magnética 1212 para facilitar la lectura automatizada y el almacenamiento de la información pertinente al proceso de esterilización, resultados de prueba, etc., como se entenderá.

La Figura 13 es una vista frontal esquemática de un lector de frasco 1300 para el uso con un indicador biológico autocontenido de FABI (SCBI) , tal como aquel descrito y mostrado con respecto a la Figura 3. El lector de frasco 1300 incluye un panel de visualización frontal 1302 y un panel de acceso frontal 1304, similares a aquellos de las modalidades de base electrónica y a base de fluorescencia, descritas anteriormente. El panel de acceso frontal 1304 incluye una pluralidad de concavidades 1306, en las cuales se pueden insertar los SCBI. El panel de acceso frontal 1304 gira hacia afuera, para permitir la inserción o remoción de los SCBI y se puede cerrar en una cámara de lector 1308. El lector de frasco 1300 se puede usar con un SCBI basado en fluorescencia o con un SCBI basado en electrónica, aplicando los mismos principios básicos como se describe en la presente para leer los resultados del proceso de esterilización e indicar por el indicador biológico de la presente invención. La Figura 13 incluye un SCBI 1310 de FABI de ejemplo.

Con el método inventivo, un cambio en el potencial de membrana de un organismo viable se puede usar para evaluar la efectividad del proceso de esterilización. Esta técnica se puede usar con un indicador de esterilización adecuado o SCBI como se conoce en la técnica. También se puede usar con una suspensión de organismos (por ejemplo, de espora) en una ampolleta. También se puede usar con un indicador de esterilización que comprende un material eléctricamente conductor colocado en un substrato (por ejemplo, circuitería de cobre formado o depositado en un substrato no conductor tal como silicio) con un indicador biológico (por ejemplo, esporas bacterianas) colocado en parte o todo el material conductor. El método inventivo es suficientemente flexible para ser usado a través de todas las tecnologías de esterilización. El método inventivo se puede usar para proporcionar indicadores biológicos de lectura instantánea o casi instantánea. El indicador biológico se puede referir como un indicador biológico de acción rápida.

Los ejemplos de materiales de construcción son: Soporte, Separadores y/o Aislantes: Vidrio, silicio, hojas metálicas, papel y otras formas celulósicas, poliolefina incluyendo polipropileno, policarbonatos o mezclas, acetato de celulosa, Mylar y similares. Membrana semi-permeables o permeables: Glasina, membranas de diálisis de origen natural o sintético, poliolefina porosa y otros materiales de plástico. Conductores: metales, hojas, tintes conductoras, nanotubos, fullerenos y similares. Conductores/aislantes cambiables u otros materiales semiconductores tal como polianilina y similares. Químicas de unión (por ejemplo SPDP y similares). Organismos: incluyendo G. stea.rothermoph.ilus, B. atrophaeus y similares. Fluoróforos y/o flüorógenos, por ejemplo, MUG y yoduro de propidio, fluoresceína, rodamina, etc., incluyendo todos aquellos que responden a excitaciones físicas tal como fotoexcitación, inducción química y activación electro-física.

En una modalidad, el potencial de membrana de plasma es el único medio de detección. En otra modalidad, la detección es tanto por potencial de membrana , como por fluorescencia eléctricamente inducida (por ejemplo, usando di-4-A EPPS o similares) . El tinte ANEP (AminoNaftilEtenilPiridinio) , di-4-ANEPPS es una sonda sensible para la detección de cambios de sub-milisegundo del potencial de membrana. En este último caso un lector será un híbrido de un lector a base de electrónica tal como aquel de la Figura 10, y un lector a base de fluorescencia tal como aquel de la Figura 12. En una modalidad, la fluorescencia de un compuesto fluorogénico después de la inducción y activación enzimática puede ser el único medio de detección. En otra modalidad, un segundo fluoróforo unido a superficie (por ejemplo rojo Texas WGA) también se puede usar, lo que proporcionará fluorescencia continua como un control de referencia como un medio para asegurar que todas las esporas se asocien aún con la tarjeta de indicador biológico. Cada fluoróforo puede tener longitudes de onda de emisión y de excitación separadas.

Ej emplos Los ejemplos proporcionados en la presente son sólo para propósitos ilustrativos. Se proponen para proporcionar detalles suficientes de composición para permitir que una persona experta en la técnica haga y use la presente invención y proporcionen ejemplos ilustrativos de dispositivos y métodos adecuados. La modalidad preferida puede comprender parte o todos los materiales, componentes, métodos o aplicaciones descritas en la presente; pero no se limita a solo estos presentados. Se pueden realizar sustituciones simples que pueden alterar la lista de componentes o la utilidad de la solicitud pero estas también se contemplan. El dispositivo de producción final puede tomar la forma de una u otra de las modalidades presentadas, con una o más de las opciones descritas, pero las configuraciones ejemplificadas no constituyen el abandono de ninguna otra variación ni modo de acción que un experto en la técnica pueda extender a la invención descrita.

Ejemplo 1 La evaluación de los cambios de potencial de membrana en esporas vivas/muertas de Bacillus atrophaeus ilustran la correlación entre los cambios de potencial de membrana y la viabilidad. El potencial de membrana se mide usando DiOC6(3) y fluorómetro de Picoflúor. Se incuban esporas tanto viables como no viables (en autoclave) en caldo de soja tríptico y DiOC6(3) a 37°C por tiempos representativos. A los tiempos de incubación indicados, los organismos se remueven y lavan en Tris/EDTA (pH 7.4) . Entonces se toman mediciones de fluorescencia. Los resultados se muestran en la Figura 1.

Ejemplo 2 Detección Eléctrica de Esporas Viables de Geobacillus stearothermophilus en una Superficie Plana Un material metalizado conductor se moldea uniformemente sobre una hoja de Mylar no conductora aproximadamente del tamaño de una tarjeta de crédito. La hoja de mylar es tanto impermeable a gas como a líquido. Se moldea una mezcla de poliacrilamida/polianilina en la parte superior de la capa metalizada. La mezcla de poliacrilamida/polianilinas es permeable tanto a gas como a vapor. Se re-suspenden esporas de Geobacillus stearothermophilus en una mezcla de poliacrilamida/polianilina a una concentración de 108 cfu/ml. Esta concentración de esporas da una espora individual en cada gota de 10 pL (picolitro) de una impresora de inyección de tinta. La mezcla de poliacrilamida/polianilina de esporas se deposita sobre la película moldeada de poliacrilamida/polianilina en un formato de arreglo. Un segundo material metalizado conductor se moldea sobre el arreglo de esporas. Esto forma la tarjeta de indicador biológico (BI, por sus siglas en inglés) . Conforme germinan las esporas, se empezará a incrementar la conductividad del material. El flujo de corriente se detecta por preamplificadores de transistores en serie tal como coplas Darlington debido a que estos transistores Darlington. se ponen en pares permiten la amplificación de la corriente. Los transistores Darlington se conectan a conductores que monitorizan la corriente del sistema. Se adhiere una barrera a gas, tal como mylar a la parte superior del indicador por un adhesivo desprendible justo antes del uso. En el momento de uso, esta barrera se remueve de modo que el vapor o gas puede penetrar el sistema cuando se coloca en un esterilizador. En el extremo lejano del indicador hay una pequeña cámara frágil que contiene el medio de incubación que permitirá que las esporas viables germinen. Después de un proceso de esterilización utilizando vapor o peróxido de hidrógeno en vapor, se incuba el indicador biológico.

La tarjeta BI se inserta en la ranura del lector de tarjeta/incubadora que está integrada en un esterilizador. El lector/incubadora consiste de bloques calentadores para mantener la temperatura de incubación, conexiones eléctricas en las cuales se conecta la tarjeta BI, cabezal de impresión para hacer parámetros de ciclo ID de carga en una forma leíble por el usuario, rodillos para guiar la tarjeta BI en la ranura y para activar automáticamente el BI al romper la cámara frágil que contiene el medio de incubación y al ayudar a la dispersión del medio, un explorador de tira magnética, y un lector de código de barras para seguir los resultados de la tarjeta BI de regreso al ciclo de carga a esterilización del dispositivo.

El indicador se incuba a 55-60°C (temperatura óptima para Geobacillus stearothermophilus) y la conductancia del indicador se monitoriza. Los pequeños cambios en la corriente que resultan de la germinación de esporas viables se detectan en cuestión de minutos alertando al usuario que su proceso de esterilización puede no haber sido exitoso. Si fue exitoso el proceso de esterilización, no habrá incremento en la corriente medida con el tiempo de incubación.

Ejemplo 3 Detección de Fluorescencia de Esporas Viables de Geobacillus stearothermophilus en una Superficie Plana Una capa de poliacrilamida se moldea sobre un respaldo de polipropileno aproximadamente del tamaño de una tarjeta de crédito. La capa de poliacrilamida actúa como una monocapa hidratante. Entonces se . imprimen esporas de Geobacillus stearothermophilus en los puntos de organismos . Los puntos se imprimen en un arreglo o formato de rejilla con cada, punto que contiene entre 150 - 300 esporas. En un extremo · está una cámara frágil que contiene el medio de incubación con los fluoróforos requeridos. Al término del proceso de esterilización, la tarjeta BI se inserta en la "ranura de lector de tarjeta/incubadora que está integrada en un esterilizador. El lector/incubadora consiste de bloques calentadores para mantener la temperatura de incubación, fuentes de excitación LED, fotodiodos para detección de fluorescencia, cabezal de impresión para ser parámetros de ciclo e ID de carga en una forma libre por el usuario, rodillos para guiar la tarjeta BI en la ranura y para activar automáticamente el BI al romper la cámara frágil que contiene el medio de incubación y al ayudar a la dispersión del medio, un explorador de tira magnética, y un lector de código de barras para seguir los resultados de la tarjeta BI de regreso al ciclo de carga y esterilización del dispositivo.

El indicador se incuba a 55-60°C (temperatura óptima para Geobacillus stearothermophilus) . Un formador de imágenes fuera de estante, tal como el LumiSens, se puede emplear en este lector. Esto permitirá la detección de dos o más longitudes de onda de interés. Una longitud de onda medirá las esporas teñidas para asegurarse que todos los controles están en su lugar y la segunda longitud de onda medirá el fluoróforo usado para detectar organismos viables. Si fue exitoso el proceso de esterilización, todas las esporas no serán viables y el detector sólo detectará el fluoróforo usado para teñir los organismos. Sino fue exitoso el proceso de esterilización las esporas viables se detectarán por dos señales distintas de fluorescencia.

Ejemplo 4 Lector/Incubadora Independiente El lector/incubadora puede ser una unidad independiente de cualquiera de los lectores/incubadoras descritas en el Ejemplo 2 y en Ejemplo 3. En una unidad independiente, todos los componentes electrónicos son los mismos como el. lector/incubadora que se integra en los esterilizadores mismos.

En tanto que la invención se ha explicado con relación a modalidades específicas, se va a entender que varias modificaciones de estas llegarán a ser evidentes para aquellos expertos en la técnica en la lectura de la descripción. Por lo tanto, se va a entender que la invención escrita en la presente se propone para cubrir todas estas modificaciones como puedan caer dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido, por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro á partir de la presente descripción de la invención.

Claims (44)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. l. Un método para monitorizar un proceso de esterilización, caracterizado porque comprende: (A) exponer un artículo que se va a esterilizar y un indicador biológico a un medio de esterilización durante un proceso de esterilización, el indicador biológico que comprende una espora con una membrana de plasma; y (B) medir un cambio en el potencial de membrana de una espora en germinación para detectar la viabilidad de la espor .
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el indicador biológico se incuba en un medio de incubación después del paso (A) pero antes del paso (B) .
3. 3. El método de conformidad con la . reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el medio de esterilización comprende al menos un esterilizante líquido.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el esterilizante líquido comprende al menos un ácido peracé ico, al menos un peróxido, o una mezcla de dos o más de estos.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación l o 2, caracterizado porque el medio de esterilización comprende al menos un esterilizante gaseoso.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el esterilizante gaseoso comprende peróxido de hidrógeno .
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el esterilizante gaseoso comprende además amoníaco .
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el medio de esterilización comprende vapor.
9. 9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque el indicador biológico comprende bacterias de los géneros Bacillus, Geobacillus o Clostridia .
10. 10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado porque el indicador biológico comprende Geobacillus stearothermophilus, Bacillus atrophaeus, Bacillus subtilis, Bacillus sphaericus, Bacillus anthracis, Bacillus pumilus, Bacillus coagulans, Clostridium sporogenes, Clostridium difficile, Clostridium botulinum, Bacillus subtilis globigii, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Escherichia coli, o una mezcla de dos o más de los mismos.
11. 11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque el indicador biológico comprende además hongos, micobacterias , protozorios, bacterias vegetativas, o una mezcla de dos o más de estos.
12. 12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque el indicador biológico comprende Aspergillus niger, Candida albicans, Trichophyton mentagrophytes, Wangiella dermatitis, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium terrae, Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis, Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum, Aeromonas hydrophila, Enterococcus faecalis, Streptococcus faecalis, Enterococcus faeciu , Streptococcus pyrogenes, Escherichia coli, Klebsiella (pneumoniae) , Legionella pneu ophila, Metilobacterium, Pseudo onas aeruginosa, Salmonella choleraesuis, Helicobacter pylori, Micrococcus radiodurans, Deinococcus radiodurans, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis . Stenotrophomonas maltophilia, o una mezcla de dos o más de estos .
13. 13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque el indicador biológico comprende Geobacillus stearothermophilus.
14. 14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones *l-8, caracterizado porque el indicador biológico comprende un indicador biológico genéticamente sometido a estudio técnico que comprende: al menos un organismos de prueba y al menos un gen indicador adecuado paira producir una enzima, el gen indicador que se toma por el organismo de prueba.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el gen indicador se toma por el organismo de prueba usando al menos un plásmido y/o al menos un virus .
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el indicador biológico genéticamente sometido a estudio técnico comprende además al menos un gen represor que inhibe la expresión del gen indicador hasta que el gen indicador se expone al menos un inductor.
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el gen indicador y el gen represor se toman por el organismo de prueba usando al menos un plásmido y/o al menos un virus .
18. 18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14-17, caracterizado porque el organismo de prueba comprende además una o más bacterias, patógenos, organismos gramnegativos , organismos grampositivo, organismos vegetativos, virus, agentes no autoreplicantes , componentes subcelulares o productos de células .
19. 19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14-17, caracterizado porque el organismo de prueba comprende bacterias de los géneros Bacillus, Geobacillus o Clostridia genera.
20. 20. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14-17, caracterizado porque el organismo de prueba comprende Geobacillus stearothermophilus, Bacillus atrophaeus, Bacillus subtilis, 25 Bacillus sphaericus, Bacillus anthracis, Bacillus pu ilus, Bacillus coagulans, Clostridium sporogenes, Clostridium difficile, Clostridium botulinum, Bacillus subtilis globigii, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Escherichia coli, o una mezcla de dos o más de los mismos.
21. 21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14-17, caracterizado porque el organismo de prueba comprende además hongos, micobacterias , protozoarios , bacterias vegetativas, o una mezcla de dos o más de los mismos .
22. 22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14-17, caracterizado porque el organismo de prueba comprende Aspergillus niger, Candida albicans, Trichophyton mentagrophytes, Wangiella dermatitis, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium terrae, Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis, Giardia la blia, Cryptosporidium parvum, Aeromonas hydrophila, Enterococcus faecalis, Streptococcus faecalis, Enterococcus faecium, Streptococcus pyrogenes, Escherichia coli, Klebsiella (pneumoniae) , Legionella pneumophila, Metilobacterium, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella choleraesuis, Helicobacter pylori, Micrococcus radiodurans, Deinococcus radiodurans, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis. Stenotrophomonas altophilia, o una mezcla de dos o más de estos.
23. 23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14-17, caracterizado porque el organismo de prueba comprende además bacterias vegetativas, células vegetativas y/o sus partes constituyentes.
24. 24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14-17, caracterizado porque el organismo de prueba comprende enterococos resistentes a vancomicina, Staphyloccus aureus, Mycobacterium cheloni resistentes a meticilina, o una mezcla de dos o más de estos.
25. 25. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14-17, caracterizado porque el medio de incubación comprende una o más fuentes de nutrientes y uno o más indicadores de recuperación, inducción o crecimiento microbiano.
26. 26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el medio de incubación comprende además uno o más amortiguadores de pH, uno o más agentes para mantener equilibrio osmótico, uno o más neutralizadores, o una mezcla de dos o más «de los mismos.
27. 27. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque el indicador biológico se incuba en un medio de incubación, el indicador biológico que . se incuba en la presencia de un tinte fluorescente de potencial de membrana.
28. 28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el tinte es una carbocianina .
29. 29. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el tinte es un oxonol.
30. 30. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el tinte es yoduro de 3,3'-dihexiloxicarbocianina o bis- (ácido 1, 3-dibutilbarbitúrico) -trimetina-oxonol .
31. 31. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-30, caracterizado porque el potencial de membrana se mide usando polarización de fluorescencia.
32. 32. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-30, caracterizado porque el potencial de membrana se mide usando transferencia de energía de resonancia de fluorescencia.
33. 33. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque el indicador biológico se incuba en la presencia de un tinte sensible a voltaje.
34. 34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el tinte sensible a voltaje es un tinte de estirilo.
35. 35. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el tinte sensible al voltaje es di-8-butil-aminonaftil-etilen-piridinio-propilsulfonato o di-4-butil-aminonaftil-etilen-piridinio-propil-sulfonato .
36. 36. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el potencial de membrana se mide usando transferencia de energía de resonancia de fluorescencia .
37. 37. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque el indicador biológico se coloca en un material eléctricamente conductor.
38. 38. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque durante el paso (B) el indicador biológico se coloca en el medio y conductores electrónicos en el medio se usan para medir el potencial de membrana.
39. 39. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque el potencial de membrana se mide usando conductores electrónicos colocados a través de o dentro del indicador biológico.
40. 40. Un indicador de esterilización, caracterizado porque comprende: un material eléctricamente conductor colocado en un substrato; y un indicador biológico colocado en parte o todo el material eléctricamente conductor; en donde el indicador biológico comprende esporas .
41. 41. Un método, caracterizado porque comprende: depositar un material eléctricamente conductor en un substrato usando una impresora de inyección de tinta; y depositar un indicador biológico en un arreglo o parte o todo del material eléctricamente conductor usando la impresora de inyección de tinta; proporcionar circuitería eléctricá adaptada para detectar cambios en una propiedad eléctrica del material eléctricamente conductor; exponer el indicador biológico a un medio de esterilización; y determinar si se presenta algún cambio en la propiedad eléctrica del material eléctricamente conductor.
42. 42. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el indicador biológico comprende esporas .
43. 43. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-39, caracterizado porque si no se mide un cambio en el potencial de membrana, se juzga . exitoso el proceso de esterilización.
44. 44. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-38, caracterizado porque si se mide un cambio en el potencial de membrana, se juzga no exitoso el proceso de esterilización.