ES2606309T3 - Procedimiento de monitorización de un proceso de esterilización - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de fabricación de un indicador de esterilización, que comprende: depositar un material eléctricamente conductor sobre un sustrato utilizando una impresora de chorro de tinta; depositar un indicador biológico en una matriz en una parte o todo el material eléctricamente conductor utilizando la impresora de chorro de tinta; y proporcionar un circuito eléctrico en comunicación eléctrica con el material eléctricamente conductor, estando el circuito eléctrico adaptado para detectar cambios en una propiedad eléctrica del material eléctricamente conductor.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento de monitorizacion de un proceso de esterilizacion Campo tecnico

La presente invencion versa acerca de un procedimiento de monitorizacion de un proceso de esterilizacion. Mas en particular, la presente invencion versa acerca de un procedimiento de monitorizacion de un proceso de esterilizacion en el que un indicador biologico que comprende una celula con una membrana plasmatica esta expuesta al medio de esterilizacion. Posteriormente, se mide el potencial de membrana del indicador biologico para detectar la viabilidad de la celula.

Antecedentes

Es habitual emplear indicadores biologicos tales como bacterias en procedimientos de esterilizacion para determinar si un artfculo que va a ser esterilizado ha sido expuesto o no a un nivel eficaz del o de los ingredientes activos del esterilizante. Se pueden utilizar indicadores biologicos para proporcionar una garantfa de que se satisfacen las condiciones de esterilizacion en el procesador o en la propia carga procesada. Se pueden utilizar indicadores biologicos para representar el caso mas desfavorable para el sistema de procesamiento al proporcionar un numero sumamente grande de organismos muy resistentes a ese procedimiento particular dentro del indicador, o tras el mismo. A menudo se utilizan esporas como el organismo de eleccion para monitorizar tales procedimientos de esterilizacion. Normalmente, los usuarios de indicadores biologicos dependen de los efectos visuales que seguinan a la multiplicacion de cualquier organismo viable superviviente para determinar la eficacia del proceso de esterilizacion en el que se emplean los indicadores biologicos. Este procedimiento puede llevar desde horas hasta dfas para producir un cambio visible tal como turbidez en un medio de incubacion o un cambio de color en un indicador de pH si se utiliza tal indicador.

Se han propuesto indicadores biologicos que correlacionan la actividad de una enzima termostable endogena (derivada internamente, preexistente) presente en una capa de esporas con la viabilidad real del organismo. Esto ha tenido como resultado tiempos de lectura que vanan desde minutos hasta horas con un fluonmetro o colonmetro. Aunque estos indicadores biologicos proporcionan una correlacion entre la actividad de la enzima y la viabilidad del organismo, los resultados reales obtenidos son debidos completamente a la actividad de la enzima y no tienen una relacion directa con la viabilidad del organismo.

Tambien se han propuesto indicadores biologicos que correlacionan la actividad de una enzima exogena (derivada externamente, no existente anteriormente) que es producida tras una Induccion qmmica de un gen recombinante si hay organismos viables de ensayo presentes despues del evento de esterilizacion que esta siendo evaluado que porta ese gen. Esto proporciona tiempos de lectura biologica que vanan desde minutos hasta horas con una lectura fluorometrica y proporciona una relacion directa con la viabilidad del organismo.

Sumario

Un problema con estas tecnologfas anteriores esta relacionado con el hecho de que la tecnica anterior ha dependido principalmente del crecimiento y de la division de organismos o de la presencia de actividad enzimatica para detectar la viabilidad. La deteccion del crecimiento y de la division de organismos puede llevar desde horas hasta dfas. La deteccion de la actividad enzimatica puede llevar desde minutos hasta horas. La actividad enzimatica puede llevar desde minutos hasta horas para generar senales suficientemente Intensas para que sean detectadas bien de forma fluorometrica o bien de forma colorimetrica. Por lo tanto, existe una necesidad de un procedimiento para conseguir resultados rapidos que sean tan definitivos como los conseguidos utilizando tecnicas de crecimiento y de division. La presente invencion proporciona una solucion a este problema.

La presente invencion se refiere a un procedimiento, que comprende: (A) exponer tanto un artfculo que va a ser esterilizado como un indicador biologico a un medio de esterilizacion durante un proceso de esterilizacion, comprendiendo el indicador biologico celulas con membranas plasmaticas; y (B) medir el potencial de membrana de las celulas procesadas para detectar cualquier viabilidad restante dentro de la poblacion de las celulas que siguen la finalizacion del proceso de esterilizacion. Esta viabilidad puede ser ejemplificada, sin limitacion, por los cambios de potencial de la membrana asociados con eventos de flujo ionico o la germinacion de las esporas indicadoras.

La invencion se refiere a un indicador de esterilizacion que comprende un material conductor electricamente colocado sobre un sustrato, y un indicador biologico (por ejemplo, esporas) colocados en parte o todo el material conductor electricamente.

La presente invencion se refiere a un procedimiento para hacer un indicador de esterilizacion, que comprende: depositar un material electricamente conductor sobre un sustrato (por ejemplo, usando un procedimiento de impresion como se ejemplifica, pero no se limita a impresion de chorro de tinta) y depositar un indicador biologico (por ejemplo, esporas) en parte o todo el material electricamente conductor usando, por ejemplo, una impresora de chorro de tinta.

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Breve descripcion de los dibujos

La figura 1 es un grafico que muestra los cambios de potencial de la membrana para las esporas sometidas a ensayo en el Ejemplo 1.

La figura 2 es una ilustracion esquematica de un polarizador de fluorescencia.

La figura 3 es una ilustracion esquematica de un indicador biologico utilizado junto con una monitorizacion electronica de una germinacion.

Las figuras 4 y 5 son ilustraciones de indicadores biologicos alternativos para la evaluacion del potencial de membrana por medio de senales electricas.

La figura 6 es una representacion esquematica de un elemento inferior de una realizacion electrica de un indicador de esterilizacion segun la presente invencion.

La figura 7 es una representacion esquematica de un elemento superior de una realizacion electrica de un indicador de esterilizacion segun la presente invencion, tal como el de la figura 6.

La figura 8 es una vista esquematica en planta desde arriba de una capa estanca superior para ser utilizada con una realizacion de la presente invencion, tal como las de las figuras 4-7.

La figura 9 es una vista esquematica en planta desde arriba de un elemento inferior 700 de otra realizacion de la presente invencion, que es una realizacion basada en la fluorescencia de un indicador de esterilizacion.

La figura 10 es una vista frontal esquematica de un lector para ser utilizado con una version basada en la electronica de un indicador de esterilizacion segun una realizacion de la presente invencion, junto con vistas frontal y trasera de una tarjeta indicadora electronica de esterilizacion ejemplar.

Las figuras 11A y 11B son vistas frontales esquematicas de un lector para ser utilizado con una version basada en la fluorescencia de un indicador de esterilizacion segun una realizacion de la presente invencion, en una posicion cerrada y abierta, respectivamente.

La figura 12 es una vista esquematica en perspectiva de componentes internos de un lector de fluorescencia tal como el de la figura 11, junto con vistas frontal y trasera de una tarjeta indicadora ejemplar de esterilizacion basada en fluorescencia.

La figura 13 es una vista frontal esquematica de un lector para ser utilizado con un indicador biologico autocontenido FABI.

Descripcion detallada

El termino "esterilizacion" hace referencia a hacer que una sustancia sea incapaz de reproduccion, de metabolismo y/o de crecimiento. Aunque a menudo esto se interpretado con el significado de una ausencia total de organismos vivos, el termino puede ser utilizado en el presente documento para hacer referencia a una sustancia libre de organismos vivos hasta un grado acordado o determinado anteriormente que es aceptable. A no ser que se indique lo contrario, el termino esterilizacion puede ser utilizado en el presente documento para hacer referencia tambien a metodos y procedimientos menos rigurosos que la esterilizacion, por ejemplo, una desinfeccion, un saneamiento y similares.

Los procedimientos y los aparatos descritos en el presente documento pueden ser utilizados en campos de la industria sanitaria, en campos cientfficos y similares. Estos pueden ser utilizados en aplicaciones comerciales e industriales en las que pueden ser deseados una esterilizacion, una desinfeccion, un saneamiento, una descontaminacion, una limpieza y similares. Las aplicaciones comerciales e industriales pueden incluir procesos tales como la preparacion de alimentos, la pasteurizacion, la descontaminacion de suelos, la descontaminacion de agua, y similares.

El proceso de esterilizacion con el que se puede utilizar el procedimiento inventivo puede comprender cualquier proceso de esterilizacion. El proceso de esterilizacion puede incluir procedimientos de esterilizacion en los que el medio de esterilizacion o esterilizante puede comprender vapor, calor seco, radiacion, plasma, al igual que uno o mas esterilizantes gaseosos, uno o mas esterilizantes lfquidos y similares. Los procedimientos basados en radiacion utilizados pueden comprender un haz de electrones o cualquier espectro electromagnetico, incluidos radiacion ionizante, luz blanca o ultravioleta pulsatil, microondas y similares. La radiacion puede comprender radiacion gamma o beta. Los esterilizantes gaseosos pueden comprender oxido de etileno, peroxido de hidrogeno gaseoso y similares. Los esterilizantes lfquidos pueden comprender formalina (gas formaldehudo disuelto en agua y que contiene, opcionalmente, metanol para inhibir la formacion de sustancias toxicas), glutaraldehfdo, acido peracetico, peroxido de hidrogeno lfquido y similares. El indicador biologico puede ser utilizado para examinar la letalidad de esterilizantes contra cualquier microorganismo con menos resistencia al proceso de esterilizacion que el organismo

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de ensayo proporcionado dotado del indicador biologico. Estos microorganismos pueden incluir bacterias tales como Escherichia coli, Legionella sp., Campylobacter sp., y otras bacterias entericas, al igual que especies Staphylococcus y Streptococcus y otros microorganismos patogenos humanos tales como Cryptosporidium. El indicador biologico puede comprender uno o mas organismos de ensayo. El organismo de ensayo puede comprender cualquier celula con una membrana plasmatica cuya resistencia al procedimiento previsto de esterilizacion supere la de los otros organismos para cuya destruccion esta disenado el proceso de esterilizacion. El tipo de organismo de ensayo utilizado como el indicador biologico puede depender de una variedad de factores ejemplificados, sin limitacion, por el tipo de proceso de esterilizacion que esta siendo utilizado. El organismo de ensayo puede ser un microorganismo. Las cepas que pueden ser utilizadas pueden ser aquellas que sean las mas resistentes al procedimiento utilizado para la esterilizacion. El microorganismo de ensayo puede comprender bacterias. Los microorganismos bacterianos pueden ser aquellos que forman endoesporas, es decir, esporas bacterianas. El organismo de ensayo puede comprender bacterias de los generos Bacillus o Clostridia. El organismo de ensayo puede incluir Geobacillus stearothermophilus, Bacillus atrophaeus, Bacillus subtilis, Bacillus sphaericus, Bacillus anthracis, Bacillus pumilus, Bacillus coagulans, Clostridium sporogenes, Clostridium difficile, Clostridium botulinum, Bacillus subtilis globigii, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Escherichia coli, o una mezcla de dos o mas de los mismos.

El organismo de ensayo puede comprender hongos, micobacterias, protozoos, bacterias vegetativas, celulas vegetativas y/o sus partes constituyentes y similares. Ejemplos de hongos que pueden ser utilizados pueden incluir Aspergillus niger, Candida albicans, Trichophyton mentagrophytes, Wangiella dermatitis y similares. Ejemplos de micobacterias que pueden ser utilizadas pueden incluir Mycobacterium chelonae, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium terrae y similares. Ejemplos de protozoos que pueden ser utilizados pueden incluir Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum y similares. Ejemplos de bacterias vegetativas que pueden ser utilizadas pueden incluir Aeromonas hydrophila, Enterococcus faecalis, Streptococcus faecalis, Enterococcus faecium, Streptococcus pyrogenes, Escherichia coli, Klebsiella (pneumoniae), Legionella pneumophila, Methylobacterium, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella choleraesuis, Helicobacter pylori, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Stenotrophomonas maltophilia y similares. Se pueden utilizar organismos tales como Geobacillus stearothermophilus, Bacillus atrophaeus, Bacillus subtilis, Bacillus coagulans, Clostridium sporogenes y similares para determinar la eficacia de una esterilizacion con calor humedo (en autoclave), siendo especialmente util el Geobacillus stearothermophilus.

El organismo de ensayo puede comprender Aspergillus niger, Candida albicans, Trichophyton mentagrophytes, Wangiella dermatitis, Mycobacteriums chelonae, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium terrae, Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis, Giardia lamblia, Crystosporidium parvum, Aeromonas hydrophila, Enterococcus faecalis, Streptococcus faecalis, Enterococcus faecium, Streptococcus pyrogenes, Escherichia coli, Klebsiella (pneumoniae), Legionella pneumophila, Methylobacterium, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella choleraesuis, Helicobacter pylori, Micrococcus radiodurans, Deinococcus radiodurans, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Stenotrophomonas maltophilia o una mezcla de dos o mas de los mismos.

Ademas de los organismos de ensayo seleccionados en funcion de su aspecto representantes del organismo mas resistente (por ejemplo, Geobacillus stearothermophilus y Bacillus atropheaus), el indicador biologico puede comprender, ademas, agentes de bioterrorismo o guerra biologica, por ejemplo, Bacillus anthracis y similares. Estos organismos resistentes tambien pueden comprender cepas que se han vuelto resistentes a medios anteriormente eficaces de tratamiento antibiotico o desinfeccion qmmica debido a modificaciones naturales o hechas por el hombre. Ejemplos del tipo anterior pueden incluir ERV (enterococos resistentes a la vancomicina), SARM (Staphylococcus aureus resistente a la meticilina), Mycobacterium cheloni y similares. Tales organismos resistentes pueden ser deseables debido a que los ERV y SARM han desarrollado recientemente una resistencia a contramedidas terapeuticas (por ejemplo, resistencia a los antibioticos) y M. cheloni ha desarrollado una resistencia a algunos modos de desinfeccion (por ejemplo, resistencia al glutaraldetndo) y, por lo tanto, proporcionan organismos de ensayo adecuados como modelos de "caso mas desfavorable".

En organismos viables tales como bacterias, se desarrolla un potencial electrico a traves de la membrana plasmatica de la celula. Este potencial de membrana desempena un papel vital en fuerzas proton-motrices en organismos requeridas para actividades tales como la generacion de adenosintrifosfato (ATP), quimiotaxis, transporte de glucosa, y la supervivencia del organismo a pH bajo. El establecimiento de un potencial de membrana permite que la celula intercambie material/informacion con su entorno. Por lo tanto, al medir el potencial de membrana, el procedimiento inventivo proporciona una lectura instantanea o rapida acerca de la viabilidad de la celula.

El potencial de membrana en organismos viables activamente metabolizantes puede ser alto y las celulas con un potencial elevado de membrana son denominadas, a menudo, energizadas o hiperpolarizadas. Los organismos no viables y los organismos latentes pueden exhibir un potencial bajo o nulo de membrana y son denominados, a menudo, desenergizados o despolarizados.

El procedimiento inventivo puede depender de cambios en el potencial de membrana que se producen tras la germinacion y el crecimiento del organismo de ensayo como un medio de deteccion de la viabilidad del organismo de ensayo. Cuando se coloca un organismo viable en condiciones que favorecen la germinacion y el crecimiento, el

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potencial de membrana del organismo puede cambiar. Por otra parte, si el organismo no es viable sena incapaz de germinar y no habna ningun cambio en su potencial de membrana.

El indicador biologico puede comprender un indicador biologico modificado geneticamente que puede comprender, ademas, un gen informador adecuado para aumentar el potencial de membrana incorporado por un organismo de ensayo (por ejemplo, un microorganismo bacteriano) que utiliza un vehuculo adecuado (por ejemplo, plasmido o virus). La expresion del gen informador puede ser bloqueada activamente por un gen represor. La expresion del gen informador puede permanecer bloqueada hasta que se expone el gen represor a un inductor que puede estar presente en un medio de recuperacion. El organismo de ensayo para ser utilizado en un indicador biologico modificado geneticamente puede comprender cualquiera de los organismos de ensayo descritos anteriormente. En una realizacion, el organismo de ensayo no sera expuesto al inductor hasta despues de que se haya completado el proceso de esterilizacion y, por consiguiente, la enzima indicadora no existira antes de la esterilizacion ni durante la misma. Lo que puede exponerse al proceso de esterilizacion son los mecanismos diversos y vitales que el organismo de ensayo utiliza para sobrevivir y crecer y que tambien son utilizados para la produccion de la enzima indicadora. Estos pueden incluir las ADN-polimerasas utilizadas para un crecimiento celular (y la replicacion del plasmido), ARN-polimerasas para la transcripcion de los requerimientos metabolicos de los organismos de ensayo (y el gen informador portado por un plasmido o un virus) y los polisomas ribosomales requeridos para la traduccion de protemas celulares (al igual que la expresion de la enzima indicadora y/o mecanismos de transporte de iones).

Existen dos clases principales de colorantes fluorescentes de potencial de membrana, diferenciandose cada clase en su procedimiento de union a la celula. La primera clase de colorantes de potencial de membrana, carbocianinas, puede acumularse en membranas hiperpolarizadas y puede ser translocada al interior de la bicapa lipfdica. Una carbocianina util es yoduro de 3,3-dihexiloxacarbocianina [DiOC6(3)j. La segunda clase de colorantes de potencial de membrana que puede ser utilizada comprende los oxonoles. Los colorantes de oxonol pueden entrar en celulas despolarizadas y unirse a protemas o membranas intracelulares. Un colorante de oxonol util es acido bis-(1,3- dibutilbarbiturico) trimetina oxonol [DiBAC4(3)j. Con colorantes de carbocianina la fluorescencia puede aumentar con el tiempo y el potencial de membrana, mientras que con los colorantes de oxonol, la fluorescencia puede reducir con el tiempo y el menor potencial de membrana. Entonces, se puede asociar directamente la presencia o ausencia de un potencial de membrana con fluorescencia con el tiempo.

El medio de incubacion puede ser denominado un medio de crecimiento o un medio de recuperacion. El medio de incubacion puede tener la forma de un solido o un lfquido. El medio de incubacion puede comprender una disolucion acuosa tamponada particular, de forma que el indicador biologico puede ser mas sensible a cambios de pH, potenciales redox, actividad enzimatica y similares.

El indicador de esterilizacion puede ser utilizado en cualquier procedimiento en el que el indicador de esterilizacion sea expuesto a un medio de esterilizacion durante un proceso de esterilizacion y luego a recuperacion e induccion. El medio de incubacion puede comprender una o mas fuentes nutrientes. La fuente nutriente puede ser utilizada para proporcionar energfa para el crecimiento de cualquiera de los organismos de ensayo que pueden sobrevivir el proceso de esterilizacion. Ejemplos de las fuentes nutrientes pueden incluir digesto pancreatico de casema, digesto enzimatico de harina de soja, sacarosa, dextrosa, extracto de levadura, L-cistina y mezclas de dos o mas de los mismos. Un indicador de crecimiento microbiano, que cambia de color o estado nativo, en presencia de organismos viables de ensayo que pueden ser utilizados con el medio de incubacion.

El medio de incubacion (recuperacion/induccion) puede contener, por ejemplo, un colorante de potencial de membrana o colorante sensible a la tension. El uso de estos indicadores de crecimiento microbiano puede tener como resultado un cambio en la fluorescencia en respuesta a un fenomeno de crecimiento de microorganismos, tales como el cambio de pH, en potenciales de oxidorreduccion, en la actividad enzimatica, al igual que otras indicaciones de crecimiento.

El medio de incubacion puede comprender, ademas, uno o mas tampones de pH, uno o mas neutralizadores, uno o mas agentes para mantener el equilibrio osmotico o una mezcla de dos o mas de los mismos. Los tampones de pH pueden incluir K2HPO4, KH2PO4, (NH4)2HP4, 2,2-bis(hidroximetil)-2,2,,2"-nitrilotrietanol (bis tris), 1,3- bis[tris(hidroximetil)-metilaminolpropano (bis-tris propano), acido 4-(2-hidroxietil)piperazina-etanosulfonico (HEPES), 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol (Trizma, Tris base), N-[tris(hidroximetil)metil]glicina (Tricina), diglicina (Gly- Gly), N,N-bis(2-hidroxietil)glicina (Bicina), acido N-(2-15 acetamidojiminodiacetico (ADA), acido N-(2-acetamido)-2- aminoetanosulfonico (aces), acido 1,4-piperazinadiaetanosulfonico (PIPES), acido 3-hidroxi-4-morfolino- propanosulfonico (MOPSO), acido N,N-bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanosulfonico (BES), acido 3-(N- morfolino)propanosulfonico (MOPS), acido 2-[(2-hidroxi-1,1-bis(hidroximetil)etil)amino]etanosulfonico (TES), acido 3- [N,N-bis(2-hidroxietil)amino]-2-hidroxi-1-propanosulfonico (DIPSO), acido 4-(N-morfolino)butanosulfonico (MOBS), acido 2-hidroxi-3-[tris(hidroximetil)metilamino]-1-propanosulfonico (TAPSO), acido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-(2- hidroxipropanosulfonico hidratado (NEPPSO), acido piperazina-1,4-bis(2-hidroxipropanosulfonico) dihidratado (POPSO), acido 4-(2-25 hidroxietil)-1-piperazina propanosulfonico (EPPS), acido N-(2-hidroxietil)-piperazina-N-(4- butanosulfonico) (HERBS), acido [(2-hidroxi-1,1-bis(hidroximetil)etil)amino]-1-propanosulfonico (TAPS), 2-amino-2- metil-1,3-propanodiol (AMPD), acido N-tris(hidroximetil)metil-4-aminobutanosulfonico (TABS), acido N-(1,1 -dimetil-2- hidroxietil)-3-amino-2-hidroxipropanosulfonico (AMPSO), acido 2-(cicloheixilamino)etanosulfonico (CHES), acido 3- (ciclohexilamino)-2-hidroxil-1-propanosulfonico (CAPSO), 2-amino-2-metil-1 -propanol (AMP), acido 3-

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Los neutralizadores pueden incluir, sin limitacion, tioglicolato de sodio, tiosulfato de sodio, catalasa, bisulfato de sodio, lecitina bisulfato de sodio, polisorbato 20, polisorbato 80, bicarbonato calcico y mezclas de dos o mas de los mismos.

Los agentes para mantener un equilibrio osmotico pueden incluir sal de sodio, sales de potasio, sales de magnesio, sales de manganeso, sales de calcio, otros, por ejemplo, sales de metales de transicion, cloruro sodico, cloruro potasico, sulfato de magnesio, cloruro de hierro y mezclas de dos o mas de los mismos.

En una realizacion, el medio de incubacion comprende una composicion acuosa que comprende: agua; de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 gramos por litro de agua (g/l) y, en una realizacion de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 g/l, de uno o mas nutrientes fuentes; de aproximadamente 1,0 x 10"5 a aproximadamente 10 g/l, y en una realizacion desde aproximadamente 1,0 x 10"4 a alrededor de 1,0 g/l de uno o mas indicadores de crecimiento microbiano; hasta aproximadamente 5000 g/l, y en una realizacion de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 5000 g/l, y en una realizacion de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1000 g/l, de uno o mas tampones de pH; hasta aproximadamente 100 g/l, y en una realizacion desde aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 g/l, y en una realizacion de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 g/l, de uno o mas neutralizadores; hasta aproximadamente 50 g/l, y en una realizacion de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 g/l, y en una realizacion de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 25 g/l, de uno o mas agentes para el mantenimiento del equilibrio osmotico.

El medio de incubacion puede comprender un caldo nutriente, caldo neutralizante D/E, medio mmimo de Davies, caldo en ensayo de esterilidad, al igual que cualquier medio de digesto de soja-casema o a base de extracto de ternera. Estos pueden incluir una disolucion acuosa de caldo de digesto de soja-casema, fluido de tioglicolato y dextrosa triptona (Difeo Laboratories, Inc). Se puede utilizar una base de caldo tnptico de soja modificado, sin glucosa. Tambien se puede anadir un colorante de potencial de membrana o colorante sensible a la tension.

Un ejemplo de un medio de incubacion que puede ser utilizado es Bacto™ Tryptic Soy Broth que contiene digesto pancreatico de casema (17,0 g/l), digesto enzimatico de harina de soja (3,0 g/l), cloruro de sodio (5,0 g/l), fosfato dipotasico (2,5 g/l) y dextrosa (2,5 g/l). Estos ingredientes pueden ser dispersados o disueltos en agua. Las concentraciones expresadas en terminos de g/l hacen referencia a gramos de ingrediente por litro de agua. El digesto pancreatico de casema, el digesto enzimatico de harina de soja, y dextrosa proporcionan fuentes de energfa para el crecimiento del microorganismo. Estos pueden ser denominados fuentes nutrientes. Se puede utilizar cloruro de sodio para mantener un equilibrio osmotico en el medio lfquido. El fosfato dipotasico puede accionar como un tampon de pH. Se puede anadir DiOC6(3), por ejemplo, que es un colorante de potencial de membrana (3 pg/l) a la formulacion BactoTM Tryptic Soy Broth.

El medio de incubacion puede comprender una formulacion muy basica que puede servir unicamente para potenciar eventos de flujo ionico y/o para iniciar la germinacion de esporas. Este medio puede comprender aminoacidos, sales y/o azucares. Ejemplos de aminoacidos incluyen L-alanina, L-leucina, L-cistema, L-valina, L-lactato, L-treonina, acido L-tartarico, acido folico, L-tirosina, L-prolina y asparagina. Ejemplos de sales son cloruro de sodio y cloruro de potasio. Ejemplos de azucares incluyen glucosa, sacarosa, fructosa y xilosa. Los componentes encontrados en el sobrenadante de organismos en crecimiento, tales como peptidoglucano y muropeptidos pueden desencadenar eventos de flujo ionico o eventos de germinacion adicionales.

Los colorantes de potencial de membrana son fluorescentes y, por lo tanto, el procedimiento de deteccion de eleccion debe tener la capacidad para distinguir entre la fluorescencia de las moleculas de colorante que estan acotadas dentro de la membrana en contraposicion con la fluorescencia de las moleculas de colorante libres. Dos procedimientos particularmente adecuados para distinguir entre las emisiones de fluorescencia procedente de estas dos fuentes son las tecnicas de polarizacion de fluorescencia (tambien conocida como anisotropfa de fluorescencia) y la basada en una transferencia de energfa de resonancia de fluorescencia (basada en FRET), incluyendo la FRET resuelta por tiempo.

La polarizacion de fluorescencia es un procedimiento de deteccion que depende de cambios en el tamano aparente de una molecula fluorescente para su deteccion. Las mediciones de polarizacion pueden estar basadas en el principio de excitacion selectiva de fluoroforos por medio de luz polarizada. Los fluoroforos tienen momentos de transicion para la absorcion y emision que se encuentran en orientaciones espedficas con respecto a los ejes moleculares del fluoroforo y que absorberan, preferentemente, fotones cuyos vectores electricos esten alineados en paralelo con estos momentos de transicion. En una disolucion isotropica, los fluoroforos pueden estar orientados aleatoriamente. Tras una excitacion con luz polarizada, aquellas moleculas de fluoroforo cuyo dipolo de transicion de absorcion es paralelo al vector electrico de la excitacion pueden ser excitadas preferentemente. Esta excitacion selectiva puede tener como resultado una poblacion de fluoroforos parcialmente orientada y tiene como resultado, ademas, una emision de fluorescencia polarizada parcialmente. La emision tambien se produce con la luz polarizada a lo largo de un eje fijo en el fluoroforo. La polarizacion de fluorescencia puede excitar las moleculas con luz

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polarizada en un plano. Entonces, se puede medir la luz emitida tanto en la posicion inicial polarizada en un plano como en una posicion desplazada con respecto a la luz polarizada en un plano, normalmente desplazada 90°. Por ejemplo, si el vector electrico de la luz de excitacion esta polarizado en un plano vertical, entonces se puede medir la luz emitida tanto en las posiciones vertical como horizontal. Los fluoroforos que estan "alineados" con el vector electrico de la luz de excitacion absorberan preferentemente la luz. Entonces, se puede medir la luz emitida tanto en la posicion polarizada horizontalmente como en la posicion polarizada verticalmente. La polarizacion puede ser expresada como una relacion de las intensidades de luz y es una medida del grado de rotacion molecular durante el periodo entre la excitacion y la emision. Las moleculas pequenas pueden girar mas rapido y tendnan un menor valor intrmseco de polarizacion que las moleculas mas grandes. Por otra parte, las moleculas mas grandes pueden girar menos y, por lo tanto, tienen un mayor valor intrmseco de polarizacion. Utilizando una polarizacion de fluorescencia, puede ser posible distinguir entre colorantes de potencial de membrana acotados y colorantes de potencial de membrana no acotados.

Una incubadora/lectora basada en la polarizacion de fluorescencia puede estar disenada como se muestra en la figura 2. La figura 2 es una ilustracion esquematica de un polarizador de fluorescencia. Con referencia a la figura 2, la incubadora/lectora 100, que permite el ensayo de la muestra 110, incluye una fuente 120 de luz monocromatica, un divisor 130 de haz y polarizadores 140, 150 y 160. La luz monocromatica procedente de la fuente 120 de luz monocromatica pasa a traves del polarizador 140, de forma que se polariza toda la luz de excitacion. Entonces, esta luz polarizada excita, preferentemente, unicamente las moleculas en la muestra 110 que se encuentran en el mismo estado de polarizacion que el filtro. Segun giran estas moleculas, salen de la posicion polarizada en un plano. La luz emitida es dividida por el divisor 130 de haz. El divisor de haz divide la luz y pasa aproximadamente la mitad de la luz a traves del polarizador 150 orientado en el mismo plano que la luz de excitacion y la otra mitad a traves del polarizador 160 orientado con un angulo con respecto a la luz de excitacion inicial. Se mide y se compara la luz que pasa a traves de cada polarizador 150 y 160.

La transferencia de energfa de resonancia de fluorescencia (FRET) es la transferencia de energfa de un fluoroforo donante excitado inicialmente a un fluoroforo receptor. Normalmente, el fluoroforo donante emite con una longitud de onda menor que se solapa con el espectro de absorcion del receptor. Se produce una transferencia de energfa de resonancia sin la aparicion de un foton y es el resultado de interacciones a larga distancia entre dipolos entre los fluoroforos donante y receptor.

Para monitorizar los cambios en el potencial de membrana con FRET, se requieren dos fluoroforos. El donante de FRET podna ser cualquier fluoroforo que proporcione un espectro suficiente de absorcion para el receptor. El fluoroforo receptor sena el colorante de potencial de membrana. Preferentemente, el fluoroforo donante se fijana o adherina a la pared de esporas, permitiendo una proximidad estrecha con el colorante de potencial de membrana. De lo contrario, se monitorizana la opcion de deteccion de fluorescencia (FRET) mediante el mismo tipo de fluonmetro descrito en otro lugar del presente documento y en los ejemplos proporcionados.

Ademas de los colorantes de potencial de membrana, los colorantes de deteccion de tension o sensibles a la tension pueden detectar los mismos cambios en el potencial de membrana de organismos que utilizan otro conjunto mas de principios. El uso de colorantes sensibles a la tension para la deteccion de un potencial de membrana esta basado en el mecanismo ffsico conocido como electrocromismo. Tanto el espectro de excitacion como el de emision de estos colorantes exhiben cambios significativos debidos a cambios de tension. Estos cambios en los espectros surgen de las redistribuciones de carga que reflejan los cambios de potencial de membrana. La clase utilizada mas habitualmente de colorantes sensibles a la tension son los colorantes de estirilo, ejemplos espedficos Incluyen di-8- butil-amino-naftil-etlleno-piridinlo-propil-sulfonato (di-8-ANEPPS) y di-4butil-amino-naftil-etileno-piridinio- propilsulfonato (dl-4-ANEPPS).

El uso de colorantes sensibles a la tension en combinacion con una tecnica de tipo FRET permite la deteccion sencilla de cambios en el potencial de membrana. Por ejemplo, segun se producen redistribuciones de carga en la membrana de organismos germinantes tales como esporas, la longitud de onda de emision de los colorantes sensibles a la tension comenzara a desplazarse. Este desplazamiento en la longitud de onda de emision puede ser detectado, entonces, por medio de un segundo fluoroforo ubicado en el medio de cultivo. La emision desde esta segunda longitud de onda puede ser detectada por medio del detector. Por ejemplo, el pico en los espectros de excitacion para di-8-ANEPPS se desplaza entre 450 nm y 520 nm dependiendo de las caractensticas de tension/carga. Esto tiene como resultado un correspondiente desplazamiento maximo en los espectros de emision desde 530 nm hasta 640 nm. El fluonmetro/incubadora puede estar disenado para excitar di-8-ANEPPS bien a 450 nm o bien a 520 nm y luego detectar un segundo fluoroforo que tiene un pico de excitacion en el pico de emision correspondiente del di-8-ANEPPS.

Un procedimiento alternativo de deteccion para la deteccion de cambios en el potencial de membrana es el uso de senales electronicas. Segun comienzan a germinar organismos tales como esporas, el potencial de membrana aumentara permitiendo mas flujo de corriente y mayores cafdas de tension que tienen como resultado un aumento en el transporte de iones, que es observado como un aumento en el flujo de corriente, por el mayor potencial de membrana. Se pueden colocar conductores electronicos en el medio o a traves/dentro de un sustrato Indicador biologico para medir electricamente el potencial de membrana. A continuacion, se muestran en las figuras 3-5 tres disenos potenciales para indicadores biologicos que miden senales electricas. Con referencia a la figura 3, se

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coloca un indicador biologico 200 en el medio 202 que esta contenido en un recipiente 204. Se colocan conductores electronicos 206 y 208 en el medio 202 y son utilizados para medir el potencial de membrana. Con referencia a la figura 4, se utilizan conductores electronicos 210 y 212 para medir el potencial de membrana a traves de un indicador biologico 214. Con referencia a la figura 5, se utilizan conductores electronicos 220 y 222 para medir el potencial de membrana dentro de un indicador biologico 224.

El indicador de esterilizacion puede comprender un material conductor electricamente colocado sobre un sustrato (por ejemplo, un material conductor electricamente tal como una circuitena de cobre formada sobre un sustrato no conductor tal como silicio) y un indicador biologico (por ejemplo, esporas) colocado en parte del material conductor, o en todo el. Por ejemplo, se pueden depositar el indicador biologico (por ejemplo, esporas) y una circuitena electronica o un patron digital conductor que comprende un material conductor (por ejemplo, cobre) sobre un sustrato no conductor (por ejemplo, un sustrato de silicio) utilizando una impresora de chorro de tinta tal como una impresora Dimatrix Materials DMP-2800 que esta disponible en Fuji Film. Se puede depositar la circuitena electronica o el patron digital conductor sobre el sustrato utilizando cualquier patron deseado. Entonces, se puede depositar el indicador biologico sobre parte de la circuitena electronica o del patron digital conductor, o sobre toda ella, utilizando la impresora de chorro de tinta. El indicador biologico puede ser dispersado en un vehuculo o medio lfquido (por ejemplo, agua) que puede ser depositado, entonces, sobre parte de la circuitena electronica o del patron digital, o sobre toda ella, con gotitas de solo aproximadamente 5 picolitros, o aproximadamente 10 picolitros. Los volumenes tfpicos de esporas pueden ser de aproximadamente 3 picolitros por espora.

El indicador biologico puede ser evaluado electricamente monitorizando la tension (potencial), el flujo de corriente, la resistencia y/o la impedancia segun comienzan a germinar los organismos (esporas) viables. La eleccion del procedimiento de medicion dictara el diseno de la electronica. Una ventaja incluye una reduccion en el tiempo requerido para leer el indicador biologico. Dado que el procedimiento de deteccion depende de una de las etapas mas tempranas en la cascada de eventos de germinacion de organismos en vez de en una excrecencia de enzimas informadoras espedficas se puede reducir mucho el tiempo de deteccion.

La figura 6 es una representacion esquematica del elemento inferior 600 de una version electronica de un indicador de esterilizacion segun una realizacion de la presente invencion, tal como la mostrada en las figuras 4 y 5. La figura 6 muestra los elementos del elemento inferior 600 del indicador de esterilizacion con mas detalle. El elemento inferior 600 incluye un material conductor electricamente 602, tal como una monocapa de poliacrilamida/polianilina, colocada sobre un sustrato no conductor 604. El material conductor electricamente 602 puede incluir cualquier material adecuado siempre que el material sea adecuado para ser utilizado con las condiciones de esterilizacion con las que se utilizara el indicador de esterilizacion. El sustrato no conductor 604 puede ser cualquier material adecuado de sustrato impermeable a gases/lfquidos tal como PET u otro material adecuado que sea adecuado para ser utilizado en las condiciones de esterilizacion en las que se utilizara el indicador de esterilizacion. Como se muestra en la figura 6, hay un sustrato conductor 606 colocado entre el material conductor 602 y la capa 604, que se encuentra en comunicacion electrica con el material conductor 602 y con circuitena de deteccion. La circuitena de deteccion incluye una serie de preamplificadores 608 de transistores en serie, que estan conectados electricamente a conectores electricos 610 y al conector 611 a tierra. Los conectores electricos 61 proporcionan una comunicacion electrica desde el elemento inferior 600 hasta un dispositivo lector, descrito a continuacion. Los preamplificadores 608 proporcionan una amplificacion progresiva de cambios en la corriente electrica que pasa a traves del indicador de esterilizacion, como se describe con mas detalle a continuacion. Al tener una serie de amplificadores, se puede amplificar de forma adecuada una senal procedente de la tarjeta indicadora biologica sin la introduccion de excesivo ruido. El circuito se completa con el conector 611 a tierra.

Como se muestra en la figura 6, se pueden depositar esporas 612 de un organismo de ensayo adecuado sobre una monocapa conductora 602, o embebidas en la misma. Las esporas 612 pueden ser depositadas como esporas individuales o como multiples esporas. Las esporas 612 pueden ser depositados, por ejemplo, en una mezcla de poliacrilamida/tampon, en cuyo caso se considera que la espora se encuentra dentro de una "burbuja" del material tampon, "burbuja" que esta embebida en una matriz tal como poliacrilamida. De forma alternativa, las esporas 612 pueden ser embebidas directamente en una capa, por ejemplo, de polianilina.

Con referencia ahora a la figura 7, que es una vista en planta desde arriba de un elemento superior 614 para el indicador de esterilizacion, se muestran detalles adicionales de esta realizacion de la invencion. El lado del elemento superior 614 mostrado en la figura 7 es el lado que estara orientado hacia la capa superior, y hara contacto con la misma, de la estructura mostrada en la figura 6. El elemento superior 614 incluye una membrana separable 616 impermeable a los gases/lfquidos de proteccion, sobre la que se forma una capa 618 permeable a los gases/vapor. Sobre la capa permeable 618 hay una capa conductora 620. Cuando se monta el indicador de esterilizacion, la capa conductora 620 se encontrara en comunicacion electrica con las esporas 612 y cualquier material conductor circundante tal como la monocapa conductora 620, y tambien se encontrara en comunicacion electrica con un conector 622 por medio del conductor 626. Como se muestra en la figura 7, el conector 622 esta colocado por debajo de una almohadilla aislante 624. El conectar 622, por medio del cable 626, completara el circuito electrico formado por la capa conductora 620, las esporas 612, el sustrato conductor 606, los preamplificadores 608 y los conectares 610. Se utilizaran cambios en el flujo de corriente a traves de este circuito electrico para detectar si ha sobrevivido o no algun organismo de ensayo al proceso de esterilizacion en el que se utilizara el indicador 600 de esterilizacion. Como se muestra en la figura 7, el elemento superior 614 incluye una lmea adhesiva 628, por medio

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de la cual se fijara de forma estanca el elemento superior 614 al elemento inferior 600, formando, de esta manera, el indicador de esterilizacion de la presente realizacion.

Antes del uso del Indicador de esterilizacion, la membrana 616 Impermeable a gases/Kquidos de proteccion permanecera en su lugar para proteger al indicador 600 de esterilizacion de una exposicion al medio ambiente. Justo antes de que se vaya a utilizar el indicador de esterilizacion en un proceso de esterilizacion, se retirara la membrana 616 para permitir que el medio de esterilizacion alcance las esporas 612 en el Indicador de esterilizacion.

La figura 8 es una vista esquematica en planta desde arriba de una capa estanca superior 63 para ser utilizada con una realizacion de la presente invencion, tales como las de las figuras 4-7. En la realizacion mostrada en la figura 8, el cierre estanco superior 630 incluye una camara 632 llena de fluido que contiene un inductor estable termicamente y un medio para activar y soportar las esporas subyacentes 612. La camara 632 llena de fluido esta conectada al resto de la capa estanca superior 630 por medio de una zona separable frangible 634, por medio de la cual se puede retirar la camara del resto del cierre estanco superior 630. El cierre estanco superior 630 incluye, ademas, una ventana 636 que se comunica con la capa 618 permeable a los gases/lfquidos del elemento superior 614. El cierre estanco superior 630 incluye, ademas, una soldadura termica 638 y una zona adhesiva pelable 64, para fijar el cierre estanco superior 630 al elemento superior 614. La soldadura termica 638 fija la camara 632 al elemento superior 630.

La figura 9 es una vista esquematica en planta desde arriba de un elemento inferior 7 de otra realizacion de la presente invencion, que es una realizacion basada en fluorescencia de un indicador de esterilizacion. El indicador de esterilizacion mostrado en la figura 9 depende de la fluorescencia generada por esporas en desarrollo como la indicacion de exito o de fallo del proceso de esterilizacion.

En la realizacion mostrada en la figura 9, el elemento inferior 700 incluye un sustrato 702 de apoyo sobre el que se depositaran los materiales o elementos suprayacentes. El sustrato 702 de apoyo puede ser cualquier material adecuado impermeable a los gases/lfquidos, tal como PET (por ejemplo, Mylar®), polipropileno, metal o papel metalizado lacado o cualquier poliolefina adecuada que conocen los expertos en la tecnica que es util con un Indicador de esterilizacion. Depositada sobre el sustrato 702 de apoyo hay una monocapa hidratante 704. La monocapa hidratante 704 puede ser, por ejemplo, pollacrilamida, y puede tener fijaciones anadidas para esporas, o las esporas pueden estar embebidas en la monocapa hidratante 704. El elemento inferior 702 estara cubierto por un cierre estanco transparente a la longitud de onda de la fluorescencia permeable a gases/vapor (no mostrado), que sera adherido o soldado al elemento inferior 702. El cierre estanco transparente permitira el acceso de medio de esterilizacion a las esporas del organismo de ensayo y permitira el paso de las longitudes de onda de excitacion y fluorescencia utilizadas para la lectura del Indicador de esterilizacion.

En la realizacion ilustrada en la figura 9, las esporas se aplican en rejillas 706 de 10 x 10 de "puntos" de esporas. Cada punto puede contener, por ejemplo, desde aproximadamente 150 hasta aproximadamente 300 esporas. En la realizacion de la figura 9, hay una matriz de 8x12 de las rejillas de 10 x 10. Dado que cada punto contiene desde aproximadamente 150 hasta aproximadamente 300 esporas, hay 100 puntos en cada uno de los 96 elementos de la matriz, hay desde aproximadamente 1,44 x 106 hasta aproximadamente 2,88 x 106 esporas presentes en el indicador de esterilizacion mostrado en la figura 9.

La realizacion ilustrada en la figura 9 incluye, ademas, una camara 708 llena de fluido que contiene, por ejemplo, inductor y medios estables termicamente necesarios para activar y soportar las esporas que generaran eventos fluorescentes que seran detectados. El recipiente 708 lleno de fluido esta fijado al resto del elemento inferior 700 por medio de una zona separable frangible 710. Cuando se rompe la zona separable frangible 710, se proporciona el contenido del recipiente 708 a las esporas en las rejillas 706.

El elemento inferior 700 incluye, ademas, una lmea adhesiva perimetral 712 mediante la cual se fija de forma estanca la cubierta permeable a los gases/vapor (no mostrada) al elemento inferior.

La figura 10 es una vista frontal esquematica de un lector electronico 1000 para ser utilizado con una version, basada en la electronica, de un indicador de esterilizacion segun una realizacion de la presente invencion, junto con vistas frontal y trasera de una tarjeta indicadora electronica de esterilizacion ejemplar, tal como el de la figura 6. El lector electronico 1000 incluye un panel frontal 1002 de visualizacion para representar visualmente informacion relevante obtenida de su lectura de la tarjeta indicadora biologica. El lector electronico 1000 incluye, ademas, un panel 1004 de acceso frontal y una ranura 1006 para insertar una tarjeta indicadora biologica. La figura 10 tambien incluye una representacion de una version electronica ejemplar de una tarjeta indicadora biologica 1008, que incluye los componentes biologicos y electronicos tales como los descritos anteriormente con respecto a la figura 6, incluyendo los conectares electricos 1010.

El lector electronico 1000 incluye componentes electronicos adecuados para hacer contacto con los conectores electricos 1010 de la tarjeta indicadora biologica 1008. El panel 1004 de acceso frontal puede incluir rodillos integrados o similares para activar un deposito de fluido y un calentador para una incubacion.

La figura 10 muestra tanto una vista frontal como una vista trasera de la tarjeta indicadora biologica electronica ejemplar 1008. Los componentes de la vista frontal han sido descritos, en general, con respecto a la realizacion de la

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figura 6. El lado trasero de la tarjeta indicadora 1008 puede incluir, por ejemplo, informacion relevante acerca del tipo espedfico de indicador biologico, del medio de esterilizacion, de los parametros del proceso de esterilizacion, del numero de lote, de la fecha y del resultado del ensayo del indicador biologico. La informacion mostrada en la tarjeta indicadora 1008 no esta limitada a estos ejemplos espedficos; como se comprendera tambien se puede incluir otra informacion que puede ser considerada importante. Como se comprendera, la tarjeta indicadora 1008 puede incluir una banda magnetica 1012 para facilitar la lectura y el almacenamiento automatizados de informacion relevante al proceso de esterilizacion, los resultados de ensayos, etc.

Las figuras 11A y 11B son vistas frontales esquematicas de un lector 1100 de fluorescencia para ser utilizado con una version basada en fluorescencia de un indicador de esterilizacion segun una realizacion de la presente invencion, en una posicion cerrada y abierta, respectivamente. La figura 11A muestra el lector 1100 de fluorescencia en la posicion cerrada. El lector 1100 de fluorescencia incluye un panel frontal 1102 de visualizacion para representar visualmente informacion relevante obtenida de su lectura de la tarjeta indicadora biologica. El lector 1100 de fluorescencia Incluye, ademas, un panel 1104 de acceso frontal, que puede abrirse, como se muestra en la figura 11B.

Como se muestra en la figura 11B, el panel 1104 de acceso frontal se abre hacia fuera e incluye una ranura 1106 en la que se puede insertar una tarjeta indicadora biologica basada en la fluorescencia, tal como la descrita anteriormente con respecto a la figura 9. Cuando se ha insertado una tarjeta indicadora en la ranura 1106, se cierra el panel 1104 de acceso frontal, colocando la tarjeta indicadora en una camara lectora 1108, que contiene componentes para obtener informacion de la tarjeta indicadora en la ranura. Se describen componentes adecuados ejemplares de la camara lectora 1108 con respecto a la figura 12. El panel 1104 de acceso frontal puede incluir rodillos integrados o similares para activar un deposito de fluido y un calentador para una incubacion.

La figura 12 es una vista esquematica en perspectiva de componentes internos de un lector 1200 de fluorescencia, tal como el de la figura 11, junto con vistas frontal y trasera de una tarjeta indicadora ejemplar de esterilizacion basada en fluorescencia.

El lector 1200 de fluorescencia incluye componentes adecuados para leer un indicador de esterilizacion basado en fluorescencia. En la figura 12 se ilustran algunos componentes ejemplares. El lector 1200 puede incluir un dispositivo adecuado de lectura, tal como una camara de CCD (dispositivo de transferencia de carga) enfriado y un procesador 1202 de imagenes, que incluye soporte rtsico y soporte logico adecuados para procesar datos obtenidos de la camara CCD. El lector 1200 puede incluir optica adecuada 1204, tal como un lEd de excitacion y un detector de fluorescencia. El lector 1200 puede incluir componentes mecanicos adecuados 1206, tales como una placa de camara, un control de LED y una interfaz USB. El lector 1200 puede incluir, ademas, un aparato adecuado 1210 para sujetar la tarjeta indicadora biologica, para alinear la tarjeta y sujetarla en la posicion alineada para una excitacion y lectura. El lector 1200 puede incluir, ademas, un puerto adecuado 1214 de escaneo de imagenes.

La figura 12 muestra tanto una vista frontal como una vista trasera de la tarjeta indicadora biologica electronica ejemplar 1208. Los componentes de la vista frontal han sido descritos, en general, con respecto a la realizacion de la figura 9. La cara trasera de la tarjeta indicadora 1208 incluye diversa informacion relevante al tipo espedfico de Indicador biologico, al esterilizante, al proceso de esterilizacion, al numero de lote, a la fecha, a las condiciones de esterilizacion y al resultado del ensayo de indicador biologico. La informacion mostrada en la tarjeta indicadora 1208 no esta limitada a estos ejemplos espedficos; como se comprendera, tambien se puede incluir otra informacion que puede ser considerada importante. Como se comprendera, la tarjeta indicadora 1208 puede incluir una banda magnetica 1212 para facilitar la lectura y el almacenamiento automatizados de informacion relevante al proceso de esterilizacion, los resultados de ensayos, etc.

La figura 13 es una vista frontal esquematica de un lector 1300 de viales para ser utilizado con un indicador biologico autocontenido FABI (SCBI), tal como el descrito y mostrado con respecto a la figura 3. El lector 1300 de viales incluye un panel frontal 1302 de visualizacion y un panel 1304 de acceso frontal, similar a los de las realizaciones descritas anteriormente basadas en la electronica y basadas en la fluorescencia. El panel 1304 de acceso frontal incluye una pluralidad de pocillos 1306, en los que se pueden Insertar SCBI. El panel 1304 de acceso frontal pivota hacia fuera, para permitir la insercion o la extraccion de SCBI y puede ser cerrado en una camara lectora 1308. El lector 1300 de viales puede ser utilizado con un SCBI basado en fluorescencia o con un SCBI basado en electronica, aplicando los mismos principios basicos dados a conocer en el presente documento para leer los resultados del proceso de esterilizacion e indicados por medio del indicador biologico de la presente invencion. La figura 13 incluye un SCBI FABI 1310.

Con el procedimiento inventivo, se puede utilizar un cambio en el potencial de membrana de un organismo viable para evaluar la eficacia del proceso de esterilizacion. Se puede utilizar esta tecnica con un Indicador adecuado de esterilizacion o SCBI, como se conoce en la tecnica. Tambien puede ser utilizado con una suspension de organismos (por ejemplo, esporas) en una ampolla. Tambien puede ser utilizado con un indicador de esterilizacion que comprende un material conductor electricamente colocado sobre un sustrato (por ejemplo, circuitena de cobre formada o depositada sobre un sustrato no conductor tal como silicio) con un Indicador biologico (es decir, esporas bacterianas) colocado en parte del material conductor, o en todo el. El procedimiento inventivo es lo suficientemente flexible como para ser utilizado en todas las tecnologfas de esterilizacion. El procedimiento inventivo puede ser

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utilizado para permitir indicadores biologicos de lectura instantanea o lectura casi instantanea. El indicador biologico puede ser denominado indicador biologico de accion rapida.

Ejemplos de materiales de construccion global: soportes, separadores y/o aislantes: vidrio, silicio, papeles metalicos, papel y otras formas celulosicas, poliolefina, incluyendo polipropileno, policarbonatos o mezclas, acetato de celulosa, Mylar y similares. Membranas semipermeables o permeables: glasina, membranas de dialisis de origen natural o sintetico, poliolefina porosa y otros materiales plasticos. Conductores: metales, papeles metalizados, tintas conductoras, nanotubos, fulerenos y similares. Conductores/aislantes conmutables u otros materiales semiconductores como polianilina y similares. Qmmicas de union (por ejemplo, SPDP y similares). Organismos: incluyendo G. Stearothermophilus, B. atrophaeus y similares. Fluoroforos y/o fluorogenes, por ejemplo, MUG y yoduro de propidio, fluorescema, rodamina, etc., incluyendo todos los que responden a excitaciones ffsicas como la fotoexcitacion, la induccion qmmica y la activacion electroffsica.

En una realizacion, el potencial de membrana plasmatica es el unico medio de deteccion. En otra realizacion, la deteccion es tanto mediante potencial de membrana como mediante fluorescencia inducida electricamente (por ejemplo, utilizando di-4-ANEPPS o similares). El colorante de ANEP (AminoNaftilEtenilPiridinio), di-4-ANEPPS es una sonda sensible para la deteccion de cambios de potencial de membrana en menos de un milisegundo. En este caso un lector sena un hubrido de un lector basado en electronica tal como el de la figura 10, y de un lector basado en fluorescencia tal como el de la figura 12. En una realizacion, la fluorescencia de un compuesto fluorogenico despues de una activacion enzimatica y de induccion puede ser el unico medio de deteccion. En otra realizacion, tambien se puede utilizar un segundo fluoroforo acotado a la superficie (por ejemplo, rojo de Texas WGA), que proporcionana una fluorescencia continua tanto como un control de referencia como como un medio para garantizar que todas las esporas siguen estando asociadas con la tarjeta indicadora biologica. Cada fluoroforo puede tener longitudes de onda separadas de emision y de excitacion.

Ejemplos

Los ejemplos proporcionados en el presente documento solo tienen fines ilustrativos. Se concibe que proporcionen suficiente detalle compuesto para permitir que un experto en la tecnica realice y utilice la presente invencion y para proporcionar ejemplos ilustrativos de dispositivos y procedimientos adecuados. La realizacion preferente puede comprender parte de los materiales, componentes, procedimientos o aplicaciones, o todos ellos, descritos en el presente documento; pero no estan limitados solo a los presentados. Se pueden llevar a cabo sustituciones sencillas que pueden alterar la lista de componentes o la utilidad de la aplicacion, pero tambien se contemplan estos. El dispositivo de produccion final puede adoptar la forma de una u otra de las realizaciones presentadas, con una o mas de las opciones descritas, pero las configuraciones ejemplificadas no constituyen un abandono de cualquier otra variacion o modo de accion que un experto en la tecnica pudiera extender a la invencion divulgada.

Ejemplo 1

La evaluacion de cambios en el potencial de membrana en esporas vivas/muertas de Bacillus atrophaeus ilustra la correlacion entre cambios de potencial de membrana y la viabilidad. Se mide el potencial de membrana utilizando DiOC6(3) y un fluonmetro Picofluor. Se incuban las esporas tanto viables como no viables (en autoclave) en caldo tnptico de soja y DiOC6(3) a 37°C durante tiempos representativos. En los tiempos indicados de incubacion, se eliminan los organismos y son lavados en Tris/EDTA (pH 7,4). Entonces, se toman mediciones de fluorescencia. Los resultados son mostrados en la FIG. 1.

Ejemplo 2

Deteccion electrica de esporas viables de Geobacillus stearathermaphilus sobre una superficie plana

Se vierte uniformemente un material metalizado conductor sobre una lamina no conductora de Mylar aproximadamente el tamano de una tarjeta de credito. La lamina de mylar es impermeable tanto a los gases como a los lfquidos. Se vierte una mezcla de poliacrilamida/polianilina encima de la capa metalizada. La mezcla de poliacrilamida/polianilina es permeable tanto al gas como al vapor. Se vuelven a suspender esporas de Geobacillus stearothermophilus en una mezcla de poliacrilamida/polianilina con una concentracion de 108 cfu/ml. Esta concentracion de esporas proporciona una unica espora en cada gota de 10 pl (picolitro) procedente de una impresora de chorro de tinta. Se deposita la mezcla de esporas de poliacrilamida/polianilina sobre la pelfcula vertida de poliacrilamida/polianilina en un formato matricial. Se vierte un segundo material metalizado conductor sobre la matriz de esporas. Esto forma la tarjeta indicadora biologica (Bl). Segun germinan las esporas, la conductividad del material comenzara a incrementarse. El flujo de corriente es detectado por medio de preamplificadores de transistores en serie, tales como pares Darlington. Debido a que estos transistores Darlington estan pareados, permiten la amplificacion de la corriente. Los transistores Darlington estan conectados a conductores que monitorizan la corriente del sistema. Se adhiere una barrera a los gases, tal como Mylar, a la parte superior del indicador por medio de un adhesivo pelable hasta justo antes de su uso. En el momento de su uso se retira esta barrera, de forma que vapor o gas pueda penetrar en el sistema cuando se coloca en un esterilizador. En el extremo alejado del indicador hay una pequena camara frangible que contiene un medio de incubacion que permitira que germinen las esporas viables. Despues de un proceso de esterilizacion que utiliza vapor o peroxido de hidrogeno

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vaporoso se Incuba el Indicador biologico.

Se inserta la tarjeta Bl en el lector de tarjetas/ranura de la incubadora que esta integrado en un esterilizador. El lector/incubadora consiste en bloques de calentamiento para mantener la temperatura de incubacion, las conexiones electricas en las que se conecta la tarjeta Bl, un cabezal de impresion para marcar parametros del ciclo e ID de carga en una forma legible por un usuario, rodillos para guiar a la tarjeta Bl al interior de la ranura y para activar automaticamente la Bl rompiendo la camara frangible que contiene el medio de incubacion y que contribuye a la dispersion del medio, un escaner de bandas magneticas y un lector de codigos de barras para hacer un seguimiento de los resultados de la tarjeta Bl back al ciclo de carga y de esterilizacion del dispositivo.

Se incuba el indicador a 55-60°C (temperatura optima para Geobacillus stearothermophilus) y se monitoriza la conductancia del indicador. Se detectan pequenos cambios en la corriente que son el resultado de esporas germinantes viables en cuestion de minutos, alertando al usuario de que el proceso de esterilizacion puede no haber tenido exito. Si el proceso de esterilizacion tuvo exito, no habna un aumento en la corriente medida con el tiempo de incubacion.

Ejemplo 3

Deteccion de fluorescencia de esporas viables de Geobacillus stearothermophilus sobre una superficie plana

Se vierte una capa de pollacrilamida sobre un soporte de polipropileno con un tamano aproximadamente el tamano de una tarjeta de credito. La capa de pollacrilamida actua como una monocapa hidratante. Entonces, se imprimen esporas de Geobacillus stearothermophilus en puntos de organismos. Los puntos son impresos en un formato matricial o de rejilla, conteniendo cada punto entre 150 - 300 esporas. En un extremo hay una camara frangible que contiene el medio de Incubacion con el o los fluoroforos requeridos. A la terminacion del proceso de esterilizacion se Inserta la tarjeta Bl en el lector de tarjetas/ranura de la Incubadora que esta integrado en un esterilizador. El lector/incubadora consiste en bloques calentadores para mantener la temperatura de incubacion, fuentes de excitacion LED, fotodiodos para la deteccion de fluorescencia, cabezal de impresion para marcar los parametros de los ciclos e ID de carga en una forma legible por un usuario, rodillos para guiar la tarjeta Bl en la ranura y para activar automaticamente el Bl al romper la camara frangible que contiene el medio de incubacion y ayudar en la dispersion del medio, un escaner de bandas magneticas y un lector de codigos de barras para hacer un seguimiento de los resultados de la tarjeta Bl, devolviendolo al ciclo de carga y de esterilizacion del dispositivo.

Se incuba el indicador a 55-60°C (temperatura optima para Geobacillus stearothermophilus). Se puede emplear un dispositivo de formacion de imagenes de serie, tal como LumiSens, en este lector. Esto permitira la deteccion de dos o mas longitudes de onda de interes. Una longitud de onda medira las esporas tincionadas para garantizar que todos los controles se encuentran en su lugar y la segunda longitud de onda medira el fluoroforo utilizado para detectar organismos viables. Si el proceso de esterilizacion tuvo exito, todas las esporas seran no viables y el detector solo detectara el fluoroforo utilizado para tincionar los organismos. Si el proceso de esterilizacion no tuvo exito, se detectaran las esporas viables mediante dos senales diferenciadas de fluorescencia.

Ejemplo 4

Lector/incubadora autonomo

El lector/incubadora puede ser una unidad autonoma para cualquiera de los lectores/incubadoras descritos en los Ejemplos 2 y 3. En una unidad autonoma, toda la electronica es la misma, dado que los lectores/incubadoras estan integrados en los propios esterilizadores.

Aunque se ha explicado la invencion en relacion con realizaciones espedficas, se debe comprender que seran evidentes diversas modificaciones de las mismas para los expertos en la tecnica tras la lectura de la memoria. Por lo tanto, se debe comprender que se concibe que la invencion dada a conocer en el presente documento abarque tales modificaciones que puedan encontrarse dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

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   REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento de fabricacion de un indicador de esterilizacion, que comprende:

   depositar un material electricamente conductor sobre un sustrato utilizando una impresora de chorro de tinta; depositar un indicador biologico en una matriz en una parte o todo el material electricamente conductor utilizando la impresora de chorro de tinta; y

   proporcionar un circuito electrico en comunicacion electrica con el material electricamente conductor, estando el circuito electrico adaptado para detectar cambios en una propiedad electrica del material electricamente conductor.
2. 2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el sustrato es no conductor.
3. 3. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el circuito electrico comprende circuitos de deteccion para detectar cambios en la propiedad electrica.
4. 4. El procedimiento de cualquier reivindicacion anterior, en el que el procedimiento comprende ademas la aplicacion de una membrana impermeable a gas lfquido extrafble sobre por lo menos el indicador biologico.
5. 5. El procedimiento de cualquier reivindicacion anterior, en el que el indicador biologico comprende celulas que tienen una membrana celular capaz de exhibir un potencial de membrana y de estar en contacto electrico con el material electricamente conductor.
6. 6. El procedimiento de cualquier reivindicacion anterior, en el que el indicador biologico comprende esporas.
7. 7. El procedimiento de cualquier reivindicacion anterior, en el que el indicador biologico comprende Geobacillus stearothermophilus, Bacillus atrophaeus, Bacillus subtilis, Bacillus sphaericus, Bacillus anthracis, Bacillus pumilus, Bacillus coagulans, Clostridium sporogenes, Clostridium difficile, Clostridium botulinum, Bacillus subfilis globigii, Bacillus cereus, Bacillus circulans,Escherichia coli, o una mezcla de dos o mas de los mismos; o

   Aspergillus niger, Candida albicans, Trichophyton mentagrophytes, Wangiella dermatitis, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium terrae, Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis, Giardia lamblia, Cryptosporidium patvum, Aeromonas hydrophila, Enterococcus faecalis, Streptococcus faecalis, Enterococcus faecium, Streptococcus pyrogenes, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, Methylobacterium, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella choleraesuis, Helicobacter pylori, Micrococcus radiodurans, Deinococcus radiodurans, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Stenotrophomonas maltophilia, o una mezcla de dos o mas de los mismos; o enterococos resistani vancomicina, Staphylococcus aureus resistente a la meticilina, Mycobacterium cheloni, o una mezcla de dos o mas de los mismos.
8. 8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1a 6, en el que el indicador biologico comprende un indicador biologico de ingeniena genetica que comprende:

   al menos un organismo de ensayo y al menos un gen informador adecuado para la produccion de una enzima, pudiendose ser recogido el gen informador por el organismo de ensayo, en el que preferiblemente el gen informador es absorbido por el organismo de ensayo usando al menos un plasmido y/o al menos un virus;

   y en el que el indicador biologico de ingeniena genetica comprende ademas al menos un gen represor que inhibe la expresion del gen indicador hasta que el gen informador se expone a al menos un inductor, en el que preferiblemente el gen informador y el gen represor son absorbidos por el organismo de ensayo usando al menos un plasmido y/o al menos un virus.
9. 9. El procedimiento de la reivindicacion 8, en el que el organismo de ensayo comprende Geobacillus stearothermophilus, Bacillus atrophaeus, Bacillus subtilis, Bacillus sphaericus, Bacillus anthracis, Bacillus pumilus, Bacillus coagulans, Clostridium sporogenes, Clostridium difficile, Clostridium botulinum, Bacillus subfilis globigii, Bacillus cereus, Bacillus circulans,Escherichia coli, o una mezcla de dos o mas de los mismos; o

   Aspergillus niger, Candida albicans, Trichophyton mentagrophytes, Wangiella dermatitis, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium terrae, Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis, Giardia lamblia, Cryptosporidium patvum, Aeromonas hydrophila, Enterococcus faecalis, Streptococcus faecalis, Enterococcus faecium, Streptococcus pyrogenes, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, Methylobacterium, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella choleraesuis, Helicobacter pylori, Micrococcus radiodurans, Deinococcus radiodurans, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Stenotrophomonas maltophilia, o una mezcla de dos o mas de los mismos; o enterococos resistani vancomicina, Staphylococcus aureus resistente a la meticilina, Mycobacterium cheloni, o una mezcla de dos o mas de los mismos.
10. 10. El procedimiento de cualquier reivindicacion anterior, en el que el procedimiento comprende, ademas:

    exponer el indicador biologico en el material conductor de la electricidad a un medio esterilizacion;

    incubar el indicador biologico en el material electricamente conductor; y determinar si hay algun cambio en la propiedad electrica del material electricamente conductor durante la incubacion.
11. 11. El procedimiento de la reivindicacion 10, en el que el medio de esterilizacion comprende:

    5 al menos un agente esterilizante lfquido, preferiblemente al menos un acido peracetico, al menos un

    peroxido, o una mezcla de dos o mas de los mismos, o al menos un agente esterilizante gaseoso, preferiblemente peroxido de hidrogeno o peroxido de hidrogeno y amornaco; o vapor.