CN111304276A - 一种快速检测金针菇黑腐病的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于金针菇生产的技术领域，具体的涉及一种快速检测金针菇黑腐病的方法。首先采集搔菌后的培养分离水，然后将该培养分离水于检测培养基中，在26～28℃环境中培养72小时，观察生长菌落出现最初呈绿色后期呈墨绿色，菌落呈不规则圆形的菌落特征，则认定为含有黑腐病原菌；其中检测培养基包括以下原料：PAF培养基、甘油、酒石酸钠、溴麝香草酚蓝和结晶紫。该方法成本低廉、操作简单、试验周期短、检测迅速，是一种便捷、经济、高效、可靠的金针菇黑腐病检测方法。

Description

一种快速检测金针菇黑腐病的方法
技术领域
本发明属于金针菇生产的技术领域，具体的涉及一种快速检测金针菇黑腐病的方法。
背景技术
金针菇学名毛柄金钱菌，又称毛柄小火菇、构菌、冬菇、朴菰、冻菌、金菇、智力菇等，其菌柄细长，似金针菜，故称金针菇。金针菇质地脆嫩，营养丰富，氨基酸含量高于一般菇类，尤其氨基酸含量特别高，能促进记忆、开发智力，特别有利于儿童的健康成长和智力发育，因此又有“增智菇”、“智力菇”之称。黑腐病在金针菇培养中是一个非常大的祸患，造成金针菇黑腐病的病原菌是托拉斯假单胞杆菌，该病通常有很高的传染性，稍不注意会引起大面积发病的情况；而且只要发生病害，只能通过清除染病栽培瓶的方式来处理，给企业造成巨大的损失。
传统的金针菇工厂化生产中，只有在金针菇出菇过程中病原菌肉眼可见时才清楚是否染病，但此时已经造成了实质性的损失。因此亟待解决金针菇工厂化生产中发现黑腐病滞后性问题，避免给企业造成重大损失。
发明内容
本发明的目的在于针对目前金针菇工厂化生产中发现黑腐病的滞后性，造成企业重大损失、浪费资源人力的技术问题而提供一种快速检测金针菇黑腐病的方法，该方法成本低廉、操作简单、试验周期短、检测迅速，是一种便捷、经济、高效、可靠的金针菇黑腐病检测方法。
发明的技术方案为：一种快速检测金针菇黑腐病的方法，首先自搔菌后3～4天的栽培瓶中采集培养分离水，然后将该培养分离水于检测培养基中，在26～28℃环境中培养72小时，观察菌落生长情况，当菌落出现最初呈绿色后期呈墨绿色，菌落呈不规则圆形的菌落特征，则认定为含有黑腐病原菌；其中检测培养基包括以下原料：PAF培养基(全名为假单孢菌琼脂培养基F)、甘油、酒石酸钠、溴麝香草酚蓝和结晶紫。
所述快速检测金针菇黑腐病的方法，包括以下步骤：
(1)采集检测样本：从搔菌后3～4天的栽培瓶中采集培养分离水作为检测样本，备用；
(2)制备检测培养基：检测培养基包括以下原料：PAF培养基、甘油、酒石酸钠、溴麝香草酚蓝和结晶紫；首先将甘油调和成甘油水溶液；将溴麝香草酚蓝调和成溴麝香草酚蓝溶液；将结晶紫调和成结晶紫溶液；然后将PAF培养基加入至甘油水溶液中；再依次加入酒石酸钠、溴麝香草酚蓝溶液以及结晶紫溶液；最后用甘油水溶液定容；
(3)处理检测培养基：将步骤(2)所得的检测培养基在101kpa、121℃环境下高压灭菌35～40分钟；然后待冷却至80℃取出，放置于超净工作台上紫外灯杀菌不低于15分钟，冷却至40℃倒入平板，其中每个平板倒入15～20ml冷却备用；
(4)培养：将步骤(1)所采集的检测样本接入步骤(3)制备好的平板上在25～28℃环境中进行培养72小时；
(5)观察菌落：菌落出现最初呈绿色后期呈墨绿色，菌落呈不规则圆形的菌落特征，则认定为含有黑腐病原菌。
所述步骤(2)制备检测培养基具体操作如下：首先将所述甘油调和成质量体积浓度为10g/L的甘油水溶液；取1g溴麝香草酚蓝溶解于1mL体积分数为70％的乙醇中，再加入500ml蒸馏水调和成浓度为0.2％的溴麝香草酚蓝溶液；取1g结晶紫溶解于1mL体积分数为70％的乙醇中，再加入1000mL蒸馏水调和成浓度为0.1％的结晶紫溶液；然后将40g的PAF培养基加入至900mL甘油水溶液中；再依次加入2g的酒石酸钠、15mL的溴麝香草酚蓝溶液以及5mL的结晶紫溶液；最后用甘油水溶液定容至1000mL。
所述(1)采集检测样本过程中搔菌时补充水分为无菌水。
所述步骤(1)采集检测样本中从搔菌后3天的栽培瓶中采集培养分离水作为检测样本，备用。
所述步骤(3)处理检测培养基中高压灭菌时间为40分钟，紫外灯杀菌时间为30分钟，检测培养基平板倒入量为20ml。
所述步骤(4)培养中在28℃环境中进行培养。
本发明的有益效果为：本发明所述检测金针菇黑腐病的方法仅需将搔菌后培养分离水接入检测培养基中培养72小时便能够精准的检测到金针菇生产中是否含有病原菌，解决了金针菇发病显著造成实际损失才发现黑腐病的滞后性问题。其中该方法中所采用的检测培养基由PAF培养基加入甘油水溶液、酒石酸钠、溴麝香草酚蓝和结晶紫所配得，PAF培养基对于假单孢有分离和增殖作用，加入酒石酸钠、溴麝香草酚蓝、结晶紫会将黑腐病原菌染成绿色，生长后期会呈墨绿色，检测结果简单直观。
该方法具有较强的推广价值，成本低廉，检测迅速，早发现早防治，为企业排除安全隐患，挽回重大损失。推动食用菌产业的发展。
传统检测方法是在发病后，肉眼能看到发病黑色菌落，金针菇已经染病并能够肉眼识别时候采集样本进行检测，周期长，而且发现时病害已经爆发了，有传播病害，感染其他未染病菇的危险；对环境也有污染。PCR法价格高昂，一般企业用不了。
而本发明所述检测方法成本低，操作方便，在感染病菌未发病前，便能够检测到含有病菌，及时清理，避免发病对其他产生影响，将损失降到最低。
附图说明
图1为实施例1与实施例3的观察结果。
图2为实施例2的观察结果。
图3为对比例1的观察结果。
图4为对比例2的观察结果。
图5为未染病、染病初期、染病后期金针菇的对比图。
图6为实施例2培养基培养所得的菌落回接入正常生长的金针菇后的生长图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
所述快速检测金针菇黑腐病的方法，包括以下步骤：
(1)采集检测样本：随机从搔菌后3天的栽培瓶中采集其中一瓶的培养分离水作为检测样本1号，备用；其中搔菌时补充水分为无菌水，避免水体污染造成的病害；
(2)制备检测培养基：检测培养基包括以下原料：PAF培养基(全名为假单孢菌琼脂培养基F)、甘油、酒石酸钠、溴麝香草酚蓝和结晶紫；pH值为7.2；首先将所述甘油调和成质量体积浓度为10g/L的甘油水溶液；将所述溴麝香草酚蓝先用1ml体积分数为70％的乙醇溶解后再调和成浓度为0.2％的溴麝香草酚蓝溶液；将所述结晶紫先用1ml体积分数为70％的乙醇溶解后再调和成浓度为0.1％的结晶紫溶液；然后将40g的PAF培养基加入至900ml甘油水溶液中；再依次加入2g的酒石酸钠、15ml的溴麝香草酚蓝溶液以及5ml的结晶紫溶液；最后用甘油水溶液定容至1000mL；
(3)处理检测培养基：将步骤(2)所得的检测培养基在101kpa、121℃环境下高压灭菌40分钟；然后待冷却至80℃取出，放置于超净工作台上紫外灯杀菌30分钟，冷却至40℃倒入平板，其中每个平板倒入20ml冷却备用；
(4)培养：将步骤(1)所采集的检测样本接入步骤(3)制备好的平板中在28℃环境中进行培养72小时；
(5)观察菌落：菌落出现最初呈绿色后期呈墨绿色，菌落呈不规则圆形的菌落特征，则认定为含有黑腐病原菌。
再从之前未杀菌的搔菌补充用水中分离的细菌进行分子鉴定，经比对分析其中一个细菌样品与类黄假单胞菌(Pseudomonas synxantha)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、Pseudomonas libanensis三种细菌具有99％相似性；第二个细菌样品与类黄假单胞菌(Pseudomonas synxantha)具有100％相似性。鉴定结果见表1、表2，认定发生金针菇黑腐病的病原菌为假单孢菌属，进一步分析鉴定表明为托拉斯假单孢杆菌。
表1
Figure BDA0002384231030000051
表2
Figure BDA0002384231030000052
实施例2
所述快速检测金针菇黑腐病的方法，包括以下步骤：
(1)采集检测样本：随机从搔菌后3天的栽培瓶中采集其中一瓶的培养分离水(与实施例1不同瓶)作为检测样本2号，备用；其中搔菌时补充水分为无菌水，避免水体污染造成的病害；
(2)制备检测培养基：检测培养基包括以下原料：PAF培养基、甘油、酒石酸钠、溴麝香草酚蓝和结晶紫；pH值为7.2；首先将所述甘油调和成质量体积浓度为10g/L的甘油水溶液；将所述溴麝香草酚蓝先用1ml体积分数为70％的乙醇溶解后再调和成浓度为0.2％的溴麝香草酚蓝溶液；将所述结晶紫先用1ml体积分数为70％的乙醇溶解后再调和成浓度为0.1％的结晶紫溶液；然后将40g的PAF培养基加入至900ml甘油水溶液中；再依次加入2g的酒石酸钠、15ml的溴麝香草酚蓝溶液以及5ml的结晶紫溶液；最后用甘油水溶液定容至1000mL；
(3)处理检测培养基：将步骤(2)所得的检测培养基在101kpa、121℃环境下高压灭菌40分钟；然后待冷却至80℃取出，放置于超净工作台上紫外灯杀菌30分钟，冷却至40℃倒入平板，其中每个平板倒入20ml冷却备用；
(4)培养：将步骤(1)所采集的检测样本接入步骤(3)制备好的平板中在28℃环境中进行培养72小时；
(5)观察菌落：菌落出现最初呈绿色后期呈墨绿色，菌落呈不规则圆形的菌落特征，则认定为含有黑腐病原菌。
实施例3
所述快速检测金针菇黑腐病的方法，包括以下步骤：
(1)采集检测样本：随机从搔菌后3天的栽培瓶中采取其中一瓶的培养分离水(与实施例1、实施例2不同瓶)作为检测样本3号，备用；其中搔菌时补充水分为无菌水，避免水体污染造成的病害；
(2)制备检测培养基：检测培养基包括以下原料：PAF培养基、甘油、酒石酸钠、溴麝香草酚蓝和结晶紫；pH值为7.2；首先将所述甘油调和成质量体积浓度为10g/L的甘油水溶液；将所述溴麝香草酚蓝先用1ml体积分数为70％的乙醇溶解后再调和成浓度为0.2％的溴麝香草酚蓝溶液；将所述结晶紫先用1ml体积分数为70％的乙醇溶解后再调和成浓度为0.1％的结晶紫溶液；然后将40g的PAF培养基加入至900ml甘油水溶液中；再依次加入2g的酒石酸钠、15ml的溴麝香草酚蓝溶液以及5ml的结晶紫溶液；最后用甘油水溶液定容至1000mL；
(3)处理检测培养基：将步骤(2)所得的检测培养基在101kpa、121℃环境下高压灭菌40分钟；然后待冷却至80℃取出，放置于超净工作台上紫外灯杀菌30分钟，冷却至40℃倒入平板，其中每个平板倒入20ml冷却备用；
(4)培养：将步骤(1)所采集的检测样本接入步骤(3)制备好的平板中在28℃环境中进行培养72小时；
(5)观察菌落：菌落出现最初呈绿色后期呈墨绿色，菌落呈不规则圆形的菌落特征，则认定为含有黑腐病原菌。
对比例1
采集与实施例1检测样本1号相同的搔菌后培养分离水作为对照检测样本1号，采用普通PDA培养基作为检测培养基，将该检测培养基在101kpa、121℃环境下高压灭菌40分钟；然后待冷却至80℃取出，放置于超净工作台上紫外灯杀菌30分钟，冷却至40℃倒入平板，其中每个平板倒入20ml冷却备用；然后将对照检测样本接入制备好的平板中在28℃环境中进行培养72小时；观察菌落。
对比例2
采集与实施例1检测样本1号相同的搔菌后培养分离水作为对照检测样本2号，采用的检测培养基配比如下：PAF培养基40g，甘油10g，质量体积百分比为0.2％的溴麝香草酚蓝溶液15mL，质量体积百分比为0.1％的结晶紫溶液5mL，其余制备方法同实施例1，在此不做赘述。将该检测培养基在101kpa、121℃环境下高压灭菌40分钟；然后待冷却至80℃取出，放置于超净工作台上紫外灯杀菌30分钟，冷却至40℃倒入平板，其中每个平板倒入20ml冷却备用；然后将对照检测样本接入制备好的平板中在28℃环境中进行培养72小时；观察菌落。
下面对实施例1-3和对比例1-2的结果进行对比分析如下：
实施例1与实施例3结果见图1，可见菌落出现最初呈绿色后期呈墨绿色，菌落呈不规则圆形，将该培养基培养所得的细菌培养回接入正常的金针菇后发现发病特征与黑腐病一致，如图5中的右一瓶。证明所得为黑腐病原菌。重复实验证明结果的非偶然性；重复实验结果表明，实验所得结果一致。
实施例2结果见图2，可见菌落并未出现绿色，将该实施例培养基培养所得的菌落回接入正常生长的金针菇后发现虽然会轻微发病，但与黑腐病特征不同。
对比例1结果见图3，可见菌落均呈乳白色，无法分辨是否是病原菌，将该对比例培养基培养所得的细菌培养回接入正常的金针菇后发现发病特征与黑腐病一致，如图5中的右一瓶。
对比例2结果见图4，可见菌落未出现染色，无法分辨是否是病原菌，将该对比例培养基培养所得的细菌培养回接入正常的金针菇后发现发病特征与黑腐病一致，如图5中的右一瓶。可见本发明快速检测方法所采用的检测培养基为了达到对病原菌精准显色的目的，其原料之间是相互协同配合，缺一不可。
通过观察结果的对比分析可知：本发明所述快速检测金针菇黑腐病的方法检测结果简单直观，实施例1和实施例3菌落特征相同，回接实验所得结果也一致，证明所述检测方法的可行性。实施2、对比例1、对比例2与实施例1以及实施例3对比可知，本发明所述方法对于检测黑腐病的精准性和非偶然性，该检测方法可以对黑腐病的致病菌准确显色，其他菌不会对结果造成干扰，但前提是所采用的检测培养基原料缺一不可。

Claims (7)

1.一种快速检测金针菇黑腐病的方法，其特征在于，首先自搔菌后3～4天的栽培瓶中采集培养分离水，然后将该培养分离水于检测培养基中，在26～28℃环境中培养72小时，观察菌落生长情况，当菌落出现最初呈绿色后期呈墨绿色，菌落呈不规则圆形的菌落特征，则认定为含有黑腐病原菌；其中检测培养基包括以下原料：PAF培养基、甘油、酒石酸钠、溴麝香草酚蓝和结晶紫。
2.根据权利要求1所述快速检测金针菇黑腐病的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采集检测样本：从搔菌后3～4天的栽培瓶中采集培养分离水作为检测样本，备用；
(2)制备检测培养基：检测培养基包括以下原料：PAF培养基、甘油、酒石酸钠、溴麝香草酚蓝和结晶紫；首先将甘油调和成甘油水溶液；将溴麝香草酚蓝调和成溴麝香草酚蓝溶液；将结晶紫调和成结晶紫溶液；然后将PAF培养基加入至甘油水溶液中；再依次加入酒石酸钠、溴麝香草酚蓝溶液以及结晶紫溶液；最后用甘油水溶液定容；
(3)处理检测培养基：将步骤(2)所得的检测培养基在101kpa、121℃环境下高压灭菌35～40分钟；然后待冷却至80℃取出，放置于超净工作台上紫外灯杀菌不低于15分钟，冷却至40℃倒入平板，其中每个平板倒入15～20ml冷却备用；
(4)培养：将步骤(1)所采集的检测样本接入步骤(3)制备好的平板上在25～28℃环境中进行培养72小时；
(5)观察菌落：菌落出现最初呈绿色后期呈墨绿色，菌落呈不规则圆形的菌落特征，则认定为含有黑腐病原菌。
3.根据权利要求2所述快速检测金针菇黑腐病的方法，其特征在于，所述步骤(2)制备检测培养基具体操作如下：首先将所述甘油调和成质量体积浓度为10g/L的甘油水溶液；取1g溴麝香草酚蓝溶解于1mL体积分数为70％的乙醇中，再加入500ml蒸馏水调和成浓度为0.2％的溴麝香草酚蓝溶液；取1g结晶紫溶解于1mL体积分数为70％的乙醇中，再加入1000mL蒸馏水调和成浓度为0.1％的结晶紫溶液；然后将40g的PAF培养基加入至900mL甘油水溶液中；再依次加入2g的酒石酸钠、15mL的溴麝香草酚蓝溶液以及5mL的结晶紫溶液；最后用甘油水溶液定容至1000mL。
4.根据权利要求2所述快速检测金针菇黑腐病的方法，其特征在于，所述步骤(1)采集检测样本过程中搔菌时补充水分为无菌水。
5.根据权利要求2所述快速检测金针菇黑腐病的方法，其特征在于，所述步骤(1)采集检测样本中从搔菌后3天的栽培瓶中采集培养分离水作为检测样本，备用。
6.根据权利要求2所述快速检测金针菇黑腐病的方法，其特征在于，所述步骤(3)处理检测培养基中高压灭菌时间为40分钟，紫外灯杀菌时间为30分钟，检测培养基平板倒入量为20ml。
7.根据权利要求2所述快速检测金针菇黑腐病的方法，其特征在于，所述步骤(4)培养中在28℃环境中进行培养。
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