CN101743318A - 用于鉴定/检测微生物的反应介质 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于鉴定/检测微生物的反应介质，其包含至少一种包囊化在环式糊精中的活性分子。

Description

用于鉴定/检测微生物的反应介质
本发明的领域是通过接种到反应介质来检测和鉴定微生物，诸如具体是细菌或酵母。
目前存在非常多的用于检测微生物的反应介质。这种检测具体基于利用特定的底物，其对于希望检测的微生物的酶特异。因此，对于细菌，通常大肠杆菌菌株通过显示糖苷酶(osidase)类型的酶活性来证实，所述的糖苷酶活性诸如beta-葡糖醛酸糖苷酶或beta-半乳糖苷酶活性。类似地，利斯特菌可通过显示beta-葡糖苷酶来检测。氨基肽酶活性也可用于显示细菌的组、属或种。因此，丙氨酸-氨基肽酶活性，例如使得能够区分革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。最后，还要提到检测酯酶活性以显示沙门氏菌。除了利用特定的底物，通过反应介质鉴定微生物或微生物的组还可基于微生物对于治疗性处理的抗性。所述介质通常包含一或多种“活性”分子，诸如具体是微生物易于产生抗性的抗生素。最后，存在用于控制环境的介质，基于表面控制，使得能够检测例如试验台上的微生物的存在。为了检测微生物在实验室中的存在以制备抗生素，可利用包含活性分子的介质，诸如beta-内酰胺酶以抑制可能存在试验台上的残留抗生素的作用，由此允许可能的微生物的生长和鉴定。
然而，活性分子在溶液中的保存通过它们在复合介质或在非常高稀释度时的稳定性来调节。它们可根据物理化学条件快速变性，或被酶降解。例如β-内酰胺酶对于热变性(60～70℃)敏感。抗生素也可对热敏感。为了补偿随时间的这种降解，初始活性分子浓度必须非常高，由此使得生产费用昂贵。包含所述活性分子的介质的保存就活性而言也成了主要的问题；它们通常不能在室温保存，这是由于持续暴露于热会诱导介质活性分子诸如抗生素，酶等的变性。此外，即使存在低温运输系统(cold chain)，反应介质通常应在生产后2-4个月内使用。由此，增加存在反应介质中的活性分子的稳定性非常重要。
由此本发明涉及通过降低制备成本和提高稳定性以延长保质期来改善介质对于目前市场上的微生物的检测。
令人吃惊地，本发明人显示将活性分子包囊化在环式糊精中使得可能在反应介质中的这些活性分子，从而赋予所述活性分子对于各种因子诸如热、震动等的抗性。
环式糊精或环糊精是已知的分子。它们包含其中可安置疏水分子疏水空腔，以及使得环式糊精-疏水分子复合物能溶于含水溶剂中的疏水外表面。由于这种无极性空腔，环式糊精能在含水介质中与多种疏水宿主分子形成包含复合体。这种复合体形成的结果是在含水相中不溶的疏水分子被溶解。然而，根据申请人的知识，从未描述过这些分子能保护反应介质中的活性分子抵抗各种因子诸如热、震动等。在反应介质中利用活性分子/环式糊精包囊化复合物由此使得能够增加这些活性分子的稳定性并延长这些反应介质的寿命。
在继续描述本发明之前，给出以下定义以说明本发明。
术语反应介质意图指包含表达代谢物和/或微生物生长所必需的所有成分的介质。所述的反应介质可为固体、半固体或液体的。术语“固体介质”意图指例如凝胶状介质。琼脂是常规的凝胶化剂，在微生物学中用于培养微生物，但可利用明胶或琼脂糖。一些制备物可购得，例如Columbia琼脂，Trypcase-soya琼脂，Mac Conkey琼脂，Sabouraud琼脂或更常见的Handbook of Microbiological Media(CRC Press)中描述的那些。
反应介质可包含组合的一或多种成分，诸如氨基酸，蛋白胨，碳水化合物，核苷酸，矿物质，微生物，活性分子诸如抗生素、酶、表面活性剂、缓冲液、磷酸盐、铵盐、钠盐、金属盐、一或多种使得能检测酶活性或代谢活性的底物，等。
所述介质还包含着色剂。着色剂可指Evans蓝，中性红，绵羊血，马血，不透明剂诸如，氧化钛，硝基苯胺，孔雀绿，亮绿，等。
所述反应介质可为显示介质(revealing medium)，或培养型显示介质。第一种情况中，所述微生物在接种前培养，第二种情况中，所述检测和/或鉴定介质也构成培养介质。
为了本发明的目的，术语微生物包括细菌，具体是革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，酵母，和更广泛意义上的微生物，广泛意义上的单细胞微生物，其是裸眼不可见的，可在实验室中扩增并操纵。
革兰氏阴性菌指例如以下属：假单胞菌(Pseudomonas)，埃希氏菌(Escherichia)，沙门菌(Salmonella)，志贺菌(Shigella)，肠杆菌(Enterobacter)，克雷伯菌(Klebsiella)，沙雷菌(Serratia)，变形杆菌(Proteus)，弯曲杆菌(Campylobacter)，嗜血菌(Haemophilus)，摩根菌(Morganella)，弧菌(Vibrio)，耶尔森菌(Yersinia)，不动杆菌(Acinetobacter)，布兰汉氏球菌(Branhamella)，奈瑟球菌(Neisseria)，伯霍尔德杆菌(Burkholderia)，柠檬酸杆菌(Citrobacter)，哈夫尼亚菌(Hafnia)，爱德华菌(Edwardsiella)，气单胞菌(Aeromonas)，摩拉克氏菌(Moraxella)，巴斯德菌(Pasteurella)，普罗威登斯菌(Providencia)，放线杆菌(Actinobacillus)，产碱菌(Alcaligenes)，博德特菌(Bordetella)，西地西菌(Cedecea)，欧文氏菌(Erwinia)，成团泛菌(Pantoea)，罗尔斯通氏菌(Ralstonia)，狭长平胞菌(Stenotrophomonas)，黄单胞菌(Xanthomonas)和军团病杆菌(Legionella)。
革兰氏阳性菌指例如以下属：肠球菌(Enterococcus)，链球菌(Streptococcus)，葡萄球菌(Staphylococcus)，芽孢杆菌(Bacillus)，利斯特菌(Listeria)，梭菌(Clostridium)，加德那菌(Gardnerella)，考克氏菌(Kocuria)，乳球菌(Lactococcus)，明串球菌(Leuconostoc)，微球菌(Micrococcus)，分枝杆菌(Mycobacteria)和棒杆菌(Corynebacteria)。
酵母菌指例如以下属：念珠菌(Candida)，隐球菌(Cryptococcus)，酵母菌(Saccharomyces)和毛孢子菌(Trichosporon)。
术语活性分子指对微生物产生影响诸如破坏力或对化学反应产生催化作用的分子，其随时间降解，尤其是在热的作用下。
术语“活性分子”优选意图指抗生素或酶。
术语抗生素意图指化学物质，其对微生物具有破坏力。
具体可为beta-内酰胺家族，具体包括青霉烷类(诸如青霉素；bipenicillin；苄星青霉素(extencillin)；青霉素v(oracillin)，苯唑西林(oxacillin)；氯唑西林(cloxacillin)；氨苄西林(ampicillin)；阿莫西林(amoxicillin)；巴氨西林(bacampicillin)；美坦西林(metampicillin)；匹氨西林(pivampicillin)；阿洛西林(azlocillin)；美洛西林(mezlocillin)；哌拉西林(piperacillin)；替卡西林(ticarcillin)；匹美西林(pivmecillinam)；氧青霉烷(oxapenam)；克拉维酸(clavulanic acid)；舒巴坦(sulbactam)；他唑巴坦(tazobactam))；青霉烯类(诸如亚胺培南)；头孢烯类(诸如一代头孢菌素(头孢氨苄；头孢羟氨苄；头孢克洛；头孢曲秦；头孢噻吩；cefapyrine；头孢唑啉)，2代头孢菌素(头孢西丁；头孢孟多；头孢替坦；头孢呋辛)，3代头孢菌素(头孢噻肟；头孢磺啶；头孢哌酮；头孢替安；头孢他啶；头孢曲松；头孢克肟；头孢泊肟；拉氧头孢))；单酰胺菌素类诸如氨曲南。
也可为以下种类的家族：磷霉素类；糖肽类(万古霉素；替考拉宁)；多霉素类(粘菌素)；短杆菌肽类和短杆菌酪肽(杆菌肽；短杆菌素)；氨基糖肽类(链霉素(streptomycin)；妥布霉素(tobramycin)；阿米卡星(amikacin)；西索米星(sisomicin)；地贝卡星(dibekacin)；奈替米星(netilmicin))；大环内酯类(螺旋霉素(spiramycin)；红霉素(erythromycin)；erythrocine；交沙霉素(josamycin)；罗红霉素(roxithromycin)；克拉霉素(clarithromycin)；阿奇霉素(azithromycin))；林肯胺类(林可霉素(lincomycin)；克林霉素(clindamycin))；协同菌素类(维吉霉素(virginiamycin)；原始霉素(pristinamycin))；苯丙醇(氯霉素；甲砜霉素)；四环素类(四环素；多西环素；米诺环素)；夫西地酸；oxazolidinones(linezolide)；利福霉素类(利福霉素；利福平)；喹诺酮类(萘啶酸；奥索利酸；吡哌酸)；氟喹诺酮类(氟甲喹；培氟沙星；诺氟沙星；氧氟沙星；环丙沙星；依诺沙星；左氧氟沙星；莫西沙星)；羟喹啉类(硝羟喹啉；tilboquinol)；硝基呋喃类(呋喃妥因；硝呋齐特)；硝基咪唑类(甲硝唑；奥硝唑)；磺酰胺类(磺胺嘧啶；sulfamethisol)，甲氧苄啶类(甲氧苄啶)。
术语酶意图指性质是蛋白质的分子，其催化细胞或细胞外介质中存在的代谢的生化反应。具体例如氧化还原酶(诸如氧化酶，还原酶，过氧化物酶，加氧酶，氢化酶或脱氢酶)；转移酶(诸如激酶；转氨酶；变位酶)；水解酶(诸如酯酶；肽酶；糖苷酶；葡糖苷酶)；裂合酶(诸如脱羧酶，醛缩酶；脱水酶)；异构酶(诸如消旋酶；表异构酶)；连接酶。优选，所述酶是水解酶，更优选是beta-内酰胺酶。
术语环式糊精意图指环式寡糖家族的分子，其由α-(1，4)-连接的吡喃葡萄糖亚基组成并对应经验式C42H70O35或其衍生物，其中吡喃葡萄糖亚基的羟基可被胺化，酯化或醚化。具体例如beta-环式糊精(BCD)，羟基丙基-beta-环式糊精(HPCD)，甲基-beta-环式糊精(MCD)，alpha-环式糊精(ACD)和gamma-环式糊精(GCD)。
优选，环式糊精选自alpha-环式糊精，其优选环状麦芽六糖(bioCydex参考号ACD N0；CAS No.51211-54-9)；gamma-环式糊精，其优选环状麦芽十糖(cyclomaltooctaose)(bioCydex参考号GCD N0；CAS No.91464-90-3)；beta-环式糊精，其优选2-O-甲基-beta-环式糊精或任意2-O-甲基-环状麦芽七糖(cyclomaltoheptaose)(bioCydex参考号BCD C15)；或优选2-羟基丙基-beta-环式糊精，也已知为任意2，3，6-O-(2-羟基丙基)环式麦芽七糖(bioCydex参考号BCD R59，CAS No.128449-35-5)；或优选单丙烷二氨基(monopropanediamino)-beta-环式糊精，也已知为6I-(3-氨基丙基氨基)-6I-去氧环式麦芽七糖(deoxycyclomaltoheptaose)(bioCydex参考号BCD A56)。通常，本发明的环式糊精由BioCydex公司(Poitiers，France)提供。作为说明，环式麦芽六糖和环式麦芽十糖是Wacker Chemie出售的；环式麦芽七糖，2-O-甲基环式麦芽七糖和羟基丙基-beta-环式糊精是Roquette Frères出售的，单丙烷二氨基-beta-环式糊精是BioCydex出售的。
表达使得能检测酶活性或代谢活性的底物意图指任何由于微生物的酶活性或代谢活性而能直接或间接产生可检测信号的分子。
当这种活性是酶活性时，所述的底物为酶底物。术语″酶底物″意图指任何可被酶水解以产生使得能直接或间接检测微生物的产物的底物。所述底物具体包含对于待显示酶活性特异的第一部分以及作为标记的第二部分，下文称为标记部分。所述标记部分可为生色的，生荧光的，发光的等。适合固相支持物(滤纸，琼脂，电泳凝胶)的生色底物例如基于吲哚酚及其衍生物的底物，以及基于羟基喹啉或七叶苷(esculetin)及其衍生物的底物，其使得能检测糖苷酶和酯酶活性。
基于吲哚酚的底物具体例如3-吲哚酚，5-溴-3-吲哚酚，5-碘-3-吲哚酚，4-氯-3-吲哚酚，5-溴-4-氯-3-吲哚酚，5-溴-6-氯-3-吲哚酚，6-溴-3-吲哚酚，6-氯-3-吲哚酚，6-氟-3-吲哚酚，5-溴-4-氯-N-甲基-3-吲哚酚，N-甲基-3-吲哚酚，等。
类黄酮(flavoid)衍生的底物具体例如3’，4’-二羟基黄酮-4’-β-D-核糖苷，3’，4’-二羟基黄酮-4’-β-D-半乳糖苷，3’，4’-二羟基黄酮-4’-β-D-葡糖苷，3-羟基黄酮-β-D-半乳糖苷，3-羟基黄酮-β-D-葡糖苷or 3’，4’-二羟基黄酮-3’，4’-双乙酸盐。
还涉及基于硝基酚(邻硝基酚，对硝基酚，等)和硝基苯胺及其衍生物的底物，使得可利用基于硝基酚的底物检测糖苷酶和酯酶活性以及利用基于硝基苯胺的底物检测肽酶活性。
最后，还涉及基于萘酚和萘胺及其衍生物的底物，使得可通过萘酚检测糖苷酶和酯酶活性，通过萘胺检测肽酶活性。该底物具体但非限制性地可使得能够检测酶活性诸如糖苷酶、酯酶等的活性。
还涉及例如基于香豆素及其衍生物的底物，其也使得可利用基于羟基香豆素的底物具体是4-甲基伞形酮或环己酮七叶苷检测糖苷酶和酯酶活性，利用基于氨基香豆素具体是7-氨基-4-甲基香豆素的底物检测肽酶活性。
还涉及基于氨基苯酚及其衍生物的底物，其使得可检测糖苷酶，值么和肽酶活性。还涉及基于茜草素及其衍生物的底物，其使得可疑检测糖苷酶和酯酶活性。最后，还涉及基于萘酚和萘胺及其衍生物的底物，其使得可通过萘酚检测糖苷酶和酯酶活性，以及通过萘胺检测肽酶活性。
术语“基于萘酚的底物”具体意图指基于α-萘酚，β-萘酚，6-溴-2-萘酚，萘酚AS BI，萘酚AS，或p-萘酚苯的底物，如本申请人的专利申请EPl224196。其可为糖苷酶，磷酸酶或硫酸酯酶底物。糖苷酶底物具体是N-乙酰-β-己糖胺酶，β-半乳糖苷酶，α-半乳糖苷酶，β-葡糖苷酶，α-葡糖苷酶，β-葡糖醛酸糖苷酶，β-纤维二糖糖苷酶(cellobiosidase)或α-甘露糖苷酶底物。
术语“基于茜草素的底物”具体意图指申请人在专利申请EP1235928中描述的底物。
酶底物也可为天然底物，其水解产物可直接或间接检出。天然底物指色氨酸，用于检测色氨酸酶或脱氨酶活性，环式氨基酸(色氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、酪氨酸)用于检测脱氨酶活性，磷脂酰肌醇，用于检测磷脂酶活性等。当这种活性是代谢活性时，所述底物则是代谢底物，诸如碳源或氮源，其与在代谢产物之一存在下产生颜色的指示物偶联。
例如，用于检测beta-葡糖醛酸糖苷酶活性的底物具体是4-甲基香豆素-beta-葡糖苷酸，5-溴-4-氯-3-吲哚基-beta-葡糖苷酸，5-溴-6-氯-3-吲哚基-beta-葡糖苷酸，6-氯-3-吲哚基-beta-葡糖苷酸，茜草素-beta-葡糖苷酸，环己酮七叶苷-beta-葡糖苷酸或其盐。例如用于检测beta-半乳糖苷酶活性的底物具体是4-甲基香豆素-beta-半乳糖苷，5-溴-4-氯-3-吲哚基-beta-半乳糖苷，5-溴-6-氯-3-吲哚基-beta-半乳糖苷，6-氯-3-吲哚基-beta-半乳糖苷，茜草素-beta-半乳糖苷，环己酮七叶苷-beta-半乳糖苷或其盐。用于检测beta-葡糖苷酶活性的底物具体可为4-甲基香豆素-beta-葡糖苷，5-溴-4-氯-3-吲哚基-beta-葡糖苷，5-溴-6-氯-3-吲哚基-beta-葡糖苷，6-氯-3-吲哚基-beta-葡糖苷，茜草素-beta-葡糖苷，环己酮七叶苷-beta-葡糖苷，硝基苯基-beta-葡糖苷，二氯氨基苯基葡糖苷或其盐。
术语生物样品意图指来自生物流体样本的临床样品或来自任何类型的食物的食物样品。所述样品可为液体或固体，并且非限制性地例如临床血液、血浆、尿液或粪便样品，鼻、喉、伤口或脑脊液样品，或食品样品，其可来自水、饮料诸如牛奶或果汁；来自酸奶，来自肉，来自蔬菜，来自蛋黄酱，来自奶酪；来自鱼肉等，来自动物饲料的食品样品，具体例如来自动物膳食的样品。
在这方面，本发明涉及用于鉴定/检测微生物的反应介质，其波阿含至少一种包囊化在环式糊精中的活性分子。
根据本发明的一个优选实施方案，所述环式糊精选自：
alpha-环式糊精，其优选为环式麦芽六糖(bioCydex参考号ACD N0；CAS No.51211-54-9)；gamma-环式糊精，其优选环式麦芽十糖(bioCydex参考号GCD N0；CAS No.91464-90-3)；beta-环式糊精，其优选2-O-甲基-beta-环式糊精或任意2-O-甲基环式麦芽七糖(bioCydex参考号BCD C15)；或优选2-羟基丙基-beta-环式糊精，也已知为任意2，3，6-O-(2-羟基丙基)环式麦芽七糖(bioCydex参考号BCD R59；CAS No.128449-35-5)；或优选单丙烷二氨基-beta-环式糊精，也已知为6I-(3-氨基丙基氨基)-6I-去氧环式麦芽七糖(bioCydex参考号BCD A56)。
根据本发明的一个优选实施方案，所述活性分子是抗生素。优选所述抗生素选自青霉烷或头孢烷(cepham)家族。优选，所述抗生素是头孢西丁或氯唑西林。
当然，本发明的反应介质可包含一种抗生素或多种抗生素。本领域技术人员可容易地根据所需的效应调节抗生素的浓度。优选，抗生素浓度为0.01-80mg/l，优选0.05-32mg/l，更优选0.1-8mg/l，更优选0.25-6mg/l。
例如，抗生素是头孢噻肟时，该介质中头孢噻肟的浓度优选0.25-8mg/l，优选1-2mg/l；当抗生素是头孢西丁时，所述介质中头孢西丁的浓度优选0.1-8mg/l，更优选0.25-6mg/l；当抗生素是氯唑西林时，所述介质中氯唑西林的浓度优选0.1-8mg/l，更优选0.25-6mg/l；当抗生素是头孢他啶时，所述介质中头孢他啶的浓度优选0.25-8mg/l，优选2-2.5mg/l；当抗生素是头孢曲松时，所述介质中头孢曲松的浓度优选0.25-8mg/l，优选1-2.5mg/l；当抗生素是头孢泊肟是，所述介质中头孢泊肟的浓度优选0.1-32mg/l，优选0.75-10mg/l，更优选1-6mg/l。
根据本发明的一个优选实施方案，所述活性分子是酶，优选beta-内酰胺酶。本领域技术人员可根据所需的效应调节酶的浓度。优选，所述介质中的beta-内酰胺酶优选50-500IU/l，优选100-150IU/l。
根据本发明的一个优选实施方案，所述反应介质包含至少一种使得能够检测酶活性或代谢活性的底物。
所述介质也可根据其需要鉴定的微生物而包含底物的组合。本领域技术人员将根据需要鉴定的微生物调节底物的浓度。优选，底物的浓度为25-750mg/l，优选40-200mg/l。例如当底物是使得能检测beta-葡糖苷酶的酶活性的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷时，所述浓度优选25-500mg/l，优选40-150mg/l。例如，当底物是使得能检测己糖胺酶的酶活性的5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷时，所述浓度优选25-500mg/l，优选40-150mg/l。例如，当使用使得能检测磷酸酶活性的5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸时，所述浓度优选25-750mg/l，优选40-200mg/l。
本领域技术人员也可使用双片，从而可容易地比较两种介质，其中包含多种底物，并且相同的生物样品将被置于其上。
优选，所述使得能检测酶活性或代谢活性的底物是酶底物，优选荧光或生色酶底物。
优选，所述的酶活性选自以下酶活性：糖苷酶，酯酶和肽酶，更优选所述相同的酶活性选自以下酶活性：β-D-葡糖苷酶，β-D-半乳糖苷酶，alpha-D-葡糖苷酶，alpha-D-半乳糖苷酶，alpha-甘露糖苷酶，β-D-葡糖醛酸糖苷酶，N-乙酰-β-D-己糖胺酶，β-D-纤维二糖糖苷酶，酯酶，磷酸酶，磷酸脂酶，硫酸酯酶以及肽酶。
本发明还涉及检测和/或鉴定微生物的方法，特征在于其包含以下步骤：
a)提供如上定义的反应介质，
b)用受试生物样品接种所述介质，
c)允许保温，和
d)检测和/或鉴定所述微生物。
所述微生物的接种可利用任何本领域已知接种技术进行。接种步骤可在希望检测的酶活性是最佳的温度下进行，所述温度可由本领域技术人员根据要检测的酶活性容易地选择。步骤d)可通过目测，比色法，或荧光测定法来进行。
本发明还涉及利用如上所述的反应介质来检测和/或鉴定微生物。
本发明还涉及环式糊精在增加反应介质稳定性中的用途。通过所述的用途，可使得反应介质的过期日推后，并且更容易保存所述的介质。
优选，所用环式糊精选自alpha-环式糊精，其优选环状麦芽六糖(bioCydex参考号ACD N0；CAS No.51211-54-9)；gamma-环式糊精，其优选环状麦芽十糖(cyclomaltooctaose)(bioCydex参考号GCD N0；CAS No.91464-90-3)；beta-环式糊精，其优选2-O-甲基-beta-环式糊精或任意2-O-甲基-环状麦芽七糖(cyclomaltoheptaose)(bioCydex参考号BCD C15)；或优选2-羟基丙基-beta-环式糊精，也已知为任意2，3，6-O-(2-羟基丙基)环式麦芽七糖(bioCydex参考号BCD R59，CAS No.128449-35-5)；或优选单丙烷二氨基(monopropanediamino)-beta-环式糊精，也已知为6I-(3-氨基丙基氨基)-6I-去氧环式麦芽七糖(deoxycyclomaltoheptaose)(bioCydex参考号BCD A56)。
本发明还涉及环式糊精用于保护培养介质中的活性分子对抗物理化学降解作用诸如热或振荡的用途。优选，所用的环式糊精选自alpha-环式糊精，其优选环状麦芽六糖(bioCydex参考号ACD N0；CAS No.51211-54-9)；gamma-环式糊精，其优选环状麦芽十糖(cyclomaltooctaose)(bioCydex参考号GCD N0；CAS No.91464-90-3)；beta-环式糊精，其优选2-O-甲基-beta-环式糊精或任意2-O-甲基-环状麦芽七糖(cyclomaltoheptaose)(bioCydex参考号BCD C15)；或优选2-羟基丙基-beta-环式糊精，也已知为任意2，3，6-O-(2-羟基丙基)环式麦芽七糖(bioCydex参考号BCD R59，CAS No.128449-35-5)；或优选单丙烷二氨基(monopropanediamino)-beta-环式糊精，也已知为6I-(3-氨基丙基氨基)-6I-去氧环式麦芽七糖(deoxycyclomaltoheptaose)(bioCydex参考号BCD A56)。
以下实施例用于解释而非限制。它们使得更容易理解本发明。
以下实施例涉及通过将3种活性分子(两种抗生素，氯唑西林和头孢西丁，和一种酶，β-内酰胺酶)包囊化在环式糊精中抵抗对其降解的保护作用。检测了
Figure G2008800142698D00101
范围的多种环式糊精(ACD N0，GCD N0，BCD C15，BCDR59，BCD A56)减慢活性分子热降解的能力。稳定性通过HPLC评估。
1.氯唑西林的保护和稳定
氯唑西林(分子量475.88)是β-内酰胺类型的抗生素，用于已知一些细菌诸如产气肠杆菌或大肠杆菌的生长。BioCydex文库的环式糊精与氯唑西林以1∶1的摩尔比(浓度＝210.12mM)，在20℃保温72h(黑暗中振荡)。残余氯唑西林的量随后通过HPLC分析。
以下实验在含水介质中并在高温(75℃)进行以加速降解速率。
1.1易位筛选(Screening ex-situ)
氯唑西林的钠盐(Sigma，Ref.C 9393)在含水介质中具有高固有溶解度(～100g.L-1)。
所述复合物在室温利用氯唑西林∶环式糊精摩尔比1∶16和1∶79来制备。含有0.63mM，即300mg.L-1，氯唑西林的溶液在75℃保温31h。对样品进行分析及定量以评估抗生素稳定性，在Thermo FinniganSpectraSYSTEM HPLC系统上进行，所述系统装备有P1000XR泵，AS3000自动注射器，UV1000 UV/可见光检测器，以及位于Merck
Figure G2008800142698D00102
RP-18e保护柱(5-4.6mm)之后的Merck
Figure G2008800142698D00103
Performance RP-18endcapped柱(100-4.6mm)。
流动相利用HPLC-级乙腈和三氟乙酸酸化的水(100μL/L)来制备。0/100-100/0的甲醇/水梯度在12min中施加。稳定2min后，所述柱在初始条件下重平衡。洗脱速度是1mL/min，温度是22℃，检测在220nm进行。样品注射体积是20μL。色谱数据利用Atlas软件，version 2003.1(Thermo Electron Corporation，UK)处理。
结果示于表I：
表I：氯唑西林在环式糊精存在下在75℃的稳定性
  环式糊精   氯唑西林稳定性(％)
  无   0.6
  环式糊精   氯唑西林稳定性(％)
  BCD R59 10   16.3
  BCD R59 50   37.7
  BCD C15 10   14.9
  BCD C15 50   39.9
这些结果显示了环式糊精BCD R59和BCD C15对氯唑西林的保护作用。这些结果在相同实验条件下在氯唑西林∶环式糊精摩尔比为1∶15的最小值时确认。在该方面，图1显示环式糊精对抗氯唑西林的降解的保护作用(-CD：缺乏环式糊精；1∶1到1∶125：氯唑西林∶CD摩尔比)。
环式糊精BCD C15在低摩尔比提供最好的保护作用。对于高于1∶50的摩尔比，对于两种环式糊精观察到相似的性能水平。
这些结果显示氯唑西林与环式糊精诸如BCD R59或BCD C15的复合对抗生素分子赋予对热处理的灭活作用(31h，75℃)的保护，这是由于在加热之后发现40％的活性分子，而在氯唑西林不与环式糊精结合时为0％。
2.头孢西丁复合物
头孢西丁是β-内酰胺家族的抗生素，其抑制细菌细胞壁的粘肽合成。
2.1易位筛选
0.444mM的头孢西丁(Sigma，Ref.C4786-5G)和8.88mM的环式糊精(ACD N0或GCD N0或BCD R59或BCD C15)，即摩尔比1∶20，通过搅拌一小时在室温溶解。该混合物随后被置于65℃、90min。头孢西丁的稳定性随后通过HPLC分析。样品的分析及其定量在Thermo FinniganSpectraSYSTEM HPLC系统上进行，所述系统装备有P1000XR泵，AS3000自动注射器，UV1000UV/可见光检测器，以及位于Merck
Figure G2008800142698D00111
RP-18e保护柱(5-4.6mm)之后的Merck
Figure G2008800142698D00112
Performance RP-18endcapped柱(100-4.6mm)。
流动相利用HPLC-级乙腈和三氟乙酸酸化的水(100μL/L)来制备。0/100-100/0的甲醇/水梯度在12min中施加。稳定2min后，所述柱在初始条件下重平衡。洗脱速度是1mL/min，温度是22℃，检测在254nm进行。样品注射体积是20μL。色谱数据利用Atlas软件，version 2003.1(Thermo Electron Corporation，UK)处理。
结果示于表II：
表II：各种环式糊精对头孢西丁在65℃的稳定性的影响
  环式糊精   头孢西丁稳定性/％
  无   38.5
  ACD N0   41.3
  环式糊精   头孢西丁稳定性/％
  GCD N0   40.5
  BCD R59   43.8
  BCD C15   42.0
最佳保护通过改变头孢西丁∶环式糊精(BCD R59和BCD C15)的摩尔比从1∶1到1∶216，其他条件保持不变来发现。在这方面，图2显示BCDR59和BCD C15对含水介质中头孢西丁的保护作用。稳定性的改善相对于无环式糊精的对照计算。
对于1∶6到1∶30范围内的摩尔比，环式糊精BCD C15是最为有效的。在此之上，两种环式糊精相等同。摩尔比1∶50足以实现在低温的较高程度的保护。在这种情况中，头孢西丁在65℃、90min之后的稳定性是47.5％，而在无环式糊精的对照中所述的稳定性是38.5％。
这些结果表明环式糊精ACD N0，GCD N0，BCD R59和BCD C15保护头孢西丁对抗热变性，这是由于在BCD C15存在下，复合的抗生素的降解比单独的抗生素减少大约10％。
3.对BETA-内酰胺酶的保护作用
3.1β-内酰胺酶的稳定性
等同于0.375U.mL-1的量的β-内酰胺酶(Genzyme Biochemicals Ref.BELA-70-1431)与
Figure G2008800142698D00121
范围(1或10mM)的环式糊精BCD A56混合，在室温和黑暗中放置30min。所述混合物随后在70℃加热45min。阿莫西林(Glaxo，Ref.5003)，500mg.L-1，其显示β-内酰胺酶活性，随后在室温加入。在25℃保温5min之后，残余的阿莫西林利用HPLC分析。获得的图谱显示在图3中，其显示以下物质的HPLC分析：阿莫西林(A：未经处理的阿莫西林对照；B：阿莫西林+β-内酰胺酶，未加热；C：阿莫西林+β-内酰胺酶，加热；D：阿莫西林+β-内酰胺酶：BCD A56复合物(1mM)，加热。TR阿莫西林＝5.5min)。阿莫西林峰值在5.5min出现。
β-内酰胺酶的活性通过与单独的阿莫西林对照(图3A)相比阿莫西林峰值的降低(图3B)，以及水解产物的出现(特征在于较短保持时间的不能分辨的峰)来证实。当β-内酰胺酶通过热降解时，其丧失部分活性，这可通过阿莫西林较好的稳定性来反映(图3C)。在环式糊精存在下相同的热处理(图3D)使得能够维持与阿莫西林-β-内酰胺酶未经处理的对照相同的β-内酰胺酶活性(图3B)。
基于上述图谱，可定量阿莫西林的浓度并将该值与β-内酰胺酶活性关联。结果显示于表III。
表III：BCD A56对β-内酰胺酶热降解抗性的影响
  β-内酰胺酶的处理   [阿莫西林](任意单位)
  加热，无BCD A56   100
  加热+BCD A56，1mM   4.3
  加热+BCD A56，10mM   0.8
将缺乏环式糊精的情况作为参照，结论是在存在10mM BCD A56时有非常好的保护作用，并且此外，环式糊精不与酶的活性位点相互作用。
这些结果显示与环式糊精相结合的beta-内酰胺酶即使在70℃加热45分钟也保持其所有酶活性，这是由于其仍能完全降解阿莫西林(该酶的底物)，而未结合的蛋白质则不能。由此，环式糊精保护该酶及其活性位点对抗由于热处理造成的变性。
4.反应介质：
两种反应介质从ChromIDTM MRSA介质制备，一种含有头孢西丁，另一种含有环式糊精BCD C15+头孢西丁复合物。后者通过将头孢西丁和环式糊精溶于渗透的水中然后在室温、黑暗中搅拌溶液来获得。混合物随后过滤然后掺入琼脂。
所述介质储存在2-8℃19周，通过与商业购得的即用介质比较，每周评估性能水平(MRSA：甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌的生长，MSSA：甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌的抑制)。
环式糊精对头孢西丁的保护作用通过比较具有或不具有环式糊精BCDC15的介质上对MSSA生长的抑制(活性头孢西丁)随时间的变化来测定。
MRSA和MSSA菌株根据三象限划线法接种在介质上并随后将培养皿在37℃保温48h。
保温24和48h之后观察菌株的生长(集落在培养皿上的存在)以及集落的颜色。结果示于下表：
  chromIDMRSA+头孢西丁  chromID MRSA+头孢西丁+环式糊精
第0周   MRSA生长MSSA生长集落颜色   +(2/2)-(0/2)G  +(2/2)-(0/2)G
第1周   MRSA生长MSSA生长集落颜色   +(2/2)-(0/2)G  +(2/2)-(0/2)G
  chromIDMRSA+头孢西丁  chromID MRSA+头孢西丁+环式糊精
  第10周   MRSA生长MSSA生长集落颜色   +(2/2)-(0/2)G  +(2/2)-(0/2)G
第17周   MRSA生长MSSA生长集落颜色   +(2/2)-(0/2)G  +(2/2)-(0/2)G
  第18周   MRSA生长MSSA生长集落颜色   +(1/1)+(1/4在48h1个集落)G  +(1/1)-(0/4)G
第19周   MRSA生长MSSA生长集落颜色   +(1/1)+(2/4)G  +(1/1)+(2/4)G
说明：
+：生长
-：无生长
(N)：生长菌株数目/受试菌株数目
G：绿色
如在T＝0预期那样，MRSA菌株形成绿色集落，而MSSA菌株被正确抑制。环式糊精的存在与其在培养介质中的用途相适合。

Claims (11)

1.用于鉴定/检测微生物的反应介质，包含包囊化在环式糊精中的至少一种活性分子。
2.权利要求1的反应介质，特征在于所述的环式糊精选自：alpha-环式糊精；gamma-环式糊精；beta-环式糊精：2-O-甲基-beta-环式糊精；2-羟基丙基-beta-环式糊精；以及单丙烷二氨基-beta-环式糊精。
3.权利要求1或2的反应介质，特征在于所述活性分子是抗生素。
4.权利要求3的反应介质，特征在于素数抗生素选自青霉烷或头孢烷家族。
5.权利要求1或2的反应介质，特征在于所述活性分子是酶，优选水解酶，更优选beta-内酰胺酶。
6.权利要求1-5之一的反应介质，特征在于其包含至少一种使得能够检测酶活性或代谢活性的底物。
7.权利要求6的反应介质，其特征在于所述使得能够检测酶活性或代谢活性的底物是酶底物，优选荧光或生色型的。
8.检测和/或鉴定微生物的方法，特征在于其包含以下步骤，包括：
a)提供权利要求1-7之一的反应介质，
b)将受试生物样品接种于所述介质，
c)允许保温，和
d)检测和/或鉴定所述微生物。
9.权利要求1-7之一的反应介质在检测和/或鉴定微生物中的用途。
10.环式糊精在增加反应介质稳定性中的用途。
11.环式糊精在保护活性分子对抗反应介质中的物理化学降解中的用途。
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