WO2008148972A2 - Milieu reactionnel pour l'identification/detection de microorganismes - Google Patents

Milieu reactionnel pour l'identification/detection de microorganismes Download PDF

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WO2008148972A2
WO2008148972A2 PCT/FR2008/050761 FR2008050761W WO2008148972A2 WO 2008148972 A2 WO2008148972 A2 WO 2008148972A2 FR 2008050761 W FR2008050761 W FR 2008050761W WO 2008148972 A2 WO2008148972 A2 WO 2008148972A2
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cyclodextrin
beta
reaction medium
bcd
microorganisms
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El Mustapha Belgsir
Yves Cenatiempo
Manilduth Ramnath
Denis Robichon
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bioMérieux
Biocydex
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor

Definitions

  • the field of the invention is that of the detection and identification of microorganisms, such as in particular bacteria or yeasts by seeding reaction media.
  • reaction media for the detection of microorganisms. This detection can be based in particular on the use of particular substrates, specific for an enzyme of the microorganism that one wishes to detect.
  • the Escherichia coli strains are often evidenced by the revelation of an enzymatic activity of the osidase type such as beta-glucuronidase or beta-galactosidase activity.
  • the genus Listeria can be detected by demonstrating beta-glucosidase activity.
  • Aminopeptidase activity can also be used to reveal a group, a genus or a species of bacteria.
  • alanine aminopeptidase activity makes it possible to differentiate gram-negative bacteria from gram-positive bacteria.
  • the identification of a microorganism or a group of microorganisms through the reaction media may be based on the resistance of a microorganism to a therapeutic treatment.
  • the medium then generally comprises one or more so-called active molecules, such as in particular antibiotics against which the microorganism is likely to be resistant.
  • there are environments dedicated to environmental control such as surface control, for detecting the presence of microorganisms on a laboratory bench for example.
  • a medium comprising an active molecule such as beta lactamase to inhibit the action of residual antibiotics that may be present on the bench, and thus allow the growth and identification of possible microorganisms.
  • active molecules such as beta lactamase
  • the maintenance of active molecules in solution is conditioned by their stability in complex media or at very high dilutions. They can be quickly denatured depending on the physico-chemical or degraded conditions under the action of enzymes.
  • ⁇ -Lactamase for example is sensitive to thermal denaturation (60 ⁇ 70 ° C).
  • Antibiotics are also sensitive to heat. To overcome this degradation over time, the initial concentration of active molecule must be very important, which poses a problem of manufacturing cost.
  • the preservation of media comprising such active molecules remains a major problem in this field of activity: they can not generally be kept at room temperature, because prolonged exposure to heat can induce denaturation of the active molecules of the medium such as the antibiotics, enzymes ... Moreover, even if the cold chain is respected, the reaction media must be generally used within 2 to 4 months of their manufacture. It is therefore very important to increase the stability of the active molecules present in a reaction medium.
  • the present invention therefore proposes to improve the reaction media allowing the detection of microorganisms currently marketed by reducing their manufacturing cost and improving their stability, so as to extend their shelf life.
  • the inventors have shown that the encapsulation of active molecules in cyclodextrins makes it possible to protect these active molecules in reaction media, conferring a resistance of the active molecules to various factors such as heat, agitation, etc.
  • Cyclodextrins or cycloamyloses are well known molecules. They are composed of a hydrophobic cavity in which hydrophobic molecules can be housed, and a hydrophilic outer surface allowing the cyclodextrin-hydrophobic molecule complex to dissolve in the aqueous solvents. Thanks to this apolar cavity, cyclodextrins are capable of forming inclusion complexes in aqueous medium with a large variety of hydrophobic host molecules. The resultant of this complexation is the solubilization of hydrophobic molecules that are very insoluble in the aqueous phase.
  • reaction medium a medium comprising all the elements necessary for the expression of a metabolism and / or the growth of microorganisms.
  • the reaction medium may be solid, semi-solid or liquid.
  • solid medium is meant for example a gelled medium.
  • Agar is the traditional gelling agent in microbiology for the cultivation of microorganisms, but it is possible to use gelatin or agarose.
  • a number of preparations are commercially available, such as, for example, Columbia agar, Trypcase-soy agar, Mac Conkey agar, Sabouraud agar or more generally those described in the Handbook of Microbiological Media (CRC Press).
  • the reaction medium may comprise one or more elements in combination, such as amino acids, peptones, carbohydrates, nucleotides, minerals, vitamins, active molecules such as antibiotics, enzymes, surfactants, buffers, phosphate, ammonium, sodium, metal salts, one or more substrates for the detection of enzymatic or metabolic activity ...
  • the medium may also include a dye.
  • a dye of Evans blue, neutral red, sheep blood, horse blood, an opacifier such as titanium oxide, nitroaniline, malachite green, brilliant green ...
  • the reaction medium may be a revelation medium, or a culture and revelation medium.
  • the culture of the microorganisms is carried out before seeding, and in the second case, the detection and / or identification medium also constitutes the culture medium.
  • the term microorganism covers bacteria, in particular gram-negative and gram-positive, yeast, and more generally, generally unicellular organisms, invisible to the naked eye, which can be multiplied and manipulated in the laboratory .
  • gram-negative bacteria As gram-negative bacteria, mention may be made of the following genera: Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, Campylobacter, Haemophilus, Morganella, Vibrio, Yersinia, Acinetobacter, Branhamella, Neisseria, Burkholderia , Citrobacter, Hafnia, Edwardsiella, Aeromonas, Moraxella, Pasteurella, Providentiel, Actinobacillus, Alcaligenes, Bordetella, Cedecea, Erwinia, Pantoea, Ralstonia, Stenotrophomonas, Xanthomonas and Legionella.
  • Gram-positive bacteria mention may be made of the following genera: Enterococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Bacillus, Listeria, Clostridium, Gardnerella, Kocuria, Lactococcus, Leuconostoc, Micrococcus, Mycobacteria and Corynebacteria.
  • yeasts that may be mentioned include yeasts of the following genera: Candida, Cryptococcus, Saccharomyces and Trichosporon.
  • active molecule a molecule that produces an effect, such as a destructive effect on microorganisms or a catalyst effect on chemical reactions, and which degrades over time, particularly under the effect of heat.
  • active molecule we preferentially mean an antibiotic or an enzyme.
  • antibiotic is meant a chemical substance having a destructive effect on microorganisms.
  • betalactamines including penams (such as Penicillin, Bipenicillin, Extencillin, Oracillin, Oxacillin, Cloxaciline, Ampicillin, Amoxicillin, Bacampicillin, Metampicillin, Pivampicillin, Azlocillin, Mezlocillin, Piperacillin, Ticarcillin, Pivmecillinam and Oxapenam; Clavulanic acid, Sulbactam, Tazobactam); penems (such as imipenem); cephems (such as cephalosporins of the 1st generation (cefalexin, cefadroxil, cefaclor, cefatrizine, cefalotine, cefapyrin, cefazolin), second-generation cephalosporins (cefoxitin, cefamandole, cefotetan, cefuroxime), cephalosporins of third generation ( Cefotaxime, Cefsulo
  • Teicoplanin Teicoplanin
  • polymycins colistin
  • gramicidines and tyrocidine Bacillus subtilis
  • Bacillus subtilis Bacillus subtilis
  • sisomicin dibekacin; Netilmicin; macrolides (Spiramycin, Erythromycin;
  • Pristinamycin phenycoles (chloramphenicol, thiamphenicol); tetracyclines (Tetracycline, Doxycycline, Minocycline); fusidic acid; oxazolidinones
  • pefloxacin pefloxacin; norfloxacin; ofloxacin; Ciprofloxacin; enoxacin; levofloxacin;
  • Moxifloxacin Moxifloxacin
  • oxyquinolines Niroxoline; Tilboquinol
  • nitrofurans Non-furantoin; Nifuroxazide
  • nitroimidazoles metalronidazole, ornidazole
  • sulfonamides Sulfadiazine, Sulfamethisol
  • trimethoprim Trimethoprim
  • enzyme By enzyme is meant a molecule of a protein nature catalyzing the biochemical reactions of the metabolism taking place in the cellular or extracellular medium.
  • oxidoreductases such as oxidases, reductases, peroxidases, oxygenases, hydrogenases, or dehydrogenases
  • transferases such as kinases, transaminases, mutases
  • hydrolases such as esterases, peptidases, osidases: glucosidases
  • lyases such as decarboxylases, aldolases, dehydratases
  • isomerases such as racemases, epimerases
  • ligases such as racemases, epimerases.
  • the enzyme is a hydrolase, and even more preferentially a beta lactamase.
  • cyclodextrin is meant a molecule of the family of cyclic oligosaccharides composed of ⁇ - (1,4) -linked glucopyranose subunits and corresponding to the empirical formula
  • BCD beta-cyclodextrin
  • HPCD hydroxypropyl-beta-cyclodextrin
  • MCD methyl-beta-cyclodextrin
  • ACD alpha-cyclodextrin
  • GCD gamma-cyclodextrin
  • the cyclodextrin is chosen from an alpha-cyclodextrin, which is preferably Cyclomaltohexaose (reference BioCydex ACD NO; CAS No. 51211-54-9); a gamma-cyclodextrin, which is preferentially Cyclomaltooctaose (reference BioCydex GCD NO, CAS No.
  • beta-cyclodextrin which is preferably 2-O-methyl-beta-cyclodextrin or randomly 2-O-methyl-cyclomaltoheptaose
  • reference bioCydex BCD C 15 or preferentially a 2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrin also called randomly 2,3,6-O- (2-hydroxypropyl) -cyclomaltoheptaose
  • reference bioCydex BCD R59 CAS No.
  • cyclodextrins of the present invention were provided by BioCydex (Poitiers, France).
  • cyclomaltohexaose and cyclomaltooctaose are on sale at Wacker Chemie; cyclomaltoheptaose, 2, O-methyl-cyclomaltoheptaose and hydroxypropyl-beta-cyclodextrin are available from Roquette Fromme and monopropane-diamino-beta-cyclodextrin is available from BioCydex.
  • substrate allowing the detection of an enzymatic or metabolic activity is meant any molecule capable of generating, directly or indirectly, a detectable signal due to an enzymatic or metabolic activity of the microorganism. When this activity is an enzymatic activity, it is called enzymatic substrate.
  • enzymatic substrate any substrate that can be hydrolyzed by an enzyme into a product for the direct or indirect detection of a microorganism.
  • This substrate comprises in particular a first specific part of the enzymatic activity to be revealed and a second part serving as a marker, hereinafter referred to as a marker part.
  • This marker part can be chromogenic, fluorogenic, luminescent, etc.
  • a chromogenic substrate well suited to solid supports (filter, agar, electrophoresis gel), mention may be made in particular of substrates based on indoxyl and its derivatives, and substrates based on hydroxyquinoline or esculetin and their derivatives, which allow the detection of osidase and esterase activities.
  • Indoxyl As substrates based on Indoxyl, there may be mentioned in particular 3-Indoxyl, 5-Bromo-3-indoxyl, 5-Iodo-3-indoxyl, 4-chloro-3-indoxyl, 5-Bromo-4-chloro 3-indoxyl, 5-bromo-6-chloro-3-indoxyl, 6-bromo-3-indoxyl, 6-chloro-3-indoxyl, 6-fluoro-3-indoxyl, 5-bromo-4-chloro-N- 3-methyl-3-indoxyl, N-methyl-3-indoxyl, etc.).
  • substrates derived from flavoids such as in particular 3 ', 4'-dihydroxyflavone-4'- ⁇ -D-riboside. , 3 ', 4'-Dihydroxyflavone-4'- ⁇ -D-galactoside, 3', 4'-Dihydroxyflavone-4'- ⁇ -D-glucoside, 3-Hydroxyflavone- ⁇ -D-galactoside, 3- Hydroxyflavone- ⁇ -D-glucoside, 3 ', 4'-dihydroxyflavone-3', 4'-diacetate.
  • substrates based on nitrophenol ortho-nitrophenol, para-nitrophenol, etc.
  • nitroaniline and derivatives for detecting osidase and esterase activities in the case of substrates based on nitrophenol, and peptidase activities. in the case of substrates based on nitroaniline.
  • substrates based on naphthol and naphthylamine and their derivatives which make it possible to detect the osidase and esterase activities via naphthol, and the peptidase activities via naphthylamine.
  • This substrate may make it possible in particular, but in a non-limiting manner, to detect an enzymatic activity such as the activity of an osidase, peptidase, esterase, etc.
  • Coumarin-based substrates and derivatives may also be mentioned.
  • Naphtol and Naphtylamine substrates and their derivatives which make it possible to detect the osidase and esterase activities via Naphtol, and the peptidase activities via Naphtylamine.
  • Naphtol-based substrate is understood to mean in particular substrates based on ⁇ -Naphtol, ⁇ -Naphtol, 6-Bromo-2-naphthol, Naphtol AS BI, Naphtol AS, p-Naphtholbenzein as defined. in the patent application EP 1224196 of the Applicant.
  • the osidase substrates are in particular substrates of N-acetyl- ⁇ -hexosaminidase, ⁇ -galactosidase, ⁇ -galacotosidase, ⁇ -glucosidase, ⁇ -glucosidase, ⁇ -glucuronidase, ⁇ -cellobiosidase, of ⁇ -mannosidase.
  • substrate based on Alizarin is meant in particular the substrates described in the patent EP1235928 of the applicant.
  • the enzymatic substrate can also be a natural substrate whose hydrolysis product is detected directly or indirectly.
  • a natural substrate mention may in particular be made of Tryptophan for detecting tryptophanase or desaminase activity, a cyclic amino acid (Tryptophan, Phenylalanine, Histidine, Tyrosine) for detecting a desaminase activity, Phosphatidyl Inositol for detecting phospholipase activity, etc.
  • the substrate is then a metabolic substrate, such as a source of carbon or nitrogen, coupled to an indicator producing a staining in the presence of one of the products of metabolism.
  • a metabolic substrate such as a source of carbon or nitrogen
  • the substrates used for the detection of a beta- glucuronidase activity may especially be 4-methylumbelliferyl-beta-glucuronide, 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-glucuronide, 5-Bromo 6-chloro-3-indolyl-beta- glucuronide, 6-chloro-3-indolyl-beta-glucuronide, Alizarin-beta-glucuronide, Cyclohexeno-esculetin-beta-glucuronide or their salts.
  • the substrates used for the detection of a beta-galactosidase activity may especially be 4-methylumbelliferyl-beta-galactoside, 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-galactoside, 5-Bromo 6-chloro-3-indolyl-beta-galactoside, 6-chloro-3-indolyl-beta-galactoside, Alizarin-beta-galactoside, Cyclohexeno-esculetin-beta-galactoside or their salts.
  • the substrates used for the detection of a beta-glucosidase activity may especially be 4-methylumbelliferyl-beta-Glucoside, 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-glucoside, 5-Bromo-6-chloro 3-indolyl-beta-glucoside, 6-chloro-3-indolyl-beta-glucoside, Alizarin-beta-Glucoside, Cyclohexeno-esculetin-beta-glucoside, Nitrophenyl-beta-glucoside, Dichloroaminophenyl -glucoside or their salts.
  • biological sample we mean a clinical sample, from a sample of biological fluid, or a food sample, from any type of food.
  • This sample may thus be liquid or solid and may be mentioned in a nonlimiting manner, a clinical sample of blood, plasma, urine, faeces, nose samples, throats, skin, wounds, cerebrospinal fluid, a food sample of water, beverages such as milk, fruit juice; yogurt, meat, eggs, vegetables, mayonnaise, cheese; fish ..., a food sample from a feed intended for animals, such as in particular a sample from animal meal.
  • the invention relates to a reaction medium for the identification / detection of microorganisms comprising at least one active molecule encapsulated in a cyclodextrin.
  • the cyclodextrin is chosen from: an alpha-cyclodextrin, which is preferably Cyclomaltohexaose (reference BioCydex ACD NO, CAS No. 51211-54-9); a gamma-cyclodextrin, which is preferentially Cyclomaltooctaose (reference BioCydex GCD NO, CAS No.
  • beta-cyclodextrin which is preferably 2-O-methyl-beta- cyclodextrin or randomly 2-O-methyl-cyclomaltoheptaose
  • reference bioCydex BCD C 15 or preferentially a 2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrin also called randomly 2,3,6-O- (2-hydroxypropyl) -cyclomaltoheptaose
  • the active molecule is an antibiotic.
  • the antibiotic is chosen from the family of penams or cephams.
  • the antibiotic is cefoxitin or cloxacillin.
  • the reaction medium according to the present invention may comprise an antibiotic or several antibiotics. Those skilled in the art will easily adapt the antibiotic concentration according to the desired effect.
  • the antibiotic concentration is between 0.01 and 80 mg / l, preferentially between 0.05 and 32 mg / l, more preferably between 0.1 and 8 mg / l and even more preferably between 0.25 and 6 mg / l.
  • the concentration of cefotaxime in the medium is preferably between 0.25 and 8 mg / l, preferably between 1 and 2 mg / l; when the antibiotic is cefoxitine, the concentration of cefoxitine in the medium is preferably between 0.1 and 8 mg / l and even more preferably between 0.25 and 6 mg / l; when the antibiotic is cloxacillin, the concentration of cloxacillin in the medium is preferably between 0.1 and 8 mg / l and even more preferably between 0.25 and 6 mg / l; when the antibiotic is ceftazidime, the concentration of ceftazidime in the medium is preferably between 0.25 and 8 mg / l, preferably between 2 and 2.5 mg / l; when the antibiotic is ceftriaxone, the concentration of ceftriaxone in the medium is preferably between 0.25 and 8 mg / l, preferably between 1 and 2.5 mg / l; when the antibiotic is ceftriaxone, the concentration of ceftri
  • the active molecule is an enzyme, preferably beta lactamase.
  • the beta lactamase concentration in the medium is preferably between 50 and 500 IU / l, preferably between 100 and 150 IU / l.
  • the reaction medium comprises at least one substrate for detecting an enzymatic or metabolic activity.
  • the medium may also comprise a combination of substrates, depending on the microorganisms that one wishes to identify. Those skilled in the art will adapt the substrate concentration (s) according to the microorganism that one wishes to identify. Preferably, the concentration of substrate is between 25 and 750 mg / l, preferably between 40 and 200 mg / l.
  • the concentration is preferably at a concentration of between 25 and 500 mg / l, preferably between 40 and 150 mg / l.
  • the concentration is preferably at a concentration of between 25 and 500 mg / l, preferably between 40 and 150 mg / l.
  • the concentration is preferably at a concentration of between 25 and 750 mg / l, preferably between 40 and 750 mg / l. and 200 mg / l.
  • biboite which makes it easy to compare two media, comprising different substrates, on which a same biological sample has been deposited.
  • said substrate allowing the detection of an enzymatic or metabolic activity is an enzymatic substrate, preferentially fluorescent or chromogenic.
  • the enzymatic activity is chosen from the following enzymatic activities: osidase, esterase, peptidase, and even more preferentially, said same enzymatic activity is chosen from the following enzymatic activities: BD-glucosidase, ⁇ -D-galactosidase, alpha-D glucosidase, alpha-D-galactosidase, alpha-mannosidase, ⁇ -D-glucuronidase, N-acetyl- ⁇ -D-hexosaminidase, ⁇ -D-cellobiosidase, esterase, phosphatase, phospholipase, sulfatase, peptidase.
  • BD-glucosidase ⁇ -D-galactosidase
  • alpha-D glucosidase alpha-D-galactosidase
  • alpha-mannosidase alpha-D-glucu
  • the invention also relates to a method for detecting and / or identifying microorganisms, characterized in that it comprises the following steps: a) having a reaction medium as defined above, b) seeding the medium with a biological sample to be tested, c) allow to incubate, and d) detect and / or identify microorganisms
  • the seeding of the microorganisms can be carried out by all the seeding techniques known to those skilled in the art.
  • An incubation step can be carried out at a temperature for which the enzymatic activity that one wishes to detect is optimal, that the person skilled in the art can easily choose according to the enzymatic activity to be detected.
  • Step d) can be carried out by visual examination, colorimetry or fluorimetry.
  • the invention also relates to the use of the reaction medium as described above for the detection and / or identification of microorganisms.
  • the invention also relates to the use of cyclodextrin (s) to increase the stability of a reaction medium. Thanks to such use, it is possible to set back the expiry date of the reaction medium, and to preserve the medium more easily.
  • the cyclodextrin used is chosen from an alpha-cyclodextrin, which is preferably Cyclomaltohexaose (BioCydex reference ACD NO: CAS No. 51211-54-9); a gamma-cyclodextrin, which is preferentially Cyclomaltooctaose (reference BioCydex GCD NO, CAS No.
  • beta-cyclodextrin which is preferably 2-O-methyl-beta-cyclodextrin or randomly 2-O-methyl-cyclomaltoheptaose
  • reference bioCydex BCD C 15 or preferentially a 2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrin also called the randomly 2,3,6-O- (2-hydroxypropyl) -cyclomaltoheptaose
  • reference bioCydex BCD R59 CAS No.
  • the invention also relates to the use of cyclodextrin (s) for protecting active molecules against physico-chemical degradation in a reaction medium, such as in particular heat or agitation.
  • the cyclodextrin used is chosen from an alpha-cyclodextrin, which is preferably Cyclomaltohexaose (BioCydex reference ACD NO: CAS No. 51211-54-9); a gamma-cyclodextrin, which is preferentially Cyclomaltooctaose (reference BioCydex GCD NO, CAS No.
  • beta-cyclodextrin which is preferably a 2-O-methyl-beta-cyclodextrin or the randomly 2-O-methyl-cyclomaltoheptaose (Reference bioCydex BCD C 15); or preferably a 2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrin also called the randomly 2,3,6-O- (2-hydroxypropyl) -cyclomaltoheptaose (Reference bioCydex BCD R59, CAS No.
  • PROTECTION AND STABILIZATION OF CLOXACILLIN Cloxacillin (Molecular Weight 475.88) is a ⁇ -lactam antibiotic, used to inhibit the growth of certain bacterial species such as Enterobacter aerogenes or Escherichia coli.
  • the sodium salt of cloxacillin (Sigma, Ref C 9393) has a high intrinsic solubility in aqueous medium ( ⁇ 100 gL -1 ).
  • the complexes were prepared at room temperature with cloxacillin: cyclodextrin molar ratios of 1:16 and 1:79.
  • the analysis of the samples and their quantification to evaluate the stability of the antibiotic were carried out on a Thermo chain.
  • Table I Stability of cloxacillin in the presence of cyclodextrins at 75 ° C.
  • FIG. 1 shows the protective effect of cyclodextrins against the degradation of cloxacillin by heat (- CD: absence of cyclodextrin, 1: 1 to
  • Cyclodextrin BCD C 15 exhibited the best protection at a low ratio. For molar ratios greater than 1:50, similar performance was observed for both cyclodextrins.
  • Cefoxitin is an antibiotic of the ⁇ -lactam family, an inhibitor of mucopeptide synthesis in the bacterial wall.
  • Thermo Finnigan SpectraSYSTEM HPLC System equipped with a P1000XR pump, an AS3000 automatic injector, a UV1000 UV / Visible detector, a Merck Chromolith ® Performance RP-18 endcapped column (100- 4.6 mm) preceded by a Merck Chromolith ® RP-18e guard column (5-4.6 mm).
  • the mobile phases were prepared from acetonitrile grade-HPLC and water acidified with trifluoroacetic acid (100 ⁇ L / L). A methanol / water gradient of 0/100 to 100/0 was applied in 12 min. After stabilization for 2 min the column is rebalanced under the initial conditions.
  • the elution rate is 1 mL / min, the temperature is 22 ° C. and the detection is carried out at 254 nm.
  • the injection volume of the samples is 20 ⁇ L.
  • Chromatographic data were processed by Atlas software, version 2003.1 (Thermo Electron Corporation, UK). The results are shown in Table II:
  • the ⁇ -lactamase (Genzyme Biochemicals Ref BELA-70-1431) in an amount equivalent to 0.375 U.mL "1 was mixed with the cyclodextrin BCD A56 of the Protéosol ® range (1 or 10 mM), at room temperature and at room temperature. the mixture was then heated at 70 ° C. for 45 minutes, the amoxicillin (Glaxo, 5003), 500 mg.L -1 , revealing the activity of the ⁇ -lactamase, was then added at room temperature. After a 5 min incubation at 25 ° C, the residual amoxicillin was analyzed by HPLC. The profiles obtained are presented in FIG.
  • reaction media were made from ChromlD TM MRSA medium, one with cefoxitin and the other containing a BCD Cl 5 + cefoxitin cyclodextrin complex.
  • the latter being obtained by solubilizing cefoxitin and cyclodextrin in osmosis water and then stirring the solution at room temperature and protected from light. The mixture is then filtered before being incorporated in the agar.
  • the media are stored at 2-8 0 C for 19 weeks and the performances (growth of MRSA: Meticillin-resistant Staphylococcus aureus, inhibition of MSSA: Meticillin-sensitive Staphylococcus aureus) are evaluated weekly compared to a marketed ready medium. to work.
  • the protection of cefoxitin by cyclodextrin is measured by comparing growth inhibition of MSSA (active cefoxitin) over time on media with and without BCD C 15 cyclodextrin.
  • strains of MRSA and MSSA are seeded on the media according to the three-dial method and then the dishes are incubated for 48 hours at 37 ° C.
  • MRSA strains grow to form green colonies whereas MSSA strains are correctly inhibited.
  • the presence of cyclodextrins is compatible with use in culture medium.

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Abstract

La présente invention concerne un milieu réactionnel pour l' identification/détection de microorganismes comprenant au moins une molécule active encapsulée dans une cyclodextrine.

Description

Milieu réactionnel pour l'identification/détection de microorganismes
Le domaine de l'invention est celui de la détection et de l'identification de microorganismes, tels que notamment de bactéries ou de levures par ensemencement de milieux réactionnels.
Il existe actuellement de très nombreux milieux réactionnels permettant la détection de microorganismes. Cette détection peut être basée notamment sur l'utilisation de substrats particuliers, spécifiques d'une enzyme du microorganisme que l'on souhaite détecter. Ainsi, dans le cas de bactéries, les souches d'Escherichia coli sont souvent mises en évidence par la révélation d'une activité enzymatique du type osidase telle que l'activité beta-glucuronidase ou beta-galactosidase. De la même façon, le genre Listeria peut être détecté par la mise en évidence d'une activité beta- glucosidase. Une activité aminopeptidase peut également être utilisée pour révéler un groupe, un genre ou une espèce de bactéries. Ainsi, l'activité alanine-aminopeptidase, par exemple, permet de différencier les bactéries à Gram négatif des bactéries à Gram positif. Enfin, on peut citer également la détection d'une activité estérase pour notamment la mise en évidence du genre Salmonella. Outre l'utilisation de substrats particuliers, l'identification d'un microorganisme ou d'un groupe de microorganismes grâce aux milieux réactionnels, peut reposer sur la résistance d'un microorganisme à un traitement thérapeutique. Le milieu comprend alors généralement une ou plusieurs molécules dites actives, tel que notamment des antibiotiques contre lequel le microorganisme est susceptible d'être résistant. Il existe enfin des milieux dédiés au contrôle d'environnement tel que le contrôle de surface, permettant de détecter la présence de microorganismes sur une paillasse de laboratoire par exemple. Pour détecter la présence de microorganismes dans un laboratoire de fabrication d'antibiotiques, il est possible d'utiliser un milieu comprenant une molécule active telle que la beta lactamase afin d'inhiber l'action des antibiotiques résiduels qui pourraient être présents sur la paillasse, et ainsi permettre la croissance et l'identification des éventuels microorganismes. Toutefois, le maintien de molécules actives en solution est conditionné par leur stabilité dans des milieux complexes ou à de très fortes dilutions. Elles peuvent être rapidement dénaturées en fonction des conditions physico-chimiques ou dégradées sous l'action d'enzymes. La β-lactamase par exemple est sensible à la dénaturation thermique (60~70°C). Les antibiotiques sont également sensibles a la chaleur. Pour pallier cette dégradation au cours du temps, la concentration initiale en molécule active doit être très importante, ce qui pose un problème de coût de fabrication. La conservation de milieux comprenant de telles molécules actives reste un problème majeur dans ce domaine d'activité : ils ne peuvent généralement pas être conservés à température ambiante, car une exposition prolongée à la chaleur peut induire une dénaturation des molécules actives du milieu tels que les antibiotiques, les enzymes... De plus, même si la chaîne du froid est respectée, les milieux réactionnels doivent être généralement utilisés dans un délai de 2 à 4 mois suivant leur fabrication. Il est donc très important d'augmenter la stabilité des molécules actives présentes dans un milieu réactionnel. La présente invention se propose donc d'améliorer les milieux réactionnels permettant la détection de microorganismes actuellement commercialisés en diminuant leur coût de fabrication et en améliorant leur stabilité, de façon à allonger leur durée de conservation. De façon surprenante, les inventeurs ont montré que l'encapsulation de molécules active dans des cyclodextrines permettait de protéger ces molécules actives dans des milieux réactionnels, conférant une résistance des molécules actives à différents facteurs tels que la chaleur, l'agitation etc...
Les cyclodextrines ou cycloamyloses sont des molécules bien connues. Elles sont composées d'une cavité hydrophobe dans laquelle peuvent venir se loger des molécules hydrophobes, et d'une face externe hydrophile permettant au complexe cyclodextrine- molécule hydrophobe de se dissoudre dans les solvants aqueux. Grâce à cette cavité apolaire, les cyclodextrines sont capables de former des complexes d'inclusion en milieu aqueux avec une grande variété de molécules-hôtes hydrophobes. La résultante de cette complexation est la solubilisation de molécules hydrophobes très insolubles dans la phase aqueuse. Toutefois, ces molécules n'ont, à la connaissance des Demanderesses, jamais été décrite comme étant capable de protéger des molécules actives dans des milieux réactionnels à différents facteurs tels que la chaleur, l'agitation etc .. L'utilisation de complexes d'encapsulation molécule(s) active(s) / cyclodextrine(s) dans des milieux réactionnels permet ainsi d'accroître la stabilité de ces molécules actives et d'allonger la durée de vie de ces milieux réactionnels.
Avant d'aller plus avant dans la description de l'invention, les définitions ci dessous sont données afin de faciliter l'exposé de l'invention.
Par milieu réactionnel, on entend un milieu comprenant tous les éléments nécessaires à l'expression d'un métabolisme et/ou à la croissance de microorganismes. Le milieu réactionnel peut être solide, semi-solide ou liquide. Par milieu solide, on entend par exemple un milieu gélifié. L'agar est l'agent gélifiant traditionnel en microbiologie pour la culture des microorganismes, mais il est possible d'utiliser de la gélatine ou de l'agarose. Un certain nombre de préparation sont disponibles dans le commerce, comme par exemple l'agar Columbia, la gélose Trypcase-soja, la gélose Mac Conkey, la gélose Sabouraud ou plus généralement celles décrites dans le Handbook of Microbiological Media (CRC Press).
Le milieu réactionnel peut comprendre un ou plusieurs éléments en combinaison, tels que des acides aminés, des peptones, des hydrates de carbone, des nucléotides, des minéraux, des vitamines, des molécules actives telles que des antibiotiques, des enzymes, des tensioactifs, des tampons, des sels de phosphate, d'ammonium, de sodium, de métaux, un ou plusieurs substrats permettant la détection d'une activité enzymatique ou métabolique...
Le milieu peut comprendre également un colorant. A titre indicatif, on peut citer comme colorant le bleu d'Evans, du rouge neutre, du sang de mouton, du sang de cheval, un opacifiant tel que l'oxyde de Titane, de la nitroaniline, du vert malachite, du vert brillant...
Le milieu réactionnel peut être un milieu de révélation, ou un milieu de culture et de révélation. Dans le premier cas, la culture des microorganismes est effectuée avant ensemencement et, dans le deuxième cas, le milieu de détection et/ou d'identification constitue également le milieu de culture. Au sens de la présente invention, le terme microorganisme recouvre les bactéries, notamment à gram négatif et à gram positif, les levures, et plus généralement, les organismes généralement unicellulaires, invisibles à l'œil nu, qui peuvent être multipliés et manipulés en laboratoire. A titre de bactéries à Gram négatif, on peut citer les bactéries des genres suivants : Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, Campylobacter, Haemophilus, Morganella, Vibrio, Yersinia, Acinetobacter, Branhamella, Neisseria, Burkholderia, Citrobacter, Hafnia, Edwardsiella, Aeromonas, Moraxella, Pasteurella, Providentiel, Actinobacillus, Alcaligenes, Bordetella, Cedecea, Erwinia, Pantoea, Ralstonia, Stenotrophomonas, Xanthomonas et Legionella.
A titre de bactéries à Gram positif, on peut citer les bactéries des genres suivants : Enterococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Bacillus, Listeria, Clostridium, Gardnerella, Kocuria, Lactococcus, Leuconostoc, Micrococcus, Mycobacteria et Corynebacteria. A titre de levures, on peut citer les levures des genres suivants: Candida, Cryptococcus, Saccharomyces et Trichosporon.
Par molécule active, on entend une molécule qui produit un effet, tel qu'un pouvoir destructeur sur les microorganismes ou un effet catalyseur sur des réactions chimiques, et qui se dégrade au cours du temps, sous l'effet de la chaleur notamment. Par molécule active, on entend préférentiellement un antibiotique ou une enzyme.
Par antibiotique, on entend une substance chimique ayant un pouvoir destructeur sur les micro-organismes.
On peut citer notamment la famille des betalactamines, comprenant notamment les penams (tels que Pénicilline; Bipénicilline; Extencilline; Oracilline, Oxacilline; Cloxaciline; Ampicilline; Amoxicilline; Bacampicilline; Métampicilline; Pivampicilline; Azlocilline; Mezlocilline; Pipéracilline; Ticarcilline; Pivmécillinam; Oxapénam; Acide clavulanique; Sulbactam; Tazobactam); les penems (tel que l'imipénème) ; les cephems (tels que les céphalosporines de 1° génération (Céfalexine; Céfadroxil; céfaclor; Céfatrizine; Céfalotine; Céfapyrine; Céfazoline), les céphalosporines de 2° génération (Céfoxitine; Céfamandole; Céfotétan; Céfuroxime), les céphalosporines de 3° génération (Céfotaxime; Cefsulodine; Céfopérazone; Céfotiam; Ceftazidime; Ceftriaxone; Céfixime; Cefpodoxime; Latamoxef)); les monobactams tel que l'aztréonam).
On peut citer également la famille des fosfomycines; des glycopeptides (Vancomycine;
Teicoplanine) ; des polymycines (colistine); des gramicidines et tyrocidine (Bacitracine; Tyrothricine; des aminosides (Streptomycine; Tobramycine; Amikacine;
Sisomicine; Dibékacine; Nétilmicine); des macrolides (Spiramycine; Erythromycine;
Erythrocine; Josamycine; Roxithromycine; Clarithromycine; Azithromycine); des lincosamides (Lincomycine; Clindamycine); des synergistines (Virginiamycine;
Pristinamycine); des phenycoles (Chloramphénicol; Thiamphénicol); des tetracyclines (Tétracycline; Doxycycline; Minocycline); acide fusidique; des oxazolidinones
(Linézolide); des rifamycines (Rifamycine; Rifampicine); des quinolones (Acide nalidixique; Acide oxolinique; Acide pipémidique); des fluoroquinolones (Fluméquine;
Péfloxacine; Norfloxacine; Ofloxacine; Ciprofloxacine; Enoxacine; Levofloxacine;
Moxifloxacine); des oxyquinoleines (Nitroxoline; Tilboquinol); des nitrofuranes (Nitrofurantoïne; Nifuroxazide); des nitro-imidazoles (Métronidazole; Ornidazole); des sulfamides (Sulfadiazine; Sulfaméthisol), des trimethoprime (Triméthoprime).
Par enzyme, on entend une molécule de nature protéique catalysant les réactions biochimiques du métabolisme se déroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire.
On peut citer notamment les oxydoréductases (telles que les oxydases, réductases, peroxydases, oxygénases, hydrogénases, ou déshydrogénases.); transférases (telles que les kinases ; transaminases; mutases) ; hydrolases (telles que les estérases; peptidases ; osidases: glucosidases) ; lyases (telles que les décarboxylases, aldolases; déshydratases); isomérases (telles que les racémases; épimérases) ; ligases.
Préférentiellement, l'enzyme est une hydrolase, et encore plus préférentiellement une beta lactamase.
Par cyclodextrine, on entend une molécule de la famille d'oligosaccharides cycliques composés de sous unités glucopyranose liées en α-(l,4) et répondant à la formule brute
C42H70O35 ou à un dérivé de cette molécule, dans laquelle les groupements hydroxyles des unités glucopyranose peuvent être aminés, estérifiés ou éthérifiés. On peut citer notamment la beta-cyclodextrine (BCD), l'hydroxypropyl-beta-cyclodextrine (HPCD),la méthyl-beta-cyclodextrine (MCD), l'alpha-cyclodextrine (ACD), la gamma- cyclodextrine (GCD).
Préférentiellement, la cyclodextrine est choisie parmi une alpha-cyclodextrine, qui est préférentiellement la Cyclomaltohexaose (Référence bioCydex ACD NO ; No CAS 51211-54-9) ; une gamma-cyclodextrine, qui est préférentiellement la Cyclomaltooctaose (Référence bioCydex GCD NO ; No CAS 91464-90-3) ; une beta- cyclodextrine qui est préférentiellement une 2-O-méthyl-beta-cyclodextrine ou la randomly 2-O-méthyl-cyclomaltoheptaose (Référence bioCydex BCD C 15) ; ou préférentiellement une 2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrine encore appelée la randomly 2,3,6-O-(2-hydroxypropyl)-cyclomaltoheptaose ( Référence bioCydex BCD R59, No CAS 128449-35-5) ; ou préférentiellement une monopropanediamino-beta- cyclodextrine encore appelée la 6I-(3-amino-propylamino)-6I-desoxy- cyclomaltoheptaose (Référence bioCydex BCD A56). D'une manière générale, les cyclodextrines de la présente invention ont été fournies par la société BioCydex (Poitiers, France). A titre indicatif, la cyclomaltohexaose et la cyclomaltooctaose sont en vente chez Wacker Chemie; la cyclomaltoheptaose, la 2, O methyl- cyclomaltoheptaose et l'hydroxypropyl-beta-cyclodextrine sont en vente chez Roquette Frères et la monopropane-diamino-beta-cyclodextrine est en vente chez BioCydex. Par substrat permettant la détection d'une activité enzymatique ou métabolique, on entend toute molécule susceptible d'engendrer directement ou indirectement un signal détectable dû à une activité enzymatique ou métabolique du microorganisme. Lorsque cette activité est une activité enzymatique, on parle alors de substrat enzymatique. Par substrat enzymatique, on entend tout substrat pouvant être hydrolyse par une enzyme en un produit permettant la détection, directe ou indirecte d'un microorganisme. Ce substrat comprend notamment une première partie spécifique de l'activité enzymatique à révéler et une seconde partie faisant office de marqueur, ci- après appelée partie marqueur. Cette partie marqueur peut être chromogène, fluorogène, luminescente... Comme substrat chromogène, bien adapté aux supports solides (filtre, gélose, gel d'électrophorèse), on peut citer notamment les substrats à base d'indoxyl et ses dérivés, et les substrats à base d'hydroxyquinoline ou d'esculétine et leurs dérivés, qui permettent la détection d'activités osidase et estérase. A titre de substrats à base d'Indoxyl, on peut citer notamment 3-Indoxyl, 5-Bromo-3- indoxyl, 5-Iodo-3-indoxyl, 4-Chloro-3-indoxyl, 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl, 5- Bromo-6-chloro-3-indoxyl, 6-Bromo-3-indoxyl, 6-Chloro-3-indoxyl, 6-Fluoro-3- indoxyl, 5-Bromo-4-chloro-N-méthyl-3-indoxyl, N-Méthyl-3-indoxyl, ...).. On peut également citer les substrats dérivés de flavoides, tels que notamment le 3 ',4'- Dihydroxyflavone-4'-β-D-riboside, le 3',4'-Dihydroxyflavone-4'-β-D-galactoside, le 3',4'-Dihydroxyflavone-4'-β-D-glucoside, 3-Hydroxyflavone-β-D-galactoside, le 3- Hydroxyflavone-β-D-glucoside, 3 ' ,4 ' -Dihydroxyflavone-3 ' ,4' -diacétate. On peut citer également les substrats à base de nitrophénol (ortho-Nitrophénol, para- Nitrophénol, ...) et nitroaniline et dérivés, permettant de détecter les activités osidases et estérases dans le cas de substrats à base de nitrophénol, et des activités peptidases dans le cas de substrats à base de la nitroaniline.
On peut citer enfin les substrats à base de naphtol et naphtylamine et leurs dérivés, qui permettent de détecter les activités osidases et estérases par l'intermédiaire du naphtol, et les activités peptidases par l'intermédiaire de la naphtylamine. Ce substrat peut permettre notamment, mais d'une façon non limitative, la détection d'une activité enzymatique telle que l'activité d'une osidase, peptidase, estérase... On peut aussi citer les substrats à base de Coumarine et dérivés permettant aussi de détecter les activités osidases et estérases dans le cas de substrats à base d'hydroxycoumarines et notamment de la 4-Méthyl-umbelliférone ou de la Cyclohexenoesculétine, et des activités peptidases dans le cas de substrats à base d'aminocoumarines et notamment de la 7-Amino-4-méthyl-coumarine. On peut encore citer les substrats à base d'Aminophénol et dérivés permettant de détecter les activités osidases, estérases et peptidases. On peut citer également les substrats à base d'Alizarine et dérivés permettant de détecter les activités osidases et estérases. On peut citer enfin les substrats à base de Naphtol et Naphtylamine et leurs dérivés, qui permettent de détecter les activités osidases et estérases par l'intermédiaire du Naphtol, et les activités peptidases par l'intermédiaire de la Naphtylamine. Par substrat à base de Naphtol, on entend notamment les substrats à bases d'α-Naphtol, de β-Naphtol, de 6-Bromo-2-naphtol, de Naphtol AS BI, de Naphtol AS, de p- Naphtolbenzeine tel que définis dans la demande de brevet EP 1224196 de la demanderesse. Cela peut être des substrats d'osidase, d'estérase, de phosphatase, de sulfatase. Les substrats d'osidase sont notamment des substrats de N-Acétyl-β- hexosaminidase, de β-galactosidase, d'α-galacotosidase, de β-glucosidase, d'α- glucosidase, de β-glucuronidase, de β-cellobiosidase, d'α-mannosidase. Par substrat à base d'Alizarine, on entend notamment les substrats décrits dans le brevet EP1235928 de la demanderesse.
Le substrat enzymatique peut également être un substrat naturel dont le produit d'hydrolyse est détecté directement ou indirectement. Comme substrat naturel, on peut notamment citer le Tryptophane pour détecter une activité tryptophanase ou desaminase, un acide aminé cyclique (Tryptophane, Phénylalanine, Histidine, Tyrosine) pour détecter une activité desaminase, le Phosphatidyl Inositol pour détecter une activité phospholipase, ...
Lorsque cette activité est une activité métabolique, le substrat est alors un substrat métabolique, telle qu'une source de carbone ou d'azote, couplée à un indicateur produisant une coloration en présence de l'un des produits du métabolisme.
A titre indicatif, les substrats utilisés pour la détection d'une activité beta- glucuronidase peuvent notamment être le 4-Méthylumbelliféryl-beta-glucuronide, le 5- Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-glucuronide, le 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-beta- glucuronide, le 6-Chloro-3-indolyl-beta-glucuronide, l'Alizarine-beta-glucuronide, le Cyclo-hexeno-esculetine-beta-glucuronide ou leurs sels. A titre indicatif, les substrats utilisés pour la détection d'une activité beta-galactosidase peuvent notamment être le 4- Méthylumbelliféryl-beta-galactoside, le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-galactoside, le 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-beta-galactoside, le 6-Chloro-3-indolyl-beta- galactoside, l'Alizarine-beta-galactoside, le Cyclo-hexeno-esculetine-beta-galactoside ou leurs sels. Les substrats utilisés pour la détection d'une activité beta-glucosidase peuvent notamment être le 4-Méthylumbelliféryl-beta-Glucoside, le 5-Bromo-4-chloro- 3-indolyl-beta-Glucoside, le 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-beta-Glucoside, le 6-Chloro- 3-indolyl-beta-Glucoside, l'Alizarine-beta-Glucoside, le Cyclo-hexeno-esculetine-beta- Glucoside, le Nitrophényl-beta-glucoside, le Dichloroaminophényl-glucoside ou leurs sels. Par échantillon biologique, on entend un échantillon clinique, issu d'un prélèvement de liquide biologique, ou un échantillon alimentaire, issu de tout type d'aliment. Cet échantillon peut être ainsi liquide ou solide et on peut citer d'une manière non limitative, un échantillon clinique de sang, de plasma, d'urines, de fécès, de prélèvements de nez, de gorges, de peaux, de plaies, de liquide céphalo-rachidien, un échantillon alimentaire d'eau, de boissons tels que le lait, un jus de fruits; de yaourt, de viande, d'œufs, de légumes, de mayonnaise, de fromage ; de poisson..., un échantillon alimentaire issu d'une alimentation destinée aux animaux, tel que notamment un échantillon issu de farines animales.
A ce titre, l'invention concerne un milieu réactionnel pour l' identification/détection de microorganismes comprenant au moins une molécule active encapsulée dans une cyclodextrine.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la cyclodextrine est choisie parmi : une alpha-cyclodextrine, qui est préférentiellement la Cyclomaltohexaose (Référence bioCydex ACD NO; No CAS 51211-54-9) ; une gamma-cyclodextrine, qui est préférentiellement la Cyclomaltooctaose (Référence bioCydex GCD NO ; No CAS 91464-90-3) ; une beta-cyclodextrine qui est préférentiellement une 2-O-méthyl-beta- cyclodextrine ou la randomly 2-O-méthyl-cyclomaltoheptaose (Référence bioCydex BCD C 15) ; ou préférentiellement une 2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrine encore appelée la randomly 2,3,6-O-(2-hydroxypropyl)-cyclomaltoheptaose ( Référence bioCydex BCD R59 No CAS 128449-35-5) ; ou préférentiellement une monopropanediamino-beta-cyclodextrine encore appelée la 6I-(3-amino-propylamino)- ό^desoxy-cyclomaltoheptaose (Référence bioCydex BCD A56). Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la molécule active est un antibiotique. Préférentiellement, l'antibiotique est choisi parmi la famille des penams ou des cephams. Préférentiellement, l'antibiotique est la cefoxitine ou la cloxacilline. Bien évidement, le milieu réactionnel selon la présente invention peut comprendre un antibiotique ou plusieurs antibiotiques. L'homme du métier adaptera aisément la concentration en antibiotique selon l'effet recherché. Préférentiellement, la concentration en antibiotique est comprise 0,01 et 80 mg/1, préférentiellement entre 0,05 et 32 mg/1, encore plus préférentiellement entre 0,1 et 8 mg/1 et encore plus préférentiellement entre 0,25 et 6mg/l.
A titre indicatif, lorsque l'antibiotique est la cefotaxime, la concentration en cefotaxime dans le milieu est préférentiellement comprise entre 0,25 et 8 mg/1, préférentiellement entre 1 et 2 mg/1 ; lorsque l'antibiotique est la cefoxitine, la concentration en cefoxitine dans le milieu est préférentiellement comprise entre 0,1 et 8 mg/1 et encore plus préférentiellement entre 0,25 et 6mg/l ; lorsque l'antibiotique est la cloxacilline, la concentration en cloxacilline dans le milieu est préférentiellement comprise entre 0, 1 et 8 mg/1 et encore plus préférentiellement entre 0,25 et 6mg/l ; lorsque l'antibiotique est la ceftazidime, la concentration en ceftazidime dans le milieu est préférentiellement comprise entre 0,25 et 8 mg/1, préférentiellement entre 2 et 2,5 mg/1 ; lorsque l'antibiotique est la ceftriaxone, la concentration en ceftriaxone dans le milieu est préférentiellement comprise entre 0,25 et 8 mg/1, préférentiellement entre 1 et 2,5 mg/1 ; lorsque l'antibiotique est la cefpodoxime, la concentration en cefpodoxime dans le milieu est préférentiellement comprise entre 0,1 et 32 mg/1, préférentiellement entre 0,75 et 10 mg/1 et encore plus préférentiellement entre 1 et 6 mg/1. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la molécule active est une enzyme, préférentiellement la beta lactamase. L'homme du métier adaptera la concentration en enzyme selon l'effet recherché. Préférentiellement, la concentration en beta lactamase dans le milieu est préférentiellement comprise entre 50 et 500 UI/1, préférentiellement entre 100 et 150 UI/1.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le milieu réactionnel comprend au moins un substrat permettant la détection d'une activité enzymatique ou métabolique. Le milieu peut comprendre également une combinaison de substrats, selon les microorganismes que l'on souhaite identifier. L'homme du métier adaptera la concentration en substrat(s) selon le microorganisme que l'on souhaite identifier. Préférentiellement, la concentration en substrat est comprise entre 25 et 750 mg/1, préférentiellement entre 40 et 200 mg/1. A titre indicatif, lorsqu'on utilise le substrat 5- Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucoside permettant la détection d'une activité enzymatique beta-glucosidase, la concentration est préférentiellement à une concentration comprise entre 25 et 500mg/l, préférentiellement entre 40 et 150mg/l. A titre indicatif, lorsqu'on utilise le substrat, le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-N-acétyl-β- D-glucosaminide permettant la détection d'une activité enzymatique hexosaminidase, la concentration est préférentiellement à une concentration comprise entre 25 et 500 mg/1, préférentiellement entre 40 et 150 mg/1. A titre indicatif, lorsqu'on utilise le 5- Bromo-6-chloro-3-indolyl-phosphate permettant la détection d'une activité phosphatase, la concentration est préférentiellement à une concentration comprise entre 25 et 750 mg/1, préférentiellement entre 40 et 200 mg/1.
L'homme du métier peut également utiliser une biboite, permettant de comparer aisément deux milieux, comprenant différents substrats, sur lequel on aura déposé un même échantillon biologique.
Préférentiellement, ledit substrat permettant la détection d'une activité enzymatique ou métabolique est un substrat enzymatique, préférentiellement fluorescent ou chromogène.
Préférentiellement, l'activité enzymatique est choisie parmi les activités enzymatiques suivantes: osidase, estérase, peptidase, et encore plus préférentiellement, ladite même activité enzymatique est choisie parmi les activités enzymatiques suivantes : B-D- glucosidase, β-D-galactosidase, alpha-D-glucosidase, alpha-D-galactosidase, alpha- mannosidase, β-D-glucuronidase, N-Acetyl-β-D-hexosaminidase, β-D-cellobiosidase, estérase, phosphatase, phospholipase, sulfatase, peptidase. L'invention concerne également un procédé de détection et/ou d'identification de micro-organismes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes à : a) disposer d'un milieu réactionnel tel que défini ci avant, b) ensemencer le milieu avec un échantillon biologique à tester, c) laisser incuber, et d) détecter et/ou identifier les microorganismes
L'ensemencement des microorganismes peut être réalisé par toutes les techniques d'ensemencement connues de l'homme du métier. Une étape d'incubation peut être réalisée à une température pour laquelle l'activité enzymatique que l'on souhaite détecter est optimale, que l'homme du métier peut choisir aisément selon l'activité enzymatique à détecter. L'étape d) peut s'effectuer par un examen visuel, par colorimétrie ou fluorimétrie. L'invention concerne également l'utilisation du milieu réactionnel tel que décrit ci avant pour la détection et/ou l'identification de micro-organismes. L'invention concerne également l'utilisation de cyclodextrine(s) pour accroître la stabilité d'un milieu réactionnel. Grâce à une telle utilisation, il est possible de reculer la date de péremption du milieu réactionnel, et de conserver le milieu plus aisément.
Préférentiellement, la cyclodextrine utilisée est choisie parmi une alpha-cyclodextrine, qui est préférentiellement la Cyclomaltohexaose (Référence bioCydex ACD NO ; No CAS 51211-54-9) ; une gamma-cyclodextrine, qui est préférentiellement la Cyclomaltooctaose (Référence bioCydex GCD NO ; No CAS 91464-90-3) ; une beta- cyclodextrine qui est préférentiellement une 2-O-méthyl-beta-cyclodextrine ou la randomly 2-O-méthyl-cyclomaltoheptaose (Référence bioCydex BCD C 15) ; ou préférentiellement une 2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrine encore appelée la randomly 2,3,6-O-(2-hydroxypropyl)-cyclomaltoheptaose ( Référence bioCydex BCD R59 ; No CAS 128449-35-5) ; ou préférentiellement une monopropanediamino-beta- cyclodextrine encore appelée la 6I-(3-amino-propylamino)-6I-desoxy- cyclomaltoheptaose (Référence bioCydex BCD A56).
L'invention concerne également l'utilisation de cyclodextrine(s) pour protéger des molécules actives contre une dégradation physico-chimique en milieu réactionnel, telle que notamment la chaleur ou une agitation. Préférentiellement, la cyclodextrine utilisée est choisie parmi une alpha-cyclodextrine, qui est préférentiellement la Cyclomaltohexaose (Référence bioCydex ACD NO ; No CAS 51211-54-9) ; une gamma-cyclodextrine, qui est préférentiellement la Cyclomaltooctaose (Référence bioCydex GCD NO ; No CAS 91464-90-3) ; une beta-cyclodextrine qui est préférentiellement une 2-O-méthyl-beta-cyclodextrine ou la randomly 2-O-méthyl- cyclomaltoheptaose (Référence bioCydex BCD C 15) ; ou préférentiellement une 2- hydroxypropyl-beta-cyclodextrine encore appelée la randomly 2,3,6-O-(2- hydroxypropyl)-cyclomaltoheptaose ( Référence bioCydex BCD R59 ; No CAS 128449-35-5) ; ou préférentiellement une monopropanediamino-beta-cyclodextrine encore appelée la 6I-(3-amino-propylamino)-6I-desoxy-cyclomaltoheptaose (Référence bioCydex BCD A56). Les exemples ci dessous sont donnés à titre explicatif et n'ont aucun caractère limitatif. Ils permettront de mieux comprendre l'invention.
Les exemples ci dessous sont relatifs à la protection contre la dégradation de 3 molécules actives (deux antibiotiques, la cloxacilline et la céfoxitine, et une enzyme, la β-lactamase) grâce à leur encapsulation dans une cyclodextrine. Plusieurs cyclodextrines (ACD NO, GCD NO, BCD C 15, BCD R59, BCD A56) de la gamme SolvamaχR ont été testées pour leur capacité à ralentir la dégradation thermique de molécules actives. La stabilité a été évaluée par CLHP.
1. PROTECTION ET STABILISATION DE LA CLOXACILLINE La cloxacilline (Masse Moléculaire 475,88) est un antibiotique de type β-lactamine, utilisé pour inhiber la croissance de certaines espèces bactériennes telles que Enterobacter aerogenes ou Escherichia coli. Les cyclodextrines de la librairie de BioCydex ont été incubées avec la cloxacilline dans un rapport molaire 1 : 1 (concentration = 210,12 mM), à 200C pendant 72 h (agitation à l'abri de la lumière). La quantité de cloxacilline résiduelle a été ensuite analysée par HPLC.
Les essais suivants ont été réalisés en milieu aqueux et à température élevée (75°C) pour accélérer la vitesse de dégradation.
1.1 Criblage ex-situ
Le sel de sodium de la cloxacilline (Sigma, Réf. C 9393) présente une solubilité intrinsèque élevée en milieu aqueux (~100 g.L"1).
Les complexes ont été préparés à température ambiante avec des rapports molaires cloxacilline : cyclodextrine de 1: 16 et de 1 :79. Les solutions contenant 0,63 mM soit 300 mg.L"1 de cloxacilline ont été incubées à 75 0C pendant 31 h. L'analyse des échantillons et leur quantification pour évaluer la stabilité de l'antibiotique ont été réalisés sur une chaîne Thermo Finnigan SpectraSYSTEM HPLC System équipée avec une pompe P1000XR, un injecteur automatique AS3000, un détecteur UV1000 UV/Visible, une colonne Merck ChromolithR Performance RP-18 endcapped (100-4,6 mm) précédée par une colonne de garde Merck Chromolith® RP- 18e (5-4,6 mm). Les phases mobiles ont été préparées à partir d'acétonitrile grade-HPLC et d'eau acidifiée par de l'acide trifluoroacétique (lOOμL/L). Un gradient méthanol/eau de 0/100 à 100/0 a été appliqué en 12 min. Après stabilisation pendant 2 min la colonne est rééquilibrée dans les conditions initiales. La vitesse d'élution est de 1 mL/min, la température de 22°C et la détection réalisée à 220 nm. Le volume d'injection des échantillons est de 20 μL. Les données chromatographiques ont été traitées par le logiciel Atlas, version 2003.1 (Thermo Electron Corporation, U.K.). Les résultats sont présentés dans le tableau I :
Tableau I : Stabilité de la cloxacilline en présence de cyclodextrines à 75°C
Figure imgf000015_0001
Ces résultats démontrent l'effet protecteur des cyclodextrines BCD R59 et BCD C15 sur la cloxacilline. Ces résultats ont été confirmés dans les mêmes conditions expérimentales lorsque le rapport molaire cloxacilline : cyclodextrine était au minimum de 1 : 15. A ce titre, la figure 1 présente l'effet protecteur des cyclodextrines contre la dégradation de la cloxacilline par la chaleur (-CD : absence de cyclodextrine ; 1 : 1 à
1 : 125 : rapports molaires cloxacilline:CD). La cyclodextrine BCD C 15 présentait la meilleure protection a de faible rapport. Pour des rapports molaires supérieurs à 1:50, des performances similaires étaient observées pour les deux cyclodextrines.
Ces résultats montrent que la complexation de la cloxacilline à une cyclodextrine comme la BCD R59 ou BCD C15 confère à la molécule antibiotique une protection contre l'inactivation par un traitement thermique (3 Ih à 75°C) puisque 40% de la molécule native sont retrouvés après chauffage contre 0% lorsque la cloxacilline n'est pas associée à la cyclodextrine.
2. COMPLEXATION DE LA CEFOXITINE La cefoxitine est un antibiotique de la famille des β-lactamines, inhibiteur de la synthèse des mucopeptides de la paroi bactérienne. 2.1 Criblage ex-situ 0,444 mM de céfoxitine (Sigma, Réf. C4786-5G) et 8,88 mM de cyclodextrine (ACD NO ou GCD NO ou BCD R59 ou BCD C15), soit dans un rapport molaire de 1 :20, ont été dissous sous agitation pendant une heure à température ambiante. Le mélange était ensuite porté à 65°C pendant 90 min. L'intégrité de la céfoxitine était ensuite analysée par HPLC. L'analyse des échantillons et leur quantification ont été réalisés sur une chaîne Thermo Finnigan SpectraSYSTEM HPLC System équipée avec une pompe P1000XR, un injecteur automatique AS3000, un détecteur UV1000 UV/Visible, une colonne Merck Chromolith® Performance RP- 18 endcapped (100-4,6 mm) précédée par une colonne de garde Merck Chromolith® RP- 18e (5-4,6 mm). Les phases mobiles ont été préparées à partir d'acétonitrile grade-HPLC et d'eau acidifiée par de l'acide trifluoroacétique (lOOμL/L). Un gradient méthanol/eau de 0/100 à 100/0 a été appliqué en 12 min. Après stabilisation pendant 2 min la colonne est rééquilibrée dans les conditions initiales. La vitesse d'élution est de 1 mL/min, la température de 22°C et la détection réalisée à 254 nm. Le volume d'injection des échantillons est de 20 μL. Les données chromatographiques ont été traitées par le logiciel Atlas, version 2003.1 (Thermo Electron Corporation, U.K.). Les résultats sont présentés dans le tableau II :
Tableau II : Effet de différentes cyclodextrines sur la stabilité de la céfoxitine à
65°C
Figure imgf000016_0001
L'optimisation de la protection a été recherchée en faisant varier le rapport molaire céfoxitine:cyclodextrine (BCD R59 et BCD C15) de 1 : 1 à 1 :216, les autres conditions demeurant inchangées. A ce titre, la figure 2 présente l'effet protecteur de BCD R59 et de BCD C15 sur la céfoxitine en milieu aqueux. L'amélioration de la stabilité a été calculée par rapport au témoin sans cyclodextrine.
Pour des rapports molaires variant entre 1 :6 et 1 :30, la cyclodextrine BCD C15 était la plus efficace. Au-delà, les deux cyclodextrines étaient équivalentes. Un rapport molaire de 1 :50 était suffisant pour atteindre un degré de protection important à basse température. Dans ce cas, la stabilité de la céfoxitine après 90 min à 65°C est de 47,5% au lieu de 38,5% avec le témoin sans cyclodextrine.
Ces résultats démontrent que les cyclodextrines ACD NO, GCD NO, BCD R59 et BCD C15 protègent la céfoxitine d'une dénaturation par la chaleur puisque qu'en présence de BCD C 15, l'antibiotique complexé est environ 10% moins dégradé que la molécule seule.
3. PROTECTION DE LA BETA-LACTAMASE 3.1 Stabilité de la β-lactamase
La β-lactamase (Genzyme Biochemicals Réf. BELA-70-1431) en quantité équivalente à 0,375 U.mL"1 a été mélangée à la cyclodextrine BCD A56 de la gamme Protéosol® (1 ou 10 mM), à température ambiante et à l'abri de la lumière, pendant 30 min. Le mélange a été ensuite chauffé à 700C pendant 45 min. L'amoxicilline (Glaxo, Réf. 5003), 500 mg.L"1, révélatrice de l'activité de la β-lactamase, a été ensuite ajoutée à température ambiante. Après une incubation de 5 min à 25°C, l'amoxicilline résiduelle a été analysée par HPLC. Les profils obtenus sont présentés dans la figure 3, qui présente l'analyse HPLC de l'amoxicilline (A : témoin amoxicilline non traitée ; B : amoxicilline + β-lactamase non chauffée ; C : amoxicilline + β-lactamase chauffée ; D : amoxicilline + complexe β-lactamase : BCD A56 (1 mM) chauffé. TR amoxicilline = 5,5 min). Le pic de l'amoxicilline sortait à 5,5 min.
L'activité de la β-lactamase a été attestée par la diminution du pic de l' amoxicilline (Fig. 3B) par rapport au témoin amoxicilline seule (Fig. 3A) et par l'apparition de produits d'hydrolyse caractérisés par un massif à des temps de rétention plus faibles. Lorsque la β-lactamase était dégradée par chauffage, elle perdait une partie de son activité, ce qui se traduisait par une meilleure stabilité de l'arnoxicilline (Fig. 3C). Le même traitement thermique en présence de cyclodextrine (Fig. 3D) permettait de conserver une activité de la β-lactamase identique à celle du témoin amoxicilline-β- lactamase non chauffée (Fig. 3B). A partir des profils ci-dessus, il a été possible de quantifier la concentration de l'arnoxicilline et lier cette valeur à l'activité de la β-lactamase. Les résultats sont présentés dans le tableau III.
Tableau III: Influence de BCD A56 sur la résistance de la β-lactamase à la dégradation thermique
Figure imgf000018_0001
En prenant comme référence la situation en absence de cyclodextrine, on concluait à une excellente protection de la β-lactamase en présence de BCD A56 à 10 mM et que, de plus, cette cyclodextrine n'interagissait pas avec le site actif de l'enzyme.
Ces résultats démontrent que la beta-lactamase associée à la cyclodextrine conserve toute son activité enzymatique même après chauffage à 700C pendant 45 minutes puisqu'elle reste capable de dégrader complètement l' amoxicilline, substrat de l'enzyme, contrairement à la protéine non complexée. La cyclodextrine protège donc l'enzyme et son site actif d'une dénaturation par un traitement thermique.
5. Milieu réactionnel :
Deux milieux réactionnels ont été fabriqués à partir d'un milieu ChromlD™ MRSA, l'un avec de la céfoxitine et l'autre contenant un complexe cyclodextrine BCD Cl 5 + céfoxitine. Ce dernier étant obtenu en solubilisant la céfoxitine et la cyclodextrine dans de l'eau osmosée puis en agitant la solution à température ambiante et à l'abri de la lumière. Le mélange est ensuite filtré avant d'être incorporé dans la gélose. Les milieux sont stockés à 2-8 0C pendant 19 semaines et les performances (croissance des MRSA : Staphylococcus aureus Résistants à la Méticilline, inhibition des MSSA : Staphylococcus aureus Sensibles à la Méticilline) sont évaluées toutes les semaines comparativement à un milieu commercialisé prêt à l'emploi. La protection de la céfoxitine par la cyclodextrine est mesurée en comparant l'inhibition de croissance des MSSA (céfoxitine active) au cours du temps sur les milieux avec et sans cyclodextrine BCD C 15.
Les souches de MRSA et MSSA sont ensemencées sur les milieux selon la méthode en trois cadrans puis les boîtes sont incubées 48 h à 37°C.
La croissance des souches (présence de colonies sur la boîte) ainsi que la couleur des colonies après 24 et 48 h d'incubation sont observées. Les résultats sont présentés dans le tableau ci-dessous :
Figure imgf000019_0001
Légende :
+ : croissance
- : absence de croissance
(N) : nombre de souches qui poussent/nombre de souches testées
V : vert
Comme attendu à T=O, les souches MRSA se développent en formant des colonies vertes alors que les souches de MSSA sont correctement inhibées. La présence de cyclodextrines est compatible avec une utilisation en milieu de culture.

Claims

REVENDICATIONS
1. Milieu réactionnel pour l' identification/détection de microorganismes comprenant au moins une molécule active encapsulée dans une cyclodextrine.
2. Milieu réactionnel selon la revendication 1 caractérisé en ce que la cyclodextrine est choisie parmi : une alpha-cyclodextrine ; une gamma-cyclodextrine ; une beta- cyclodextrine : une 2-0-méthyl-beta-cyclodextrine ; une 2-hydroxypropyl-beta- cyclodextrine ; une monopropanediamino-beta-cyclodextrine.
3. Milieu réactionnel selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que la molécule active est un antibiotique.
4. Milieu réactionnel selon la revendication 3 caractérisé en ce que l'antibiotique est choisi parmi la famille des penams ou des cephams.
5. Milieu réactionnel selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que la molécule active est une enzyme, préférentiellement une hydrolase et encore plus préférentiellement une beta lactamase.
6. Milieu réactionnel selon la revendication 1 a 5 caractérisé en ce qu'il comprend au moins un substrat permettant la détection d'une activité enzymatique ou métabolique.
7. Milieu réactionnel selon la revendication 6 caractérisé en ce que ledit substrat permettant la détection d'une activité enzymatique ou métabolique est un substrat enzymatique, préférentiellement fluorescent ou chromogène.
8. Procédé de détection et/ou d'identification de micro-organismes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes à : a) disposer d'un milieu réactionnel selon l'une quelconque des revendications
1 à 7, b) ensemencer le milieu avec un échantillon biologique à tester, c) laisser incuber, et d) détecter et/ou identifier les microorganismes.
9. Utilisation du milieu réactionnel selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 pour la détection et/ou l'identification de micro-organismes.
10. Utilisation de cyclodextrine(s) pour accroître la stabilité d'un milieu réactionnel.
11. Utilisation de cyclodextrine(s) pour protéger des molécules actives contre une dégradation physico-chimique en milieu réactionnel.
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