FR2915492A1 - Milieu reactionnel pour l'identification / detection de microorganismes - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un milieu réactionnel pour l'identification/détection de microorganismes comprenant au moins une molécule active encapsulée dans une cyclodextrine.

Description

1 Le domaine de l'invention est celui de la détection et de

l'identification de microorganismes, tels que notamment de bactéries ou de levures par ensemencement de milieux réactionnels.

Il existe actuellement de très nombreux milieux réactionnels permettant la détection de microorganismes. Cette détection peut être basée notamment sur l'utilisation de substrats particuliers, spécifiques d'une enzyme du microorganisme que l'on souhaite détecter. Ainsi, dans le cas de bactéries, les souches d'Escherichia coli sont souvent mises en évidence par la révélation d'une activité enzymatique du type osidase telle que l'activité beta-glucuronidase ou beta-galactosidase. De la même façon, le genre Listeria peut être détecté par la mise en évidence d'une activité betaglucosidase. Une activité aminopeptidase peut également être utilisée pour révéler un groupe, un genre ou une espèce de bactéries. Ainsi, l'activité alanine-aminopeptidase, par exemple, permet de différencier les bactéries à Gram négatif des bactéries à Gram positif. Enfin, on peut citer également la détection d'une activité estérase pour notamment la mise en évidence du genre Salmonella. Outre l'utilisation de substrats particuliers, l'identification d'un microorganisme ou d'un groupe de microorganismes grâce aux milieux réactionnels, peut reposer sur la résistance d'un microorganisme à un traitement thérapeutique. Le milieu comprend alors généralement une ou plusieurs molécules dites actives, tel que notamment des antibiotiques contre lequel le microorganisme est susceptible d'être résistant. Il existe enfin des milieux dédiés au contrôle d'environnement tel que le contrôle de surface, permettant de détecter la présence de microorganismes sur une paillasse de laboratoire par exemple. Pour détecter la présence de microorganismes dans un laboratoire de fabrication d'antibiotiques, il est possible d'utiliser un milieu comprenant une molécule active telle que la beta lactamase afin d'inhiber l'action des antibiotiques résiduels qui pourraient être présents sur la paillasse, et ainsi permettre la croissance et l'identification des éventuels microorganismes. Toutefois, le maintien de molécules actives en solution est conditionné par leur stabilité 30 dans des milieux complexes ou à de très fortes dilutions. Elles peuvent être rapidement dénaturées en fonction des conditions physico-chimiques ou dégradées sous l'action 2 d'enzymes. La (3-lactamase par exemple est sensible à la dénaturation thermique (6070 C). Les antibiotiques sont également sensibles a la chaleur. Pour pallier cette dégradation au cours du temps, la concentration initiale en molécule active doit être très importante, ce qui pose un problème de coût de fabrication. La conservation de milieux comprenant de telles molécules actives reste un problème majeur dans ce domaine d'activité : ils ne peuvent généralement pas être conservés à température ambiante, car une exposition prolongée à la chaleur peut induire une dénaturation des molécules actives du milieu tels que les antibiotiques, les enzymes... De plus, même si la chaîne du froid est respectée, les milieux réactionnels doivent être généralement utilisés dans un l0 délai de 2 à 4 mois suivant leur fabrication. Il est donc très important d'augmenter la stabilité des molécules actives présentes dans un milieu réactionnel. La présente invention se propose donc d'améliorer les milieux réactionnels permettant la détection de microorganismes actuellement commercialisés en diminuant leur coût de fabrication et en améliorant leur stabilité, de façon à allonger leur durée de 15 conservation. De façon surprenante, les inventeurs ont montré que l'encapsulation de molécules active dans des cyclodextrines permettait de protéger ces molécules actives dans des milieux réactionnels, conférant une résistance des molécules actives à différents facteurs tels que la chaleur, l'agitation etc... 20 Les cyclodextrines ou cycloamyloses sont des molécules bien connues. Elles sont composées d'une cavité hydrophobe dans laquelle peuvent venir se loger des molécules hydrophobes, et d'une face externe hydrophile permettant au complexe cyclodextrinemolécule hydrophobe de se dissoudre dans les solvants aqueux. Grâce à cette cavité apolaire, les cyclodextrines sont capables de former des complexes d'inclusion en milieu 25 aqueux avec une grande variété de moléculeshôtes hydrophobes. La résultante de cette complexation est la solubilisation de molécules hydrophobes très insolubles dans la phase aqueuse. Toutefois, ces molécules n'ont, à la connaissance des Demanderesses, jamais été décrite comme étant capable de protéger des molécules actives dans des milieux réactionnels à différents facteurs tels que la chaleur, l'agitation etc... 30 L'utilisation de complexes d'encapsulation molécule(s) active(s) / cyclodextrine(s) dans 3 des milieux réactionnels permet ainsi d'accroître la stabilité de ces molécules actives et d'allonger la durée de vie de ces milieux réactionnels.

Avant d'aller plus avant dans la description de l'invention, les définitions ci dessous 5 sont données afin de faciliter l'exposé de l'invention. Par milieu réactionnel, on entend un milieu comprenant tous les éléments nécessaires à l'expression d'un métabolisme et/ou à la croissance de microorganismes. Le milieu réactionnel peut être solide, semi-solide ou liquide. Par milieu solide, on entend par exemple un milieu gélifié. L'agar est l'agent gélifiant traditionnel en microbiologie l0 pour la culture des microorganismes, mais il est possible d'utiliser de la gélatine ou de l'agarose. Un certain nombre de préparation sont disponibles dans le commerce, comme par exemple l'agar Columbia, la gélose Trypcase-soja, la gélose Mac Conkey, la gélose Sabouraud ou plus généralement celles décrites dans le Handbook of Microbiological Media (CRC Press). 15 Le milieu réactionnel peut comprendre un ou plusieurs éléments en combinaison, tels que des acides aminés, des peptones, des hydrates de carbone, des nucléotides, des minéraux, des vitamines, des molécules actives telles que des antibiotiques, des enzymes, des tensioactifs, des tampons, des sels de phosphate, d'ammonium, de sodium, de métaux, un ou plusieurs substrats permettant la détection d'une activité 20 enzymatique ou métabolique... Le milieu peut comprendre également un colorant. A titre indicatif, on peut citer comme colorant le bleu d'Evans, du rouge neutre, du sang de mouton, du sang de cheval, un opacifiant tel que l'oxyde de Titane, de la nitroaniline, du vert malachite, du vert brillant... 25 Le milieu réactionnel peut être un milieu de révélation, ou un milieu de culture et de révélation. Dans le premier cas, la culture des microorganismes est effectuée avant ensemencement et, dans le deuxième cas, le milieu de détection et/ou d'identification constitue également le milieu de culture. Au sens de la présente invention, le terme microorganisme recouvre les bactéries, 30 notamment à gram négatif et à gram positif, les levures, et plus généralement, les 4 organismes généralement unicellulaires, invisibles à l'oeil nu, qui peuvent être multipliés et manipulés en laboratoire. A titre de bactéries à Gram négatif, on peut citer les bactéries des genres suivants : Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, Campylobacter, Haemophilus, Morganella, Vibrio, Yersinia, Acinetobacter, Branhamella, Neisseria, Burkholderia, Citrobacter, Hafnia, Edwardsiella, Aeromonas, Moraxella, Pasteurella, Providencia, Actinobacillus, Alcaligenes, Bordetella, Cedecea, Erwinia, Pantoea, Ralstonia, Stenotrophomonas, Xanthomonas et Legionella. A titre de bactéries à Gram positif, on peut citer les bactéries des genres suivants Enterococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Bacillus, Listeria, Clostridium, Gardnerella, Kocuria, Lactococcus, Leuconostoc, Micrococcus, Mycobacteria et Corynebacteria. A titre de levures, on peut citer les levures des genres suivants: Candida, Cryptococcus, Saccharomyces et Trichosporon.

Par molécule active, on entend une molécule qui produit un effet, tel qu'un pouvoir destructeur sur les microorganismes ou un effet catalyseur sur des réactions chimiques, et qui se dégrade au cours du temps, sous l'effet de la chaleur notamment. Par molécule active, on entend préférentiellement un antibiotique ou une enzyme. Par antibiotique, on entend une substance chimique ayant un pouvoir destructeur sur les micro-organismes. On peut citer notamment la famille des betalactamines, comprenant notamment les penams (tels que Pénicilline; Bipénicilline; Extencilline; Oracilline, Oxacilline; Cloxaciline; Ampicilline; Amoxicilline; Bacampicilline; Métampicilline; Pivampicilline; Azlocilline; Mezlocilline; Pipéracilline; Ticarcilline; Pivmécillinam; Oxapénam; Acide clavulanique; Sulbactam; Tazobactam); les penems (tel que l'imipénème) ; les cephems (tels que les céphalosporines de 1 génération (Céfalexine; Céfadroxil; céfaclor; Céfatrizine; Céfalotine; Céfapyrine; Céfazoline), les céphalosporines de 2 génération (Céfoxitine; Céfamandole; Céfotétan; Céfuroxime), les céphalosporines de 3 génération (Céfotaxime; Cefsulodine; Céfopérazone; Céfotiam; Ceftazidime; Ceftriaxone; Céfixime; Cefpodoxime; Latamoxef)); les monobactams tel que l'aztréonam).

On peut citer également la famille des fosfomycines; des glycopeptides (Vancomycine; Teicoplanine) ; des polymycines (colistine); des gramicidines et tyrocidine (Bacitracine; Tyrothricine; des aminosides (Streptomycine; Tobramycine; Amikacine; Sisomicine; Dibékacine; Nétilmicine); des macrolides (Spiramycine; Erythromycine; 5 Erythrocine; Josamycine; Roxithromycine; Clarithromycine; Azithromycine); des lincosamides (Lincomycine; Clindamycine); des synergistines (Virginiamycine; Pristinamycine); des phenycoles (Chloramphénicol; Thiamphénicol); des tetracyclines (Tétracycline; Doxycycline; Minocycline); acide fusidique; des oxazolidinones (Linézolide); des rifamycines (Rifamycine; Rifampicine); des quinolones (Acide l0 nalidixique; Acide oxolinique; Acide pipémidique); des fluoroquinolones (Fluméquine; Péfloxacine; Norfloxacine; Ofloxacine; Ciprofloxacine; Enoxacine; Levofloxacine; Moxifloxacine); des oxyquinoleines (Nitroxoline; Tilboquinol); des nitrofuranes (Nitrofurantoïne; Nifuroxazide); des nitro-imidazoles (Métronidazole; Ornidazole); des sulfamides (Sulfadiazine; Sulfaméthisol), des trimethoprime (Triméthoprime). 15 Par enzyme, on entend une molécule de nature protéique catalysant les réactions biochimiques du métabolisme se déroulant dans le milieu cellulaire ou extracellulaire. On peut citer notamment les oxydoréductases (telles que les oxydases, réductases, peroxydases, oxygénases, hydrogénases, ou déshydrogénases.); transférases (telles que les kinases ; transaminases; mutases) ; hydrolases (telles que les estérases; peptidases ; 20 osidases: glucosidases) ; lyases (telles que les décarboxylases, aldolases; déshydratases); isomérases (telles que les racémases; épimérases) ; ligases. Préférentiellement, l'enzyme est une hydrolase, et encore plus préférentiellement une beta lactamase. Par cyclodextrine, on entend une molécule de la famille d'oligosaccharides cycliques 25 composés de sous unités glucopyranose liées en a-(1,4) et répondant à la formule brute C42H70O35 ou à un dérivé de cette molécule, dans laquelle les groupements hydroxyles des unités glucopyranose peuvent être aminés, estérifiés ou éthérifiés. On peut citer notamment la beta-cyclodextrine (BCD), l'hydroxypropyl-beta-cyclodextrine (HPCD),la méthyl-beta-cyclodextrine (MCD), l'alpha-cyclodextrine (ACD), la gammacyclodextrine (GCD). 6 Préférentiellement, la cyclodextrine est choisie parmi une alpha-cyclodextrine, qui est préférentiellement la Cyclomaltohexaose (Référence bioCydex ACD NO ; No CAS 51211-54-9) ; une gamma-cyclodextrine, qui est préférentiellement la Cyclomaltooctaose (Référence bioCydex GCD NO ; No CAS 91464-90-3) ; une beta- cyclodextrine qui est préférentiellement une 2-0-méthyl-beta-cyclodextrine ou la randomly 2-0-méthyl-cyclomaltoheptaose (Référence bioCydex BCD C15) ; ou préférentiellement une 2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrine encore appelée la randomly 2,3,6-0-(2-hydroxypropyl)-cyclomaltoheptaose ( Référence bioCydex BCD R59, No CAS 128449-35-5) ; ou préférentiellement une monopropanediamino-beta- cyclodextrine encore appelée la 61-(3-amino-propylamino)-6i-desoxycyclomaltoheptaose (Référence bioCydex BCD A56). D'une manière générale, les cyclodextrines de la présente invention ont été fournies par la société BioCydex (Poitiers, France). A titre indicatif, la cyclomaltohexaose et la cyclomaltooctaose sont en vente chez Wacker Chemie; la cyclomaltoheptaose, la 2, 0 methyl-cyclomaltoheptaose et l'hydroxypropyl-beta-cyclodextrine sont en vente chez Roquette Frères et la monopropane-diamino-beta-cyclodextrine est en vente chez BioCydex. Par substrat permettant la détection d'une activité enzymatique ou métabolique, on entend toute molécule susceptible d'engendrer directement ou indirectement un signal détectable dû à une activité enzymatique ou métabolique du microorganisme.

Lorsque cette activité est une activité enzymatique, on parle alors de substrat enzymatique. Par substrat enzymatique, on entend tout substrat pouvant être hydrolysé par une enzyme en un produit permettant la détection, directe ou indirecte d'un microorganisme. Ce substrat comprend notamment une première partie spécifique de l'activité enzymatique à révéler et une seconde partie faisant office de marqueur, ci- après appelée partie marqueur. Cette partie marqueur peut être chromogène, fluorogène, luminescente... Comme substrat chromogène, bien adapté aux supports solides (filtre, gélose, gel d'électrophorèse), on peut citer notamment les substrats à base d'indoxyl et ses dérivés, et les substrats à base d'hydroxyquinoline ou d'esculétine et leurs dérivés, qui permettent la détection d'activités osidase et estérase.

A titre de substrats à base d'Indoxyl, on peut citer notamment 3-Indoxyl, 5-Bromo-3-indoxyl, 5-Iodo-3-indoxyl, 4-Chloro-3-indoxyl, 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl, 5- 7 Bromo-6-chloro-3-indoxyl, 6-Bromo-3-indoxyl, 6-Chloro-3-indoxyl, 6-Fluoro-3-indoxyl, 5-Bromo-4-chloro-N-méthyl-3-indoxyl, N-Méthyl-3-indoxyl, ...).. On peut également citer les substrats dérivés de flavoides, tels que notamment le 3',4'-Dihydroxyflavone-4'-B-D-riboside, le 3',4'-Dihydroxyflavone-4'-B-D-galactoside, le 3',4'-Dihydroxyflavone-4'-B-D-glucoside, 3-Hydroxyflavone-B-D-galactoside, le 3-Hydroxyflavone-B-D-glucoside, 3' ,4 ' -Dihydroxyflavone-3 ' ,4 ' -diacétate. On peut citer également les substrats à base de nitrophénol (ortho-Nitrophénol, para-Nitrophénol, ...) et nitroaniline et dérivés, permettant de détecter les activités osidases et estérases dans le cas de substrats à base de nitrophénol, et des activités peptidases dans le cas de substrats à base de la nitroaniline. On peut citer enfin les substrats à base de naphtol et naphtylamine et leurs dérivés, qui permettent de détecter les activités osidases et estérases par l'intermédiaire du naphtol, et les activités peptidases par l'intermédiaire de la naphtylamine. Ce substrat peut permettre notamment, mais d'une façon non limitative, la détection d'une activité enzymatique telle que l'activité d'une osidase, peptidase, estérase... On peut aussi citer les substrats à base de Coumarine et dérivés permettant aussi de détecter les activités osidases et estérases dans le cas de substrats à base d'hydroxycoumarines et notamment de la 4-Méthyl-umbelliférone ou de la Cyclohexenoesculétine, et des activités peptidases dans le cas de substrats à base d' aminocoumarines et notamment de la 7-Amino-4-méthyl-coumarine. On peut encore citer les substrats à base d'Aminophénol et dérivés permettant de détecter les activités osidases, estérases et peptidases. On peut citer également les substrats à base d'Alizarine et dérivés permettant de détecter les activités osidases et estérases. On peut citer enfin les substrats à base de Naphtol et Naphtylamine et leurs dérivés, qui permettent de détecter les activités osidases et estérases par l'intermédiaire du Naphtol, et les activités peptidases par l'intermédiaire de la Naphtylamine. Par substrat à base de Naphtol, on entend notamment les substrats à bases d'a-Naphtol, de B-Naphtol, de 6-Bromo-2-naphtol, de Naphtol AS BI, de Naphtol AS, de p-Naphtolbenzeine tel que définis dans la demande de brevet EP1224196 de la demanderesse. Cela peut être des substrats d'osidase, d'estérase, de phosphatase, de sulfatase. Les substrats d'osidase sont notamment des substrats de N-Acétyl-B- 8 hexosaminidase, de B-galactosidase, d'a-galacotosidase, de B-glucosidase, d'aglucosidase, de B-glucuronidase, de B-cellobiosidase, d'a-mannosidase. Par substrat à base d'Alizarine, on entend notamment les substrats décrits dans le brevet EP1235928 de la demanderesse.

Le substrat enzymatique peut également être un substrat naturel dont le produit d'hydrolyse est détecté directement ou indirectement. Comme substrat naturel, on peut notamment citer le Tryptophane pour détecter une activité tryptophanase ou desaminase, un acide aminé cyclique (Tryptophane, Phénylalanine, Histidine, Tyrosine) pour détecter une activité désaminase, le Phosphatidyl Inositol pour détecter une activité phospholipase, .. . Lorsque cette activité est une activité métabolique, le substrat est alors un substrat métabolique, telle qu'une source de carbone ou d'azote, couplée à un indicateur produisant une coloration en présence de l'un des produits du métabolisme. A titre indicatif, les substrats utilisés pour la détection d'une activité beta- glucuronidase peuvent notamment être le 4-Méthylumbelliféryl-beta-glucuronide, le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-glucuronide, le 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-betaglucuronide, le 6-Chloro-3-indolyl-beta-glucuronide, l'Alizarine-beta-glucuronide, le Cyclo-hexeno-esculetine-beta-glucuronide ou leurs sels. A titre indicatif, les substrats utilisés pour la détection d'une activité betagalactosidase peuvent notamment être le 4Méthylumbelliféryl-beta-galactoside, le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-galactoside, le 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-beta-galactoside, le 6-Chloro-3-indolyl-betagalactoside, l'Alizarine-beta-galactoside, le Cyclo-hexeno-esculetine-beta-galactoside ou leurs sels. Les substrats utilisés pour la détection d'une activité beta-glucosidase peuvent notamment être le 4-Méthylumbelliféryl-beta-Glucoside, le 5-Bromo-4-chloro- 3-indolyl-beta-Glucoside, le 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-beta-Glucoside, le 6-Chloro-3-indolyl-beta-Glucoside, l'Alizarine-beta-Glucoside, le Cyclo-hexeno-esculetine-beta-Glucoside, le Nitrophényl-beta-glucoside, le Dichloroaminophényl-glucoside ou leurs sels. Par échantillon biologique, on entend un échantillon clinique, issu d'un prélèvement de 30 liquide biologique, ou un échantillon alimentaire, issu de tout type d'aliment. Cet échantillon peut être ainsi liquide ou solide et on peut citer d'une manière non 9 limitative, un échantillon clinique de sang, de plasma, d'urines, de fécès, de prélèvements de nez, de gorges, de peaux, de plaies, de liquide céphalo-rachidien, un échantillon alimentaire d'eau, de boissons tels que le lait, un jus de fruits; de yaourt, de viande, d'oeufs, de légumes, de mayonnaise, de fromage ; de poisson..., un échantillon alimentaire issu d'une alimentation destinée aux animaux, tel que notamment un échantillon issu de farines animales.

A ce titre, l'invention concerne un milieu réactionnel pour l'identification/détection de microorganismes comprenant au moins une molécule active encapsulée dans une 10 cyclodextrine. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la cyclodextrine est choisie parmi : une alpha-cyclodextrine, qui est préférentiellement la Cyclomaltohexaose (Référence bioCydex ACD NO; No CAS 51211-54-9) ; une gamma-cyclodextrine, qui est préférentiellement la Cyclomaltooctaose (Référence bioCydex GCD NO ; No CAS 15 91464-90-3) ; une beta-cyclodextrine qui est préférentiellement une 2-0-méthyl-betacyclodextrine ou la randomly 2-0-méthyl-cyclomaltoheptaose (Référence bioCydex BCD C15) ; ou préférentiellement une 2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrine encore appelée la randomly 2,3,6-0-(2-hydroxypropyl)-cyclomaltoheptaose ( Référence bioCydex BCD R59 No CAS 128449-35-5) ; ou préférentiellement une 20 monopropanediamino-beta-cyclodextrine encore appelée la 61-(3-amino-propylamino)-61-desoxy-cyclomaltoheptaose (Référence bioCydex BCD A56). Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la molécule active est un antibiotique. Préférentiellement, l'antibiotique est choisi parmi la famille des penams ou des cephams. Préférentiellement, l'antibiotique est la cefoxitine ou la cloxacilline. 25 Bien évidement, le milieu réactionnel selon la présente invention peut comprendre un antibiotique ou plusieurs antibiotiques. L'homme du métier adaptera aisément la concentration en antibiotique selon l'effet recherché. Préférentiellement, la concentration en antibiotique est comprise 0,01 et 80 mg/1, préférentiellement entre 0,05 et 32 mg/1, encore plus préférentiellement entre 0,1 et 8 mg/1 et encore plus 30 préférentiellement entre 0,25 et 6mg/l. 10 A titre indicatif, lorsque l'antibiotique est la cefotaxime, la concentration en cefotaxime dans le milieu est préférentiellement comprise entre 0,25 et 8 mg/1, préférentiellement entre 1 et 2 mg/1; lorsque l'antibiotique est la cefoxitine, la concentration en cefoxitine dans le milieu est préférentiellement comprise entre 0,1 et 8 mg/1 et encore plus préférentiellement entre 0,25 et 6mg/1; lorsque l'antibiotique est la cloxacilline, la concentration en cloxacilline dans le milieu est préférentiellement comprise entre 0,1 et 8 mg/1 et encore plus préférentiellement entre 0,25 et 6mg/1; lorsque l'antibiotique est la ceftazidime, la concentration en ceftazidime dans le milieu est préférentiellement comprise entre 0,25 et 8 mg/1, préférentiellement entre 2 et 2,5 mg/1; lorsque l0 l'antibiotique est la ceftriaxone, la concentration en ceftriaxone dans le milieu est préférentiellement comprise entre 0,25 et 8 mg/1, préférentiellement entre 1 et 2,5 mg/1; lorsque l'antibiotique est la cefpodoxime, la concentration en cefpodoxime dans le milieu est préférentiellement comprise entre 0,1 et 32 mg/1, préférentiellement entre 0,75 et 10 mg/1 et encore plus préférentiellement entre 1 et 6 mg/1. 15 Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la molécule active est une enzyme, préférentiellement la beta lactamase. L'homme du métier adaptera la concentration en enzyme selon l'effet recherché. Préférentiellement, la concentration en beta lactamase dans le milieu est préférentiellement comprise entre 50 et 500 UI/l, préférentiellement entre 100 et 150 UI/l. 20 Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le milieu réactionnel comprend au moins un substrat permettant la détection d'une activité enzymatique ou métabolique. Le milieu peut comprendre également une combinaison de substrats, selon les microorganismes que l'on souhaite identifier. L'homme du métier adaptera la concentration en substrat(s) selon le microorganisme que l'on souhaite identifier. 25 Préférentiellement, la concentration en substrat est comprise entre 25 et 750 mg/1, préférentiellement entre 40 et 200 mg/1. A titre indicatif, lorsqu'on utilise le substrat 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-B-D-glucoside permettant la détection d'une activité enzymatique beta-glucosidase, la concentration est préférentiellement à une concentration comprise entre 25 et 500mg/1, préférentiellement entre 40 et 150mg/1. A 30 titre indicatif, lorsqu'on utilise le substrat, le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-N-acétyl-BD-glucosaminide permettant la détection d'une activité enzymatique hexosaminidase, 11 la concentration est préférentiellement à une concentration comprise entre 25 et 500 mg/1, préférentiellement entre 40 et 150 mg/l. A titre indicatif, lorsqu'on utilise le 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-phosphate permettant la détection d'une activité phosphatase, la concentration est préférentiellement à une concentration comprise entre 25 et 750 mg/1, préférentiellement entre 40 et 200 mg/1. L'homme du métier peut également utiliser une biboite, permettant de comparer aisément deux milieux, comprenant différents substrats, sur lequel on aura déposé un même échantillon biologique. Préférentiellement, ledit substrat permettant la détection d'une activité enzymatique ou l0 métabolique est un substrat enzymatique, préférentiellement fluorescent ou chromogène. Préférentiellement, l'activité enzymatique est choisie parmi les activités enzymatiques suivantes: osidase, estérase, peptidase, et encore plus préférentiellement, ladite même activité enzymatique est choisie parmi les activités enzymatiques suivantes : B-D- 15 glucosidase, B-D-galactosidase, alpha-D-glucosidase, alpha-D-galactosidase, alphamannosidase, B-D-glucuronidase, N-Acetyl-B-D-hexosaminidase, B-D-cellobiosidase, estérase, phosphatase, phospholipase, sulfatase, peptidase. L'invention concerne également un procédé de détection et/ou d'identification de micro-organismes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes à : 20 a) disposer d'un milieu réactionnel tel que défini ci avant, b) ensemencer le milieu avec un échantillon biologique à tester, c) laisser incuber, et d) détecter et/ou identifier les microorganismes L'ensemencement des microorganismes peut être réalisé par toutes les techniques 25 d'ensemencement connues de l'homme du métier. Une étape d'incubation peut être réalisée à une température pour laquelle l'activité enzymatique que l'on souhaite détecter est optimale, que l'homme du métier peut choisir aisément selon l'activité enzymatique à détecter. L'étape d) peut s'effectuer par un examen visuel, par colorimétrie ou fluorimétrie. 30 L'invention concerne également l'utilisation du milieu réactionnel tel que décrit ci avant pour la détection et/ou l'identification de micro-organismes. 12 L'invention concerne également l'utilisation de cyclodextrine(s) pour accroître la stabilité d'un milieu réactionnel. Grâce à une telle utilisation, il est possible de reculer la date de péremption du milieu réactionnel, et de conserver le milieu plus aisément. Préférentiellement, la cyclodextrine utilisée est choisie parmi une alpha-cyclodextrine, qui est préférentiellement la Cyclomaltohexaose (Référence bioCydex ACD NO ; No CAS 51211-54-9) ; une gamma-cyclodextrine, qui est préférentiellement la Cyclomaltooctaose (Référence bioCydex GCD NO ; No CAS 91464-90-3) ; une betacyclodextrine qui est préférentiellement une 2-0-méthyl-beta-cyclodextrine ou la randomly 2-0-méthyl-cyclomaltoheptaose (Référence bioCydex BCD C15) ; ou préférentiellement une 2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrine encore appelée la randomly 2,3,6-0-(2-hydroxypropyl)-cyclomaltoheptaose ( Référence bioCydex BCD R59 ; No CAS 128449-35-5) ; ou préférentiellement une monopropanediamino-beta- cyclodextrine encore appelée la 61-(3-amino-propylamino)-6i-desoxy- cyclomaltoheptaose (Référence bioCydex BCD A56).

L'invention concerne également l'utilisation de cyclodextrine(s) pour protéger des molécules actives contre une dégradation physico-chimique en milieu réactionnel, telle que notamment la chaleur ou une agitation. Préférentiellement, la cyclodextrine utilisée est choisie parmi une alpha-cyclodextrine, qui est préférentiellement la Cyclomaltohexaose (Référence bioCydex ACD NO ; No CAS 51211-54-9) ; une gamma-cyclodextrine, qui est préférentiellement la Cyclomaltooctaose (Référence bioCydex GCD NO ; No CAS 91464-90-3) ; une beta-cyclodextrine qui est préférentiellement une 2-0-méthyl-beta-cyclodextrine ou la randomly 2-0-méthylcyclomaltoheptaose (Référence bioCydex BCD C15) ; oupréférentiellement une 2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrine encore appelée la randomly 2,3,6-0-(2- hydroxypropyl)-cyclomaltoheptaose ( Référence bioCydex BCD R59 ; No CAS 128449-35-5) ; ou préférentiellement une monopropanediamino-beta-cyclodextrine encore appelée la 61-(3-amino-propylamino)-6i-desoxy-cyclomaltoheptaose (Référence bioCydex BCD A56).

Les exemples ci dessous sont donnés à titre explicatif et n'ont aucun caractère limitatif Ils permettront de mieux comprendre l'invention. 13 Les exemples ci dessous sont relatifs à la protection contre la dégradation de 3 molécules actives (deux antibiotiques, la cloxacilline et la céfoxitine, et une enzyme, la (3-lactamase) grâce à leur encapsulation dans une cyclodextrine. Plusieurs cyclodextrines (ACD NO, GCD NO, BCD C15, BCD R59, BCD A56) de la gamme Solvamax ont été testées pour leur capacité à ralentir la dégradation thermique de molécules actives. La stabilité a été évaluée par CLHP. 1. PROTECTION ET STABILISATION DE LA CLOXACILLINE La cloxacilline (Masse Moléculaire 475,88) est un antibiotique de type (3-lactamine, utilisé pour inhiber la croissance de certaines espèces bactériennes telles que Enterobacter aerogenes ou Escherichia coli. Les cyclodextrines de la librairie de BioCydex ont été incubées avec la cloxacilline dans un rapport molaire 1 :1 (concentration = 210,12 mM), à 20 C pendant 72 h (agitation à l'abri de la lumière). La quantité de cloxacilline résiduelle a été ensuite analysée par HPLC. Les essais suivants ont été réalisés en milieu aqueux et à température élevée (75 C) 15 pour accélérer la vitesse de dégradation. 1.1 Criblage ex-situ Le sel de sodium de la cloxacilline (Sigma, Réf. C 9393) présente une solubilité intrinsèque élevée en milieu aqueux (û100 g.L-i). Les complexes ont été préparés à température ambiante avec des rapports molaires 20 cloxacilline : cyclodextrine de 1:16 et de 1:79. Les solutions contenant 0,63 mM soit 300 mg.L_i de cloxacilline ont été incubées à 75 C pendant 31 h. L'analyse des échantillons et leur quantification pour évaluer la stabilité de l'antibiotique ont été réalisés sur une chaîne Thermo Finnigan SpectraSYSTEM HPLC system équipée avec une pompe P1000XR, un injecteur automatique AS3000, un détecteur UV1000 25 UV/Visible, une colonne Merck Chromolith Performance RP-18 endcapped (100-4,6 mm) précédée par une colonne de garde Merck Chromolith RP-18e (5-4,6 mm). Les phases mobiles ont été préparées à partir d'acétonitrile grade-HPLC et d'eau acidifiée par de l'acide trifluoroacétique (100 L/L). Un gradient méthanol/eau de 0/100 à 100/0 a été appliqué en 12 min. Après stabilisation pendant 2 min la colonne est 30 rééquilibrée dans les conditions initiales. La vitesse d'élution est de 1 mL/min, la température de 22 C et la détection réalisée à 220 nm. Le volume d'injection des 5 14 échantillons est de 20 L. Les données chromatographiques ont été traitées par le logiciel Atlas, version 2003.1 (Thermo Electron Corporation, U.K.). Les résultats sont présentés dans le tableau I : Tableau I : Stabilité de la cloxacilline en présence de cyclodextrines à 75 C Cyclodextrine Stabilité de la cloxacilline(%) Aucune 0,6 BCD R59 10 mM 16,3 BCD R59 50 mM 37,7 BCD C15 10 mM 14,9 BCD C15 50 mM 39,9 Ces résultats démontrent l'effet protecteur des cyclodextrines BCD R59 et BCD C15 sur la cloxacilline. Ces résultats ont été confirmés dans les mêmes conditions expérimentales lorsque le rapport molaire cloxacilline : cyclodextrine etait au minimum 10 de 1:15. A ce titre, la figure 1 présente l'effet protecteur des cyclodextrines contre la dégradation de la cloxacilline par la chaleur (-CD : absence de cyclodextrine ; 1:1 à 1:125 : rapports molaires cloxacilline:CD). La cyclodextrine BCD C15 présentait la meilleure protection a de faible rapport. Pour des rapports molaires supérieurs à 1:50, des performances similaires étaient observées 15 pour les deux cyclodextrines. Ces résultats montrent que la complexation de la cloxacilline à une cyclodextrine comme la BCD R59 ou BCD C15 confère à la molécule antibiotique une protection contre l'inactivation par un traitement thermique (31h à 75 C) puisque 40% de la molécule native sont retrouvés après chauffage contre 0% lorsque la cloxacilline n'est 20 pas associée à la cyclodextrine.

2. COMPLEXATION DE LA CEFOXITINE La céfoxitine est un antibiotique de la famille des (3-lactamines, inhibiteur de la synthèse des mucopeptides de la paroi bactérienne. 25 2.1 Criblage ex-situ 0,444 mM de céfoxitine (Sigma, Réf. C4786-5G) et 8,88 mM de cyclodextrine (ACD NO ou GCD NO ou BCD R59 ou BCD C15), soit dans un rapport molaire de 1:20, ont été dissous sous agitation pendant une heure à température ambiante. Le mélange était 15 ensuite porté à 65 C pendant 90 min. L'intégrité de la céfoxitine était ensuite analysée par HPLC. L'analyse des échantillons et leur quantification ont été réalisés sur une chaîne Thermo Finnigan SpectraSYSTEM HPLC system équipée avec une pompe P1000XR, un injecteur automatique AS3000, un détecteur UV1000 UV/Visible, une colonne Merck Chromolith Performance RP-18 endcapped (100-4,6 mm) précédée par une colonne de garde Merck Chromolith RP-18e (5-4,6 mm). Les phases mobiles ont été préparées à partir d'acétonitrile grade-HPLC et d'eau acidifiée par de l'acide trifluoroacétique (100 L/L). Un gradient méthanol/eau de 0/100 à 100/0 a été appliqué en 12 min. Après stabilisation pendant 2 min la colonne est rééquilibrée dans les conditions initiales. La vitesse d'élution est de 1 mL/min, la température de 22 C et la détection réalisée à 254 nm. Le volume d'injection des échantillons est de 20 L. Les données chromatographiques ont été traitées par le logiciel Atlas, version 2003.1 (Thermo Electron Corporation, U.K.). Les résultats sont présentés dans le tableau II : Tableau II : Effet de différentes cyclodextrines sur la stabilité de la céfoxitine à 65 C Cyclodextrine Stabilité de la céfoxitine / % Aucune 38,5 ACD NO 41,3 GCD NO 40,5 BCD R59 43,8 BCD C15 42,0 L'optimisation de la protection a été recherchée en faisant varier le rapport molaire céfoxitine:cyclodextrine (BCD R59 et BCD C15) de 1:1 à 1:216, les autres conditions demeurant inchangées. A ce titre, la figure 2 présente l'effet protecteur de BCD R59 et de BCD C15 sur la céfoxitine en milieu aqueux. L'amélioration de la stabilité a été calculée par rapport au témoin sans cyclodextrine. Pour des rapports molaires variant entre 1:6 et 1:30, la cyclodextrine BCD C15 était la plus efficace. Au-delà, les deux cyclodextrines étaient équivalentes. Un rapport molaire de 1:50 était suffisant pour atteindre un degré de protection important à basse température. Dans ce cas, la stabilité de la céfoxitine après 90 min à 65 C est de 47,5% au lieu de 38,5% avec le témoin sans cyclodextrine. 5 16 Ces résultats démontrent que les cyclodextrines ACD NO, GCD NO, BCD R59 et BCD C15 protègent la céfoxitine d'une dénaturation par la chaleur puisque qu'en présence de BCD C15, l'antibiotique complexé est environ 10% moins dégradé que la molécule seule. 3. PROTECTION DE LA BETA-LACTAMASE 3.1 Stabilité de la 13-lactamase La (3-lactamase (Genzyme Biochemicals Réf. BELA-70-1431) en quantité équivalente à 0,375 U.mL i a été mélangée à la cyclodextrine BCD A56 de la gamme Protéosol (1 10 ou 10 mM), à température ambiante et à l'abri de la lumière, pendant 30 min. Le mélange a été ensuite chauffé à 70 C pendant 45 min. L'amoxicilline (Glaxo, Réf. 5003), 500 mg.L-i, révélatrice de l'activité de la (3-lactamase, a été ensuite ajoutée à température ambiante. Après une incubation de 5 min à 25 C, l'amoxicilline résiduelle a été analysée par HPLC. Les profils obtenus sont présentés dans la figure 3, qui 15 présente l'analyse HPLC de l'amoxicilline (A : témoin amoxicilline non traitée ; B : amoxicilline + 3-lactamase non chauffée ; C : amoxicilline + 3-lactamase chauffée ; D : amoxicilline + complexe (3-lactamase : BCD A56 (1 mM) chauffé. TR amoxicilline = 5,5 min). Le pic de l'amoxicilline sortait à 5,5 min. L'activité de la (3-lactamase a été attestée par la diminution du pic de l'amoxicilline 20 (Fig. 3B) par rapport au témoin amoxicilline seule (Fig. 3A) et par l'apparition de produits d'hydrolyse caractérisés par un massif à des temps de rétention plus faibles. Lorsque la (3-lactamase était dégradée par chauffage, elle perdait une partie de son activité, ce qui se traduisait par une meilleure stabilité de l'amoxicilline (Fig. 3C). Le même traitement thermique en présence de cyclodextrine (Fig. 3D) permettait de 25 conserver une activité de la (3-lactamase identique à celle du témoin amoxicilline-(3-lactamase non chauffée (Fig. 3B). A partir des profils ci-dessus, il a été possible de quantifier la concentration de l'amoxicilline et lier cette valeur à l'activité de la (3-lactamase. Les résultats sont présentés dans le tableau III.

Tableau III: Influence de BCD A56 sur la résistance de la (3-lactamase à la dégradation thermique Traitement de la (3-lactamase [Amoxicilline] (unités arbitraires) Chauffage sans BCD A56 100 Chauffage + BCD A56 à 1 mM 4,3 Chauffage + BCD A56 à 10 mM 0,8 En prenant comme référence la situation en absence de cyclodextrine, on concluait à une excellente protection de la (3-lactamase en présence de BCD A56 à 10 mM et que, 5 de plus, cette cyclodextrine n'interagissait pas avec le site actif de l'enzyme.

Ces résultats démontrent que la beta-lactamase associée à la cyclodextrine conserve toute son activité enzymatique même après chauffage à 70 C pendant 45 minutes puisqu'elle reste capable de dégrader complètement l'amoxicilline, substrat de 10 l'enzyme, contrairement à la protéine non complexée. La cyclodextrine protège donc l'enzyme et son site actif d'une dénaturation par un traitement thermique. 10 20

Claims (11)

REVENDICATIONS

1. Milieu réactionnel pour l'identification/détection de microorganismes comprenant au moins une molécule active encapsulée dans une cyclodextrine.

2. Milieu réactionnel selon la revendication 1 caractérisé en ce que la cyclodextrine est choisie parmi : une alpha-cyclodextrine ; une gamma-cyclodextrine ; une betacyclodextrine : une 2-0-méthyl-beta-cyclodextrine ; une 2-hydroxypropyl-betacyclodextrine ; une monopropanediamino-beta-cyclodextrine.

3. Milieu réactionnel selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que la molécule active est un antibiotique.

4. Milieu réactionnel selon la revendication 3 caractérisé en ce que l'antibiotique est 15 choisi parmi la famille des penams ou des cephams.

5. Milieu réactionnel selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que la molécule active est une enzyme, préférentiellement une hydrolase et encore plus préférentiellement une beta lactamase.

6. Milieu réactionnel selon la revendication 1 a 5 caractérisé en ce qu'il comprend au moins un substrat permettant la détection d'une activité enzymatique ou métabolique.

7. Milieu réactionnel selon la revendication 6 caractérisé en ce que ledit substrat 25 permettant la détection d'une activité enzymatique ou métabolique est un substrat enzymatique, préférentiellement fluorescent ou chromogène.

8. Procédé de détection et/ou d'identification de micro-organismes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes à : 30 a) disposer d'un milieu réactionnel selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, 19 b) ensemencer le milieu avec un échantillon biologique à tester, c) laisser incuber, et d) détecter et/ou identifier les microorganismes.

9. Utilisation du milieu réactionnel selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 pour la détection et/ou l'identification de micro-organismes.

10. Utilisation de cyclodextrine(s) pour accroître la stabilité d'un milieu réactionnel.

11. Utilisation de cyclodextrine(s) pour protéger des molécules actives contre une dégradation physico-chimique en milieu réactionnel.