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Hemmstoffe der Acetylcholin-Esterase sind hochgifte Stoffe aus der Gruppe der Phosphororganischen Verbindungen und Carbamate. Diese werden in großen Mengen als Pestizide eingesetzt. Die toxischsten Vertreter der Phosphororganischen Verbindungen sind die Nervenkampfstoffe wie Tabun, Sarin, Soman, Cyclosarin oder VX.
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Die toxische Wirkung der genannten Hemmstoffe wird verursacht durch eine Hemmung der Acetylcholin-Esterase im cholinergen Nervensystem. Hierdurch wird die Hydrolyse und Inaktivierung des Acetylcholins verhindert und es kommt zu einer Anreicherung des Acetylcholins im synaptischen Spalt. Die Folge ist eine Dauererregung insbesondere des Parasympathikus und der muskulären Endplatten sowie des cholinergen zentralen Nervensystems.
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Phosphororganischen Verbindungen und Carbamate weisen überwiegend eine mittlere Lipophilie auf bzw. sind amphiphil und sind dadurch hautgängig. Sie wirken daher auch als Kontaktgift. Weiterhin zeigen sie überwiegend einen ausreichenden Dampfdruck um in geschlossenen Räumen über die Atemwege toxisch zu wirken.
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Das schnelle Erkennen von kontaminierten Gegenständen, Gefäßen und Oberflächen ist bei Unfällen oder nach kriminellem bzw., militärischem Einsatz daher notwendig. Hierfür eingesetzte elektronische Spürgeräte wie Massenspektrometer können nur jeweils einzelne Substanzen mit vorher bekannten spezifischen Massen aus der Gruppe detektieren. Eine spezifische Detektion der toxischen Wirkung aller denkbaren Hemmstoffe kann durch Test-Systeme erfolgen, die Acetylcholin-Esterase enthalten und nach einer vorgegebenen Hemmzeit die Umsetzung des Substrates Acetylcholin detektieren. Wird Acetylcholin nicht mehr zu Essigsäure und Cholin umgesetzt liegt ein Hemmstoff des Enzyms vor.
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Die ersten hierzu entwickelten Tests beobachteten lediglich die pH-Verschiebung von Lösungen der entstehenden Essigsäure in den sauren Bereich mit Hilfe eines pH-Farbindikators.
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Mit (1) wurde als alternatives Substrat Indoxylacetat eingeführt. Bei Hydrolyse des Indoxylacetats durch die nicht gehemmte Acetylcholin-Esterase zu Essigsäure und Indol (Entsteht durch Oxidation mit Luftsauerstoff) ändert der Testansatz seine Farbe von farblos nach blau. Im Falle einer vollständigen Hemmung des Enzyms ändert der Ansatz seine Farbe nicht d.h. er bleibt farblos.
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Mit (2) wurde von Ellmann als weiteres alternatives Substrat Acetylthiocholin eingeführt. Bei Hydrolyse des Acetylthiocholins entsteht Thiocholin welches Ellmann's Reagenz (Dithionitrobenzoesäure- DTNB) zum gelben Thionitrobenzoat reduziert. Durch die nicht gehemmte Acetylcholin-Esterase ändert der Testansatz seine Farbe von farblos nach gelb. Im Falle einer vollständigen Hemmung des Enzyms ändert der Ansatz seine Farbe nicht d.h. er bleibt farblos.
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Problematik der beiden unter [0006] und [0007] beschriebenen Testansätze sind die falsch positiven Anzeigen bei unspezifischer Inaktivierung der Acetylcholin-Esterase durch Denaturierung. Diese kann durch Alterung, zu hohe Lagertemperaturen oder durch Kontakt mit denaturierenden Chemikalien (z.B. starke Säuren und Basen, Oxidations- und Reduktionsmittel, organische Lösungsmittel wie Ethanol oder Aceton) ausgelöst werden und ist nicht reversible.
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Weiterhin ist bei beiden unter [0006] und [0007] beschriebenen Testansätze problematisch, dass im Falle eines Vorhandenseins von Hemmstoffen der zu Beginn farblose Testansatz farblos bleibt. Die Erkennung einer Gefahr durch nicht eingewiesene Anwender ist hierdurch fraglich.
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Mit Patent
US9556471B2 wurde dem Testansatz nach [0007] eine Urease und Harnstoff zugefügt. Bei noch intakten Proteinen kommt es zu einer Alkalisierung des Ansatzes, so dass mit Hilfe eines pH-Indikators die noch vorhandene Aktivität der Urease und indirekt der Acetylcholin-Esterase erkannt werden kann. Die Urease selbst wird von Acetlycholinesterase-Hemmstoffen nicht gehemmt, so dass die Anwesenheit der Hemmstoffe weiterhin detektiert werden kann. Durch den pH-Indikator ist zusätzlich ein Hintergrund-Farbstoff vorhanden, der eine Warnfarbe bei Vorhandensein eines Hemmstoffes der Acetylcholin-Esterase darstellt. Problematik des Ansatzes ist, dass die Aktivität des zweiten Enzym-Substrat-Systems lediglich durch pH-Wert-Änderungen angezeigt wird. Bei pH-Änderungen durch Einflüsse bei der Probenahme, z.B. bei vorausgegangenen Dekontaminationsversuchen mit Chlorbleichlauge oder durch alkalische Oberflächen wie Beton versagt das System. Dies betrifft zusätzlich die Hintergrundfarbe, so dass es zu falsch positiven und falsch negativen Ergebnisse kommen kann.
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Mit Gebrauchsmuster
DE 202 09 105.8 wurde im Testansatz nach [0007] das zusätzliche Farbreagenz 2,6-Dichlorphenolindophenol-Natrium (Tillmans Reagenz) eingeführt. Hierbei reduziert das Thiocholin das blaue Reagenz zur fast farblosen Leukoform. Bei positivem Nachweis eines Hemmstoffes bleibt der Ansatz dann blau. Bei Nichtvorhandensein eines Hemmstoffes wird der Ansatz gelbgrün. Mit Hilfe dieses zweiten Farbreagenz erscheint bei Nachweis eines Hemmstoffes eine Warnfarbe. Die Problematik des falsch positive Nachweises bei Denaturierung des Enzyms ist damit aber nicht gelöst.
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Das erfindungsgemäße Lösungsprinzip beinhaltet die Verwendung einer Glycosidase und eines Glykosides, dessen Aglycon eine auffällige Farbe aufweist. Verfügbare Glycosidasen sind insbesondere β-Glucosidasen und β-Galactosidasen, hierfür spezifische Substrate mit der genannten Eigenschaft sind insbesondere Triphenylmethin-Farbstoffe und Anthrachinonfarbstoffe β-glycosidisch gebunden an Glucose bzw. Galactose. Ein beispielhafter Enzym-Substrat-Ansatz findet sich in (3).
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Glycosidasen werden durch Hemmstoffe der Acetylcholin-Esterase nicht gehemmt und können daher zur Anzeige von intakten Enzymen in entsprechenden Testsystemen verwendet werden.
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Die unter [0012] genannten Glycoside sind farblos bis gelb und weisen als Aglycon eine auffällige Farbe auf.
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Die Farbe des Aglycon ist hierbei so zu wählen, dass im Testsystem nach [0006] eine Farbe ausgewählt wird, die sich deutlich von der Farbe Blau unterscheidet. Als Aglycon kann beispielsweise Chlorphenolrot eingesetzt werden. Im Falle eines positiven Nachweises ist der Ansatz dann Rot, im Falle eines negativen Ergebnisses Magenta und bei Denaturierung der Enzyme Gelb.
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Die Farbe des Aglycon ist im Testsystem nach [0007] so zu wählen, dass eine Farbe ausgewählt wird, die sich deutlich von der Farbe Gelb unterscheidet. Als Aglycon kann beispielsweise Bromphenolblau eingesetzt werden. Im Falle eines positiven Nachweises ist der Ansatz dann Blau, im Falle eines negativen Ergebnisses Grün und bei Denaturierung der Enzyme Gelb.
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Die in [0012] genannten Enzyme und Substrate können in den Testanordnungen nach [0006] und [0007] so angeordnet werden, dass sie in wässrigen Proben oder auf zu beprobenden Oberflächen jeweils gleichzeitig vorhanden sind und die gleichen Einwirkzeiten aufweisen.
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Durch das Einhalten einer Hemmzeit sind Test-Anordnungen nach [0017] so zu gestalten, dass zunächst nur die beiden Enzyme Acetylcholin-Esterase und Glycosidasen einwirken und nach der vorgegebenen Hemmzeit die Substrate und Farbreagenzien zugesetzt werden. Nach einer weiteren Wartezeit zur Umsetzung der Substrate ist dann die entstandene Farbe auszuwerten.
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Die Testanordnung zur Untersuchung von Wasser, wässrigen Proben oder wässrigen Extrakten kann so gestaltet werden, dass die beiden Enzyme in gefriergetrocknete Form auf einem Trägermaterial in einem Glas vorgelegt werden. Nach Zufügen der wässrigen Probe und nach Abwarten der Hemmzeit werden die Substrate - aufgebracht auf einem Träger oder in Form eines Komprimates- zugefügt.
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Die Testanordnung zur Untersuchung von Oberflächen kann so gestaltet werden, dass die beiden Enzyme in gefriergetrocknete Form auf einem Trägermaterial oder als Komprimat bereitgestellt werden und bei Bedarf in einer mit einer neutralen Pufferlösung gefüllten Dosierflasche oder Sprühflasche gelöst werden. In einer zweiten Anordnung werden die Substrate und Farbreagenzien ebenfalls in gefriergetrocknete Form auf einem Trägermaterial oder als Komprimat bereitgestellt und ebenfalls in einer mit einer neutralen Pufferlösung gefüllten Dosierflasche oder Sprühflasche gelöst. In einer dritten Testanördnung wird ein Ascorbinsäure-Komprimat bereitgehalten und in einer mit einer neutralen Pufferlösung gefüllten Dosierflasche oder Sprühflasche gelöst.
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Auf die zu untersuchende Oberfläche wird zunächst die Enzymlösung aufgebracht und nach Abwarten der Hemmzeit wird abschließend die Lösung mit den Substraten und Farbreagenzien aufgebracht. Bei vorausgegangenen Dekontaminationsversuchen wird zunächst die Ascorbinsäure-Lösung aufgetragen.
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Die Testanordnungen zur Herstellung von wässrigen Extrakten von Umweltproben und kleinen Gegenständen beinhalten Flüssigkeits-Gefäße gefüllt mit neutralen Pufferlösungen und Detergentien mit entsprechenden Aufnahemeinrichtungen für Flüssigkeiten. Bei Bedarf wird ein Komprimat mit Ascorbinsäure zugefügt.
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Ausführungsbeispiel für eine Testanordnung nach [0019]:
- 10 µι einer Lösung von 1 U Acetylcholin-Esterase vom Zitteraal werden zusammen mit einem nichtionogenen Detergens und Saccharose auf einem Nylonplättchen 5 * 5 mm lyophilisiert.
- 10 µl einer Lösung von 1 U bakterieller β-Galactosidase werden zusammen mit einem nichtionogenen Detergens und Saccharose auf einem Nylonplättchen 5 * 5 mm lyophilisiert.
Nachweisgrenze für VX: ca. 5 µg/Liter
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Beide Nylonplättchen werden in ein 10 ml Schraubdeckelgläschen (Gläschen 1) gelegt, dieses mit Argon befüllt und verschlossen.
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Jeweils 10 µl von Lösungen von 0,2 mg Acethylthiocholin-Jodid, 0,1 mg DTNB und 0,1 mg Bromphenolblau-β-Galactosid werden jeweils auf drei unterschiedlichen Nylonplättchen 5 * 5 mm zusammen mit einem nichtionogenen Tensid und Saccharose lyophilisiert und in ein zweites Schraubdeckelgläschen (Gläschen 2) gelegt. Dieses wird ebenfalls mit Argon befüllt und verschlossen.
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Anwendung: Wässrige Probe in Gläschen 1 geben und gut schütteln, 1 Minute warten. Dann die Plättchen aus Gläschen 2 in Gläschen 1 überführen und gut schütteln, 2 Minuten warten. Farbe auswerten:
- • grün: Kein Hemmstoff vorhanden
- • blau: Hemmstoff vorhanden
- • gelb: Test nicht auswertbar
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Ausführungsbeispiel für eine Testanordnung nach [0020]:
- 1 ml einer Lösung von 100 U Acetylcholin-Esterase vom Zitteraal werden zusammen mit einem nichtionogenen Detergens auf ein Komprimat von 1 g Saccharose gegeben und lyophilisiert.
- 1 ml einer Lösung von 100 U bakterieller β-Galactosidase werden zusammen mit einem nichtionogenen Detergens auf ein Komprimat von 1 g Saccharose gegeben und lyophilisiert.
- Jeweils 20 mg Acethylthiocholin-Jodid, 10 mg DTNB und 10 mg Bromphenolblau-β-Galactosid werden mit je 1 g Saccharose verrieben und hieraus werden Komprimate gepresst.
- Handelsübliche Komprimate mit 500 mg Ascorbinsäure werden bereitgehalten.
- Alle Komprimate werden verblistert.
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Drei 500 ml Sprühflasche werden mit einer 0,01 molaren Phosphatpuffer-Lösung pH 7,2 und 0,1% Natrium-Dodecylsulfat befüllt.
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Anwendung: Die beiden Enzym-Komprimate in Sprühflasche 1 geben und gut schütteln. Lösung 1 auf die zu untersuchenden Oberflächen sprühen. Mindestens 1 Minute warten. Dann die anderen Komprimate in Sprühflasche 2 geben und gut schütteln. Lösung 2 ebenfalls auf die zu untersuchenden Oberflächen sprühen. 2 Minuten warten. Farbe auswerten:
- • grün: Kein Hemmstoff vorhanden
- • blau: Hemmstoff vorhanden
- • gelb: Test nicht auswertbar
Nachweisgrenze für VX: ca. 1 µg/cm2
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Bei vorausgegangenen Dekontaminationsversuchen wird zuvor das Ascorbinsäure Komprimat in Sprühflasche 3 gelöst, gut geschüttelt und die Lösung aufgesprüht. Ohne Wartezeit wird mit den beschriebenen Schritten fortgefahren.
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Ausführungsbeispiel für eine Testanordnung zur Herstellung von wässrigen Extrakten nach [0021]:
- Eine 500 ml Weithalsflasche wird mit einer 0,01 molaren Phosphatpuffer-Lösung pH 7,2 und 0,1 % Natrium-Dodecylsulfat befüllt. Hinzu kommt ein im Deckel fixierter Schwamm. Weiterhin wird ein Komprimat mit 500 mg Ascorbinsäure (handelsüblich) bereitgestellt.
- Anwendung Oberflächen: Bei Annahme, dass auf der zu untersuchenden Oberfläche bereits ein Dekontaminationsversuch durchgeführt wurde: Ascorbinsäure-Komprimat in die Flasche geben. Falls vorher keine Dekontaminationsversuche stattgefunden haben, kann auf die Zugabe des Ascorbinsäure-Komprimates verzichtet werden. Flasche gut schütteln, so dass der Schwamm gut benetzt ist. Mit dem feuchten Schwamm die betroffene Oberfläche abreiben, Deckel mit Schwamm wieder aufsetzen und gut schütteln. 10 ml des Inhalts in eine Testanordnung nach [0022] überführen und dort weiter testen.
- Anwendung Umweltproben oder kleine Gegenstände: Bei Annahme, dass bereits ein Dekontaminationsversuch durchgeführt wurde: Ascorbinsäure-Komprimat in die Flasche geben. Falls vorher keine Dekontaminationsversuche stattgefunden haben, kann auf die Zugabe des Ascorbinsäure-Komprimates verzichtet werden. Etwa 10 -20 g der Probe bzw. der kleinen Gegenstände in die Flasche geben. Deckel aufsetzen und gut schütteln. 10 ml des Inhalts in eine Testanordnung nach [0022] überführen und dort weiter testen.
Patentzitate | Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
| US4668622A | 1983-12-17 | 1987-05-26 | Roche Diagnostics GmbH | Phenolsulphonphthaleinyl-β-D-galactosides and diagnostic agents containing them |
| EP0146866A2 | 1983-12-17 | 1985-07-03 | Roche Diagnostics GmbH | Phenylsulfonephthaleinyl-beta-D-galactosides, methods for their preparation and their use in the determination of beta-D-galactosidase |
| US5068180A | 1987-05-21 | 1991-11-26 | Technicon Instruments Corp | Substrates for β-galactosidase |
| US9556471B2 | 2006-08-09 | 2017-01-31 | FLIR Detection Inc | Enzyme containing liquid and delivery system for detection of analytes on surfaces |
| DE 202 09 105.8 | - | 2003-01-16 | Bundesamt für Wehrtechnik und Beschaffung | Testset zum Nachweis von Nervenkampfstoffen und Phosphorsäureestern |
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- US 9556471 B2 [0010]
- DE 20209105 [0011]
- US 4668622 A [0031]