FI75436C - Foerfarande och vid detta anvaendbar framkallningsloesning foer paovisande av blod i ett prov. - Google Patents

Description

1 75436

Menetelmä ja siinä käytettävä kehitysliuos näytteessä piilevän veren osoittamista varten

Testiliuskat näytettä varten ja menetelmät, joiden avulla voidaan saada selville ulosteissa piilevä veri, ovat hyvin tunnettuja. Esimerkiksi US-patentissa 3 996 006 tehdään selkoa liuskoista, joissa on substraattia, joka muodostuu etu-seinämän ja takaseinämän välissä olevasta levystä, johon pannaan näyte ja etuseinämässä on yksi tai useampia aukkoja ja takaseinämässä yksi aukko ja kääntyvät kannet peittävät nämä aukot. Kun kyseessä on testi piilevän veren havaitsemiseksi ulosteista, on näytteen vastaanottava levy tyypillisesti absorboivaa paperia, joka on impregnoitu tai painettu guajakil-la, ja kehitysliuos kuten peroksidi1iuos pannaan takaseinä-mässä olevan aukon läpi. Erästä tällaista testiliuskaa myydään tavaramerki11ä "Hemoccult".

Testimenetelmä on lyhyesti seuraava. Ulostusnäyte voidellaan guajakkipaperi 11 e etuseinämässä olevan aukon kautta. Seinämä peitetään sen jälkeen ja avataan takaseinämän läppä. Kehitys-liuosta, kuten vetyperoksidia, pannaan guajakkipaperi 11 e vastaavan aukon kautta takaseinämässä. Jos ulosteissa on verta, guajakkireaktio värjää paperin siniseksi. Sininen väri johtuu hemoglobiinin katalysoimasta guajakin hapettumisesta.

guajakki H 0 "hapettunut" guajakki 2 2 -» väritön hemoglobiini sininen väri

Eräs guajakkitestiä rajoittava ominaisuus on se, että hemoglobiinin katalysoiman sinisen värin syntyminen on riippuvainen pH-arvosta. Kehitysliuos e1 toimi uudelleen toistettavasi! jonkin määrätyn pH-arvon alapuolella. Edellä olevan tunnetun systeemin menestykselliseen suorittamiseen tarvittava pH-alue on noin 4,0 - 7,0, ja optimaalinen pH on 5,5 - 6,0. Jos siis hemoglobiinia pannaan guajakilla käsitellylle substraatille sellaisessa väiaineessa, joka 2 75436 eroaa huomattavasti optimi pH:sta, havaitaan vain vähän tai ei lainkaan väriä.

Kyseessä olevan testiliuskan edellä mainitusta haitasta johtuen se ei sovellu testaamaan piilevää verta näytteissä, joiden pH on alhainen kuten mahaneste, jonka pH voi olla alle 2. Mahan sisällössä olevien yhdisteiden havaitseminen joita siellä ei normaalisti ole, erikoisesti piilevän veren olemassaolon selville saaminen on kliinisesti tärkeätä. Mahalaukussa oleva veri voi olla peräisin useista eri lähteistä kuten nieltyä verta jostakin traumasta gastroin- / testinaaliseudun ulkopuolella, ja gastrointestinaalisesta verenvuodosta. Joissakin patologisissa tiloissa kuten mahalaukun karsinoina, mahahaava ja gastriitti, voi verta esiintyä mahalaukussa. Alkoholin nauttiminen ja useat eri lääkkeet kuten aspiriini, muut analgeetit ja kortikosteroidit voivat aiheuttaa syöpymistä mahalaukun limakalvon soluissa ja mahdollisesti mahalaukun verenvuotoa. Mahalaukun syöpymistä ja siitä johtuvaa verenvuotoa on havaittu myös potilaissa, jotka on tuotu sairaalaan vaikeiden loukkaantumisien tai palamisen takia. Tämän tyyppistä syöpymistä voi ilmetä 24 h kuluessa alkuperäisestä traumasta ja seurauksena voi olla akuutti hengenvaarallinen mahalaukun verenvuoto. Gastrointitestinaalialueella yllättäen piilevän veren selville saaminen aikaisessa vaiheessa on tärkeätä, sillä se helpottaa diagnoosin tekemistä edellä mainituissa sairaustiloissa jo aikaisessa vaiheessa, sillä-hoito voi olla tällöin tehokkaampaa.

Tämän keksinnön kohteena on sen vuoksi saada aikaan testi-liuska, johon eivät vaikuta vaihtelut näytteessä tai näytteen pH-arvossa ja jota voitaisiin käyttää muihinkin näytteisiin kuin ulosteisiin.

Tämän keksinnön kohteena on myös saada aikaan nopea, helppo kvalitatiivinen testi, joka auttaa tekemään diagnoosia 3 75436 gastrointestinaal1-sairauksissa paljastamalla alkaisin maha-nesteissä piilevä veri.

Tämän keksinnön kohteena on vielä saada aikaan testiliuska, joka eliminoisi virheelliset positiiviset reaktiot, jotka johtuvat peroksidaasien, raudan, kuparin ja kemikaalien, kuten simetidiinin, läsnälosta.

Aikaisemmin on yritetty stabiloida guajakilla Impregnoitua paperia tai testiliuskaa pH-vaihtelui1 ta ja häiritseviltä aineilta kuten peroksidaasei1 ta. Saksalaisessa hakemusjui kaisus-sa 2 716 060 tehdään selkoa puskuriaineista tai kelaatteja muodostavista aineista guajakki paperissa , joilla voitaisiin voittaa edellä mainitut probleemat. Kaikkein kriittisin on puskuri aineen tarve silloin, kun testatut väliaineet poikkeavat suuresti optimaalisesta pH-arvosta, kuten mahanesteet, tai kun on saatava selville pieniä määriä katalysaattoria, kuten hemoglobi1ni a.

Yllättäen on keksitty, että kun puskurlainelta pannaan kehi-tysliuokseen eikä impregnoida niitä guajakkipaperiin, kuten aikaisemmassa tekniikassa on selostettu, testiliuskaan eivät näytteen tai kokeen pH-vaihtelut vaikuta ja virheelliset positiiviset reaktiot, jotka johtuvat peroksidaasien, metalli-ionien ja simetidlinin läsnäolosta, voitiin eliminoida.

Keksinnön tunnusmerkit on esitetty patenttivaatimuksissa.

Useita suuria etuja voidaan saavuttaa, kun puskuroidaan ke-hitysliuos sen sijaan että impregnoi tais11 n guajakklpaperi puskuria1ne111 a. Guajakki paperiin pantavien puskuri aineiden määrää rajoittaa paperin absorptiokyky. Jos sen vuoksi tarvitaan voimakas puskurointi, olisi tehokkaampaa puskuroida kehltysl1uos. Olisi myös vaikeata saada puskuria1 neet jakautumaan tasaisesti paperille. Puskuroitaessa kehitysliuos ei pH ole rajoittunut substraatin pH:hon, so. ph:ta voidaan muuttaa. Kun paperi on impregnoitu, sen pH on määrätty ja rajoittunut. Voimakas suo! akonsentraatio paperilla 4 75436 voisi myös vaikuttaa muihin reagensseihin ja itse paperin fysikaalisiin ominaisuuksiin. Kun puskuroidaan kehitysliuos, testiliuskan valmistusmenetelmässä ei tulisi olemaan mitään muutosta. Tämä mahdollisuus vaikuttaa paljon kustannuksiin.

On saatu erittäin edullisia tuloksia käyttämällä yhdistelmää hapolla käsitelty guajakkipaperi ja puskuroitu kehitys-aine. On havaittu, että guajakkipaperin happokäsittely eliminoi virheellisesti positiivisia testejä simetidiinin kanssa ja vähensi peroksidaasien haittoja. Lisäksi guajakkipape-rissa oleva happo estää yllättäen guajakin muuttumasta siniseksi varastoinnin aikana, kun tapahtuu mahdollisesti atmosfääristä hapettumista. Puskuroitua kehitysainetta tarvitaan sen vuoksi, että voidaan saada selville hemoglobiini happamissa olosuhteissa guajakissa. Tätä valaisevat seuraa-vien kokeiden tulokset.

Valmistettiin näytteitä synteettisestä mahanesteestä, joka sisälsi 0,05 mg hemoglobiinia ja 30 mg simetidiiniä per ml. i 25 ^,ul:n näytteitä pantiin "Hemocculf-liuskoille ja kehi tettiin puskuroitujen ja ei-puskuroitujen kehitysaineiden kanssa. "Hemanculf-liuskoja tehtiin sen jälkeen happamik-si käsittelemällä guajakkipaperia hapolla ennen näytteen levittämistä ja näytteiden kehittämistä. Taulukot 1 ja 2 seuraavassa esittävät näiden kokeiden tuloksia.

TAULUKKO 1: Puskuroitu vast, ei-puskuroitu kehitysaine käytettyinä tavallisten "Hemoccult"-liuskojen kanssa Lukemat 30 sek kuluttua

Hemoglobiini________ Simetidi ini_ Näytteen Puskuroitu Ei-pusku- Puskuroitu Ei-puskuroi- pH_ kehitin roitu kehitin kehitin tu kehitin 1.32 3 1 0 1 2,20 3 3 0 2 3.60 4 4 0 2 4.32 4 40 2 5.60 4 3 0 4 6,37 4 3 0 4 75436 5 TAULUKKO 2: Happoa sisältävät vast, happoa sisältämättömät levyt ja puskuroitua kehitys-liuosta _Hemoglobiini_ _Simetidiini_

Levyt Happoa_Ei happoa Happoa Ei happoa

Lukema- aika 0,5 2 5 0,5 2 5 0,5 2 50,52 5 (min)_ _ Näytteen

PH

1/32 2 55 3 55 0 00000 5,60 5 55 5 55 0 00015 6,37 5 55 4 55 0 00035 "Hemoccult"-levyt tehtiin happamiksi käsittelemällä guajak-kipaperin keskusta 25 ^ul:n kanssa 0,1 M sitruunahappoa. Paperin annettiin kuivua ympäristön olosuhteissa ennen käyttöä. Puskuroitu kehitysaine sisälsi vetyperoksidia 0,2 M sirtuunahappoa/sitraattipuskurissa, jonka pH oli 5,8. Pus-kuroimaton kehitysaine oli kaupasta saatavaa "Hemoccult" kehitysainetta, joka sisältää vetyperoksidia etanolissa ja vedessä.

Sinisen värin intensiteetti arvosteltiin asteikolla 1-5 ja 0 oli väritön. Taulukosta 1 havaitaan, että puskuroidun kehitysaineen käyttö tavanmukaisissa "Hemoccult"-levyissä saa aikaan luotettavamman hemoglobiinin positiivisen testin. Puskuroitu kehitysaine myös eliminoi simetidiinin aiheuttamat virheellisesti positiiviset testit. Taulukon 2 tulokset osoittavat, että happamaksi tehdyn guajakkipaperin käyttö yhdessä puskuroidun kehitysaineen kanssa ei aiheuta virheellisesti positiivista tulosta simetidiinistä johtuen vaikka testilukemia viivyteltiin ja lukemat otettiin vasta määrättyjen 30 sekunnin jälkeen. Havaitaan, että tämä käsittely ei häirinnyt hemoglobiinitestiä.

Peroksidaasin katalysoima virheellisesti positiivinen reaktio 75436 6 on myös pH:sta riippuvainen, katalyysi vähenee pH:n pienentyessä. Havaittiin, että guajakkipaperin happokäsittely ennen näytteen sivelemistä estää virheellisesti positiivisen reaktion, jota katalysoivat happo-labiilit peroksidaasit. Käsitelty paperi, kun sitä käytetään puskuroidun kehitys-aineen kanssa, synnyttää sinisen värin hemoglobiinia sisältävien näytteiden kanssa eikä häiritse hemoglobiinitestiä. Esimerkiksi synteettinen mahaneste, pH 6,5, joka sisälsi puhdistettua piparjuuriperoksidaasia (2 yksikköä/ml) antoi "Hemoccult"-levyillä testattuna virheellisesti positiivisia tuloksia. Kun guajakkipaperia oli esikäsitelty hapon kanssa ja edellä mainittua synteettistä mahanestettä ja perok-sidaasia pantiin levylle ja annettiin reagoida hapon kanssa viisi minuuttia ennen kehittämistä, ei syntynyt sinistä positiivista väriä.

Guajakkipaperin käsittelyssä ovat osoittautuneet tehokkaiksi hapoiksi kloorivety-, rikki-, sitruuna-, fosfori- ja oksaalihappo. Muita voimakkaita orgaanisia ja epäorgaanisia happoja voidaan myös käyttää. Parhaana pidetty resepti ja menetelmä guajakkipaperin käsittelyyn hapolla on seuraava:

Liuos I

Guajakki 7,8 g

Isopropanoli 92,2 g

Liuos II

Liuos I 800 g

Sitruunahappo 768 g

Isopropanoli 432 g

Vesi 300 g

Liuos II:ta voidaan levittää absorboivalle paperille impreg noimalla tai painamalla.

Kehitysaine voidaan puskuroida millä tahansa hyvin tunnetulla puskurisysteemillä, joita ovat esimerkiksi sitruuna- 75436 7 happo/natriumsitraatti, sitruunahappo/kaksiemäksinen nat-riumfosfaatti, tris-maleaatti tai EDTA.

Puskuroitu kehitysliuos sisältää edullisesti noin 1 % - 5 % vetyperoksidia. Seuraavaa puskuroitua kehitysainetta, joka on 0,2 M sitruunahappoa/sitraatti-puskuria, jonka pH on 5,8, on käytetty edullises/i tässä keksinnössä.

Vetyperoksidi 2,17 g

Etanoli 32,87 g

Sitruunahappo 0,75 g

Natriumsitraatti 4,37 g

Vesi 58,80 g

Triton X-100 1,04 g

Ei-ionista pinta-aktiivista ainetta lisätään edullisesti puskuroituun kehitysaineeseen auttamaan peroksidaasin inhiboimista. Kaikkein edullisimmin käytetään Triton X pinta-aktiivista ainetta, polyetyleeniglykoli-p-iso-oktyylifenyy-lieetteriä.

Kun puskuroitua kehitysainetta levitetään hapolla käsitellyn guajakkipaperin substraatille, on tuloksena testiliuska, joka on stabiili ja jonka avulla voidaan testata piilevän veren läsnäolo näytteissä, joiden pH on alhainen, kuten mahanesteessä. Lisäksi virheellisesti positiiviset tulokset, jotka johtuvat simetidiinistä, peroksidaaseista ja metalli-ioneista kuten kuparista ja raudasta, eliminoituvat.

Claims (5)

75436

1. Menetelmä, jonka avulla voidaan testata mahanesteessä piilevä veri, tunnettu siitä, että mahanestettä levitetään puskuroimattoman hapolla käsitellyn absorboivan substraatin päälle, joka sisältää guajakkia reagenssina ja levitetään puskuroitua kehitysliuosta mainitulle substraatille ja tarkastetaan värjäytyykö substraatti siniseksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kehitysliuos sisältää vetyperoksidia.

3· Testikitti, jolla voidaan määrätä mahanesteessä pii levän veren läsnäolo, tunnettu siitä, että se muodostuu hapolla käsitellystä absorboivasta substraatista, joka sisältää guajakkireagenssia ja säiliöstä, joka sisältää puskuroitua kehitysliuosta, joka reagoi sanotun reagenssin kanssa värjäten substraatin siniseksi.

4· Patenttivaatimuksen 1 mukaisessa menetelmässä käytet tävä kehitysliuos, tunnettu siitä, että se sisältää noin 1 ^ - noin 5 % vetyperoksidia, joka on puskuroitu 0,2 M sit-ruunahappo/natriumsitraatilla, jonka pH on noin 5>8.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen liuos, tunnettu sii tä, että siihen lisätään ei-ionista pinta-aktiivista ainetta.