CS259514B2 - Means for occult bleeding's demonstration - Google Patents

Description

Vynález s^týká prostředku pro průkaz okultního krvácení.

Prostředky a postupy к průkazu okultního krvácení ve stolici jsou známy. Například v US patentovém spisu 6. 3 996 006 je popsán prostředek, který sestává z materiálu pro nanášení vzorku, uloženého mezi předním krytem a zadním krytem, přičemž v předním krytu se nachází jeden nebo větší počet otvorů, v zadním krytu se nachází jeden otvor a tyto otvory jsou uzavřeny otočnými uzávěrkami. V případě testu na okultní krvácení ve stolici je materiál pro příjem vzorku impregnován guajakovou modří a otvorem v zadním krytu se nanáší vyvíjecí roztok, například peroxid vodíku.

Postup probíhá následujícím způsobem. Vzorek stolice se nanese na guajakový papír otvorem v předním krytu. Kryt se pak uzavře a otevře se otvor v zadním krytu a tímto otvorem se nanese vyvíjecí roztok, například roztok peroxidu vodíku. V případě, že se ve stolici nachází krev, vzniká reakce, která způsobí modré zbarvení papíru. Toto modré zbarvení způsobuje oxidace, která je katalvzovária hemoglobinem podle následující rovnice.

Bezbarvá H2O2 oxidovaná guajaková------> guajaková modř hemoglobin modř

Tato reakce je nežádoucím způsobem omezena v tom smyslu, že vznik modrého zbarvení při reakci, katalyzované hemoglobinem je závislý na pH. Vyvíjecí roztok nepodává reprodukovatelné výsledky v určitém rozmezí pH. Rozsah pH pro reprodukovatelnost výsledku ve svrchu uvedeném systému je 4,0 až 7,0, optimální pH je 5,5 až 6,0. Znamená to, že při nanesení hemoglobinu na substrát, jehož pH se podstatně liší od optimálního rozmezí, vyvine se slabé nebo žádné zbaravení.

Vzhledem ke svrchu uvedeným nevýhodám není možno svrchu uvedený prostředek užít ke stanovení okultního krvácení ve vzorcích s nízkým pH, například v žaludeční šťávě, jejíž pH může být i nižší než 2. Stanovení látek, které se běžně v žaludečním obsahu vyskytují, zvláště stanovení krve má však velký klinický význam. Krev v žaludečním obsahu může pocházet z celé řady zdrojů, například může jít o spolknutou krev, o krev z poranění vně trávicí soustavy, ale také o žaludeční a střevní krvácení. Při některých chorobných stavech, například zhoubných nádorech žaludku, žaludečních vředů a zánětu žaludeční sliznice může být v žaludku přítomna krev. Požívání alkoholu a různých léků, například acylpyrinu, jiných prostředků proti bolestem a kortikosteroidů může způsobit poškození buněk žaludeční sliznice a občasné žaludeční krvácení. Eroze žaludeční sliznice s následným krvácením byly pozorovány také u nemocných, kteří byli· hospitalizováni pro těžké úrazy nebo spáleniny. TentQ. typ poškození se objevuje většinou 24 hodin po původním úrazu a může svou intenzitou ohrožovat život nemocného. Je důležité, aby v těchto případech bylo brzy prokázáno okultní krvácení, protože zjištění tohoto stavu může přispět к účinné léčbě již v počátečním stadiu tohoto onemocnění.

Předmětem vynálezu je prostředek pro průkaz okultního krvácení v žaludeční šťávě, vyznačující se tím, že sestává z předního krytu a zadního krytu, přičemž v předním krytu je proveden alespoň jeden otvor, z absorpčního substrátu, zpracovaného kyselinou bez pufru s obsahem guajaku jako reakčního činidla, uloženého pod předním krytem a pod otvory pro nanesení vzorku a za sklopného krytu, který je uložen přes část předního krytu a je opatřen uzávěry pro udržení krytu v uzavřené poloze. .

Absorpčním substrátem je s výhodou papír, kyselinou je s výhodou kyselina citrónová.

Při použití prostředku podle vynálezu má být možno rychle a kvalitativně prokázat okultní krvácení v žaludečním i střevním obsahu.

Při použití prostředku podle vynálezu má být možno vyloučit také falešně pozitivní výsledky, které vznikají při náhodné přítomnosti peroxidáz, železa, mědi nebo některých chemických látek, například cimetidinu.

Již dříve byly činěny pokusy stabilizovat guajakový papír nebo zkušební proužek proti změnám pH a proti působení dalších interferujících látek, například peroxidáz. V NSR vykládacím spisu č. 2 716 060 se popisuje včlenění pufru nebo chelátu do guajakovélio papíru za svrchu uvedeným účelem. Největší potřeba pufru nastává v případě, že se zkoumaný vzorek podstatně- odlišuje od optimálního pH, jako tomu je například v případě žaludeční šťávy, nebo v případě, že vzorek obsahuje velmi malé množství krve a tedy i velmi malé množství hemoglobinu jako katalyzátoru.

Nyní bylo neočekávaně zjištěno, že v případě, že se pufr nebo podobná látka uloží do vyvíjecího roztoku místo aby byl užit к impregnaci guajakového papíru, není prostředek ovlivňován změnami pH vzorku a rovněž nedochází к falešně pozitivním reakcím v důsledku přítomnosti peroxidáz, kovových iontů nebo například cimetidinu.

V případě, že se pufr včlení do vyvíjecího roztoku, místo aby byl užit к impregnaci guajakového papíru, získá se celá rada výhod. Množství pufru, včleněného do guajakového papíru je omezeno absorpční schopností papíru. Proto v případě, že je nutno užít silnější pufr, je účinnější včlenit jej do vyvíjecího roztoku. Bylo také obtížné získat rovnoměrné rozdělení pufru v guajakovém papíru. V případě, že se pufr včlení do vyvíjecího roztoku, není pH omezeno na pH vzorku a je možno jej měnit. Jakmile.se impregnuje papír, je naproti tomu pH přesně stanoveno a omezeno. Vysoká koncentrace solí a papíru také ovlivní působení dalších reakčních činidel a mimoto změní fyzikální vlastnosti papíru. V případě včlenění pufru do vyvíjecího roztoku se nijak nezmění způsob výroby celého prostředku, takže tento způsob je velmi hospodárný.

Nejvýhodnějších výsledků je možno dosáhnout v případě, že se současně užije guajakový papír, zpracovaný působením kyseliny a vyvíjecí roztok s obsahem pufru. Bylo zjištěno, že v případě, že se na guajakový papír působí kyselinou, je možno vyloučit falešně pozitivní výsledky, vznikající působením cimetidinu a podstatně snížit in* terferenci peroxidázami. Mimoto bylo neo čekávaně prokázáno, že kyselina v guajakovém papíru chrání prostředek před zmodráním v průběhu skladování působením oxidace z atmosféry. Vyvíjecího roztoku s obsahem pufru je zapotřebí к průchodu hemoglobinu za kyselých podmínek, které uvedeným způsobem vznikají. Celý postup bude osvětlen následujícími pokusy.

Vzorky syntetické žaludeční šťávy s obsahem 0,05 mg hemoglobinu a 30 mg cimetidinu v 1 ml se připraví a rozdělí na menší vzorky po 25 mikrolitrech, které se nanesou na prostředky „Hemoccult“ a vyvíjí se vývojkami s obsahem pufru a bez obsahu pufru. Pak se prostředky ,,Hemoccult“ zpracují působením kyseliny před nanesením a vyvíjením vzorku. Výsledky jsou uvedeny v tabulkách 1 a 2.

TABULKA 1

Použitím prostředku „Hemoccult“ a vyvíjecího roztoku s obsahem a bez obsahu pufru

Odečtení po sekundách pH vzorku Hemoglobin Cimetidin roztok s pufrem roztok bez pufru roztok s pufrem roztok bez pufru

1,32	3	1	0	1
2,20	3	3	0	2
3,60	4	4	0	2
4,32	4	4	0	2
5,60	4	3	0	4
6,37	4	3 TABULKA 2	0	4

Použití substrátu zpracovaného kyselinou a známého substrátu spolu s vyvíjecím roztokem s obsahem pufru

Absorpční Hemoglobin Cimetidin .

prostředek s kyselinou bez kyseliny s kyselinou bez kyseliny

doba odečtení (min.)	0,5	2	5	0,5	2	5	0,5	2	5	0,5	2	5
pH vzorku
1,32	2	5	5	3	5	5	0	0	0	0	0	0
5,60	5	5	5	5	5	5	0	0	0	0	1	5
6,37	5	5	5	4	5	5	0	0	0	0	3	5

Prostředky „Hemoccult“ byly zpracovány kyselinou tak, že na střed guajakového papíru bylo naneseno 25 mikrolitrů kyseliny citrónové o koncentraci 0,1 M. Papír byl pak usušen při teplotě místnosti před použitím. Vyvíjecí roztok s obsahem pufru obsahoval peroxid vodíku v pufru s 0,2 M kyseliny citrónové/citrátu při pH 5,8. Vyvíjecím roztokem bez pufru byl běžný roztok „Hemoccult“ s obsahem peroxidu vodíku ve směsi ethanolu a vody.

Intenzi a modrého zbarvení byla hodnocena stupnicí 1 až 5, 0 znamená bezbarvý roztok. Z tabulky 1 je zřejmé, že při použití vyvíjecího roztoku s obsahem pufru a běžného prostředku „Hemoccult“ se dosáhne reprodukovatelnějších výsledků při průkazu hemoglobinu. Vyvíjecí roztok s obsahem pufru vyloučil falešné pozitivní výsledky, způsobené přítomností cimetidinu. Výsledky, slinuté v tabulce 2 prokazují, že při použití okyseleného guajakového papíru a vyvíjecího roztoku s obsahem pufru nedochází ke vzniku falešně pozitivních výsledků působením cimetidinu ani v případě, že se výsledky odečítají později než v průběhu předepsaných 30 s. Je zřejmé, že toto zpracování také neruší výsledky pro hemoglobin.

Falešně pozitivní reakce, katalyzovaná peroxidázou je také závislá na pH, katalytický účinek se snižuje při snížení pH. Bylo prokázáno, že v případě, že se na guajakový papír před nanesením vzorku působí kyselinou, je možno předejít falešně pozitivním reakcím, které jsou katalyzovány peroxidázami, labilními v kyselém prostředí.

V případě, že se takto ošetřený papír užije spolu s vyvíjecím roztokem, který obsahuje pufr, vznikne modré zbarvení za přítomnosti vzorku s obsahem hemoglobinu, při vyloučení falešných výsledků. Například při použití syntetické žaludeční šťávy o pH 6,5 s obsahem čištěné peroxidázy z křenu v množství 2 jednotek/ml vznikají na prostředcích Hemoccult falešně pozitivní výsledky.

V případě, že se guajakový papír předem zpracuje působením kyselinou a pak se nanese svrchu uvedená žaludeční šťáva s peroxidázou a nechá se reagovat 5 minut před vyvíjením, modré zbarvení se nevytvoří.

Z použitelných kyselin pro impregnaci guajakového papíru je možno užít například kyselinu chlorovodíkovou, sírovou, citrónovou, fosforečnou a šťavelovou, je však možno užít další silné organické a anorganické kyseliny. Výhodné roztoky pro zpracování papíru jsou dále uvedeny:

Roztok I guajak 7,8g isopropanol 92,2g

Roztok II roztok I 800g kyselina citrónová 768g isopropanol 432g voda 300g

Roztok II je možno nanášet na absorpční papír impregnací nebo tiskem.

Vyvíjecí roztok je možno smísit s jakýmkoli známým pufrem, například se směsí kyseliny citrónové a citronanu sodného, kyseliny citrónové a hydrogenfosforečnanu sodného, tris-pufrem s maleátem nebo EDTA.

Do vyvíjecího roztoku s obsahem pufru se s výhodou přidává 1 až 5 °/o peroxidu vodíku. S výhodou byl užit následující roztok, který obsahoval 0,2 M pufr s kyselinou citrónovou a citronanem o pH 5,8.

Složka9 peroxid vodíku2,17 ethanol32,87 kyselina citrónová0,75 citronan sodný4,37 voda58,80

Triton X-1001,04

К vyvíjecímu roztoku s obsahem pufru se s výhodou přidává smáčedlo neiontového typu, které napomáhá inhibici peroxidázy. Velmi výhodné je použití prostředku Triton X, což je polyethylenglykol-p-isopktylfenylether.

V případě, že se nanese vyvíjecí roztok s obsahem pufru na prostředek, obsahující guajakový papír, zpracovaný působením kyseliny, dovoluje výsledný prostředek prokázat okultní krvácení i ve vzorcích s nízkým pH, například ve vzorcích žaludeční šťávy. Mimoto tento prostředek vylučuje vznik falešných pozitivních výsledků za přítomnosti cimetidinu, peroxidáz a kovových iontů, například iontů mědi a železa.

Claims (3)

1. Prostředek pro průkaz okultního krvácení v žaludeční šťávě, vyznačující se tím, že sestává z předního a zadního krytu, přičemž v předním krytu je proveden alespoň jeden otvor, z absorpčního substrátu, zpracovaného kyselinou bez pufru s obsahem guajaku jako reakčního činidla, uloženého pod předním krytem a pod otvory pro na nesení vzorku a ze sklopného krytu, který je uložen přes část předního krytu a je opatřen uzávěry pro udržení krytu v uzavřené poloze.

2. Prostředek podle bodu 1, vyznačující se tím, že substrátem je papír.

3. Prostředek podle bodu 1, vyznačující se tím, že kyselinou je kyselina citrónová.