Przedmiotem wynalazku jest zestaw testowy do badania krwi utajonej w tresci zoladkowej.Zestawy testowe i sposoby wykrywania krwi utajonej w kale sa dobrze znane. Przykladowo, w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 996 006 przedstawiono zestawy zawiera¬ jace bibule miedzy przednia a tylna plytka, z jednym lub wieksza iloscia otworów w przedniej plytce, z otworem w tylnej plytce i z obrotowymi przykrywkami na te otwory. Typowo, w przypadku badania na krew utajona w kale, bibulka przyjmujaca próbke jest absorbcyjnym papierem impregnowanym lub nasyconym odczynnikiem gwajakowym, natomiast wywolujacy roztwór, jak np. roztwór nadtlenku, jest wprowadzany przez otwór w tylnej plytce. Jedno z takich zestawów testowych sprzedawane jest pod nazwa firmowa „Hemocoult".Testprzeprowadza sie w sposób nastepujacy: próbke kalu rozmazuje sie na bibule z odczynni¬ kiem gwajakowym przez otwór w przedniej plytce. Plytke zalrywa sie, a nastepnie otwiera sie przykrywke na tylnej plytce. Na bibule nasycona odczynnikiem gwajakowym naklada sie przez odpowiedni otwór w tylnej plytce wywolujacy roztwór, taki jak nadtlenek wodoru. Jezeli w próbce kalu znajduje sie krew, odczynnik gwajakowy zabarwia bibule na niebiesko. Niebieskie zabarwie¬ nie jest spowodowane katalizowanym przez hemoglobine utlenianiem odczynnika gwajakowego.Bezbarwny H2O2 Niebiesko zabarwiony odczynnik „utleniony" gwajakowy Hemoglobina odczynnik gwajakowy Jednym z ograniczen testu gwajakowego jest fakt, ze katalizowane przez hemoglobine pow¬ stawanie niebieskiego zabarwienia jest zalezne od wartosci pH. Roztwór wywolujacy nie dziala powtarzalnie ponizej pewnej wartosci pH. Zakres wartosci pH dla pomyslnego wykonywania powyzszego ukladu wynosi okolo 4,0-7,0, optymalnie wartosc pH wynosi 5,5-6,0. Zatem, jezeli hemoglobina laczy sie z substratem traktowanym odczynnikiem gwajakowym w srodowisku, która rózni sie znacznie od optymalnej wartosci pH, wówczas powstajace zabarwienie moze byc niewiel¬ kie, a nawet w ogóle moze go nie byc.POLSKA RZECZPOSPOLITA LUDOWA URZAD PATENTOWY PRL\ 2 142241 \ Ze wzgledu na powyzsza niedogodnosc znany zestaw, nie jest przeznaczony do tesowa ya obcenosci krwi utajonej w próbkach o niskiej wartosci pH, np. w tresci zoladkowej o wartosci pil ponizej 2. Wykrycie skladników, których prawidlowo nie ma w tresci zoladkowej, a zwlaszcza krv; utajonej, ma znaczenie kliniczne. Krew w tresci zoladkowej moze pochodzic z róznych zróde. wlaczajac w to polknieta krew pochodzenia urazowego z poza przewodu pokarmowego oraz krew A krwawienia w obrebie tego przewodu. Krew moze byc obecna w zoladku w niektórych stanach; patologiczynch takich,jak rak zoladka, wrzód trawienny lub niezyt zoladka. Wypicie alkoholu lub t zuzycie róznych leków, takichjak aspiryna i inne srodki przeciwbólowe oraz kortykosterydy, moga' powodowac nadzerki komórek blony sluzowej zoladka i ewentualnie krwawienie z zoladka.Nadzerki zoladka i nastepowe krwawienie notowano równiez u chorych przyjetych do szpitala z » powodu ciezkich obrazen lub oparzen. Ten typ nadzerek moze wystapic w ciagu 24 godzin po • urazie i moze spowodowac ostry, zagrazajacy zyciu krwotok zoladka. Wczesne wykrycie niepo- dziewanej obecnosci utajonej krwi w przewodzie pokarmowym pomaga w rozpoznaniu którego¬ kolwiek z powyzszych stanów we wczesnym okresie, kiedy stany te moga byc leczone bardziej skutecznie.Próbowano ustabilizowac bibule impregnowana odczynnikiem gwajakowym lub pasek testowy w stosunku do zmian wartosci pH lub w stosunku do takich interferujacych substancji,jak peroksydazy. Opis patentowy RFN nr 2 716 060 przedstawia nasaczanie bibuly zawierajacej odczynnik gwajakowy srodkami buforujacymi lub chelatujacymi w celu pokonania wyzej opisa¬ nych problemów. Najistotniejsza potrzeba buforowania wystepuje wtedy, gdy badany material znacznie sie rózni od optymalnej wartosci pH, np. tresci zolodkowej, lub gdy trzeba wykryc male ilosci takiego katalizatora, jak hemoglobina.Celem wynalazkujest opracowanie zestawu testowego nie reagujacego na zmiany wartosci pH próbki, stosowanego do badania innego rodzaju próbek, niz pobranych z kalu, a który to zestaw wyeliminowuje falszywie dodatnie reakcje spowodowane obecnoscia perkozydaz, zelaza, miedzi oraz takich zwiazków chemicznych, jak cimetydyna.Obcenie stwierdzono, ze jezeli srodek buforujacy umieszczono w roztworze wywolujacym, a nie nasaczono nim bibuly z odczynnikiem gwajakowym, jak to podano w stanie techniki, wówczas zestaw testowy nie podlega wplywom zmian wartosci pH próbki i zostaja wyeliminowane falszywie dodatnie reakcje spowodowane obecnoscia peroksydaz, jonów metali i cimetydyny.Zestaw testowy do badania obecnosci krwi utajonej w tresci zoladkowej, skladajacy sie ze wskaznika zawierajacego odczynnik gwajakowy, umieszczonego na szkielku wzorcowym, oraz roztworu wywolujacego, wedlug wynalazku polega na tym, ze material chlonny wskaznika zawiera nie zbuforowany odczynnik gwajakowy i kwas a roztwór wywolujacy zawiera dodatkowo bufor.Jako material chlonny zestaw wedlug wynalazku zawiera arkusz bibuly absorpcyjnej, a jako kwas kwas cytrynowy.Szereg korzysci wynika z buforowania wywolujacego roztworu zamiast nasaczania buforami bibuly z odczynnikiem gwajakowym. Ilosc buforujacego srodka, jaka mozna nalozyc na bibule z odczynnikiem gwajakowym, jest ograniczona chlonnoscia bibuly. Dlatego tez, gdy konieczne jest silne buforowanie to jest ono bardziej skuteczne, gdy buforuje sie wywolywacz. Byloby równiez trudne równomierne nasaczanie bibuly buforem. Buforujac wywolywacz, nie ogranicza sie war¬ tosci pH do wartosci pH substratu i oznacza to, ze wartosc pH moze byc zmieniona. Gdy bibule raz sie nasaczy jej wartosc pH jest okreslona i ograniczona. Znaczne stezenie soli na bibule wplywa równiez na inne odczynniki i zmienia fizyczne wlasnosci samej bibuly.Buforujac roztwór wywoly¬ wacza nie zmienia sie sposobu wytwarzania zestwu testowego wedlug wynalazku i sposób ten jest bardzo ekonomiczny.Najkorzystniejsze wyniki osiagnieto przy polaczonym uzyciu zakwaszonej bibuly z odczynni¬ kiem gwajakowym i zbuforowanego wywolywacza. Stwierdzono, ze zakwaszenie bibuly z odczyn¬ nikiem gwajakowym eliminowalo falszywie dodatnie wyniki testu z cimetydyna i zmniejszalo inferencje z peroksydazami. Co wiecej, obecnosc kwasu w bibule z odczynnikiem gwajakowym zapobiega niebieszczeniu tego odczynnika w czasie przechowywania, kiedy moze zachodzic atmos¬ feryczne utlenianie. Zbuforowany wywolywacz jest potrzebny do wykrycia hemoglobiny w kwas¬ nych warunkach istniejacych w odczynniku gwajakowym. Jest to zilustrowane wynikami nastepu¬ jacych doswiadczen.142 241 3 Przyklad. Przygotowano próbki syntetycznej tresci zoladkowej, zawierajace 0,05mg hemoglobiny i 30 mg cimetydyny w 1 ml. Na szkielko „Hemoccult" nakladano próbki 25//l i wywolywano je buforowanymi i niebuforowanymi wywolywaczami. Nastepnie zakwaszano zestawy „Hemocoult" przez zakwaszenie bibuly z odczynnikiem gwajakowym przed nalozeniem i wywolaniem próbki. Tablica 1 i 2 przedstawiaja wyniki tych testów.Tablica 1 Buforowany i niebuforowany wywolywacz z zastosowaniem zestawów „Hemocoult" (odczyty po 30 sekundach) Wartosc PH próbki 1.32 2.20 3,60 4,32 5,60 6,37 Hemoglobina Buforowany wywolywacz 3 3 4 4 4 4 Niebuforowany wywolywacz 1 3 4 4 3 3 CIMETYDYNA Buforowany wywolywacz 0 0 0 0 0 0 Niebuforowany wywolywacz 1 2 2 2 4 4 Tablica 2 Zakwaszone i niezawkwaszone zestawy z buforowanym wywolywaczem Zestaw Czas odczytu (min) Wartosc pH próbki 1,32 5,60 6,37 HEMOGLOBINA Kwas 0,5 2 5 2 5 5 5 5 5 5 5 5 Bez kwasu 6,5 2 5 3 5 5 5 5 5 4 5 5 CIMETYDYNA Kwas 0,5 2 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Bez kwasu 0,5 2 5 0 0 A 0 0 0 0 3 5 Zestaw „Hemocoult" zakwaszono przez nalozenie na srodek bibuly z odczynnikiem gwajko wym 25//l 0,1 M kwasu cytrynowego. Pozostawiono bibule do wyschniecia w otaczajacych warun¬ kach. Zbuforowany wywolywacz zawieral nadtlenek wodoru w 0,2 M kwasie cytrynowym/buforze cytranianowym o pH 5,8. Jako niebuforowany wywolywacz stosowano handlowy wywolywacz „Hemocoult" zawierajacy nadtlenek wodoru w etanolu i wodzie.Intensywnosc niebieskiego koloru byla stopniowana od 1 do 5, przy czym zero oznaczalo brak zabarwienia. Nalezy zwrócic uwage w tabeli 1, ze zastosowanie buforowanego wywolywacza w zestawach „Hemocoult" dawalo bardziej regularne dodatnie testy w obecnosci hemoglobiny.Buforowany wywolywacz eliminowal równiez falszywie dodatnie wyniki powodowane przez cime- tydyne. Wyniki tabeli 2 wykazuja, ze zastosowanie zakwaszonej bibuly z odczynnikiem gwajko- wym w polaczeniu z buforowanym wywolywaczem nie powoduje falszywie dodatnich wyników powodowanych przez cimetydyne nawet wtedy, gdy odczyt testu byl opózniony i dokonywany po uplywie zwalczanych 30 minut. Nalezy zauwazyc, ze to postepowanie nie interferowalo na obec¬ nosc hemoglobiny.Katalizowana przez peroksydaze falszywie dodatnia reakcja jest równiez zalezna od wartosci pH i kataliza zmniejsza sie wraz z obnizaniem wartosci pH. Stwierdzono, ze kwasne traktowanie bibuly z odczynnikiem gwajakowym przed nalozeniem próbki zapobiega falszywie dodatniej reakcji katalizowanej przez peroksydazy labilne w kwasnym srodowisku. Zakwaszona bibula, jezeli stosuje sieja ze zbuforowanym wywolywaczem, daje niebieskie zabwarwienie w obecnosci próbek zawierajacych hemoglobine i nie interferuje z testem na hemoglobine. Np. syntetyczna tresc zoladkowa o wartosci pH 6,5, zawierajaca oczyszczona peroksydaze z chrzanu (2j ml), daje falszywie dodatnie wyniki gdy testuje sie ja szkieljiem „Hemocult". Gdy bibule z odczynnikiem gwajakowym traktowano uprzednio kwasem i nastepnie nakladano powyzsza syntetyczna tresc zoladkowa z peroksydaza i pozwalano jej wejsc w reakcje z kwasem przez 5 minut przed wywola¬ niem, wówczas nie dochodzilo do powstania niebieskiego zabarwienia.4 142 241 Nastepujace kwasy okazaly sie skuteczne w traktowaniu nimi bibuly z odczynnikiem gwajko wym: solny, siarkowy, cytrynowy, fosforowy i szczawiowy. Mozna stosowac i inne silne kwasy organiczne i nieorganiczne. Zalecane roztwory i metody kwasnego traktowania z odczynnikiem gwajakowym sa nastepujace: Roztwór I Odczynnik gwajkowy 7,8 g Izopropanol 92,2 g Roztwór II RoztwórI 800 g Kwas cytrynowy 768 g Izopropanol 432 g Woda 300g Roztwór II moze byc nakladany na absorpbujaca bibule badz przez impregancje, badz przez nasaczenie.Wywolywacz moze byc buforowany jakimkolwiek znanym ukladem buforujacym, np. kwas cytrynowy (cytrynian sodu, kwas cytrynowy) dwuzasadowy fosforan sodu, tris-maleinian lub EDTA.Buforowy roztwór wywolujacy winien zawierac okolo 1-5% nadtlenku wodoru. Nastepujacy buforowany wywolywacz oparty na ukladzie: 0,2 M kwas cytrynowy/bufor cytrynianowy o pH 5,8 byl z korzyscia stosowany w tym wynalazku.Nadtlenek wodoru 2,17 g Etanol 32,87 g Kwas cytrynowy 0,75 g Cytrynian sodu 4,37 g Woda 58,80g TritonX-100 l,04g Niejonowy detergent jest chetnie dodawany do buforowanego wywolywacza, by wspomóc hamowanie peroksydazy. Najkorzystniej stosuje sie detergent Triton X, eter polietyleno glikolo p-izooctylofenylu.Kiedy naklada sie buforowany wywolywacz na substrat bibuly z odczynnikiem gwajakowym, traktowanej kwasem, zestaw testowy daje stabilne wyniki i pozwala na wykonywaniew testów wykrywajacych utajona krew w próbach o niskiej wartosci pH, jak np. w tresci zoladkowej. Co wiecej, wyeliminowane zostaja falszywie dodatnie wyniki spowodowane cimetydyna, peroksyda- zami i jonami takich metali, jak miedz i zelazo.Zastrzezenia patentowe 1. Zestaw testowy do badania obecnosci krwi utajonej w tresci zoladkowej, skladajacy sie ze wskaznika zawierajacego odczynnik gwajakowy, umieszczonego na szkielku wzorcowym oraz roztworu wywolujacego, znamienny tym, ze material chlonny wskaznika zawiera nie zbuforowany odczynnik gwajakowy i kwas a roztwór wywolujacy zawiera dodatkowo bufor. 2. Zestaw wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze materialem chlonnym jest arkusz bibuly absorbcyjnej. 3. Zestaw wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze kwasem jest kwas cytrynowy.Pracownia Poligraficzna UP PRL. Naklad 100 cgz Cena 220 zl PL PL