HU192806B - Improved test plate apt for the detection of hidden blood and process for the detection of blood - Google Patents

Description

A találmány tárgya rejtett vér kimutatására alkalmas tökéletesített tesztlemez és eljárás a vár kimutatására.

A rejtett vér székletből való kimutatására alkalmas tesztlemezek és a kimutatásra szolgáló eljárás jól ismertek. A 3 996 006 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leiráaban például olyan tesztlemezt ismertetnek, melynek elülső és hátulsó lemeze között egy lap van, az elülső lemezen egy vagy több, a hátulsó lemezen egy nyilassal, amelyek elforgatható fedővel lefedhetök. A rejtett vér ezékletböl való kimutatásánál szokásos módon mintát hordozó lapként impregnált vagy gvajakollal átitatott abszorbeáló papírt, kifejlesztő oldatként pedig peroxidoldatot használnak, mely oldatot a hátulsó lemez nyílásán át juttatnak be a papírra. Ilyen tesztlemez „Hemoccult márkanéven van a kereskedelmi forgalomban.

A vizsgálati eljárás röviden összefoglalva a következő. A székletmintát az elülső lemez egyik nyílásán át a gvajakolos papírra kenik. Ezután a nyílást lefedik és a hátulsó lemezen lóvó nyílást kinyitják. Ezen a nyíláson keresztül bejuttatják a gvajakolos papírra az előhívó oldatot, például a hidrogén-peroxidot. Ha a székletben vér van jelen, a gvajakollal adott reakció folytán a papír megkékül. A kék szín a gvajakolnak hemoglobinnal katalizált oxidációja folytán jelenik meg.

Gvajakol H₂O₂ „Oxidált gvajakol

Színtelen Hemoglobin Kék színű

A gvajakol teszt használhatóságát korlátozó tényező, hogy a hemoglobinnal katalizált kék szín képződés pH függő reakació. A kifejlesztő oldat bizonyos pH érték alatt nem reagál reprodukálhatéan. Ez az ismert rendszer pH 4,0-7,0 tartományban működik megbízhatóan, legelőnyösebben az 5,5-6,0 pH tartományban. Így, ha a hemoglobint a gvajakolos papírra az optimálistól jelentősen eltérő pH-jú közegben vesszük fel, nem mutatható ki a kék szín, vagy csak igen halvány lesz.

Ezen hátrányok következtében az ismert tesztlemez nem használható a rejtett vér kimutatására alacsony pH-jú mintákból, például a gyomornedvből, melynek pH-ja 2,0 alatt lehet. Az olyan anyagok kimutatása, melyek normál állapotban nincsenek jelen a gyomortartalomban, különösen a rejtett vér kimutatása, klinikai szempontból jelentős. A gyomortartalomban lévő vér többféle eredetű lehet, ezek között származhat a gasztrointesztinális szakaszon kívülesö sérülés következtében lenyelt vérből vagy gasztrointesztinális vérzésből. Egyes patológiás esetekben, például gyomorrék, gyomorfekély és gasztritiez esetén vér lehet a gyomorban. Alkohol és különböző gyógyszerek, például aszpirin vagy más fájdalomcsillapító szerek és kortikoszteroidok fogyasztása a gyomor nyálkahártyájának erózióját és ennek folytán gyomorvérzést akozhat. Gyomor-nyálkahártya eróziót és ebből adódó vérzést jegyeztek fel olyan betegeknél, akiket súlyos sérülések vagy égés miatt vettek fel kórházba. Ez a fajta erózió az okozó sérülés bekövetkeztétől számított 24 órán belül jelentkezhet, és akut életveszélyt jelentő gyomorvérzést okozhat. A gasztrointesztinális szakaszban megjelenő rejtett vér ilyen korai kimutatásénak jelentősége, hógy a fenti esetekben olyan korai stádiumban segíti elő a diagnózis megállapítását, amikor a kezelés még igen hatásos.

Ezért a találmány célja olyan tesztlemez biztosítása, amelyre nincs hatással a minták különbözősége, sem a minta pH-ja, és amelylyel székleten kívül más anyagból is kimutatható a vér.

Célja továbbá a találmánynak, hogy a gyomornedvben lévő rejtett vér kimutatására gyors, könnyen kivitelezhető, mennyiségi vizsgálórendszert nyújtson, és ezzel a gaeztrointesztinális állapot diagnózisát elősegítse.

A találmány további célja olyan tesztlemez biztosítósa, mely peroxidáz, vas, réz vagy vegyszerek, például cimetidin jelenlétéből adódó téves pozitív reakciók kiküszöbölésére képes.

A gvajakollal impregnált papír vagy tesztlemez pH eltérésekkel és zavaró anyagokkal, például peroxidázzal szembeni stabilizálására korábban már történtek kísérletek. A 2 716 060 számú német közzétételi iratban arról számolnak be, hogy a gvajakolos papírba pufferoló vagy kelátképző anyagokat visznek a fenti problémák kiküszöbölésére. A pufferoló anyagokra azokban az esetekben van leginkább szükség, amikor a vizsgálandó közeg pH-ja jelentősen eltér az optimálistól, például gyomorfolyadékok esetén, vagy amikor kis katalizátormennyieéget, azaz hemoglobint kell kimutatni.

Nem várt módon azt találtuk, hogy ha a pufferoló anyagot a kifejlesztő oldatba visszük be, nem pedig a gvajakolos papírt impregnáljuk vele - amint azt a korábbiakban végezték - a tesztlemezre nincs hatással a minta pH-jának változása és nem jelentkezik téves pozitív reakció peroxidázok, fémionok vagy cimetidin jelenlétében sem.

A puffernek a papír impregnálása helyett a kifejlesztő oldathoz történő hozzáadása a következő lényeges előnyökkel jár. A gvajakolos papírra vihető puffer mennyiséget a papír abszorbeáló képessége korlátozza. Ezért amennyiben nagymértékű pufferolásra van szükség hatásosabb, ha a kifejlesztő oldatot pufferoljuk. Nehéz lenne a puffer egyenletes eloszlatása a papíron. A kifejlesztő oldat pufferolásával nem korlátozzuk a pH-t a szubsztrátum pH-jára, azaz a pH változtatható. Ha a papírt impregnáljuk, az impregnált papír pH-ja pontosan meghatározott és nem változtatható. Ha a papíron magas a sókoncenlráció, az más reagenseket is befolyásol és a papír saját fizikai jellemzői is megváltoznak. Amennyiben a kifejlesztő oldatot pufferoljuk, a tesztlemez előállítása változtatás nélkül, egyformán történhet, ennek pedig kedvező költségkihatása van.

Még előnyösebb eredményeket értünk el savval kezelt gvajakolos papír és pufferolt kifejlesztő oldat együttes alkalmazásával. Arra a felismerésre juttatunk, hogy a gvajakolos papír savas kezelésére megszűnteti a cimetidin és csökkenti a peroxidáz jelenléte folytán fellépő téves pozitív eredményeket. Ezen kívül - nam várt módon - a sav jelenléte a gvajakolos papiron megvédi a papírt a tárolás közben való megkéküléstől, ami a levegő oxigénje hatására következik be. A hemoglobinnak savas gvajakollal való kimutatásához pufferolt előhívó oldat szükséges. Ezt igazolják a következő kísérletek eredményei.

0,05 mg/ml hemoglobint és 30 mg/mi cimetidint tartalmazó szintetikus gyomorfolyadék mintákat készítettünk. 25 ,ul mintát „Hemoccult” lemezre vittünk és pufferolt vala5 mint nem pufferolt kifejlesztő oldattal előhívtuk. Ezután olyan gvajakolos lemezekkel végeztük el a vizsgálatot, melyet a minta felvitele ée kifejlesztése előtt savval kezeltünk. Ezeknek a vizsgálatoknak az eredményét az

1· ®s a 2. táblázatokban mutatjuk be.

1. táblázat

Pufferolt és nem pufferolt kifejlesztő oldat összehasonlítása az ismert „Hemoccult lemezen, 30 sec elteltével végezve az értékelést.

Minta	Hemoglobin		Cimetidin
pH-ja	pufferolt	nem pufferolt	pufferolt	nem pufferolt
1.32	3	1	0	1
2.20	3	3	0	2
3.60	4	4	0	2
4.32	4	4-	0	2
5.60	4	3	0	4
6.37	4	3	0	4

eonlítása pufferolt kifejlesztő oldat alkalma2. táblázat zásával

Savval kezelt és nem kezelt lemezek összeha- 35

Lemez	Hemoglobin	Cimetidin
savas	sav	nélkül	savas	sav	nélkül
Leolvasás ideje (perc)	0.5	2	5	0.5	2	5	0.5	2	5	0.5	2	5
1.32	2	5	5	3	5	5	0	0	0	0	0	0
5.60	5	5	5	5	5	5	0	0	0	0	1	5
6.37	5	5	5	4	5	5	0	0	0	0	3	5

A „Hemoccult lemezeket a gvajakolos 50 papír közepére felvitt 25 pl 0,1 Μ-os citromsavval megsavanyítjuk. A papírt használat előtt szobahőmérsékleten megszáritjuk. A pufferolt kifejlesztő oldat pH 5,8-as, 0,2 M-os citromeav/citrát pufferben hidrogén-peroxi- 55 dót tartalmaz. Nem pufferolt kifejlesztő oldatként a kereskedelmi forgalomban lévő „Hemoccult kifejlesztő oldatot használjuk, mely oldat etanolban ée vízben oldott hidrogén-peroxidot tartalmaz. 60

A kék szín intenzitását 1-5 fokozatba soroltuk, a 0 jelölés ezintelen tesztet jelent.

Az 1. táblázatból látható, hogy az ismert „Hemoccult tesztlemezen, pufferolt kifejlesztő oldat alkalmazásával következetesebben 65 jelentkezik - hemoglobin jelenlétét jelző pozitív eredmény. A pufferolt előhívó a cimetidin hatására jelentkező téves pozitív eredményeket is kiküszöböli. A 2. táblázatban ismertetett eredmények azt mutatják, hogy savval kezelt gvajakolos papiron, pufferolt kifejlesztő oldat alkalmazáséval cimetidin hatására még akkor sem jelentkezik téves pozitív eredmény, ha a teszt értékelését az optimálisként megadott 30 másodpercnél később végezzük. Meg kívánjuk jegyezni, hogy ez a kezelés nem okoz zavart a hemoglobin kimutatásában.

A peroxidáz által katalizált téves pozitív reakció ezintán pH-függő, a katalízis mértéke a pH csökkenésével csökken. Felismertük, hogy a gvajakoloe papír mintafelvitelt megelőző savas kezelése meggátolja a sav-labilis peroxidázok által katalizált tóvea pozitív reakciók fellépését. A savval kezelt papír pufferolt kifejlesztő oldat alkalmazása esetén hemoglobin-tartalmú minták jelenlétében kék színűvé válik, a kezelés hemoglobin meghatározását newm zavarja. 2 egység/ml tisztított tormaperoxidázt tartalmazó, pH 6,5-öa szintetikus gyomorfolyadék például „Hemoccult” lemezen vizegálva téves pozitív reakciót adott.

Ha ugyanezt a mintát savval kezelt gvajakolos papírra visezük és a kifejlesztés előtt 5 percig hagyjuk a savval reagálni, a pozitív reakciót jelző kék szín nem jelenik meg. 15

A gvajakoloe papír kezelésére megfelelőnek bizonyult a hidrogén-klorid, a kénsav, a citromeav, a foszforsav és az oxálsav. Ezeken kívül más erős szerves és szervetlen savak is használhatóak. A kővetkezőkben a gvajakolos papír összetételét és savas kezelését ismertetjük.

I. oldat

7.8 g gvajakol

92.2 g izopropanol

II. oldat

800 g I. oldat 768 g citromsav 432 g izopropanol 300 g víz

A II. oldatot az abszorbens papírra impregnáléssal vagy nyomással visszük fel.

A kifejlesztő oldatot bármely ismert puffer-rendszerrel, például citromsav/nátrium-citrét, citromsav/dinátrium-hidrogén-foszfát, trisz/maleét vagy EDTA pufferrel, pufferolhatjuk.

A pufferolt kifejlesztő oldat előnyösen

1-5% hidrogén-peroxidot tartalmaz. Találmányunkban előnyösen a következő, 0,2 mól/les pH 5,8-as citromsav/citrát pufferrel pufferolt kifejlesztő oldatot alkalmazzuk:

2.17 g hidrogón-peroxid 32.87 g etil-alkohol

0.75 g citromsav

4.37 g nátrium-citrát

58.80 g viz

1.04 g Triton X-100

A pufferolt kifejlesztő oldathoz előnyösen nemionos detergenst adunk, mivel ez is hozzájárul a peroxidáz gátlásához. Legelőnyösebben Triton X detergenst, polietiléngli5 költ vagy p-izooktil-fenil-étert alkalmazunk.

Savval kezelt gvajakoloe papír szubsztrátum és pufferolt kifejlesztő oldat alkalmazása esetén a tesztlemez rejtett vérnek alaceony pH-jú oldatokból, például gyomorfolya10 dékból történő kimutatására is alkalmas. Ezen kívül megszűnnek a cimetidin, a peroxidáz és a fémionok, például réz- és vasionok jelenléte folytén fellépő téves pozitív reakciók.

Claims (8)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Rejtett vér kimutatására alkalmas gvajakolt tartalmazó tesztlemez, azzal jelle20 mezve, hogy tesztreagensként gvajakolt tartalmazó, savval kezelt abszorbens szubsztrátumból áll.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti tesztlemez, azzal jellemezve, hogy a szubsztrátum ab25 szorbens papírt tartalmaz.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti tesztlemez, azzal jellemezve, hogy savként citromsavat tartalmaz.
4. 4. Eljárás rejtett vér kimutatáséra gyo30 morfolyadókból, azzal jellemezve. hogy a gyomorfolyadékot savval kezelt, gvajakol reagenst tartalmazó abszorbeáló szubsztrátumra visszük fel és 5,5-6,0 pH tartományba pufferolt kifejlesztő oldattal kezeljük, a ki35 fejlődő kék szint értékeljük.
5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kifejlesztő oldatként hidrogén-peroxid tartalmú reagenst alkalmazunk.
6. 6. Rejtett vér kimutatáséra alkalmas 40 teszt-készlet, azzal jellemezve, hogy gvajakol reagenst tartalmazó, savval kezelt abszorbens szubsztrátumot és a gvajakol-tartalmú szubsztrátumot vér jelenlétében kékre színező kifejlesztő oldatot tartalmazó tartályból 45 áll.
7. 7. Gvajakol-tartalmú szubsztrátumot vér jelenlétében kékre színező vizes kifejlesztő oldat, azzal jellemezve, hogy 0,2 mól/l-es pH 5,5-6,0 közötti citromsav/nátrium-citrát ol50 dattal pufferolt, 1-5% hidrogén-peroxidot és kívánt esetben egyéb adalékanyagot tartalmaz.
8. 8. A 7. igénypont ezerinti oldat azzal jellemezve, hogy adalékanyagként nemionos

   55 detergenst tartalmaz.