DK159173B - Fremgangsmaade til paavisning af bloedningsblod i mavesaft og proevesaet og fremkalderoploesning til anvendelse ved fremgangsmaaden - Google Patents

Description

i

DK 159173 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til påvisning af blødningsblod i mavesaft og et prøvesæt og en fremkalderopløsning til brug ved denne fremgangsmåde.

5 Prøveobjektbærere og/ procedurer til påvisning af blødningsblod i fækalt materiale er velkendte. F.eks. omhandler USA-patentskrift nr. 3.996.006 objektbærere med et substrat bestående af et prøvemodtagende lag mellem en forplade og en bagplade, hvor der er én eller flere åbninger 10 i forpladen og en åbning i bagpladen samt drejelige dæksler eller klapper til at dække disse åbninger. I tilfæde af en prøve for blødningsblod i fæces er det prøvemodtagende lag typisk absorberende papir, der er imprægneret eller påtrykt med guaiak, og en fremkaldende opløsning, såsom 15 en peroxidopløsning, påføres gennem åbningen i bagpladen.

En sådan prøveobjektbærer sælges under varemærket "Hemoc= cult".

Kort fortalt er bestemmelsesproceduren som følger. En prøve af fækalt materiale smøres på guaiakpapiret gennem 20 en åbning i forpladen. Pladen dækkes derpå, og bagpladens klap åbnes. En fremkalderopløsning, såsom hydrogenperoxid, påføres på guaiakpapiret via den tilsvarende åbning i bagpladen. Hvis blod er til stede i det fækale materiale, vil guaiakreaktionen farve papiret blåt. Den blå farve skyldes 25 den hæmoglobinkatalyserede oxidation af guaiaken.

Guaiak H2°2 "Oxideret" guaiak

Farveløst Hæmoglobin Blå farve.

En af de begrænsende egenskaber ved guaiakbestemmelsen er, at den hæmoglobinkatalyserede blå farvedannelse er pH-30 afhængig. Fremkalderopløsningen fungerer ikke på reproducerbar måde under en vis pH-værdi. pH-intervallet for den vellykkede funktion af ovennævnte kendte system er fra ca. 4,0 til 7,0, idet den optimale pH-værdi ligger mellem 5,5 og 6,0. Hvis således hæmoglobin påføres på det guaiak-35 behandlede substrat i et medium, der afviger signifikant fra den optimale pH-værdi, vil kun en ringe eller mulig-

DK 159173B

2 vis ingen farve blive registreret.

Som følge af den ovennævnte ulempe ved den nuværende objektbærer er denne ikke beregnet til påvisning af tilstedeværelsen af blødningsblod i prøver med en lav pH-værdi, 5 såsom mavesaft, der kan have en pH-værdi under 2. Påvisning af forbindelser, der ikke normalt er til stede i mave-indhold, specielt tilstedeværelsen af blødningsblod, er af klinisk betydning. Blod i maveindhold kan hidrøre fra mange kilder inklusive slugt blod efter læsion uden for 10 mave-tarmkanalen samt mave-tarmblødning. Ved visse patologiske lidelser, såsom kræft i maven, peptisk sårdannelse og mavekatar, kan blod være til stede i maven. Indtagelse af alkohol og forskellige lægemidler, såsom aspirin, andre analgetika og corticosteroider, kan forårsage 15 nedbrydninger i mavens slimceller og til sidst maveblød-ning. Mavenedbrydninger og efterfølgende blødning har også været registreret hos patienter, der indlægges på hospitaler til behandling for kritiske skader eller· forbrændinger. Denne nedbrydningstype kan forekomme i løbet af 20 24 timer efter den oprindelige læsion og kan resultere i akut livstruende maveblødning. Vigtigheden af denne u-ventet tidlige registrering af blødningsblod i mave-tarmkanalen ville medvirke til diagnostisering af enhver af de ovennævnte lidelser på et tidligt trin, hvor de kan 25 behandles mere effektivt.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at at mavesaften udbredes på et med upufret syre behandlet absorberende substrat indeholdende guaiak som reagens, at pufret fremkalderopløsning udbredes på nævnte substrat, og at man iagttager, om substratet farves blåt.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan gennemføres uanset variationer i prøve eller prøve-pH, og den er velegnet til prøver af mavesaft. Den kan således gennemføres som en hur- 30

DK 159173 B

3 tig, hensigtsmæssig kvalitativ test til hjælp ved diagnose af mave-tarmlidelser ved hjælp af tidlig påvisning af blødningsblod i mavesaft.

5 Endelig gør fremgangsmåden ifølge opfindelsen det muligt at eliminere falske positive reaktioner hidrørende fra tilstedeværelsen af peroxidaser, jern, kobber eller kemikalier, såsom cimetidin.

Opfindelsen angår endvidere et prøvesæt til påvisning af tilstedeværelsen af blødningsblod i mavesaft.

Der har tidligere været gjort forsøg på at stabilisere det guaiakimprægnerede papir eller den guaiakimprægnerede prøve-15 strimmel mod pH-variationer og generende stoffer, såsom peroxidaser. Tysk offentliggørelsesskrift nr. 2.716.060 omhandler inkorporering af pufferstoffer eller chelaterings-midler i guaiakpapiret med henblik på overvindelse af de ovenfor anførte problemer. Det mest kritiske behov for puf-20 ring foreligger, når de undersøgte medier afviger meget fra optimal pH-værdi, såsom i mavesaft, eller når små mængder katalysator, såsom hæmoglobin, skal påvises.

Det har uventet vist sig, at når pufringsmidlerne blev 25 placeret i fremkalderopløsningen og ikke imprægneret ind i guaiakpapiret som det sker ved den kendte teknik, påvirkes prøveobjektbæreren ikke af variationer i prøve eller prøve-pH, og falske positive reaktioner som følge af tilstedeværelsen af peroxidaser, metalioner og cimetidin 30 blev elimineret.

Prøvesættet ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at det omfatter et syrebehandlet absorberende materiale indeholdende guaiakreagens og en beholder indeholdende en pufret 3g fremkalderopløsning, der reagerer med nævnte reagens til blåfarvning af substratet.

DK 159173 B

4

Fremdeles angår opfindelsen en fremkalderopløsning til anvendelse ved den omhandlede fremgangsmåde, hvilken opløsning er ejendommelig ved, at den indeholder fra ca. 1% til ca. 5% hydrogenperoxid og er pufret med 0,2M citron-5 syre/natriumcitrat med en pH-værdi på ca. 5,8.

Flere store fordele følger af pufring af fremkalderopløsningen i stedet for imprægnering af guaiakpapiret med puffere. Mængden af pufringsmidler, som kunne påføres på 10 guaiakpapiret, er begrænset som følge af papirets absorp tionsevne. Når derfor kraftig pufring er nødvendig, vil det være mere effektivt at pufre fremkalderen. Det ville også være vanskeligt at få en ensartet fordeling af puffere på papiret. Ved pufring af fremkalderen· er pH-værdien 15 ikke begrænset til substratets pH-værdi, dvs. at pH-værdien kan ændres. Når først papiret er imprægneret, er pH-værdien veldefineret og begrænset. En kraftig saltkoncentration på papiret ville også påvirke andre reagenser og ændre papirets fysiske egenskaber. Ved pufring af fremkalderop- 20 løsningen vil der ikke ske nogen ændring i fremstillingsproceduren for prøveobjektbæreren. Denne løsning er meget effektiv i henseende til omkostninger.

Særdeles fordelagtige resultater blev opnået med den kom-25 binerede anvendelse af syrebehandlet guaiakpapir og en pufret fremkalder. Det viste sig, at syrebehandling af guaiakpapiret eliminerede falske positive prøver med ci= metidin og formindskede forstyrrelser hidrørende fra per= oxidaser. Syren i guaiakpapiret hindrer endvidere på" uven-30 tet måde guaiaken i at blive blå under lagring, når atmosfærisk oxidation kan finde sted. Den pufrede fremkalder er nødvendig for at muliggøre hæmoglobinpåvisning under de sure betingelser, der findes i guaiaken. Dette illustreres af resultaterne ved de efterfølgende forsøg.

Prøver af syntetisk mavesaft indeholdende 0,05 mg hæmoglobin og 30 mg cimetidin pr. ml blev fremstillet. 25 yl 35 DK 159173 B - 5 prøver blev påført på "Hemoccult"-objektbærere og fremkaldt med pufrede og upufrede fremkaldere. "Hemoccult"-objektbærerne blev derpå syrnet ved hjælp af syrebehandling af guaiakpapiret forud for påføring og fremkaldelse 5 af prøverne. De efterfølgende tabeller 1 og 2 viser resul taterne af disse forsøg.

Tabel 1: Pufret kontra upufret fremkalder med rigtige "Hemoccult"-objektbærere, aflæsninger efter 10 30 sekunder.

Prøve Hæmoglobin Cimetidin pH pufret upufret pufret upufret fremkaldt fremkaldt fremkaldt fremkaldt 1.32 3 1 0 1 15 2,20 3 3 0 2 3.60 4 4 0 2 4.32 4 4 0 2 5.60 4 3 0 4 6,37 4 3 0 4 2Q Tabel 2: Syrnede kontra usyrnede objektbærere: med pufret fremkalder.

Hæmoglobin Cimetidin

Objektbærere_syre_ingen syre syre ingen syre 25 Aflæsningstid (minutter) 0,5 2 5 0,5 2 5 0,5 2 5 0,5 2 5 1,32 2 553 550 000 00 5,60 5 555 550 000 15 3 0 6,37 5 5 54 550 000 35 "Hemoccult"-objektbærer blev syrnet ved behandling af midten af guaiakpapiret med 25 μΐ 0,1M citronsyre. Papiret 35 fik lov til at tørre ved omgivelsernes betingelser før anvendelse. Den pufrede fremkalder indeholdt hydrogenperoxid i en 0,2M citronsyre/citratpuffer med en pH-værdi på 5,8.

DK 159173 B

6

Den upufrede fremkalder var den i handelen gående "Hemoc= cult"-fremkalder omfattende hydrogenperoxid i ethanol og vand.

5 Intensiteten af den blå farve blev gradueret efter en skala fra 1 til 5, idet 0 er farveløs. Det vil fremgå af tabel 1, at anvendelsen af pufret fremkalder på de rigtige "Hemoc= cult"-objektbærer frembringer en mere konsistent positiv hæmoglobinbestemmelse. Den pufrede fremkalder eliminerede 10 også i falske positive prøver forårsaget af cimetidin.

Resultaterne i tabel 2 viser, at anvendelsen af syrnet guaiakpapir i forbindelse med pufret fremkalder ikke vil frembringe et falsk positivt resultat som følge af cime= tidin selv når prøveaflæsningerne blev udsat og foretaget 15 efter de foreskrevne 30 sekunder. Det vil fremgå, at den ne behandling ikke forstyrrede bestemmelsen af hæmoglobin.

Den peroxidase katalyserede falske positive reaktion er også pH-afhængig, idet katalyse formindskes med faldende pH-værdi. Det viste sig, at syrebehandling af guaiakpa-20 piret forud for prøvepåføring hindrer en falsk positiv reaktion, der er katalyseret af syrelabile peroxidaser.

Det behandlede papir vil, når det anvendes sammen med en pufret fremkalder, frembringe en blå farve med hæmoglobin-holdige prøver og vil ikke forstyrre bestemmelsen af hæmo-25 globin. Syntetisk mavesaft med pH 6,5 indeholdende renset peberrodsperoxidase [2 enheder pr. ml] resulterede ved afprøvning med "Hemoccult"-objektbærer eksempelvis i falske positive resultater. Når guaiakpapiret var forbehandlet med syre, og den ovennævnte syntetiske mavesaft med per-30 oxidase blev påført og fik lov til at reagere med syren i 5 minutter før fremkaldelse, blev den blå positive farve ikke frembragt.

Syrer der viste sig effektive til behandling af guaiak-35 papiret, var saltsyre, svovlsyre, citronsyre, phosphor- r 7

DK .159173 B

syre og oxalsyre. Andre stærke organiske og uorganiske syrer kan anvendes. En foretrukken sammensætning og fremgangsmåde til syrebehandling af guaiakpapiret er som følger: 5 Opløsning 1.

Guaiak 7,8 g

Isopropanol 92,2 g

Opløsning II.

10 -

Opløsning I 800 g

Citronsyre 768 g

Isopropanol 432 g

Vand 300 g.

15

Opløsning II kan påføres på det absorberende papir enten ved imprægnering eller påtrykning.

20 Fremkalderen kan pufres med ethvert velkendt pufringssystem, såsom eksempelvis citronsyre/natriumcitrat, citronsyre/di= basisk natriumphosphat, tris-maleat eller EDTA.

Den pufrede fremkalderopløsning vil fortrinsvis indeholde 25 fra ca. 1% til ca. 5% hydrogenperoxid. Den nedenfor nævnte pufrede fremkalder, som er en 0,2M citronsyre/citratpuffer med en pH-værdi på 5,8, er fordelagtigt blevet benyttet i forbindelse med den foreliggende opfindelse.

30 Hydrogenperoxid 2,17 g

Ethanol 32,87 g

Citronsyre 0,75 g

Natriumcitrat 4,-37 g

Vand 58,80 g 35 "Triton" X-100 1,04 g

Fortrinsvis sættes en ikke-ionisk detergent til den pufrede fremkalder med henblik på at medvirke til peroxidase-inhiberingen. Mest fordelagtigt anvendes en "Triton" X-

Claims (5)

1. Fremgangsmåde til påvisning af blødningsblod i mavesaft, kendetegnet ved, at mavesaften udbredes på et med upufret syre behandlet absorberende substrat indeholdende 15 guaiak som reagens, at pufret fremkalderopløsning udbredes på nævnte substrat, og at man iagttager, om substratet farves blåt.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, 20 at fremkalderopløsningen indeholder hydrogenperoxid.

3. Prøvesæt til påvisning af tilstedeværelsen af blødningsblod i mavesaft, kendetegnet ved, at det omfatter et syrebehandlet absorberende materiale indeholdende guaiak- 25 reagens og en beholder indeholdende en pufret fremkalderopløsning, der reagerer med nævnte reagens til blåfarvning af substratet .

4. Fremkalderopløsning til anvendelse ved fremgangsmåden 30 ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den indeholder fra 1% til 5% hydrogenperoxid og er pufret med 0,2M citronsy-re/natriumcitrat med en pH-værdi på ca. 5,8.

5. Opløsning ifølge krav 4, kendetegnet ved, at 35 den er tilsat et ikke-ionisk detergent. r