DE2330106A1 - Verfahren zur bestimmung einer komponente mit hilfe eines testpapiers - Google Patents

Verfahren zur bestimmung einer komponente mit hilfe eines testpapiers

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Description

betreffend:
"Verfahren zur Bestimmung einer· Komponente mit Hilf e eines Testpapiers"
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung einer Komponente eines Eeaktionssystems, wobei die Bestimmung .
ehrauf der Oxidation einer omogenen Verbindung beruht und wobei ein Testpapier verwendet wird, das mit den restlichen Komponenten des Beaktionssystems versehen ist und wobei man das Testpapier mit der zu untersuchenden Flüssigkeit in Berührung bringt, in der die zuerst genannte Komponente bestimmt werden eo.ll.
Viele Bestimmungen sowohl auf chemischem als auch auf biochemischem Gebiet werden gestört durch das Vorhandensein
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«ar te ^^ (,
unerwünschter Verbindungen. Um die Zuverlässigkeit der Bestimmung zu erhöhen, wird die Wirkung einer störenden Verbindung häufig durch Maskierung neutralisiert. Die störende Verbindung kann auch aus dem System entfernt werden, in dem die Bestimmung durchgeführt werden soll, durch Zugabe eines Absorbtionsmittels, wie Aktivkohle oder Benton.it oder einem Ionen austauschenden Material·.
Wenn Absorbentien oder Ionen austauschende Materialien f'd.c diefse Zwecke angewandt werden, besteht die Gef&hr, daß nicht nur die störende Verbindung oder Verbindungen axis der zu untersuchenden Flüssigkeit entfernt werden, sondern auch die Komponente des Reaktionssystems, die bestimmt v/erden soll.
Bei der Bestimmung von beispielsweise Glucose in Urin mit Hilfe eines Testpapiers, das mit Glucose-osidasc, Peroxidase und einer chromogenen Verbindung imprägniert ist, ver-cion die Ergebnisse ernsthaft gestört durch das Vorhandensein reduzierender Komponenten, wie Harnsäure und Aacorbinsäurc (Vitamin C).
Es hat sich gezeigt, daß die Zuverlässigkeit und Virksankoit der Bestimmung einer Komponente eines Reaktionssystems, die auf der Oxidation einer chromogenen Verbindung beruht und bei der ein Testpapier verwendet wird, das mit den restlichen Komponenten des Reaktionssystems imprägniert ist und wobei man das Testpapier mit der zu untersuchenden Flüssigkeit in Berührung bringt, in der die zuerst genannte Komponente bestimmt werden soll, wesentlich verbessert werden kann, indem man die zu untersuchende Flüssigkeit zunächst mit einem Material, das im wesentlichen aus Cellulose
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oder einer cellulosöartigen Substanz besteht, in Berührung bringtj wobei das Material vorher einer Behandlung mit einem Oxidationsmittel unterworfen worden ist.
Überraschenderweise hat es sich gezeigt, daß dieses behandelte Material die in der zu untersuchenden Flüssigkeit vorhandenen störenden Verbindungen sehr selektiv inaktiviert. Bei Anwendung des so behandelten Materials, z.B. zur Bestimmung von Glucose in Urin, der Harnsäure und Ascorbinsäure als störende Verbindungen enthält, mit Hilfe von Glucose-cjcidase, Peroxidase und einer oxidierbaren chromogenen Verbindung, z.B. o-Tolidin oder der reduzierten Form von 2,6-Dichlor-phenolindophenol, üben diese störenden Verbindungen keinen nachteiligen Einfluß auf das Ergebnis der Bestimmung aus.
Das erwähnte Material, das im wesentlichen aus Cellulose . oder einem celluloseähnlichen Material besteht, kann mit irgend einem geeigneten Oxidationsmittel behandelt werden, das es nicht vollständig zerstört. Besonders werden gute Ergebnisse erhalten mit Perhalogensäuren, Salzen von Persäuren und Hypochloriten, z.B. mit Perjodsäure, Kaliumpermanganat und Natriumhypochlorit. Als bequeme und billige Behandlungsmethode hat sich die Verwendung handelsüblicher Bleichflüssigkeit oder deren konzentrierter Form erwiesen.
Der Behandlung folgt natürlich eine sorgfältige Entfernung von überschüssigem Oxidationsmittel von dem behandelten Material. Außerdem kann das so behandelte Material - wenn nötig - getrocknet werden.
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Das behandelte Material kann getrennt oder zusammen mit einem Testpapier verwendet werden und kann auch selbst das Testpapier sein. Das behandelte Material eignet sich besonders zur Anwendung auf oder in dem Testpapier, das zur Bestimmung einer Komponente eines Eeaktionssystems angewandt wird, z.B. bestehend aus einem Peroxid, Peroxidase und einer oxidierbaren chromogenen Verbindung oder bestehend aus einer Wasserstoffperoxid liefernden Oxidoreductase, einem geeigneten Substrat dafür, einer Peroxidase und einer oxidierbaren chromogenen Verbindung· Neben dem behandelten Material enthält das Testpapier alle Komponenten des Eeaktionssystems mit Ausnahme natürlich der zu bestimmenden Komponente. Darüber hinaus kann das Testpapier einen oder mehrere Hilfsstoffe, z.B. eine Puffersubstana, enthalten, soweit erforderlich.
Die Komponenten des Eeaktionssystems können entweder als freie Substanzen oder an einen geeigneten Träger gebunden angewandt werden, wobei die gebundene Form auf verschiedene Arten, z.B. durch Adsorption oder durch kovalente Bindung mit dem Träger erhalten werden kann. Die zuletzt genannte Form wird vorzugsweise angewandt, da dadurch verhindert wird, daß die jeweilige Verbindung während der Bestimmung leicht aus dem Testpapier ausgelaugt wird und da sie außerdem die Möglichkeit ergibt, wenn gewünscht, indirekt die Menge des Trägermaterials zu bestimmen. So kann z.B. das Testpapier für die Bestimmung von Peroxidase Wasserstoffperoxid enthalten, das an einen Phosphatpuffer gebunden ist, während Peroxidase selbst auch an einen geeigneten Träger, z.B. Humanchoriongonadotrop^in (HCG) gebunden sein kann. In dem zuletzt genannten Beispiel ist die
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gefundene Peroxidasemenge gleichzeitig ein Maß für die Menge an HGG.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert,
Beispiel 1
Filterpapierstreifen (Schleicher und Schüll 2316) von 20 χ 4 em Größe, wurden in eine Lösung von 4 g Perjodsäure in 600 ear Wasser ungefähr 16 Stunden eingetaucht (über Nacht stehen gelassen). Dann wurden die Streifen mit Wasser gewaschen, bis eine negative Reaktion auf Perjodsäure beobachtet wurde, und anschließend getrocknet.
B e i s ρ i e 1 2
Filterpapierstreifen (S & S 589/3; 83 - 87 g Papier/m2) in einer Größe von 20 χ 5 cm, wurden 3 Stunden in eine Lösung gelegt, bestehend aus 300 cnr 0,1 η Kaliumpermanganat und 30 cm* 4 η Schwefelsäure. Dann wurden die Streifen mit 0,1 η Schwefelsäure gewaschen, bis keine violette bzw, purpurne Sarbe mehr sichtbar war. Anschließend wurden die Streifen mit einer 3%igen Lösung von Wasserstoffperoxid behandelt, bis das gesamte Mangandioxid, das in dem Papier enthalten war, vollständig gelöst war. Schließlich wurden die Streifen mit Wasser gewaschen, bis eine negative Reaktion auf Wasserstoffperoxid auftrat.und anschließend getrocknet.
Beispiel 3
Streifen von Whatman 3 MM-Papier (185 g Papier/m ) wurden
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5 Stunden in eine Natriumhy^pochloritlösung (5 g aktives Chlor pro 100 cmr) gelegt. Nach sorgfältigem Waschen mit Wasser, bis die Reaktion auf Chlor negativ war (KJ-Stärkepapier), wurden die Streifen getrocknet.
Beispiel 4
Streifen von Whatmann 3 MM-Papier (15 x 6 cm) wurden ungefähr 16 Stunden in eine Lösung getaucht, bestehend aus 200 CDK llatriunihypochlorit (1Q g aktives Chlor pro 100 cnr ) und 200 cm* 4 η Hatriumhydroxid. !lach dem Waschen mit Wasser, bis die Reaktion auf Chlor negativ war, wurden die Streifen getrocknet.
Beispiel 5
100 g Cellulosepulver wurden mit 500 cnr der Lösung des Beispiels 4 5 Stunden behandelt und dann mit Wasser gewaschen, bis die Reaktion auf Chlor negativ war und die Reaktion des Waschwassers neutral. Schließlich wurde das Cellulosepulver an der Luft getrocknet.
B e i sp i e 1 6
(a) Ein Filterpapierstreifen mit einer Breite von 6 cm, der auf die in Beispiel 4 beschriebene Weise hergestellt worden war, wurde zweimal in einer Phosphatpufferlöpung gewaschen (bestehend aus 13,6 g Kaiiumdihydrophosphat in 800 cnr Wasser, zu der ausreichend 4 η Hatriumhydroxidlösung zugegeben worden war, um einen pH-Wert von 6,8 zu erhalten und anschließend das Volumen mit Wasser auf 1000 cm ergänzt worden war) und dann getrocknet. Die Puffer-
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lösung wurde aufbewahrt.
(b) 100 mg Ascorbinsäure wurden in 5 cnr Wasser gelöst. Anschließend wurde eine Lösung von 100 mg 2,6-Dichlorphenolindophenol (DCPIP) und 400 mg Polyvinylpyrrolidon (PVP) in 35 cnr absolutem Äthanol zugegeben, wobei man eine leicht gefärbte Losung erhielt (ein etwa auftretender Niederschlag kann durch Zentrifugieren entfernt werden).
(c) Dann wurde in der Mitte des Papierstreifens nach (a) längs ein Streifen (Breite ungefähr 5 mm) mit der nach (b) erhaltenen reduzierten DGPIP-Lösung gezogen und anschließend der Streifen getrocknet.
(d) Zu 200 cm* der Phosphatpufferlösung nach (a) wurden 16 cnr einer 30%igen Wasserstoffperoxidlösung gegeben. Der DCPIP-Streifen nach (c) wurde getrocknet und anschließend ein Streifen (Breite ungefähr 5 mm) mit der PhoBphatpuffer-Wasserstoffperoxid-Lösung (Ph-H) in einem Abstand daneben gezogen und ebenfalls getrocknet.
(e) Nach dem Trocknen wurde das so hergestellte Papier in Streifen von 60 χ 7 mm geschnitten und zwar so, daß in federn Streifen ein ECPIP- und ein Ph-Η-Bereich war.
(f) Zu 0,1 cm* einer Urinprobe von einer Frau, von der angenommen wurde, daß sie schwanger war, indem das Vorhadensein von Humanchoriongonadotrop/.in (HCG) gezeigt werden sollte, wurden 0,1 cur Antisermn (Kaninchen-Anti HCG) gegeben und zwar ausreichend, um 0,2 Einheiten HCG zu binden.
Nach einer Wartezeit von ungefähr 2 Minuten wurden 0,1 cm*
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einer Lösung von HOG-Peroxidasekonjugat mit einer Potenz von 0,2 Einheiten HCG pro 0,1 cnr gegeben.
Das Gemisch wurde zviei Minuten stehen gelassen und während dieser Zeit ab und zu geschüttelt. Anschließend wurde eine Suspension von Schafr-Antikaninchen-y-Globulin, das an Cellulose gekuppelt war, zugegeben.
Dann wurde die Suspension 5 Minuten stehen gelassen und während dieser Zeit ab und zu geschüttelt. Anschließend wurde die überstehende Flüssigkeit in einem Papierstreifen, wie unter (e) beschrieben, absorbiert. Der Streifen wurde so in die Flüssigkeit gehalten, daß der Ph— H-Streifen unterhalb des .DCPIP-Streifens war. Eine deutlich blaue Färbung zeigte das Vorhandensein von HCG in der Urinprobe an.
(g) Der gleiche Test mit einem Papierstreifen, der nicht durch Oxidation vorbehandelt worden war, ergab jedoch nur eine sehr schwache Farbänderung.
Beispiel 7
Zu 1 cm* der in dem Beispiel 6 (f) erwähnten Urinprobe wurden 50 mg Cellulosepulver gegeben, das, wie im Beispiel 5 beschrieben, vorbehandelt worden war. Das Gemisch wurde 1 Minute geschüttelt und anschließend 0,1 cnr dieser Flüssigkeit auf das Vorhandensein von HCG entsprechend Beispiel 6 untersucht, wobei jedoch ein Testpapier verwendet wurde, das nicht oxidiert worden war. Es bildete sich eine deutliche blaue Färbung.
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Beispiel 8
Der in Beispiel 6 beschriebene Versuch kann auch durchgeführt werden mit einem £Destpapier, das alle erforderlichen Reagentien enthält. Dabei wird folgendermaßen gearbeitet:
Zu 28,6 cm^ destilliertem Wasser wurden 11,43 g CuSO^.5H3O unter Erhitzen auf 95°C gegeben. Die Lösung wurde auf etwa 50 bis 6O0G abgekühlt. Dann wurden 22,86 cur einer 25%i&*en Ammoniaklösung zugegeben, wobei sich ein Niederschlag von Cu(OH)O bildete, der bei weiterer Zugabe von Ammoniak wieder in Lösung ging. Jetzt wurde die Lösung weiter auf 0 bis 5°C abgekühlt und anschießend 800 mg Saccharose und 1000 mg m-Aminobenzyloxymethyleellulose zugegeben. Für die Herstellung dieser Cellulose wird hingewiesen auf "Methods in Immunology and Immunochemistry", Bd. 1, Herausgeber CA. Williams und M.W. Chase (Academic Press, New York, London, 1967, S. 378"). Dann wurden 5,7 cm5 10 η NaOH zugegeben, wobei sich das Cellulosederivat vollständig löste.
Ein Streifen von Whatman 3 MM-FiIterpapier in einer Größe von 20 χ 8 cm, der wie im Beispiel 4 beschrieben vorbehandelt und mit einer 0,5 m Lösung von
.worden war
KH-^PO. getränkt und getrocknet,/wurde mit einem Streifen der Cu-CeIIuIοse-Lösung (Breite 15 mm) versehen.
Durch das Vorhandensein des primären Phosphats wurde der pH-Wert so stark erniedrigt, daß die gelöste Cellulose auf dem Papier ausfiel. Es wurde ein blauer Streifen sichtbar. Nun wurde das Papier einige Zeit mit kalter 0,1 η HgSO^ gewaschen, wobei die Waschflüssigkeit regel-
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mäßig durch neue ersetzt wurde. Der gesamte Prozeß, der dazu dient, alle Spuren von Kupfer zu entfernen, kann bis zu 24 Stunden dauern.
Dann wurden 14 g NaNO2 in 1000 em^ 1,6 η H2SO4 gelöst. Das Papier wurde 30 Minuten mit dieser Lösung behandelt (die Lösung wurde 3 bis 4 Mal durch eine frische ersetzt). Dann wurde das Papier mit destilliertem Wasser bissur Neutralität gewaschen und dann in einem Boratpuffer, der hergestellt worden war durch Lösen von 3,1 g H7BO1Z und 20 cnr 1 η NaOH in destilliertem V/asser, Einstellung des pH-Wertes auf 8,6 mit 4 η NaOH und Ergänzen der Lösung auf 1 1 mit destilliertem V/asser. Dieser Boratpuffer wurde ersetzt durch eine Lösung von Schaf-Antikaninchen-y-Globulin (2,5 mg pro cm in Boratpuffer, pH 8,6) und das Papier über Kaehb in dieser Lösung gehalten, wobei der pH-V/ert des Papiers und des Puffers auf 8,6 gehalten wurde. Dann wurde die Globulin-Lösung dekantiert und das Papier schließlich mit einer gesättigten Lösung von ß-Raphthol im Boratpuffer mit einem pH-Wert von 8,6 behandelt. Diese zuletzt genannte Behandlung wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Das Papier wurde schließlich mit einem 0,1 m Phosphatpuffer mit einem pK-Uert von 6,8 wie im Beispiel 6 erwähnt, gewaschen und getrocknet. Dann wurde dieses Papier mit den anderen I'iGaktionskompononten, nämlich einem Streifen einer reduzierten DCPIP-Lösung, einem Streifen von Harnstoff-WasserstofSuperoxid (ausgehend von einer 1,6%igen Lösung inÄthanol) unterhalb des Streifens von Cellulose-Sehaf-Antikaninchen-γ-Globulin und einem Streifen HCG-Peroxidase-Kongugav und unter dem zuletzt genannten einem Streifen von Antiserum-(Kaninchen-Anti-HCG·) versehen. Die letzten zwei Komponenten
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wurden in äquivalenten Mengen aufgebracht und in einer solchen Weise, daß Urin, enthaltend 2 E HCG/cm-5 genau die Menge an Antiserum binden kann. Zu diesem Zweck muß die Saugfähigkeit jeder Menge Papier immer wieder bestimmt werden. Als das Papier mit allen Komponenten versehen und getrocknet worden war, wurde es in Streifen geschnitten (Breite 7 mm).
Wenn man Urin in dem Papier absorbiert und wenn ausreichend HCG vorhanden ist, was auf das Vorliegen einer Schwangerschaft hindeutet, bindet der absorbierte Urin das Antiserura, transportiert das aufgebrachte HCG-Peroxid durch das Papier, eetst auf dem Weg ausreichend Wasserstoffperoxid aus dem Harnstoff-Wasserstoffperoxid und schließlich der Peroxidase frei und das Wasserstoffperoxid reagiert mit dem reduzierten DCPIP, wobei eine blaue Farbe auftritt.
Wenn keine Schwangerschaft vorliegt, reagiert das Antiserum mit dem HCG-Peroxidase-Konjugat und der gebildete Komplex wird von der Schaf-Antikaninchen-y-Globulin-Zone fest~ gehalten. Polglich erreicht die Peroxidase nicht den Redox»Indikator und das Papier bleibt ungefärbt.
Be i 3 ρ i e 1 2.
Zum Nachweis von Glucose in Körperflüssigkeiten wurde ein Filterpapierstreifen, wie im Beispiel $ beschrieben, vorbehandelt. Anschließend wurde das Papier gesättigt mit einer Lösung enthaltend die folgenden Reagentien:
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Glucose-oxidase 200 mg
Meerrettichperoxidase 5 mg
o-Tolidin 100 mg
Zitronensäure 600 mg
Natriumcitrat'2 H2O 1 275 mg
Wasser 20 cm^
Nach dem Trocknen wurden die auf diese Weise hergestellten Papierstreifen erfolgreich zur Bestimmung von Glucose in Körperflüssigkeiten in Gegenwart von üblicherweise störenden reduzierenden Substanzen angewandt.
Die gleichen guten Ergebnisse tfurden erhalten bei Verwendung der reduzierten Form von 2,6-Di-chlor-phenolindophenol anstelle von o-Tolidin (s. Beispiel 10).
Beispiel 10
Testpapier, wie es in Beispiel 9 zum Nachweis von Glucose beschrieben ist, wurde auf die folgende Weise hergestellt:
(a) Zu 100 mg Vitamin Cin5 cnr V/asser, wurde eine Lösung von 100 mg DOPIP und 400 mg PVP in 35 cm^ absolutem Äthanol gegeben.
(b) Filterpapier, das entsprechend Beispiel 4 vorbehandelt worden war, wurde mit einem 0,1 m Phosphatpuffer (pH 5»6) getränkt und dann getrocknet. Dann wurde ein Streifen (Breite ungefähr 5 mm) der reduzierten DCPIP-Lösung (entsprechendfa)) aufgebracht und das Papier getrocknet.
(c) Unter diesem Streifen wurde ein Streifen aus einer Lösung
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von 200 mg Glueose-oxidase und 5 mg Meerrettichperoxidase in 20 cnr Wasser aufgebracht.
(d) Das so erhaltene Papier wurde getrocknet, anschließend die zu untersuchende Flüssigkeit in Streifen des jeweiligen Papiers aufgesaugt und zwar so, daß die Flüssigkeit zunächst das Enzymsystem passieren mußte, um den Redox-Indikator zu erreichen. Die Intensität der blauen Farbe, die sich zeigte, war um das Mehrfache größer als die Intensität der blauen Farbe bei dem gleichen Versuch, der mit nicht behandeltem Papier durchgeführt worden war.
Beispiel
11
Zum Nachweis sehr kleiner Mengen Galactose in Körperflüssigkeiten (das Vorhandensein reduzierender Substanzen ist durch die Natur der Dinge sehr störend) wurde Papier mit sehr guten Ergebnissen angewandt, das auf die im Beispiel 1 beschriebene V/eise vorbehandelt, anschließend in einer Lösung der folgenden Zusammensetzung getränkt und getrocknet worden war:
Zusammensetzung der Lösung:
0, 1 m Phosphatpuffer (pH 6,8) Galactose-oxidase (8000 E/mg) Meerrettich-p eroxidase o-Tolidin
60
2 mg 20 mg 200 mg in 20 cm^ Äthanol,
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Beispiel 12,
Zum Nachweis von Bacteriuria wurde vorteilhaft von der Tatsache Gebrauch gemacht, daß kleine Mengen Glucose, die immer in Urin vorhanden sind, durch Mikroorganismen abgebaut werden.So weist die Tatsache, da3 keine Glucose nachgewiesen werden kann, auf das Vorhandensein von Mikroorganismen hin. Besonders bei den hier herrschendes Versuchsbedingungen ist es wesentlich, daß reduaierende Komponenten in dem zu untersuchenden Urin nicht vorhanden sind. Das auf die im Beispiel 2 beschriebene V/eise behandelte Papier, das mit den erforderlichen Beagentien, entsprechend den Beispielen 9 oder 10 versehen war, konnte erfolgreich angewandt werden.
PATEIi TAKSPRÜCHE:
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Claims (5)

  1. ( Ό/ · Verfahren zur Bestimmung einer Komponente eines ^■-iteaktionssystems, die auf der Oxidation einer chromogenen Verbindung beruht und mit Hilfe eines Testpapiers, das die restlichen Komponenten des Eeaktionssystems enthält, durchgeführt wird, wobei man das Testpapier mit der'zu untersuchenden Flüssigkeit, in der die zuerst genannte Komponente, die bestimmt werden soll, enthalten ist, zusammenbringt, dadurch gekennzeichnet , daß man die zu untersuchende Flüssigkeit zunächst mit einem Material zusammenbringt, bestehend im wesentlichen aus Cellulose oder einer celluloseartigen Substanz, wobei das Material einer Behandlung mit einem Oxidationsmittel unterworfen worden ist·
  2. 2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man ein Testpapier verwendet, das das behandelte Material enthält oder daraus hergestellt ist.
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  3. 3) Testpapier zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch. 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß das Testpapier ein Material enthält "oder daraus hergestellt worden ist, das im wesentlichen aus Cellulose oder einer celluloseartigen »Substanz besteht und das. einer Behandlung mit einem Oxidationsmittel unterworfen v/orden ist. .
  4. 4·) Testpapier nach Anspruch 3 zur Bestimmung .von Humanchoriongonadotropin,dadurch gekennzeichnet daß es als/ Komponenten Antikörper gegen Huaanchoriongonadotx*op-in ein Konjugat von Humanchariongonadotrophin und Peroxidase, unlöslich gemachte Antikörper, ein Substrat für die Peroxidase und eine oxidierbare chromogene Verbindung enthält.
  5. 5) Testpapier nach Anspruch 3 zum Nachweis von Humanenoriongonadotrop/in, dadurch gekennzeichnet , daß das Testpapier als restliche Komponenten Antikörper gegen Humanchoriongonadotrophin» ein Konjugat von Humanchoriongonadotrop^in und einer Wasserstoffperoxid liefernden Oxido-*!eductase,ein Substrat dafür, unlöslich gemachte Antikörper, Peroxidase und eine oxidierbare chromogene Verbindung enthält.
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DE2330106A 1972-06-14 1973-06-13 Verfahren zum Bestimmen einer Komponente eines Reaktionssystems sowie Testpapier zur Durchführung des Verfahrens Expired DE2330106C3 (de)

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DE2330106B2 DE2330106B2 (de) 1978-03-30
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