DE2257265A1 - Medizinisches pruefmittel - Google Patents
Medizinisches pruefmittelInfo
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Description
Die Erfindung betrifft ein medizinisches Prüfinittel und bezieht
sich besonders auf Untersuchungen, bei denen Reagenzien verwendet werden, die Benzidin odor benzidinartige Verbindungen
wie o-Dianiaidin oder o-Tolidin enthalten.
Bekannte Reagenzien, die bsnzidinartige Verbindungen enthalten,
mußten kurz vor der Verwendung hergestellt werden, wenn sie
deutliche Mengen an Wasser enthielten. Selbst Reagenzien, die
nur absolutes Äthanol oder wasserfreien Methylalkohol enthielten (mit benzidinartigen Verbindungen), konnten nur
einige Monate aufbewahrt werden, und sie mußten im Kühlschrank
aufbewahrt werden, um eine entsprechende Stabilität zu erhalten.
.
Dieses Stabilitätsproblem veranlaßte einige Lieferfirmen ,
die vorbereitete medizinische Testpackungen verkaufen, das
zubereitete Reagenz gefrierzutrocknen
309S22M215
um ihm eine bessere Stabilität zu verleihen. Dadurch
wurde die Stabilität etwas erhöht, aber die Kosten wesentlich erhöht.
Die Erfindung betrifft Reagenzien, die für medizinische
Tests bzw. für Untersuchungen verwendet v/erden und die
Benzidin oder benzidinartige Verbindungen enthalten. Es hat
sich gezeigt, daß derartige Reagenzien stabilisiert v/erden können, wenn Die mindestens ungefähr 50 4>
einer Verbindung enthalten, wie 1,2-Äthandiol, 1,2-Propandiol, 1,5-Propandiol,
1,4-Butandiol, 2,5-Butandiol, und / oder 1,2,3-Propantriol.
Die erfindungsgemäßen Reagenzien sind selbst bei erhöhten
Temperaturen mindestens 1 J;;-hr l^ng stabil. "Durch die Verwendung
sehr reiner Verbindungen tritt keine Störung von
Ablefjewerten auf, die sich auf die optische Dichte beziehen
und auf Grund der Tatsache , daß die Verbindungen mit V/al?.--er
vollständig mischbar sind, tritt keine Schwierigkeit auf bei:::
Vermischen des Reagenzes mit anderen wässrigen Reagenzien,
Serum, Plasma oder Urin,, Die erf indungageuäß stabiliai η rl en
Reagenzien sind wesentlich wirtschaftlicher als die "bekonnten
gefriergetrockneten.
Der wichtigste Test für den die erfindungngei^ißen Reagen-ion
geeignet sind, ist dor Nachweis von (ilxicooe. i)v>
soll ,1« ti cc ti
betont werden, daß sich die Erfindung allgemein auf die
Stabilisierung eines Reagenzes bezieht, das für medizinische
Untersuchungen verwendet wird und nicht auf eine spezielle
medizMsehe Untersuchung.
Die zur näheren Erläuterung der Erfindung dienenden 33OiOpJ-(Jl?;
beziehen sich auf die Verwendung des erfindungsgemliüen
Reagenzes zum Nachweis von Glucose in üerum.
309822/1215' BAD 0R/G(NAL
Reagenzien enthaltendinindestens 0,001$ Benzidin öder
benzidinartige Verbindungen, wie o~Dianisidin Und ο-ΐο-1-i-din
werden normalerweise für medizinische Testverfahren verwendet« Es hat sich gezeigt, daß,wenn derartige Reagenzien mindestens
ungefähr 50 $ einer stabilisierenden Verbindung, wie
1,2-Äthandiol, 1,2-Propandiol, 1,3-^Propandiol, 1,4-Butandiol,
2,3-Butandiol und/oder 1,2,3-Propatttriol enthalten, sie für
lange Zeit stabil ■ sind , ohne daß sie gekühlt werden müssen.
Vorzugsweise sollten die Reagenzien mindestens 80$ der stabilisierenden Verbindung enthalten und idealerweise würden
die Reagensien nur'die stabilisierende Verbindung und
Benzidin oder eine benzidinartige Verbindung enthalten*
Die stabilisierende Verbindung sollte von einer hohen Reinheit sein um eine optische Klarheit zu erreichen, sodaß bei
der optischen Dichtebestimmung bei medizinischen Untersuchungen keine Störung auftritt.
Zur Bestimmung des Blutzuckerspiegels werden die folgenden
Reagenzien verwendet:
a) Glucose-oxidase-Peroxidase-LÖsung
b) Puffer-Lösung
c) o-Diänisidin-LöBung
d) ein Puffer-7?arbstoff~Gemisch
e) Sehwefeisäureiüsung und
f) Glucosestandardlösung.
Die GlUGosecxidase-peroxidase-LÖsung ist ein handelsübliches
Produkt (Perpico Laboratories, Chicago 9* Illinois)*
Die 0,15 m Acetat-Puffer-Lüsunn, pH 5,0 wird hergestellt
üuroli Zugabe von )·],9B g Matriumacetattrih:/drat zii 500
(ici5tillicrto:'i V/nnser in einem 1000 cmJ Meßkolben*
j. 4 ~
BAD ORIGINAL
L·, C-
-Der Kolben wird geschüttelt um den Inhalt zu lösen. 2,3 cm'
Essigsäure v/erden zu dem Inhalt des Kolbens zugegeben und
3 mit destilliertem Wasser auf 1000 cm au.
wird dann potent io metrisch eingestellt.
mit destilliertem Wasser auf 1000 cm aufgefüllt. Die Lösung
Das o-Dianisidin-Reagenz wird hergestellt, indem man 2 g o-Dianisidinhydrochlorid ( Permco lot no. 97-966) in einen
■χ
Mischer gibt.500 cmy chromatographisch reines 1,2-Propandiol
(99,37$ rein, Matheson, Coleman & Bell: Cincinnati, Ohio) werden in den Mischer gegeben und das Gemisch 5 Minuten mit
hoher Geschv/indigkeit vermischt. Das Gemisch v/ird dann in Zentrifugier - Flaschen gegeben und mit 2 500 UpM 10 Minuten
zentrifugiert .Nach dem Zentrifugieren v.'ird die überstehende-Lösung
in einen 500 cm- Kolben gegeben, der mit einen Stopfen
verschlossen v/ird. Es wird darauf geachtet, das Gemisch vor atmonsphärischer Feuchtigkeit zu schützen. Das Gemisch v/irr]
dann ein Jahr bei 22°c gelagert. Nach dem Jahr wird der Versuch mit dem 1 Jahr alten o-Dianisidin-Reagenz durchgeführt
.
Die Puffer-Ftrbstoff-Mischung v/ird hergestellt durch Zugabe
3 3 ~
von 0,5 cnr o-Dianisidin-Filtrat zu 99,5 cm der Acetat-Puffer-Lösung,
pH 5,0.
Die Schwefelsäurelösung wird hergestellt durch Zugabe von 2 Teilen konzentrierter Schv/efelsäure, 3 Teilen destilliertem
Wasser.Die Säure sollte vorsichtig zu dem Wasser zugegeben werden um ein Verspritzen und Überhitzen zu vermeiden. Nach
dieser Zugabe sollte die entstehende Substanz abkühlen.
Die Glucose-Standardlösung wird hergestellt durch Verdünnung
von 1,0 g Dextrose auf 100 cm^ mit einer 0,25 $-igen v/äßrigen
Benzoesäure-Lösung. Die entstehende verdünnte Lösung sollte 24 Stunden zur Umkehr des Drehungsveriaögens stehengelassen
werden.
_ 5 _ 309822/ 1215
| Standard | cm | 0,25$ Benzoesäure- | cm |
| lösung | cm | . Lösung | cm |
| 0,25 | cm cm |
9,75 | cm cm |
| 0,50 | cm | 9,50 | cm . |
| 1,0 2,0 |
cm cur |
9,0 8,0 |
cm cm |
| 3,0 | 7,0 | ||
| 4,0 5,0 |
6,0 5,0 |
— 5 —
• Mögliche Standardlösungen für dieses Verfahren sind im folgenden angegeben.
25 mg/100
50 mg/100 cm; 100 mg/100 cm5
200 mg/100 cm5
300 mg/100 cm5 400 mg/100 cm5
'500 mg/100 cm5
Um den Blutzuckerspiegel von Serum oder Plasma zu bestimmen werden 0,02 ca5 C-lucose-oxidase-Peroxidase- Lösung in ein
optisch ausgewähltes Rohr gegeben. Die Inhalte des Rohrs v/erden lyophilis.iert.· Das Rohr wird dann mit einem Polyäthylen-Stopfen
verschlossen. Der Inhalt des Rohrs - das Enzym. - ist
in diesem Zustand unter Kühlung nur Monate stabil.
2,0 cm-1 des Puffer-Farbstoff-Gemisches werden zu deia Enzym
das in dem oben angegebenen Rohr ist, zugegeben um das Enzym. zu rekonstituieren. Das Rohr wird dann 2 oder 3 mal umgedreht;«
um das Enzym zu lösen. 0,013 cm5 des zu untersuchenden
Serums oder Plasmas werden in das oben angegebene Rohr gegeben. Der Stopfen wird wieder aufgesetzt und das Rohr zum
Vermischen umgedreht. Das Rohr wird 30 Minuten in einem Wärmeblock oder Wasserbad bei 37 C inkubiert. 2,0 cm des
Schwexelsäuregemisches werden in das Rohr gegeben und der
Stoplfen erneut aufgesetzt und das Rohr zum Vermischen umgedreht.
Das Rohr wird dann in ein. Colorimeter mit einem 5 25 ms Filter gegeben und der Wert abgelesen.
- 6 3098 22/121S
Um das Colorimeter zu eichen v/erden 0,01 ein jeder der oben
angegebenen 25, 50, 100, 300, 400 und 500 mg pro 100 era5
Standard-Lösungen zu den jeweiligen Rohren augegeben. Jedes der Rohre wird genau wie eine unbekannte Serum- oder Plasmaprobe
nach dem oben angegebenen Verfahren untersucht.
Die mit dem 1 Jahr alten Reagenz erhaltenen Ergebnisse sind mindestens ebenso genau wie Ergebnisse, die mit einem frisch
hergestellten o-Dianisidin-Reagenz erhalten werden. Es hat οich
gezeigt, daß die Ergebnisse bei hohen Glucose-Konzentrationen genauer sind, wenn man das Reagenz mit 1,2-Propandiol verwendet,
als wenn man eine Reagenz verwendet, das nur Methanol oder Äthanol enthält.
Das Verfahren des Beispiels 1 v/ird wiederholt, wobei ein Gemisch von 1,2-Propandiol und o-Dianisidin 6 Monate bei
50 c gelagert, v/ird. Man erhält die gleichen Ergebnisse.
Um die Einwirkung von Feuchtigkeit auf das o-Dian:: e;i:.; id inReagenz
zu untersuchen wurden v/ietere Versuch, durchgeführt,
wobei entsprechend den Beispielen 1 und P gearbeitet v/urdc,
mit der Ausnahme, daß V/asser zu dem o-Dianisidin-Reng'im: in
Mengen von 5, 10, 20, 30, 40 und 5Os zugegeben wurde. Eo v/urdo
im wesentlichen kein Unterschied festgestellt, bei den Ergebnissen der Versuche init 5, 10 und 20 lß>
Wasser. Die Genauigkeit v/ird herabgesetzt vei 30 und 4Ofο V/asser und 50^a V/asser führt
zu Ergebnissen, die nur um ein geringes besser sind als die ohne 1,2-Propandiol erhaltenen.
309822/1215
BAD ORlGiNAt
Die Verfahren der Beispiel 1 bis 3 wurden angewandt, wobei 1,2-lthandiol, 1,3-Propandiol, 1,4-Butandiol, 2,3-Butandiol
und 1,2,3-PropantriQl jeweils einzeln an Stelle des 1,2Propandio^
verwendet wurden. All diese Verbindungen führten im wesentlichen zu dem gleichen Effekt, obwohl 2,3-Butandiol es
erforderlich macht, daß der \§:such oberhalb seines Schmelzpunktes
(34 C) durchgeführt wird, wodurch eine gewisse Schwierigkeit auftritt.
Beispiele 7 bis 12
Es wurde entsprechend den Beispielen 1 bis 6 gearbeitet, wobei o-Tolidin, o-Dianisidin und Benzidin jeweils einzeln anstelle
von o-Dianisidin-Hydrochlorid verwendet wurden. In jedem Falle zeigte es sich, daß diese Verbindungen eine ■"■
bessere Stabilität in Reagenzien entsprechend den Beispielen besitzen im Vergleich zu Eeagenzien, bei denen Äthanol, Methanol
oder einfach Wasser verwendet wird.
Patentansprüche
0 9 3 2 2/1215'
Claims (6)
- PatentansprücheMedizinisches Reagenz, enthaltenda) mindestens ungefähr 50$ einer stabilisierenden Verbindung, wie 1,2-Äthandiol, 1,2-Propandiol, 1,3-Propandiol, 1,4-Butandiol, 2,3 -Butandiol und/oder 1,2,3-Propantriol undb) mindestens 0,001 $ einer 2. Verbindung, wie Benzidin, o-Dianisidin, o-Dianisidin-Hydrochlorid und/oder o-Tolidin.
- 2. Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekenn, zeichnet, daß die stabilisierende Verbindung so rein ist» daß sie eine optisch l&are Lösung ergibt und bei der Bestimmung der optischen Dichte nicht stört.
- 3· Reagenz nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die stabilisierende Verbindung 1,2-Propandiol ist.
- 4· Reagenz nach Anspruch 1 bis 3* dadurch gekennzeichnet , daß die 2. Verbindung o-Dianisidin-Hydrochlorid ist.
- 5. Reagenz nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß das Reagenz mindestens 80 fo stabilisierende Verbindung enthält.
- 6. Reagenz nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es nur die stabilisierende Verbindung und die 2. Verbindung enthält.309822/1215*7· , Verwendung des' Reagenses nach. Anspruch. 1 bis 6 zur Bestimmung der Konzentration von Glucose in einer biologischen Flüssigkeit, wobei man Glucose-oxidase zur Wasserstoffperoxidbildung verwendet und Peroxidase zu Umwandlung eines Reagenses in eine gefärbte Verbindung in Gegenwart von Wasserstoffperoxid verwendet.309322/1215
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
| E77 | Valid patent as to the heymanns-index 1977 |