DE2257265A1

DE2257265A1 - Medizinisches pruefmittel

Info

Publication number: DE2257265A1
Application number: DE2257265A
Authority: DE
Inventors: Roy Eugene Speck
Original assignee: Bio Dynamics Inc
Current assignee: Bio Dynamics Inc
Priority date: 1971-11-22
Filing date: 1972-11-22
Publication date: 1973-05-30
Also published as: AU469201B2; AU4884472A; DE2257265C3; US3753863A; JPS49133092A; DE2257265B2

Description

Die Erfindung betrifft ein medizinisches Prüfinittel und bezieht sich besonders auf Untersuchungen, bei denen Reagenzien verwendet werden, die Benzidin odor benzidinartige Verbindungen wie o-Dianiaidin oder o-Tolidin enthalten.

Bekannte Reagenzien, die bsnzidinartige Verbindungen enthalten, mußten kurz vor der Verwendung hergestellt werden, wenn sie deutliche Mengen an Wasser enthielten. Selbst Reagenzien, die nur absolutes Äthanol oder wasserfreien Methylalkohol enthielten (mit benzidinartigen Verbindungen), konnten nur einige Monate aufbewahrt werden, und sie mußten im Kühlschrank aufbewahrt werden, um eine entsprechende Stabilität zu erhalten. .

Dieses Stabilitätsproblem veranlaßte einige Lieferfirmen , die vorbereitete medizinische Testpackungen verkaufen, das zubereitete Reagenz gefrierzutrocknen

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um ihm eine bessere Stabilität zu verleihen. Dadurch wurde die Stabilität etwas erhöht, aber die Kosten wesentlich erhöht.

Die Erfindung betrifft Reagenzien, die für medizinische Tests bzw. für Untersuchungen verwendet v/erden und die Benzidin oder benzidinartige Verbindungen enthalten. Es hat sich gezeigt, daß derartige Reagenzien stabilisiert v/erden können, wenn Die mindestens ungefähr 50 4> einer Verbindung enthalten, wie 1,2-Äthandiol, 1,2-Propandiol, 1,5-Propandiol, 1,4-Butandiol, 2,5-Butandiol, und / oder 1,2,3-Propantriol.

Die erfindungsgemäßen Reagenzien sind selbst bei erhöhten Temperaturen mindestens 1 J;;-hr l^ng stabil. "Durch die Verwendung sehr reiner Verbindungen tritt keine Störung von Ablefjewerten auf, die sich auf die optische Dichte beziehen und auf Grund der Tatsache , daß die Verbindungen mit V/al?.--er vollständig mischbar sind, tritt keine Schwierigkeit auf bei::: Vermischen des Reagenzes mit anderen wässrigen Reagenzien, Serum, Plasma oder Urin,, Die erf indungageuäß stabiliai η rl en Reagenzien sind wesentlich wirtschaftlicher als die "bekonnten gefriergetrockneten.

Der wichtigste Test für den die erfindungngei^ißen Reagen-ion geeignet sind, ist dor Nachweis von (ilxicooe. i)v> soll ,1« ti cc ti betont werden, daß sich die Erfindung allgemein auf die Stabilisierung eines Reagenzes bezieht, das für medizinische Untersuchungen verwendet wird und nicht auf eine spezielle medizMsehe Untersuchung.

Die zur näheren Erläuterung der Erfindung dienenden 33OiOpJ-(Jl?; beziehen sich auf die Verwendung des erfindungsgemliüen Reagenzes zum Nachweis von Glucose in üerum.

309822/1215' BAD _0R/G(NAL

Reagenzien enthaltendinindestens 0,001$ Benzidin öder benzidinartige Verbindungen, wie o~Dianisidin Und ο-ΐο-1-i-din werden normalerweise für medizinische Testverfahren verwendet« Es hat sich gezeigt, daß,wenn derartige Reagenzien mindestens ungefähr 50 $ einer stabilisierenden Verbindung, wie 1,2-Äthandiol, 1,2-Propandiol, 1,3-^Propandiol, 1,4-Butandiol, 2,3-Butandiol und/oder 1,2,3-Propatttriol enthalten, sie für lange Zeit stabil ■ sind , ohne daß sie gekühlt werden müssen. Vorzugsweise sollten die Reagenzien mindestens 80$ der stabilisierenden Verbindung enthalten und idealerweise würden die Reagensien nur'die stabilisierende Verbindung und Benzidin oder eine benzidinartige Verbindung enthalten* Die stabilisierende Verbindung sollte von einer hohen Reinheit sein um eine optische Klarheit zu erreichen, sodaß bei der optischen Dichtebestimmung bei medizinischen Untersuchungen keine Störung auftritt.

Beispiel 1

Zur Bestimmung des Blutzuckerspiegels werden die folgenden Reagenzien verwendet:

a) Glucose-oxidase-Peroxidase-LÖsung

b) Puffer-Lösung

c) o-Diänisidin-LöBung

d) ein Puffer-7?arbstoff~Gemisch

e) Sehwefeisäureiüsung und

f) Glucosestandardlösung.

Die GlUGosecxidase-peroxidase-LÖsung ist ein handelsübliches Produkt (Perpico Laboratories, Chicago 9* Illinois)*

Die 0,15 m Acetat-Puffer-Lüsunn, pH 5,0 wird hergestellt üuroli Zugabe von )·],9B g Matriumacetattrih:/drat zii 500 (ici5tillicrto:'i V/nnser in einem 1000 cm^J Meßkolben*

j. 4 ~

BAD ORIGINAL

L·, C-

-Der Kolben wird geschüttelt um den Inhalt zu lösen. 2,3 cm'

Essigsäure v/erden zu dem Inhalt des Kolbens zugegeben und

3 mit destilliertem Wasser auf 1000 cm au.

wird dann potent io metrisch eingestellt.

mit destilliertem Wasser auf 1000 cm aufgefüllt. Die Lösung

Das o-Dianisidin-Reagenz wird hergestellt, indem man 2 g o-Dianisidinhydrochlorid ( Permco lot no. 97-966) in einen

■χ

Mischer gibt.500 cm^y chromatographisch reines 1,2-Propandiol (99,37$ rein, Matheson, Coleman & Bell: Cincinnati, Ohio) werden in den Mischer gegeben und das Gemisch 5 Minuten mit hoher Geschv/indigkeit vermischt. Das Gemisch v/ird dann in Zentrifugier - Flaschen gegeben und mit 2 500 UpM 10 Minuten zentrifugiert .Nach dem Zentrifugieren v.'ird die überstehende-Lösung in einen 500 cm- Kolben gegeben, der mit einen Stopfen verschlossen v/ird. Es wird darauf geachtet, das Gemisch vor atmonsphärischer Feuchtigkeit zu schützen. Das Gemisch v/irr] dann ein Jahr bei 22°c gelagert. Nach dem Jahr wird der Versuch mit dem 1 Jahr alten o-Dianisidin-Reagenz durchgeführt .

Die Puffer-Ftrbstoff-Mischung v/ird hergestellt durch Zugabe

3 3 ~

von 0,5 cnr o-Dianisidin-Filtrat zu 99,5 cm der Acetat-Puffer-Lösung, pH 5,0.

Die Schwefelsäurelösung wird hergestellt durch Zugabe von 2 Teilen konzentrierter Schv/efelsäure, 3 Teilen destilliertem Wasser.Die Säure sollte vorsichtig zu dem Wasser zugegeben werden um ein Verspritzen und Überhitzen zu vermeiden. Nach dieser Zugabe sollte die entstehende Substanz abkühlen.

Die Glucose-Standardlösung wird hergestellt durch Verdünnung

von 1,0 g Dextrose auf 100 cm^ _mit einer 0,25 $-igen v/äßrigen Benzoesäure-Lösung. Die entstehende verdünnte Lösung sollte 24 Stunden zur Umkehr des Drehungsveriaögens stehengelassen werden.

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Standard	cm	0,25$ Benzoesäure-	cm
lösung	cm	. Lösung	cm
0,25	cm cm	9,75	cm cm
0,50	cm	9,50	cm .
1,0 2,0	cm cur	9,0 8,0	cm cm
3,0	7,0
4,0 5,0	6,0 5,0

— 5 —

• Mögliche Standardlösungen für dieses Verfahren sind im folgenden angegeben.

Konzentration

25 mg/100

50 mg/100 cm^; 100 mg/100 cm⁵ 200 mg/100 cm⁵ 300 mg/100 cm⁵ 400 mg/100 cm⁵ '500 mg/100 cm⁵

Um den Blutzuckerspiegel von Serum oder Plasma zu bestimmen werden 0,02 ca⁵ C-lucose-oxidase-Peroxidase- Lösung in ein optisch ausgewähltes Rohr gegeben. Die Inhalte des Rohrs v/erden lyophilis.iert.· Das Rohr wird dann mit einem Polyäthylen-Stopfen verschlossen. Der Inhalt des Rohrs - das Enzym. - ist in diesem Zustand unter Kühlung nur Monate stabil.

2,0 cm-¹ des Puffer-Farbstoff-Gemisches werden zu deia Enzym das in dem oben angegebenen Rohr ist, zugegeben um das Enzym. zu rekonstituieren. Das Rohr wird dann 2 oder 3 mal umgedreht;« um das Enzym zu lösen. 0,013 cm⁵ des zu untersuchenden Serums oder Plasmas werden in das oben angegebene Rohr gegeben. Der Stopfen wird wieder aufgesetzt und das Rohr zum Vermischen umgedreht. Das Rohr wird 30 Minuten in einem Wärmeblock oder Wasserbad bei 37 C inkubiert. 2,0 cm des Schwexelsäuregemisches werden in das Rohr gegeben und der Stoplfen erneut aufgesetzt und das Rohr zum Vermischen umgedreht. Das Rohr wird dann in ein. Colorimeter mit einem 5 25 ms Filter gegeben und der Wert abgelesen.

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Um das Colorimeter zu eichen v/erden 0,01 ein jeder der oben angegebenen 25, 50, 100, 300, 400 und 500 mg pro 100 era⁵ Standard-Lösungen zu den jeweiligen Rohren augegeben. Jedes der Rohre wird genau wie eine unbekannte Serum- oder Plasmaprobe nach dem oben angegebenen Verfahren untersucht.

Die mit dem 1 Jahr alten Reagenz erhaltenen Ergebnisse sind mindestens ebenso genau wie Ergebnisse, die mit einem frisch hergestellten o-Dianisidin-Reagenz erhalten werden. Es hat οich gezeigt, daß die Ergebnisse bei hohen Glucose-Konzentrationen genauer sind, wenn man das Reagenz mit 1,2-Propandiol verwendet, als wenn man eine Reagenz verwendet, das nur Methanol oder Äthanol enthält.

Beispiel 2

Das Verfahren des Beispiels 1 v/ird wiederholt, wobei ein Gemisch von 1,2-Propandiol und o-Dianisidin 6 Monate bei 50 c gelagert, v/ird. Man erhält die gleichen Ergebnisse.

Beispiel 3

Um die Einwirkung von Feuchtigkeit auf das o-Dian:: e;i:.; id inReagenz zu untersuchen wurden v/ietere Versuch, durchgeführt, wobei entsprechend den Beispielen 1 und P gearbeitet v/urdc, mit der Ausnahme, daß V/asser zu dem o-Dianisidin-Reng'im: in Mengen von 5, 10, 20, 30, 40 und 5Os zugegeben wurde. Eo v/urdo im wesentlichen kein Unterschied festgestellt, bei den Ergebnissen der Versuche init 5, 10 und 20 ^lß> Wasser. Die Genauigkeit v/ird herabgesetzt vei 30 und 4Ofο V/asser und 50^a V/asser führt zu Ergebnissen, die nur um ein geringes besser sind als die ohne 1,2-Propandiol erhaltenen.

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BAD ORlGiNAt

Beispiele 4- "bis 6

Die Verfahren der Beispiel 1 bis 3 wurden angewandt, wobei 1,2-lthandiol, 1,3-Propandiol, 1,4-Butandiol, 2,3-Butandiol und 1,2,3-PropantriQl jeweils einzeln an Stelle des 1,2Propandio^ verwendet wurden. All diese Verbindungen führten im wesentlichen zu dem gleichen Effekt, obwohl 2,3-Butandiol es erforderlich macht, daß der \§:such oberhalb seines Schmelzpunktes (34 C) durchgeführt wird, wodurch eine gewisse Schwierigkeit auftritt.

Beispiele 7 bis 12

Es wurde entsprechend den Beispielen 1 bis 6 gearbeitet, wobei o-Tolidin, o-Dianisidin und Benzidin jeweils einzeln anstelle von o-Dianisidin-Hydrochlorid verwendet wurden. In jedem Falle zeigte es sich, daß diese Verbindungen eine ■"■ bessere Stabilität in Reagenzien entsprechend den Beispielen besitzen im Vergleich zu Eeagenzien, bei denen Äthanol, Methanol oder einfach Wasser verwendet wird.

Patentansprüche

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Claims

Patentansprüche

Medizinisches Reagenz, enthaltend

a) mindestens ungefähr 50$ einer stabilisierenden Verbindung, wie 1,2-Äthandiol, 1,2-Propandiol, 1,3-Propandiol, 1,4-Butandiol, 2,3 -Butandiol und/oder 1,2,3-Propantriol und

b) mindestens 0,001 $ einer 2. Verbindung, wie Benzidin, o-Dianisidin, o-Dianisidin-Hydrochlorid und/oder o-Tolidin.
2. Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekenn, zeichnet, daß die stabilisierende Verbindung so rein ist» daß sie eine optisch l&are Lösung ergibt und bei der Bestimmung der optischen Dichte nicht stört.
3· Reagenz nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die stabilisierende Verbindung 1,2-Propandiol ist.
4· Reagenz nach Anspruch 1 bis 3* dadurch gekennzeichnet , daß die 2. Verbindung o-Dianisidin-Hydrochlorid ist.
5. Reagenz nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß das Reagenz mindestens 80 fo stabilisierende Verbindung enthält.
6. Reagenz nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es nur die stabilisierende Verbindung und die 2. Verbindung enthält.

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7· , Verwendung des' Reagenses nach. Anspruch. 1 bis 6 zur Bestimmung der Konzentration von Glucose in einer biologischen Flüssigkeit, wobei man Glucose-oxidase zur Wasserstoffperoxidbildung verwendet und Peroxidase zu Umwandlung eines Reagenses in eine gefärbte Verbindung in Gegenwart von Wasserstoffperoxid verwendet.

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