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Diagnostizierungsmittel zum Nachweis von Zuckerarten im Urin
Die Erfindung betrifft ein Diagnostizierungsmittel zum Nachweis von Zuckerarten im Urin, vorzugsweise in Form eines mit der Reagenzmischung aus Peroxydase, Farbindikator, vorzugsweise o-Toluidin, und einer für Zuckerarten spezifischen Oxydase imprägnierten Diagnostizierungsmittels.
Methoden, basierend auf der Einwirkung von spezifischen Oxydasen auf die Zuckerart, die man nachweisen will, sind bekannt, desgleichen Verfahren, bei welchen durch Oxydation eines gleichzeitig anwesenden Farbindikators eine Verschiebung der Lichtabsorption des Indikators in den sichtbaren Teil des Spektrums zustande kommt. Diese bekannten Methoden können in gewissem Umfang auch zu Teststreifen adaptiert werden, die mit Oxydase, Peroxydase und Farbindikator imprägniert werden.
Die Verwendung von Ionenaustauschmaterial bei der Herstellung von Glukoseoxydase, welche für den Nachweis von Glukose eingesetzt wird, ist aus der österr. Patentschrift Nr. 231078 bekannt. Das lonenaustauschmaterial dient dabei der Reinigung des Enzyms. Die brite Patentschrift Nr. 922, 665 beschreibt die konventionellen Teststreifen, die bisher verwendet wurden und die Forderungen in bezug auf die diagnostische Genauigkeit nicht erfüllen (s. insbesondere Beispiel 9 der Beschreibung).
In Lösungen, die nur die Zuckerart enthalten, die man nachweisen will, arbeiten die bisher bekannten Teststreifen zufriedenstellend. Dies gilt z. B. für den Nachweis von Glykose und Galaktose (vgl. Analytical Biochemistry 3 [1962], 230-235). Bei der Prüfung von komplexerem biologischem Material aber, wie Urin, hängt die Anwendbarkeit solcher Teststreifen stark von der Zuckerart ab. Ebenso können Variationen zwischen verschiedenen Proben, die dieselbe Zuckerart enthalten, vorkommen.
Während Glykose im Urin mit einem auf bekannte Weise präparierten Teststreifen zufriedenstellend nachgewiesen werden kann, gilt dies nicht für Galaktose im Urin und sichere Daten werden hier nicht erhalten.
Ursache dieser bisweilen bedeutenden Schwankungen bei Zuckerbestimmungen in verschiedenen Urinproben sind die gleichzeitig vorkommenden, variierenden Mengen an körpereigenen Stoffen sowie Reste oder Metabolite von Nahrungs- oder Arzneimittel.
Durch die Erfindung ist es möglich geworden, den Einfluss solcher Stoffe zu eliminieren, die den Nachweis derjenigen Zuckerart stören, über deren Vorhandensein im Urin man Aufschluss wünscht.
Das vorliegende Diagnostizierungsmittel ist gekennzeichnet durch einen Teststreifen mit einer aus einem Ionenaustauschmaterial bestehenden Aufsaugzone.
Die Probe, die man zu untersuchen wünscht, muss ein Ionenaustauschmaterial passieren, das die mit der nachzuweisenden Zuckerart gleichzeitig vorkommenden Stoffe absorbiert, die den nachfolgenden Nachweis der aktuellen Zuckerart stören.
Das Diagnostizierungsmittel gemäss der Erfindung erhält zweckentsprechend die Form eines Test- streifens aus einem Filterpapier mit einer Ionenaustausch-Aufsaugzone, welche die Probe passieren muss, bevor sie die Reagenzzone erreicht, in der durch die Farbenveränderung das Vorkommen der Zuckerart nachgewiesen wird.
Vorzugsweise wird das aufsaugende, cellulosehaltige Material, das als Träger des spezifischen
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Reagenz für die aktuelle Zuckerart dient, derart behandelt, dass die Cellulose mit sauren oder basischen Resten substituiert wird. wodurch dieselbe lonenaustauscheigenschaften erhält. Cellulosederivate vom erstgenannten Typ sind Cellulosephosphat, Cellulosesulfat und Carboxymethylcellulose, während Aminoäthyl- cellulose, Diäthylaminoäthylcellulose und Ecteolacellulose (hergestellt aus Cellulose, Epichlorhydrin und Triäthanolamin) dem zweitgenannten Typ zugehören. Bei der Papierzubereitung können auch andere Typen von Ionenaustauschmaterial verwendet werden, so z. B. Amberlite SB-2 der Firma Rohm & Haas in USA oder Dowex 2 X 8 der Firma Dow in USA.
Starke Ionenaustauscher erwiesen sich bei der Bestimmung von Galaktose am geeignetsten. Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.
Beispiel l : Diäthylaminoäthyl-Ionenaustausch-Papier, erhalten durch Behandlung eines aufsaugenden cellulosehaltigen Materials, in dem die Cellulose als Natrium- oder anderes Alkalisalz vorliegt, mit Diäthylaminoäthylchlorid, wird nach Auswaschen mit Wasser und Trocknen während 10 min mit 0, 01 n Natriumphosphatpuffer, PH = 7, 0, behandelt und danach wieder mit destilliertem Wasser gewaschen und getrocknet.
Zirka 50 X 50 cm des so behandelten Papiers werden daraufhin mit o-Toluidin-Methanol, bereitet durch Auflösung von 0, 75 go-Toluidin in 50 ml Methanol, imprägniert und im Dunkelraum getrocknet.
Das Papier wird dann in Streifen von zirka 10 X 60 mm zerschnitten.
Etwa die Hälfte eines solchen Streifens wird mit zirka 40 j l einer Lösung folgender Zusammensetzung befeuchtet :
EMI2.1
<tb>
<tb> 2 <SEP> ml <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> n <SEP> Natriumphosphatpuffer, <SEP> PH <SEP> = <SEP> 6, <SEP> 9 <SEP>
<tb> 50 <SEP> mg <SEP> Polyäthylenglykol, <SEP> Mol. <SEP> -Gew. <SEP> zirka <SEP> 4000 <SEP>
<tb> 2 <SEP> mg <SEP> Peroxydase
<tb> 5 <SEP> mg <SEP> Galaktoseoxydase
<tb>
Die Papierstreifen müssen im Dunkelraum trocknen und werden trocken verwahrt. An Stelle von o-Toluidin kann auch ein anderer Farbindikator mit gleichen Charakteristika gewählt werden, z. B. o-Dianisidin.
Beispiel 2 : Ionenaustausch-Papier, erhalten durch Behandlung von Cellulose in Form des Alkalisalzes mit Epichlorhydrin, gefolgt von einer Umsetzung mit Triäthanolamin unter Wasseraustritt, wird nach Waschen und Trocknen durch 15 min mit 0, 014 n Natriumphosphatpuffer, PH- 7,0 behandelt und danach getrocknet.
Das Papier wird wie in Beispiel 1 weiter behandelt.
Beispiel 3 : Aminoäthyl-Ionenaustausch-Papier, bereitet durch Behandlung von Natriumcellulose mit Aminoäthylchlorid, wird mit destilliertem Wasser gewaschen und getrocknet. Das Material wird mit einer Pufferlösung von p = 7, 0 getränkt und getrocknet.
Das Papier wird wie in Beispiel 1 weiter behandelt.
Beispiel 4 : Nachweis von Galaktose im Urin :
1 bis 2 ml Urin werden in ein 10 ml-Becherglas gebracht. Ein, wie oben beschrieben hergestellter Teststreifen wird mit seinem ionenaustauschenden Teil in die Probe eingesenkt, wobei die Probe durch Kapillarkraft in den mit dem Reagenz imprägnierten Teil hinaufgesogen wird. Während des Durchgangs durch das Ionenaustausch-Papier werden jene Substanzen des Urins absorbiert, die mit der Galaktosebestimmung interferieren und dieselbe stören würden, während die anwesende Galaktose die Aufsaugzone passiert und einen Farbumschlag in der mit dem Farbindikator und dem Reagenz präparierten Zone bewirkt. Bei o-Toluidin tritt in Anwesenheit von Galaktose in der Probe sehr bald einblaublaugrüner Farbton auf.
Eine Urinprobe eines Patienten mit Galaktosurie mit einem Galaktosegehalt von MO mg/100 ml gibt innerhalb 15 sec eine Farbreaktion.
Eine Urinprobe mit einem Galaktosegehalt von 100 mg/100 ml gibt eine Farbreaktion innerhalb von 1 bis 2 min. Eine Urinprobe ohne Galaktose gibt keine Farbreaktion.
Beispiel 5: Es werden Streifen wie im Beispiel 1 hergestellt, mit dem Unterschied, dass die Befeuchtungslösung an Stelle von 5 mg Galaktoseoxydase 13 mg Glykoseoxydase enthält.
Beispiel 6: Es werden Streifen wie im Beispiel 2 hergestellt, mit dem Unterschied, dass die Befeuchtungslösung an Stelle von 5 mg Galaktoseoxydase 13 mg Glykoseoxydase enthält.
Beispiel 7 : Es werden Streifen wie im Beispiel 3 hergestellt, mit dem Unterschied, dass die Befeuchtungslösung an Stelle von 5 mg Galaktoseoxydase 13 mg Glykoseoxydase enthält.
Beispiel 8 : Es werden Streifen wie im Beispiel 1 hergestellt, mit dem Unterschied, dass als Befeuchtungslösung eine Lösung folgender Zusammensetzung verwendet wird :
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EMI3.1
<tb>
<tb> 2 <SEP> ml <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> n-Natriumphthalatpuffer, <SEP> p <SEP> = <SEP> 6, <SEP> 7 <SEP>
<tb> 20 <SEP> mg <SEP> Albumin
<tb> 2 <SEP> ml <SEP> Peroxydase
<tb> 13 <SEP> mg <SEP> Glykoseoxydase.
<tb>
Beispiel 9 : Nachweis von Glykose im Urin :
Bei einem Teststreifen ohne lonenaustauscheigenschaften in dem aufsaugenden Teil nach der brit.
Patentschrift Nr. 922, 665 liegt die Empfindlichkeitsgrenze bei 30 bis 60 mg/100 ml. Positive Reaktion kann zuweilen bereits bei zirka 20 mg/100 ml und negativer Bescheid bei zirka 130 mg/100 ml erhalten werden.
Über 9So der Normalbevölkerung weisen geringere Werte als 20 mg/100 ml auf. Die Werte, die mit einem unpräparierten Teststreifen erhalten werden, sind hiedurch ganz unsicher.
Es liegt ein diagnostischer Bedarf vor, Glykosemengen von einer Grössenordnung kleiner als 3 mg/100 ml nachzuweisen.
Dies ist durch einen der in den vorhergehenden Beispielen beschriebenen Teststreifen möglich. Ein solcher Teststreifen gestattet den Nachweis von Zuckermengen in den Grössenordnungen von 0, 5 bis 3 mg/100 ml Urin bei positiver Farbreaktion innerhalb von 3 min. Bei einem Gehalt von mehr als 4 mg/100 ml wird eine positive Farbreaktion bereits innerhalb von zirka 1 min erhalten.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Diagnostizierungsmittel zum Nachweis von Zuckerarten, z. B. Galaktose oder Glykose, im Urin,
EMI3.2
Aufsaugzone.