AT333975B

AT333975B - Verfahren und prufmittel zur bestimmung von empfangnisfahigkeit oder schwangerschaft

Info

Publication number: AT333975B
Application number: AT237175A
Authority: AT
Original assignee: Alza Corp
Priority date: 1975-03-27
Filing date: 1975-03-27
Publication date: 1976-12-27
Also published as: ATA237175A

Description

Es ist von grosser Bedeutung, die empfängnisfähigen Tage der Frau bestimmen und weiterhin während der frühen Stadien eine eventuelle Schwangerschaft mit Sicherheit nachweisen zu können. Die Feststellung der empfängnisfähigen Tage ist sowohl für die Frauen, die sich Kinder wünschen als auch für die Frauen, die eine Empfängnis vermeiden möchten, wichtig. Der Nachweis der Schwangerschaft ist sowohl wichtig für die medizinische Behandlung der betroffenen Frauen und das erwartete Kind, als auch für eine eventuelle Unterbrechung einer unerwünschten Schwangerschaft.

Prüfmittel und Verfahren für die kolorimetrische Bestimmung der empfängnisfähigen Tage der Frau sind bereits in den USA-Patentschriften Nr. 3, 406, 016 und Nr. 3, 699, 005 beschrieben. In beiden Fällen liegt das Prüfmittel in Form eines Papierstreifens vor. Gemäss der USA-Patentschrift Nr. 3, 406, 016 wird der Papierstreifen mit einer Peroxydase und mit Guajakol imprägniert. Der Streifen ändert die Farbe, wenn er mit Speichel der Frau während ihrer empfängnisfähigen Tage in Berührung kommt ; der Farbwechsel beruht auf der Anwesenheit von Peroxydase im Speichel. Gemäss der USA-Patentschrift Nr. 3, 699, 005 wird der Papierstreifen mit Indoxylphosphat oder 5-Bromoindoxylphosphat imprägniert sowie mit einem ungiftigen Puffer, der den pHWert bei 10, 0 bis 10, 3 hält.

Der Papierstreifen ändert die Farbe, wenn er mit Speichel der Frau während ihrer empfängnisfähigen Tage in Berührung gebracht wird ; der Farbwechsel wird hier durch erhöhten Alkaliphosphatasegehalt im Speichel während der empfängnisfähigen Tage verursacht. Kolorimetrische Analysen zum Messen von Säurephosphatasen in biologischen Flüssigkeiten sind aus der USA-Patentschrift Nr. 3, 595, 756 bekannt.

Die Erfindung beruht nun auf der überraschenden Feststellung, dass die Menge von N-Acetyl-ss-glucosaminidase in biologischen Flüssigkeiten der Frau ein Indiz ist für die empfängnisfähigen Tage und die Schwangerschaft oder das Fehlen von beiden. Es hat sich nämlich gezeigt, dass die Menge der in biologischen Flüssigkeiten vorhandenen N-Acetyl-ss-glucosaminidase während der empfängnisfähigen Tage im Monatzyklus scharf ansteigt und dass anderseits Schwangerschaft kombiniert ist mit einer Abnahme der N-Acetyl-ss-glucosaminidase während einer bestimmten Zeitspanne des normalen Menstruationszyklus.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung eines in einem biologischen Medium der Frau vorhandenen Enzyms, dessen Menge Empfängnisfähigkeit oder Schwangerschaft anzeigt, wobei das Medium, z. B. Speichel, mit einem Reagenz in Berührung gebracht wird, der in Gegenwart des
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während der Reaktion zwischen dieser Verbindung und dem Enzym N-Acetyl-ss-glucosamindase einen saueren pervert einhält und nach der Bildung des Reaktionsproduktes einen alkalischen pH-Wert einstellt.

Die Erfindung wird nun mit Bezug auf die Zeichnungen und die in den Fig. 1 bis 4 gezeigten Diagramme näher erläutert. Fig. 1 zeigt die Änderung der Aktivität (Menge) von N-Acetyl-ss-glucosaminidase im Speichel einer Frau während einer Zeitspanne im Menstruationszyklus. Fig. 2 und 3 zeigen die Änderungen der Aktivitäten (Mengen) von alkalischer Phosphatase und von Säurephosphatase im Speichel der Frau während einer Zeitspanne des Menstruationszyklus. Diese Aktivitätsänderungen von alkalischer Phosphatase sind die Basis für die USA-Patentschrift Nr. 3, 699, 005 ; Fig. 4 erläutert die Beziehung zwischen der Menge an N-Acetyl-ss-glucosaminidase im Speichel der Frau wenn die Frau nicht schwanger ist und wenn Schwangerschaft vorliegt während eines bestimmten Zeitabschnittes des weiblichen Menstruationszyklus.

In den Fig. 1 bis 3 wurden die Ergebnisse standardisiert, indem jeweils der höchsten enzymatischen Aktivität während des Menstruationszyklus der Wert 100 zugeschrieben wurde. Der Pfeil durch den Punkt 0 auf der Abszisse deutet den Beginn der Menstruation an.

Das erfindungsgemässe Verfahren beruht auf dem kolorimetrischen Nachweis von N-Acetyl-ss-glucos- aminidase in einer biologischen Flüssigkeit wie Speichel, Vaginalflüssigkeit oder Zervikal (Gebärmutterhals)- flüssigkeit mit Hilfe eines N-Acetyl-ss-d-glucosaminids, das in Gegenwart der in Rede stehenden Glucosaminidase bei einem sauren pu-wert reagiert unter Bildung eines Reaktionsproduktes, das bei einem vorbestimmten pervert, üblicherweise einem alkalischen pH-Wert eine deutlich erkennbare Farbe besitzt. Solche Glucosaminide sind Derivate von N-Acetyl-ss-d-glucosamin mit einem Substituenten, der im Verlauf der Reaktion entfernt wird und das Reaktionsprodukt bildet.

Vorzugsweise ist das Glucosaminid ein farbloses oder praktisch farbloses Phenol-Derivat von N-Acetyl-ss-d-glucosamin, das in Gegenwart der in Rede stehenden Glucosaminidase bei einem sauren pH-Wert unter Bildung eines Phenols reagiert, das bei einem alkalischen pFrWert eine bestimmte deutlich erkennbare Farbe aufweist. In den meisten Fällen tritt die Reaktion bei einem sauren pH-Wert von 4 bis 5 ein
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und im Prüfmittel eingesetzte Menge Glucosaminid soll ausreichen, damit sich die maximal mögliche Menge Reaktionsprodukt mit der in Probe vorhandenen Menge Glucosaminidase während der gegebenen Inkubationsoder Reaktionszeit bildet.

Mit solchen Mengen wird wirksam die höchstmögliche Farbreaktion auf die in der Probe vorhandene Menge Glucosaminidase erzielt und die Farbintensität ist ein Mass für die Menge.

Die Bestimmung wird in einer Lösung durchgeführt, in dem zunächst eine Probe der biologischen Flüssigkeit, beispielsweise 0, 1 ml Speichel mit 0, 1 ml 0, 1 m p-Nitrophenyl-N-acetyl-ss-d-glucosaminid gelöst in
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stehen (inkubieren) ; dabei wird das p-Nitrophenyl-N-acetyl-ss-d-glucosaminid von der im Speichel vorhandenen N-Acetyl-ss-glucosaminidase unter Bildung von p-Nitrophenol hydrolytisch gespalten. Am Ende der Inkubationszeit wird ein zweiter Puffer, bestehend aus 1, 0 ml eines 1, 0 m Natriumglycinatpuffers mit pH-Wert 10, 3 zugegeben, um die hydrolytische Aktivität zu stoppen und die charakteristische gelbe Farbe von p-Nitrophenol bei alkalischem PH zu entwickeln.

Die Absorbtion des Reaktionsgemisches wird bei 400 nm gemessen und mit einer Standard-Absorbtionskurve verglichen, die mit Lösungen bekannter Konzentration von p-Nitrophenol bei pH-Wert 10, 3 hergestellt worden sind. In gleicher Weise können andere Phenol-Derivate von N-Acetyl-ss-d-glucosamin eingesetzt werden. Beispielsweise kann 0, 1 m 3, 3-Bis (p-hydroxyphenyl) phthalid- - N-Acetyl-ss-d-glucosaminid an Stelle von p-Nitrophenyl-N-acetyl-ss-d-glucosaminid verwendet werden. In diesem Falle wird als Reaktionsprodukt Phenolphthalein gebildet.

Zur praktischen Durchführung des Verfahrens eignet sich besonders das erfindungsgemässe Prüfmittel.
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werden, die auf Grund der Kapillarwirkung oder beliebiger anderer physikalisch-chemischer Vorgänge Flüssigkeiten zurückhalten. Solche Stoffe sind Testpapier, beispielsweise Filterpapier, Cellulosestreifen, Holzstreifen, Filz, poröse keramische Streifen, Samt und Tuche. Papier wird bevorzugt, weil es billig ist.

Ein typisches Prüfmittel wird hergestellt, indem ein Streifen aus porösem Papier mit 0, 1 bis 0, 5 ml gepuffertem Substrat, bestehend aus 0, 1 m p-Nitrophenyl-N-acetyl-ss-d-glucosaminid gelöst in 0, 1 m Natriumcitratpuffer, PH 4 bis 5 imprägniert und anschliessend bei Temperaturen zwischen Raumtemperatur und 1000C (ohne anschmoren) getrocknet wird ; hiebei verdampft das wässerige Lösungsmittel und das Glucosaminid und der Puffer bleiben auf dem Papier zurück.

Das so hergestellte Prüfmittel wird zum Nachweis der empfängisfähigen Tage wie folgt eingesetzt : Die Frau berührt das Prüfmittel mit ihrer Zunge oder benetzt es auf andere Weise mit Speichel und wartet dann etwa 20 bis 40 min, allgemein 30 min bei Raumtemperatur ab, damit sich das phenolische Reaktionsprodukt auf dem befeuchteten Teil des Streifens bildet. Darauf wird die Phenolfarbe entwickelt, indem der Streifen mit einer kleinen Menge einer 0, 1 m Natriumglycinat-PufferIösung von pH-Wert 9 bis 11 befeuchtet wird. Der Streifen wird dann mit einer Standardfarbkarte verglichen, die eine Reihe von Farbtüpfeln aufweist, die in gleicher Weise mit Lösungen bekannter Konzentration von p-Nitrophenol bei pH-Wert 0 bis 11 entwickelt worden sind.

Das Prüfmittel entwickelt eine maximale Färbung während der Zeitspanne der Ovulation und der Empfängnisfähigkeit der Frau ; ein Minimum an Farbentwicklung oder überhaupt kein Farbwechsel tritt zu andern Zeiten ein. Fig. l zeigt, dass ein deutlicher Farbwechsel in der Zeitspanne vom 18. bis 11. Tag vor der Menstruation eintritt, der dem gezeigten scharfen Anstieg der Glucosaminidase-Aktivität während dieser Zeitspanne entspricht. Eine Frau kann ihre sexuelle Aktivität oder Inaktivität während dieser Zeit danach richten, ob sie schwanger zu werden wünscht oder nicht.

Die Empfindlichkeit des erfindungsgemässen Verfahrens im Vergleich mit dem auf erhöhter Phosphatase-Aktivität beruhenden Verfärben ergibt sich aus einem Vergleich von Fig. 1 mit Fig. 2 und 3. Die in Fig. 2 und 3 gezeigten Testergebnisse wurden folgendermassen erhalten. Zur Durchführung des alkalischen Phosphatasetestes wurde zunächst ein 0, 1 m-Natrium-oder Kaliumglycinatpuffer eingestellt auf PH-Wert 9, 6 und ein gepuffertes Substrat, bestehend aus 0, 1 m p-Nitrophenylphosphat gelöst in Glycinatpuffer, 0, 1 m PH-Wert 9, 6 hergestellt. Durchgeführt wurde der Test, indem 1, 0 ml des gepufferten Substratgemisches mit 0, 2 ml Speichel versetzt, das ganze geschüttelt und 45 min bei 37 C stehen gelassen wurde.

Nach dieser Zeitspanne wurde die entwickelte Farbe bei 400 nm gemessen und mit einer Standard p-Nitrophenol Farbkurve verglichen.

Zur Durchführung des sauren Phosphatasetests wurde zunächst eine 0, 1 m Essigsäure/Natriumacetatpufferlösung eingestellt auf pH-Wert 4, 7 sowie ein gepuffertes Substrat, bestehend aus p-Nitrophenylphosphat-dinatriumsalz,
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gegeben und die Absorbtion des Gemisches bei 400 nm gemessen und mit einer p-Nitrophenolstandardfarbkurve verglichen. Wie in Fig. 1 bis 3 gezeigt, liegt der Grundspiegel der Glucosaminidaseaktivität üblicherweise gut unterhalb 50%, für die Aktivität von Säurephosphatase und alkalischer Phosphatase hingegen üblicherweise über
50%.

Dies bedeutet, dass der durch die empfängnisfähigen Tage bedingte Anstieg der Aktivität bei den Phosphatasetests üblicherweise nicht so ausgeprägt'ist wie der entsprechende Anstieg der Glucosaminidaseaktivität und dass infolge dessen bei den Phosphatasetests kein so deutlicher Farbwechsel eintritt wie beim erfidungsgemässen Glucosaminidasetest. Ausserdem erstreckt sich beim alkalischen Phosphatasetest die erhöhteAktivität über einen grösseren Zeitraum als die erhöhte Glucosaminidaseaktivität, dies bedeutet, dass der Phosphatasetest nicht so genau und sicher ist wie der Glucosaminidasetest.

Fig. 1 zeigt weiterhin, dass ein zweiter schwächerer Anstieg der Glucosaminidase wenige Tage vor Eintritt der Menstruation beobachtet wird. Fig. 4 zeigt stark vergrössert diesen zweiten Anstieg und die Auswirkung von Schwangerschaft auf diesen Anstieg auf Grund der Untersuchung von 40 nicht schwangeren und 8 schwangeren Frauen gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren. Glucoseaminidaseaktivität ist wiedergegeben als die normalisierte optische Dichte der Testlösung bestimmt durch ihre Absorbtionsfähigkeit bei 400 nm. Der Pfeil durch 0 gibt den ersten Tag der Menstruation für nicht schwangere Frauen an bzw. den Tag, an dem eine schwanger gewordene Frau üblicherweise bei Abwesenheit von Schwangerschaft die Menstruation erwarten würde.

Der senkrecht gestrichelte Bereich ist der Bereich der optischen Dichte wie er sich bei den nicht schwangeren Frauen ergab. Der horizontal gestrichelte Bereich ist der Bereich der optischen Dichte, wie er sich bei schwangeren Frauen ergab. Das Diagramm zeigt, dass Schwangerschaft im wesentlichen den zweiten Anstieg an Glucosaminidaseaktivität eliminiert und im allgemeinen mit einer verminderten Aktivität während der Testperiode gekoppelt ist. Fällt das Untersuchungsergebnis einer Frau in den Bereich, der nur horizontal gestrichelt ist, so ist sie mit grosser Wahrscheinlichkeit schwanger. Fällt das Ergebnis in den Bereich, der sowohl horizontal als auch vertikal gestrichelt ist, so ist der Test nicht schlüssig. Fällt das Ergebnis in den Bereich, der lediglich vertikal gestrichelt ist, so ist die Frau mit Wahrscheinlichkeit nicht schwanger.

PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung eines in einem biologischem Medium der Frau vorhandenen Enzyms, dessen Menge Empfängnisfähigkeit oder Schwangerschaft anzeigt, wobei das Medium, z. B. Speichel, mit
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Claims

N-Acetyl-ss-d-glucosaminid ein Phenol-Derivat von N-Acetyl-ss-d-glucosamin verwendet, das bei saurem pH-Wert ein Phenol bildet, welches im alkalischen pH-Bereich deutlich gefärbt ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als N-Acetyl-ss-d-glucosaminid p-Nitrophenyl-N-acetyl-ss-d-glucosaminid oder 3, 3-Bis (p-hydroxyphenyl)-phthalid- - N-acetyl-ss-d-glucosaminid verwendet. EMI3.2 Berührung hält.

9. Prüfmittel aus einem absorbierenden Material zur Durchführung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 EMI3.3 <Desc/Clms Page number 4> EMI4.1 p-Nitrophenyl-N-Acetyl-ss-d-glucosaminid oder 3,3-Bis(p-hydroxyphenyl)phthalid-N-acetyl-ss-d-glucosaminid enthält.