DE1277592B

DE1277592B - Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung der Serum-ª‰-Lipoproteide

Info

Publication number: DE1277592B
Application number: DE1963H0048631
Authority: DE
Inventors: Dipl-Chem Dr Rudolf Fried; Dr Joachim Hoeflmayr
Original assignee: HAURY CHEM FAB DR HEINZ
Current assignee: HAURY CHEM FAB DR HEINZ
Priority date: 1963-03-26
Filing date: 1963-03-26
Publication date: 1968-09-12

Description

Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung der Serum-fl-Lipoproteide Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung einer Maßzahl für den Gehalt an Serum-ß-Lipoproteiden in einer Probe.
Den Serum-Lipoproteiden niederer Dichte, den sogenannnten fi-Lipoproteiden, kommt eine wesentliche Bedeutung für die Atherogenese zu. Die bisher bekannten Verfahren zur Bestimmung dieser Fett-Eiweiß-Fraktion weisen erhebliche Nachteile auf, die sie für die routinemäßige Bestimmung im klinisch diagnostischen Laboratorium nur wenig geeignet machen. Sie erfordern zu ihrer Durchführung meist großen apparativen und zeitlichen Aufwand.
Ein von Burstein und Samaille (Presse med., 66, 974, 1958) angegebenes Verfahren bedient sich der Fällung der ß-Lipoproteide durch Heparin oder Heparinoide in Gegenwart von zweiwertigen Kationen. Die bei dieser Fällung auftretende Trübung wird gemessen und stellt ein Maß für die Menge der im Serum vorhandenen ß-Lipoproteide dar. Nachteilig wirkt sich bei diesem Verfahren - wie bei jeder Trübungsmessung - aus, daß die entstehende Teilchengröße von vielen verschiedenen, nur schwer zu beherrschenden Faktoren abhängig ist und somit die Genauigkeit dieser Messung beeinträchtigt wird.
Außerdem muß erst auf umständliche und zeitraubende Weise durch eine gravimetrische Bestimmung, die große Serummengen erfordert, eine Eichkurve aufgestellt werden, um die Trübungswerte in die allgemein üblichen Gewichtsangaben (mgO/o Lipoproteide im Serum) umrechnen zu können.
Nach H. Schmidt, v. Elmendorff, »Zeitschrift für die gesamte experimentelle Medizin«, Bd. 130, 1958, S. 142 bis 145, bestehen Bedenken wegen Extraktionsschwierigkeiten bei Lipoiden. Ferner sollen gleiche Cholesteringehalte nicht notwendigerweise auf eine gleiche sonstige Zusammensetzung der Untersuchungsproben hinweisen. Diese Hinweise treffen jedoch auf das erfindungsgemäße Verfahren und die im Zusammenhang damit anzustellenden Untersuchungen nicht zu, denn bei der erfindungsgemäßen Bestimmungsmethode wird Cholesterin nicht extrahiert. Die in der vorgenannten Veröffentlichung erwähnten Extraktionsschwierigkeiten spielen also im vorliegenden Fall überhaupt keine Rolle.
Im Rahmen des nachstehend beschriebenen, erfindungsgemäßen Verfahrens wird durch ein an sich bekanntes Fällungsmittel zunächst die ß-Lipoproteidfraktion selektiv gefällt. Während aber bisher die bei dieser Fällung entstehende Trübung als Maß für die Menge des ausgefällten ß-Lipoproteids genommen wurde, trennt man in einem weiteren Verfahrensschritt der Erfindung die ß-Lipoproteide durch Zen- trifugieren ab und bestimmt im Niederschlag kolorimetrisch das Cholesterin. Dabei muß keine Extraktion stattfinden, sondern dieses ß-Lipoproteidmolekül wird durch das Reagens vollkommen zerstört und das dabei frei werdende Cholesterin gibt die bekannte blaugrüne Farbe der Liebermann-Burchard-Reaktion. Dieses Verfahren stellt gegenüber der Trübungsmessung einen wesentlichen Fortschritt dar, da es praktisch temperaturunabhängig ist. Während die Extinktion der Trübung in Abhängigkeit von der Temperatur verschiedene Werte annehmen kann, ändert sich der Cholesteringehalt, der in der erfindungsgemäßen Weise bestimmt wird, in Abhängigkeit von der Temperatur praktisch nicht.
Die bisher bei der Bestimmung der Serum-ß-Lipoproteide auftretenden Schwierigkeiten werden somit beseitigt, wenn man erfindungsgemäß nach Fällung der ß-Lipoproteide in an sich bekannter Weise durch Heparin oder Heparinoide in Gegenwart von zweiwertigen Kationen die Lipoproteide durch Abzentrifugieren isoliert und in dem Niederschlag den in einem festen Verhältnis zum Gehalt an ß-Lipoproteiden stehenden Cholesteringehalt kolorimetrisch ermittelt.
Das Cholesterinreagens muß allerdings so gewählt werden, daß bei dessen Zugabe das ausgefallene Eiweiß in Lösung geht. Zwischen dem Cholesterin der ß-Lipoproteide und der Gesamtfraktion besteht ein annähernd festes Verhältnis. Dies geht aus Fritz A.
Pezold, »Lipide und Lipoproteide im Blutplasma«, Springer-Verlag, 1961, S. 39, Tabelle 11, hervor. Danach haben sechs verschiedene Mitarbeiter den Cholesteringehalt der ß-Lipoproteide untersucht und übereinstimmend ein praktisch identisches Verhältnis von Cholesterin und ß-Lipoproteiden experimentell gefunden, wie durch Division der jeweiligen Werte aus Spalte 3 durch die Werte von Spalte 7 der Tabelle ohne weiteres ersichtlich ist. Daher kann man aus dem gefundenen Cholesterinwert durch Multiplikation mit einem aus der Literatur bekannten Faktor die vorhandenen Gesamt-ß-Lipoproteide berechnen. Die für dieses Bestimmungsverfahren benötigten Reagentien sind entweder an sich haltbar oder können durch geeignete Stabilisierungsmaßnahmen für längere Zeit haltbar gemacht werden. Es besteht somit die Möglichkeit, sie in vorgefertigtem Zustand als Testreagens zur Verfügung zu halten.
Beispiel 1. Das Fällungsreagens besteht aus einer 0,025 M CaCl2-Lösung, die pro Milliliter 20 Einheiten Heparin-Na enthält.
2. Das Cholesterinreagens setzt sich zusammen aus 1 Teil Eisessig, 5 Teilen Essigsäureanhydrid und 1 Teil konzentrierter H2SO4.
3. Cholesterin-Standardlösung enthält 400 mg0/o Cholesterin in Eisessig.
In ein Zentrifugenglas (Glas I), das 2 ml Fällungsreagens enthält, wird 0,1 ml Serum einpipettiert. Man wartet einige Minuten und zentrifugiert dann den Niederschlag scharf ab. Die überstehende Lösung wird vorsichtig abgegossen.
In ein zweites Reagensglas (Glas II) werden 0,1 ml Cholesterinstandard und 0,1 ml destilliertes Wasser gegeben. In ein drittes Reagensglas (Glas III) werden zur Ermittlung des Reagentien-Leerwertes 0,1 ml Wasser vorgelegt.
Dem feuchten Niederschlag (I) und dem Reagentien-Leerwert (III) werden 2,0 ml, dem Standard (II) 1,9 ml Cholesterinreagens langsam unter Schütteln zugegeben. Der Niederschlag löst sich, und es entwikkelt sich eine blaugrüne Farbe. Man läßt die Mischung genau 15 Minuten unter Lichtausschluß abkühlen und mißt gegen den Reagentien-Leerwert bei 560 bis 590 m. Die Berechnung erfolgt nach der Formel: Extinktion Standard .400 = mg0 Cholesterin der ß-Lipoproteide Extinktion Analyse Die Gesamtfraktion der ß-Lipoproteide kann durch Multiplikation mit dem Faktor 2,63 in mg0/o errechnet werden.

Claims

Patentansprüche: 1. Verfahren zur Bestimmung einer Maßzahl für den Gehalt an Serum-ß-Lipoproteiden in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß nach Fällung der ß-Lipoproteide in an sich bekannter Weise durch Heparin oder Heparinoide in Gegenwart von zweiwertigen Kationen die Lipoproteide durch Abzentrifugieren isoliert werden und in dem Niederschlag der in einem festen Verhältnis zum Gehalt an ß-Lipoproteiden ste- hende Cholesteringehalt kolorimetrisch ermittelt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Cholesterinbestimmung ein Reagens verwendet wird, welches das ausgefällte Eiweiß in Lösung bringt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß durch geeignete Stabilisierungsmaßnahmen die Lösung für eine vorgefertigte Testreagentienpackung haltbar gemacht wird. ~~~~~~~ In Betracht gezogene Druckschriften: Zeitschrift für die gesamte experimentelle Medizin, 130 (1958), S. 142 bis 145.