DE2308633A1

DE2308633A1 - Stabile zusammensetzung trockener reagenzien und deren verwendung zum dosieren von ornithin-carbamoyl-transferase

Info

Publication number: DE2308633A1
Application number: DE19732308633
Authority: DE
Inventors: Roger Prost
Original assignee: LUCIEN INTERNATIONAL
Current assignee: LUCIEN INTERNATIONAL
Priority date: 1972-02-29
Filing date: 1973-02-21
Publication date: 1973-09-06
Also published as: FR2174356A5; GB1415712A; US3812015A

Description

Dipl.-Ing. Waltnr Jackisch *^{v v y} *

BStuttgart-N, Menze'lstraße 40 Λ *\*\ / 0 Q

19, FeK tS73

Anmelder: Societe a Responsabilitfe Limitee dite.: LUCIEN INTERNATIONAL

Stabile Zusammensetzung trockener Reagenzien und deren Verwendung zum Dosieren von Ornithin-Carbamoyl-Transferase

Die Dosierung der Ornithin-Carbamoyl-Transferase (O.C.T.) im Serum ist von grosser Bedeutung bei der Reihenuntersuchung und Behandlung von Leberkrankheiten, da der Ornithin-Carbamoyl-Transferase-Spiegel als erster ansteigt, selbst vor Auftreten klinischer Beschwerden, und sich als letzter zum Zeitpunkt der Heilung normalisiert.

Die bisher üblichen Dosiermethoden sind langwierig und empfindlich und ausserdem nicht ausreichend genau und reproduzierbar.

Aufgabe der Erfindung ist, eine stabile Zusammensetzung aus Reagenzien zu schaffen, mit der Ornithin-Carbamoyl-Transferase für ein Serum schnell, reproduzierbar, genau und mit grosser

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Empfindlichkeit dosiert werden kann.

Das Prinzip des DosierungsVerfahrens, das kürzlich von den deutschen Autoren K. Lorentz und W. Wrabetz (Z.Klin. ehem. und Klin. Biochem 1971, J5, 220-223) veröffentlich wurde, ist folgendes:

In Gegenwart von Ornithin-Carbamoyl-Transferase des Serums verschiebt sich das Reaktionsgleichgewicht

Ornithin + Carbamoylphosphat Citrullin + Phosphat nach rechts.

Es wird daher eine bestimmte Menge des Serums mit entsprechenden Mengen Ornithin und Lithiumcarbamoylphosphat gebrütet. Das gebildete Citrullin wird aufgrund der Färbung, die es wie alle Ureide gibt, mit Diacet)?iylmonoxim in saurem Medium bestimmt.

Die Zunahme der Färbung, die der im Serum vorhandene Harnstoff bewirkt, ist jedoch wesentlich grosser als diejenige, die durch das gebildete Citrullin hervorgerufen wird, so dass es erforderlich ist, in das Inkubationsmedium ausreichend Urease zuzugeben, um den Serumharnstoff zu zerstören.

Es wurde aber nun gefunden, dass die gesamte handelsübliche Urease eine gewisse Ornithin-Carbamoyl-Transferase-Aktivität aufweist, die ihr eigen ist und die mit dem Ursprung und der Qualität der Urease variiert. Diese Aktivität stört aber die Ergebnisse der Dosierung und sie muss daher ausgeschaltet oder wenigstens diese Störung in Betracht gezogen und gewertet werden. Beim erfindungsgemässen Verfahren zum Dosieren wird die dem Inkubationsmedium zugegebene Menge an Urease so bemessen, dass die von ihr eingeführte Ornithin-Carbamoyl-Transferase-Aktiv!tat vernachlässigbar

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ist, d.h. unbedeutend ist gegenüber der Aktivität der Ornithin-Carbamoyl-Transferase normaler Seren. Diese letztgenannte Aktivität beträgt maximal lOmUl/ml, wobei die verwendete Urease in die Dosierungsverhältnisse eine Fehlerquelle von nicht mehr als höchstens 2mUl/ml einbringen darf. Die Menge der verwendeten Urease muss andererseits ausreichend sein, um unter den Dosierungsbedingungen den im Serum vorhandenen Harnstoff zu zerstören, maximal höchstens 2 g/l.

Ein anderer Nachteil des oben beschriebenen Dosierungsverfahrens besteht darin, dass die verwendeten Reaktionsteilnehmer in einer auf einen pH-Wert 7,7 - 0,1 gepufferten Lösung unbeständig sind, insbesondere die Lösung des Dilithiumcarbamoylphosphat, dessen Stabilität auf 4 Stunden bei etwa 0° C begrenzt ist.

Es wurde nun eine Zusammensetzung von trockenen Reaktionsteilnehmern gefunden, die über 6 Monate stabil bleibt und in Form von Einheitsdosierungen als Inkubationssubstrat mit einem gegebenen Volumen des Serums verwendet wird.

(a) Die erfindungsgemässe Zusammensetzung enthält ein Gemisch A (Analyse), bestehend aus Äthylendiamintetraessigsäure, die in Wasser in einer Konzentration von 0,2M gelöst einen pH-Wert von 7,7 ergibt; Dilithiumcarbamoylphosphat und L-Ornithinchlorhydrat in einem Verhältnis vom 1 Mol Carbamoylphosphat auf Ο,βΜοΙ L-Ornithin; und Urease in ausreichender Menge, um den in dem zur Inkubation verwendeten Serum enthaltenen -Harnstoff zu hydrolysieren wobei aber weniger oder gerade nur so viel von der Urease zugegeben wird, dass sie in die Dosierungsbedingungen eine Aktivität von nicht mehr als 2mUl/l der Ornithin-Carbamoyl-Transferase einbringt;

und (b) ein Gemisch B (Kontrolle), das die gleichen Bestandteile in der gleichen Menge wie das Gemisch enthält, mit Ausnahme des Ornithin.

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Alle Bestandteile der Gemische werden von Anfang an bei tiefen Temperaturen scharf getrocknet. Die Herstellung der Gemische erfolgt in zwei Abschnitten.

Zunächst wird ein trockener Puffer durch Mischen von Dinatrium-Kthylendiamintetraessigsäure und Tetranatrium- Ä'thylendiamintetraessigsäure in experimentell ermittelten Mengen hergestellt, um nach dem Lösen des Puffers in einer entsprechenden Menge Wasser eine 0,2 molare Konzentration und einen pH-Wert von 7*7 - 0,1 zu erhalten. Die entsprechenden Mengen der Salze werden zuerst trokken gemischt. Dann wird eine Probe dieses Gemisches entnommen und in Wasser in einer Konzentration von 0,2 M aufgelöst und der pH-Wert bestimmt. Nach dem erhaltenen Wert wird das Verhältnis der beiden Salze im Gemisch eingestellt, bis eine Probe in 0,2 molarer Lösung den gewünschten pH-Wert von 7*7 - 0,1 ergibt. Das Gemisch der beiden Salze wird dann unter Phosphorvakuum getrocknet.

Ein Beispiel der Zusammensetzung eines solchen Puffergemisches ist: dehydriertes Dinatriumsalz der Athylendiamintetraessigsäure

(M.G. 572,24): 5,06 g, 0.0135 Mol

dehydriertes Tetranatriumsalz der Athylendiamintetraessigsäure

(M.G. 416,21): 2,68g, 0,0064 Mol

Beim Auflösen dieses Gemisches, d.h. insgesamt 0,0199 Mol, in Wasser, um 100 ml des Puffers zu erhalten, ergibt sich eine Konzentration von etwa 0,2 Mol/Liter und es wird ein pH-Wert der Lösung von 7*7 festgestellt.

In einem zweiten Arbeitsgang werden die Gemische A und B hergestellt, indem zu einer bestimmten Menge des zuerst gebildeten trockenen Puffers die entsprechenden Mengen der ebenfalls vorher getrockneten übrigen .Bestandteile zugegeben werden, wobei hierbei darauf geachtet wird, dass die oben angegebenen Mengen an

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Ornithin und dem Carbamoylphosphat und die ebenfalls oben angegebene Menge an Urease eingehalten werden.

t Die verschiedenen Bestandteile werden auf etwa 5$ gewogen und die Gemische A und B werden schliesslich in Form von Einheitsdosierungen in Röhrchen oder Tuben verkaufsfertig gemacht, wobei etwa lmg für etwa 25mg in trockener Atmosphäre abgewogen und unter Stickstoff abgefüllt wird.

Als Beispiel ist die Zusammensetzung der Gemische A und B in Form von Einheitsdosierungen in den Röhrehen A, und B, angegeben:

Röhrchen A-, Röhrchen B,

23,6	mg	23,6	mg
0,2	mg	0,2	mg
1,4	mg	1,4	mg
1,0	mg	0,0	mg

Puffer (enthaltend 3,g) Dinatriumsalz der Kthylen-

diamintetraessigsäure auf 4,16 g Tetranantriumsalz der Äthylendiamintetraessigsäure

Urease (analysenrein)

Dilithiumcarbamoylphosphat

L-Ornithinchlorhydrat

Gesamt 26,2 mg 25,2 mg

Jedes Röhrchen muss vor der Inkubation mit 0,3 ml Wasser und 0,2 ml des zu dosierenden Serums versetzt werden.

Die erfindungsgemässen Reaktionsteilnehmer bestehend aus den Gemischen A und B werden demnach direkt als Inkubationssubstrat für die Dosierung der Ornithin-Carbamoyl-Transferase im Serum verwendet, wobei das ebenfalls erfindungsgemässe Verfahren in folgenden Stufen durchgeführt wird:

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-ο-Ι) Inkubation; In zwei Hämolyseröhrchen werden im Wasserbad
bei 37° C während 20 Min. getrennt gebrütet: (a) (Analyse-Röhrchen) eine bestimmte Menge des Gemisches A, verdünnt in einem
gegebenen Volumen Wasser mit einem bestimmten Volumen des zu
dosierenden Serums, und (b) (Kontroll-Röhrchen) die entsprechende Menge des Gemisches B, das, mit Ausnahme des Ornithins, wie das Gemisch A zusammengesetzt imd in einem gleichen Volumen Wasser mit dem gleichen Volumen Serum wie beim Gemisch A verdünnt ist.

Dann wird jedem der beiden Röhrchen (Analyse und Kontrolle) das gleiche Volumen einer wässrigen Lösung von Trichloressigsäure
(20$-ig) zugegeben und nach 2 bis 3 Min. wird zentrifugiert und die obenschwimmenden flüssigen Stoffe gesammelt.

2) Färbung: Beide Inkubatlons-Röhrchen werden mit jeweils dem
gleichen Volumen eines sauren Reaktionsmittels versetzt, das aus einer verdünnten Phosphorsäure- und Schwefelsäurelösung mit
Perri-Ionen als Katalysatoren besteht. Ferner wird ein Farbstoff bestehend aus einer Lösung aus Diacetylmonoxim und Thiosemicarbazid zugegeben. Ausserdem wird ein Eichröhrchen hergestellt, das neben 20$-iger Trichloressigsäure, dem sauren Reagens und dem
Farbstoff, eine Eichlösung aus einer bekannten Menge Citrullin
(oder Harnstoff) enthält, die einer bekannten Wirkung von Ornithin-Carbamoyl-Transferase entspricht.

Es kann, beispielsweise nach Verdünnten auf 1/20, eine Harnstoff-Eichlösung verwendet werden, die 0,40 g/l Harnstoff in destilliertem Wasser enthält und mit 0,004 g/l Quecksilberiodid stabilisiert ist und die unter den Dosierungsbedingungen einer Aktivität der Ornithin-Carbamoyl-Transferase von 21mUI/l entspricht. Eine solche Eichlösung bietet den Vorteil, dass sie auch zum Dosieren des
Harnstoffs ohne vorherige Verdünnung verwendet werden kann.

3) Messung und Berechnen: Nachdem die Röhrchen einige Minuten lang

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im Wasserbad waren, wird die optische Dichte aller drei Röhrchen bei 530 um bestimmt, indem sie mit einem Kontrollreagenz verglichen werden, das lediglich Trichloressigsäure, das saure Reagenz und den Farbstoff enthält. Dann wird die Aktivität der Ornithin-Carbamoyl-Transferase im Serum anhand der bekannten Aktivität der Eichlösung berechnet. Wenn die oben beschriebene Eichlösung verwendet wird, gilt für die Berechnung die folgende Formel:

Aktivität der optische Dichte optische Dichte

Ornithin-Carbamoyl- "Analysenröhrchen" "~ "Kontroll-

Transferase in _ röhrchen"

mUI/ml optische Dichte

"Eichröhrchen"

Das folgende Beispiel erläutert eine Möglichkeit der Dosierung unter Verwendung des Inhalts der Röhrchen A, und B,, deren Zusammensetzung oben beschrieben ist:

a) Inkubation:

Analyse Kontrolle

Röhrchen A₁ Röhrchen B^

V/asser: 0,3 ml 0,3 ml

Serum: 0,2 ml 0,2 ml

Die beiden Röhrchen werden gemischt und im Wasserbad bei 27° C genau 20 Minuten gehalten.

Dann wird zugegeben:

Säurelösung Analyse Kontrolle

Tri chloressigsäure

0,5 ml 0,5 ml

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Es wird gemischt, das Gemisch 2 bis j5 Minuten lang ruhen gelassen und 3 bis 4 Minuten lang bei etwa 4000 U/Min, zentrifugiert,

b) Färbung:

Analyse Kontrolle Ei chung Reagenz

obenschwimmende Stoffe 0,4 ml 0,4 ml

Eichlösung:

(verdünnt auf

1/20) 0,2 ml

Wasser 0,2 ml

Tri chloressigsäurelösung

	ml	0,	2	ml	0,	2	ml
2	,5 ml	2	ml		2	ml
0	0,	5	ml	0,	5	ml

Saures Reagenz 2 ml
Farbreagenz 0,5 ml

Es wird gemischt und 8 Minuten lang auf dem kochenden Wasserbad gehalten. Es wird gekühlt und die optische Dichte bei 530 nm eines jeden Röhrchens "Analyse", "Kontrolle" und "Eichung" verglichen mit dem Eichröhrehen "Reagenz" abgelesen.

Dann wird die Aktivität der Ornithin-Carbamoyl-Transferase des Serums nach der oben angegebenen Formel berechnet.

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Claims

Patentansprüche

1. Zusammensetzung trockener Reagenzien, die über mehrere Monate stabil ist und zur Dosierung der Ornithin-Carbamoyl-Transferase des Serums dient,

dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einem "Analyse"-Gemisch A und einem "Kontroll"-Gemisch B besteht, die beide nach Verdünnen mit einem bestimmten Volumen des zu dosierenden Serums gesondert gebrütet werden, wobei das Gemisch A ein trokkener Puffer ist, der

(a) Dinatrium-Äthylendiamintetraessigsäure und Tetranatrium-Ä'thylendiamintetraessigsäure in einem solchen Mengenverhältnis enthält, dass nach Verdünnen mit Wasser bis auf eine Gesamtkonzentration an Salzen von 0,2 M ein pH-Wert von 7*7 erreioht ist;

(b) Dilithium-Carbamoylphosphat;

(c) L-Ornithinchlorhydrat in einem Mengenverhältnis von 0,6 Mol Ornithin pro Mol Carbamoylphosphat;

(d) Urease in einer Menge, die mindestens der erforderlichen Menge zum Hydrolysieren des in dem zu dosierenden Volumen des

Serums vorhandenen Harnstoffs entspricht, wobei diese Menge geringer ist als diejenige die in die Dosierungsbedingungen eine Aktivität von Ornithin-Carbamoyl-Transferase von 2mUl/ml einbringt, enthält, und das Gemisch B die gleichen Mengen und die gleichen Bestandteile wie das Gemisch B enthält, mit Ausnahme des L-Ornithinchlorhydrat.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Gemische A und B für eine einzige Analyse dosiert sind.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,

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dass jedes der Gemische A und B aus 23,1 mg eines Puffers bestehend aus 3*70 g dehydriertem Dinatriumsalz der Ethylendiamintetraessigsäure pro 4,16 dehydriertem Tetranatriumsalz; 0,2 g analysenreiner Urease;
1, 4 mg Dilithium-Carbamoylphosphat

enthält,'wobei das Gemisch A noch zusätzlich 1 mg L-Ornithinchlorhydrat enthält, und dass beide Gemische mit jeweils 0,3 ml Wasser und 0,2 ml des zu dosierenden Serums zu brüten sind.

4. Verfahren zum Dosieren von Ornithin-Carbamoyl-Transferase des Serums unter Verwendung der Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, dass jedes Gemisch A und B mit dem gleichen Volumen Wasser versetzt mit dem gleichen Volumen Serum gebrütet wird, nach Zugabe von Trichloressigsäure das durch die Wirkung der Ornithin-Carbamoyl-Transferase des Serums gebildete Citrullin kolorimetrisch bestimmt wird, indem nach der Inkubation auf die obenschwimmende Flüssigkeit ein farbgebender Stoff bestehend aus Diacetylmonoxim und Thiosemicarbazid in stark saurem Medium zur Einwirkung gebracht wird, und dass die optische Dichte der das Gemisch A enthaltenden Lösung, sowie diejenige der das Gemisch B enthaltenden Kontroilösung in Bezug auf eine Eichlösung mit bekannter Ornithin-Carbamoyl-Transferase-Aktivität gemessen wird.

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