DE1598322C2

DE1598322C2 - Laboratoriumsreagens zur Bestimmung der Glucose

Info

Publication number: DE1598322C2
Application number: DE1598322A
Authority: DE
Inventors: Alfred Los Angeles Calif. Deutsch (V.St.A.)
Original assignee: Calbiochem Los Angeles Calif (vsta)
Current assignee: Calbiochem Los Angeles Calif (vsta)
Priority date: 1967-06-30
Filing date: 1967-06-30
Publication date: 1973-09-13
Also published as: DE1598322B1

Description

Aus H. U. Bergmeyer, Methoden der enzymatischen Analyse, Verlag Chemie GmbH, Weinheim, 1962, S. 117 bis 123, ist es bekannt, die Glucose in biologischen Flüssigkeiten, wie im Serum, mittels einer gepufferten Lösung von Zinksulfat, Bariumhydroxid, Trishydroxymethylaminomethan, Magnesiumchlorid, Serumalbumin, Adenosintriphosphat, Triphosphopyridinnucleotid, Hexokinase (HK) und Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase spektrophotometrisch zu bestimmen.

Die Lösungen der anorganischen Reagenzien können gut verschlossen bei Raumtemperatur aufbewahrt werden. Den Puffer hält man bei 5° C, und er ist brauchbar, solange kein Bakterienwachstum sichtbar ist. Lyophilisierte Hexokinase- und Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase-Präparate behalten ihre Aktivität zwar längere Zeit, wenn sie im Exsikkator bei 5°C aufgehoben werden. Die Lösungen der Enzyme sind auch bei —15°C mehrere Wochen ohne allzu großen Aktivitätsverlust haltbar. Sie müssen jedoch vorsichtig, ohne starkes Schütteln aufgetaut und während des Gebrauches in Eis gestellt werden. Diese Maßnahmen sind für den Kleinverbraucher umständlich, da er im allgemeinen nur geringe Reagensmengen benötigt.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein komplettes Laboratoriumsreagens in trockener Form zur Bestimmung der Glucose in biologischen Flüssigkeiten zu schaffen, das stabil ist, reproduzierbare Ergebnisse liefert und sich einfach und bequem, z. B. in Form von Tabletten, verpacken läßt. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Laboratoriumsreagens zur Bestimmung der Glucose in biologischen Flüssigkeiten, bestehend aus Hexokinase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, Adenosintriphosphat, Triphosphopyridinnucleotid und Trishydroxymethyl-aminomethan, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es in trockener Form vorliegt und zusätzlich (a) Tris-hydroxymethylaminomethan-sulfat oder Gummiarabicum oder Ammoniumsulfat oder ein Gemisch dieser Stoffe sowie (b) Tris-hydroxymethyl-aminomethan-succinat und (c) Mannit als stabilisierenden Füllstoff enthält.

Vorzugsweise enthält das Laboratoriumsreagens der Erfindung noch Insulin und Magnesiumsulfat.

Aus der deutschen Auslegeschrift 1 075 869 sind trockene Reagenzien als Diagnostiziermittel zum Nachweis von Glucose in Flüssigkeiten bekannt. Diese sind gekennzeichnet durch einen saugfähigen Träger, der ein Enzym, das Oxydaseaktivität für Glucose aufweist, und einen Indikator enthält, der in Gegenwart eines Reaktionsproduktes, das sich bei der Berührung des Enzyms mit der Glucose bildet, eine Farbreaktion gibt. Diese Diagnostiziermittel können in trockener Form als Pulver oder z. B. als Papierstreifen hergestellt werden. Sie dienen zur qualitativen

ίο Bestimmung von Glucose. Für diese Diagnostiziermittel werden als Enzyme Glucoseoxydase und Peroxydase verwendet.

Aus der USA.-Patentschrift 3 072 532 ist es bekannt, proteolylische Enzyme, insbesondere Protease, die in Sublingualtabletten verwendet werden sollen, mit wasserlöslichen, stabilisierenden und löslichkeitsfördernden Substanzen zusammen mit üblichen Trägern und Exzipientien zu verwenden. Als stabilisierende Substanzen werden die verschiedensten Verbindungen genannt, wie festes Polyäthylenglykol, Pflanzengummen, Kohlenhydrate, Disaccharide, Zuckeralkohole, wie Mannit, Gelatine und Natriumchlorid.

Die Enzymkomponenten des Reagens sind an sich instabil, aber in Form der beschriebenen trockenen Mischung sind sie haltbar. Das Reagens wird gewöhnlich in Einheitsmengen vertrieben, verpackt in Behältern aus Folie oder in Kapseln. Jede,dieser Einheiten enthält im allgemeinen gerade soviel Reagens, wie zur Durchführung eines einzigen Testes einer Probe nötig ist. Um einen Test zu machen, wird eine Packung ausgewählt, die das Reagens für diese besondere Bestim-. mung enthält. Das gesamte Reagens in der Packung ist vorher gemessen und von festgesetzter Aktivität. Es kann demzufolge unmittelbar in einer Standardmenge Wasser zu einem flüssigen Reagens gelöst werden. Dieses Reagens wird dann mit der biologischen Probe gemischt und führt zu einer enzymatischen Reaktion. Das Ausmaß oder die Geschwindigkeit dieser Reaktion ist eine Funktion der Menge oder der Aktivität der zu bestimmenden Substanz. In jedem Test wird, unabhängig von der besonderen Art der Bestimmung, ein Coenzym aus einer Form in eine andere überführt werden, wobei eine der beiden Formen bei einer bestimmten Wellenlänge Licht absorbiert. Dementsprechend wird die optische Dichte der Probe bei dieser Wellenlänge als Funktion der zu bestimmenden Substanz variieren. Durch Messung der optischen Dichte des Ansatzes zu verschiedenen Zeiten wird es also möglich, die Menge oder die Aktivität der zu bestimmenden Substanz in der ursprünglichen Probe zu berechnen. Das Beispiel erläutert die Erfindung.

Beispiel

Das vollständige Reagens zur Glucosebestimmung hat folgende Zusammensetzung:

Enzyme .... Hexokinase und Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase

Puffer Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-

succinat

Stabilisatoren Gummiarabicum, Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-sulfat und Ammoniumsulfat
Substrat .... Keines
Beschleuniger Insulin und Magnesiumsulfat

Coenzyme .. Adenosintriphosphat und Triphosphopyridinnucleotid Füllstoff Mannit.

Das folgende Verfahren wird verwendet zur Herstellung einer Charge an trockenem Reagens, die dann in kleine Mengen geteilt und in etwa 10 000 Kapseln verpackt wird.

Der erste Schritt in diesem Verfahren ist die Herstellung einer geeigneten Pufferlösung, die durch Vermischen der folgenden Chemikalien bereitet wird:

Tris-(hydroxymethyl)-amino-

methan 100 bis 200 g

Bernsteinsäure 30 bis 70 g

Beide Chemikalien werden vermischt und dann in einer Kugelmühle etwa 8 Stunden, zu einem feinen Pulver vermählen. Wenn der pH-Wert der wäßrigen Lösung des Pulvers nicht zwischen 7,4 und 7,6 liegt, so wird weitere Bernsteinsäure zugesetzt, um ihn zu erniedrigen, bzw. weiteres Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, um ihn zu erhöhen. Man sieht, daß das genaue Verhältnis der Komponenten dieses Puffers durch den pH-Wert bestimmt ist.

Sobald der Puffer gut gepulvert ist und der pH-Wert im angegebenen Bereich liegt, wird die Mischung bei einer Temperatur von etwa 50⁰C über Phosphorpentoxid im. Vakuum getrocknet, bis die Feuchtigkeit entfernt ist.

Ein trockenes lyophilisiertes Pulver, das die Enzyme Hexokinase und Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase enthält, wird dann durch Vermischen der folgenden Chemikalien in den angegebenen Mengen hergestellt:

Gummiarabicum .......:.. 50 bis 100 g

Tris-sulfat-Puffer, 0,2 m,

pH 7,4 bis 7,6 75 bis 150 ml

Ammoniumsulfat, 1 m, pH 7,5

(eingestellt mit Ammoniak) 75 bis 150 ml

Insulin ..; 50 bis 750 mg

Hexokinase 100 mg

Glucose-6-phosphat-Dehydro-

genase 100 mg

Zunächst wird der Trispuffer hergestellt, indem Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan gelöst und mit einer ausreichenden Menge an Schwefelsäure versetzt wird, so daß eine 0,2 molare Lösung mit einem pH-Wert von 7,4 bis 7,6 entsteht. Gummiarabicum, Ammoniumsulfat und Insulin werden dann mit der Tris-sulfat-Lösung homogen vermischt. Die Hexokinase und die Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase werden mit der Lösung zu einer homogenen Mischung vereinigt. Die Lösung wird unter Vakuum gefroren, bis das ganze Wasser entfernt ist und sich ein lyophilisiertes homogenes Pulver gebildet hat, das die Enzyme enthält.

Das Iyophilisierte Pulver wird getestet, um die Aktivität der Hexokinase und der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase zu bestimmen.

Hierzu dient folgendes Verfahren:

Tris-succinat-Pufferlösung

(1,7 g/100 ml) 1ml

Magnesiumsulfat, 0,1-m Lösung ... 0,4 ml
Triphosphopyridinnucleotid,

10 mg/2 ml Wasser 0,2 ml

Adenosintriphosphat, 9 mg/2 ml

Wasser 0,2 ml

Iyophilisierte Enzyme 10 mg

Wasser 1,2 ml

Die Tris-succinat-Pufferlösung wird zuerst hergestellt durch Lösen von 1,7 g des beschriebenen Puffers in 100 ml Wasser. Die übrigen aufgeführten Lösungen werden mit dem Puffer und dem Wasser zu einer homogenen Mischung vereinigt. Die optische Dichte dieser Lösung wird bei 340 Millimikron gemessen. Eine vorher festgesetzte Menge einer Glucoselösung bekannter Konzentration wird der Lösung zugesetzt. Das führt zu einer Reaktion, in der TPN in TPNH (Triphosphopyridinnucleotid in der reduzierten Form) überführt wird. Da TPN im Überschuß vorliegt, wird der einzige limitierende Faktor der Reaktion die Menge der

ίο Glucose sein. Nach vollständigem Ablauf der Reaktion wird die optische Dichte bei 340 Millimikron erneut gemessen. Die oben beschriebenen Teste werden vorzugsweise durch Verwendung einiger verschiedener Standardlösungen der Glucose ausgeführt, z. B. mit einem Gehalt von 200, 400 und 600 mg% Glucose.

Die Differenz zwischen den optischen Dichten vor und nach der Reaktion sollte gleich dem 0,230fachen der mg°/₀ der Standard-Glucoselösung dividiert durch 100 sein. Falls die Differenz nicht gleich oder nahe dem vorausgesagten Wert ist, haben die Enzyme nicht die ausreichende Aktivität. Ist die Änderung der optischen Dichte jedoch gleich oder sehr nahe dem vorausgesagten Wert, so sind die Enzyme genügend aktiv, und man kann die Mischung zur Abpackung in Kapseln herstellen. Hierzu werden die folgenden Chemikalien in den angegebenen Mengen verwendet:

Tris-succinat-Puffer

(oben bereitet) 100 bis 250 g

Aspartat 80 bis 120 g

TPN 12 bis 18 ε

ATP 10 bis 18 g

Iyophilisierte Enzymmischung 80 bis 200 g

Alle diese Chemikalien sind trockene Feststoffe, die unmittelbar vermischt und mittels geeigneter Vorrichtungen, wie eine Kugelmühle, vermählen werden. Diese Mischung bildet das Testpulver und enthält die Enzyme Hexokinase und Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase zusammen mit den Stabilisatoren Gummiarabicum, Tris-sulfat-Puffer und Ammoniumsiilfat, die dafür sorgen, daß die Enzyme ihre Aktivität für lange Zeiträume bewahren. Außerdem enthält dieses Testpulver die Coenzyme ATP und TPN, zusammen mit dem Puffer Tris-succinat. Diese Substanzen sind nötig zum Ablauf der gewünschten Testreaktionen bei der Durchführung der Bestimmung. Dieses Pulver wird in Einheitsmengen geteilt.

Einige kleine Proben der Mischung können in passenden Mengen Wasser zu flüssigen Reagenzien gelöst werden. Die oben verwendeten Standardwerte Glucose (200, 400 und 600 mg% Glucose) werden mit den Reagenzien vermischt und die resultierenden Änderungen der optischen Dichte gemessen. Aus den Ergebnissen dieser Teste wird die Aktivität der im Pulver enthaltenen Enzyme bestimmt. Wird das Testpulver zur Bestimmung der Glucose verwendet., so läßt man die Reaktion so lange ablaufen, bis die gesamte Glucose umgewandelt ist. Der Zeitaufwand, der für diese Umwandlung nötig ist, ist durch die Aktivität der Enzyme bestimmt. Um also die Aktivität zu bestimmen, die in jede Kapsel eingebracht werden soll, ist es nötig, eine Zeit festzusetzen, nach welcher die Reaktion vollständig abgelaufen sein soll. Hierzu wählt man eine bequeme Testperiode willkürlich, z. B. 5 Minuten. Nun wird ein Bruchteil dieses Intervalls festgelegt, z. B. 3 Minuten, währenddessen die Reaktion tatsächlich abgelaufen sein soll. Das garantiert.

daß die Reaktion am Ende der Testperiode vollständig ist. Die Menge an Testpulver, die für jede Kapsel nötig ist, wird dann bestimmt. Mit dieser Aktivität in jeder Kapsel darf sicher angenommen werden, daß die Reaktion vor Ablauf des Testintervalls vollendet ist. Um mit Hilfe einer Kapsel dieses Beispiels in einer Flüssigkeit oder einem Serum eine · Glucosebestimmung durchzuführen, wird zunächst eine Probe des Serums in passender Menge bereitet. Die optische Dichte dieser Probe wird bei 340 Millimikron gemessen. Hierauf wird der Inhalt einer der Kapseln in passender Menge Wasser gelöst, wobei ein flüssiges Reagens der richtigen Größe und Aktivität für einen Test entsteht. Dieses flüssige Reagens wird dann mit dem Serum vereinigt, wobei folgende Reaktionen ablaufen :

Glucose + ATP Glucose-6-phosph at + ADP

GIucose-6-phosphat + TPN

Glucose-6-phosph at-Dehydrogenase

» 6-Phosphogluconat ■+■ TPNH

Während diese Reaktionen ablaufen, wird die Glucose, die ursprünglich im Serum vorlag, in Glucose-6-phosphat überführt. Dieses wiederum reagiert mit TPN unter Bildung von TPNH. Da die Kapsel ihre Chemikalien im Überschuß liefert, ist der einzige Faktor, der die Reaktion begrenzt, die ursprünglich vorhandene Menge an Glucose. Daher ist die letztlich gebildete Menge an TPNH eine Funktion der ursprünglichen Menge an Glucose.

Man läßt die oben beschriebenen Reaktionen ablaufen für die Dauer der Testperiode, oder bis sie vollendet sind und die Glucose verbraucht ist. Nach vollständigem Ablauf der Reaktionen wird die optische Dichte bei 340 Millimikron erneut gemessen. Da TPNH bei dieser Wellenlänge Licht absorbiert, wird die Differenz der optischen Dichte vor und nach Ablauf der Reaktionen aus der Änderung der Menge des gebildeten TPNH resultieren. Da die Änderung der Menge an TPNH eine direkte Funktion der Menge der Glucose ist, die ursprünglich in der Probe vorlag, kann

die Änderung der optischen Dichte dazu verwendet werden, die ursprünglich vorliegende Menge an Glucose zu berechnen.

Claims

Patentansprüche:

1. Laboratoriumsreagens zur Bestimmung der Glucose in biologischen Flüssigkeiten, bestehend aus Hexokinase, GIucose-6-phosphat-Dehydrogenase, Adenosintriphosphat, Triphosphopyridinnucleotid und Tris-hydroxyrnethyl-aminornethan, dadurch gekennzeichnet, daß es in trockener Form vorliegt und zusätzlich (a) Trishydroxymethyl-aminomethan-suifat oder Gummiarabicum oder Ammoniumsulfat oder ein Gemisch dieser Stoffe sowie (b) Tris-hydroxymethylaminomethan-SLiccinat und (c) Mannit als stabilisierenden Füllstoff enthält.

2. Laboratoriumsreagens nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen weiteren Gehalt an Insulin und Magnesiumsulfat.