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Gegenstand der Erfindung
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Diese
Erfindung bezieht sich auf die Detektion und Messung von Nukleinsäuren, die
von biologischen Quellen abstammen, und bezieht sich im Speziellen
auf Verfahren zum spezifischen Detektieren von gespleißter mRNA,
die normal gespleißte
mRNA, die ein Ergebnis der intrazellulären Verarbeitung ist, und atypisch
gespleißte
mRNA, die ein Ergebnis der chromosomalen Translokationsereignisse
ist, wie sie z.B. in einigen Krebszellen auftritt, beinhaltet.
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Hintergrund der Erfindung
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In
Eukaryoten liegt die genetische Information der DNA als Chromosomen
vor, die in einem Kern enthalten sind. Einige Viren enthalten chromosomenähnliche
genetische Strukturen. Die innerhalb eines DNA-Stranges enthaltende
genetische Information hängt
von der Sequenz an Basen (d.h., „Basensequenz" oder „Nukleotidsequenz") ab, wobei die Basen
Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) und Thymin (T) sind. DNA kodiert
für komplementäre Boten-Ribonukleinsäure-(mRNA)
Sequenzen, in denen T durch Uracil (U) ersetzt ist und die 5' bis 3' Nukleotidsequenz
die Aminosäuresequenz
des kodierten Proteins spezifiziert. Eukaryotische Gene beinhalten
im Allgemeinen nicht aneinanderliegende kodierende Bereiche („Exons"), die durch dazwischenliegende
nichtkodierende Bereiche („Introns") voneinander getrennt
werden. Die kernständige
Transkription eines Gens synthetisiert eine Vorläufer-mRNA (prä-mRNA, die
Introns und Exons beinhaltet), die komplementär zum kodierenden DNA-Strang
ist. Das normale Verarbeiten der prä-mRNA eliminiert Introns durch
Schneiden und Spleißen
der RNA, um die Exons kovalent zu verknüpfen und die Introns gleichzeitig
herauszuschneiden. Die sich daraus ergebende reife kernständige mRNA
tritt in das Cytoplasma über,
wo die Translation in Proteine stattfindet.
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Das
Spleißen
von Nukleinsäure
tritt ebenso im Lebenszyklus von vielen Viren auf. Einige Viren
integrieren als Provirus mittels eines Spleißmechanismus, in dem die DNA
des Wirtes zerschnitten und die virale Nukleinsäure in die DNA des Wirtes inseriert
und legiert wird, in die DNA von Wirtszellen. Die virale Insertion tritt
häufig
im Chromosom der Wirtszelle an einem spezifischen Lokus oder verwandten
Loki auf, die charakteristisch für
das Virus oder die Virusfamilie sind. Pathogene Proviren, die in
einer Target-Zellpopulation vorhanden sind, werden häufig mit
einem speziellen Zustand oder Erkrankung in Verbindung gebracht.
Die Insertion eines Provirus in das chromosomale Exon oder in die
Nähe einer
Intron-Exon-Grenze kann zur Herstellung einer abnormalen Version
einer für
gewöhnlich
transkribierten mRNA und/oder translatierten Proteins, mit nachfolgenden
schädlichen
Wirkungen für
die Zelle, führen.
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Molekularbiologische
Verfahren sind verwendet worden, um die genetische Basis für eine Erkrankung zu
untersuchen und molekulare Ereignisse, z.B. anomales genetisches
Spleißen,
Deletionen, Insertionen, Substitutionen und Amplifikationen zu identifizieren,
die für
einige Erkrankungen, wie zum Beispiel Krebs, verantwortlich sind.
Einige anomale genetische Spleißereignisse
sind nicht zufällig
und charakteristisch für
bestimmte Erkrankungen.
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Chromosomale
Translokationen sind genetische Rekombinationsereignisse, die mit
bestimmten Krebsarten, wie zum Beispiel einigen Leukämien und
Lymphomen, in Verbindung gebracht werden. Bei einigen Translokationen
setzten sich zwei unterschiedliche Chromosomen durch reziproken
genetischen Austausch zwischen den Chromosomen wieder zusammen,
die dann zwei Hybridchromosomen ausbilden, wobei ein jedes Abschnitte von
zwei normalen Chromosomen beinhaltet. Andere Translokationen sind
intrachromosomale Rekombinanten, in denen normalerweise nicht benachbarte
Bereiche des gleichen Chromosoms miteinander verbunden werden. Eine „Bruchpunktverbindung" (engl. „breakpoint
junction") einer
Translokation bezieht sich auf einen Verbindungspunkt von Sequenzen,
die von normalerweise voneinander getrennten Chromosomalen Orten
abstammen. Bruchpunktverbindungen können an konservierten Orten
innerhalb eines oder beider Chromosomen angehäuft werden. Translokationen,
die innerhalb eines genetisch kodierenden Bereiches auftreten, können abnormale
mRNA mit diskreten Bereichen, z.B., einen 5'-Abschnitt, der von einem chromosomalen
Ort abstammt und einem 3'-Abschnitt,
der von einem anderen chromosomalen Ort abstammt, ergeben. Solche
abnormalen Transkripte sind als „Fusions-Transkripte" oder „Fusions-mRNA" bekannt.
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Eine
Familie von Translokationen ist charakteristisch für Patienten
mit chronischer myelogener Leukämie
(„CML"). Mit CML in Verbindung
stehende Translokationen treten zwischen den menschlichen Chromosomen
9 und 22 (bezeichnet als „t(9:22)") auf und das sich
daraus ergebende verkürzte
Chromosom 22 ist als das Philadelphia-Chromosom (oder Ph1) bekannt. Die t(9;22) Ereignisse verbinden
Abschnitte des abl-Gens des Chromosoms 9 und des „Bruchpunkt-Cluster-Bereichs" (engl. „breakpoint
cluster region")
oder bcr-Gen des Chromosoms 22. Eine cDNA, die aus einer Fusions-mRNA
(von etwa 8kb), die aus einer Ph1-positiven Zelllinie
isoliert worden ist, angefertigt worden ist, wurde sequenziert,
was eine Translokation zwischen dem abl-Exon 2 und dem bcr-b3-Bereich
offenbarte, der für
ein Fusionsprotein mit einer Tyrosin-Kinase-Aktivität kodiert
(Shtivelman et al., Nature 315:550-554, 1985). Eine Antikörperdetektion
eines veränderten
abl-Proteins mit einem höheren
Molekulargewicht als das eines normalen abl-Proteins, ist verwendet
worden, um Ph1-positive Zellen, Diagnostik
der CML (siehe U.S. Pat. Nr. 4,599,305 von Witte et al.), zu detektieren.
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Eine
andere Translokation zwischen den Chromosomen 22 und 9 innerhalb
eines bcr-Bereiches, der etwa 50 kb 5' des mit CML in Verbindung stehenden
bcr-Bereiches liegt, ist für
die akute lymphoplastische Leukämie
(ALL) charakteristisch. Mit ALL in Verbindung stehende Translokationen
treten innerhalb des mutmaßlich
ersten Introns des bcr-Bereichs auf, die eine chimärische mRNA
erzeugen, die das bcr b1 des Chromosoms 22 und das abl Exon 2 des
Chromosoms 9 spleißt,
was wiederum ein Fusionsprotein erzeugt (Hermans et al., Cell 51:33-40,
1987). Mit ALL in Verbindung stehende Translokationen auf Chromosom
22 sind mit für einen
Abschnitt des bcr-Gens (siehe Europäisches Patentpublikation Nr.
EP 0 364 953 von Nakamura
et al.) spezifischen Sonden detektiert worden.
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Chromosomale
Translokationen, die menschliche Chromosomen 8 und 21 einschließen sind
mit etwa 40% der pediatrisch akuten myelogenen Leukämie („AML"), welche die FAB-M2
Morphologie aufweist, in Verbindung gebracht worden. Die Bruchpunkte
auf beiden Chromosomen sind variabel, führen jedoch im Allgemeinen
zu einem einfachen Fusionstranskript, das 5'-Abschnitte des AML1-Gens von Chromosom
21 und 3'- Abschnitte
des ETO-Gens des Chromosoms 8 enthält, die ein Fusionsprotein
erzeugen (siehe U.S. Pat. Nr. 5,580,727 von Ohki et al.).
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Andere
chromosomale Translokationen, die mit Erkrankungen wie zum Beispiel
Lymphomen und Leukämie
in Verbindung stehen, sind die mit ALL in Verbindung stehende t(15;17)
Translokation und die mit AML in Verbindung stehenden t(12;21),
t(4;11) und die t(1;19) Translokationen.
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Die
Detektion von chimärischen
DNA und/oder RNA und/oder Fusionsproteinen, die mit abnormalen Zuständen oder
Erkrankungen, wie zum Beispiel den weiter oben beispielhaft dargestellten,
in Verbindung stehen, ist wertvoll zur Bestätigung einer anfänglichen
Diagnose, zum Überwachen
der Reaktion eine Patienten auf eine Behandlung und zur Bereitstellung
einer Frühwarnung
vor dem Wiederauftreten der Erkrankung nach der Remission. Die Fähigkeit,
chimärische
Nukleinsäuren
oder Proteine zu detektieren, ist durch die extrem kleine Anzahl
von Zellen, die in unterschiedlichen Stufen einer Erkrankung vorhanden
sind, z.B. im Anschluss an eine Remission oder in einer nicht akuten
Phase, begrenzt. Die Prognose von Zuständen eines Patienten, die mit
chromosomalen Translokationen in Verbindung stehen, das Wiederauftreten
der Zustände
eingeschlossen, ist bei einer frühen
Diagnose für
gewöhnlich
günstiger.
Im Allgemeinen sind immunologische Techniken nicht empfindlich genug,
um sehr kleine Mengen des Analyten in einer Probe zu detektieren.
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Von
Verfahren zur Diagnose von Zuständen,
die mit chromosomalen Translokationen, wie zum Beispiel CML und
ALL in Verbindung stehen, ist berichtet worden. Das U.S. Pat. Nr.
4,681,840 von Stephenson et al. und die PCT Veröffentlichung Nr. WO 85/03297
offenbaren DNA- und Hybridisationsverfahren zur Detektion von mit
CML in Verbindung stehenden Ph1-Abnormalitäten mittels
einer chromosomalen von DNA abstammenden Sonde, die komplementär zum bcr-Bereich
ist. Mit CML in Verbindung stehende t(9:22) Translokationen, die
bcr b2 oder b3 mit dem abl-Exon 2 verbinden, können durch Amplifizieren der
Fusions-mRNA und anschließendem
Hybridisieren synthetischer Oligonukleotidsonden, die für diese
gespleißten
Sequenzen spezifisch sind, für
die amplifizierten Nukleinsäuresequenz
(siehe U.S. Pat. Nr. 4,874,853 von Rossi et al. und Europäische Pat.
Veröffentlichungsnr.
0338713) detektiert werden. Verfahren zur Detektion einzigartiger
anomaler Gentranskripte durch Hybridisieren der RNA mit einem oder
mehreren synthetischen DNA-Oligonukleotiden, die komplementär zu Sequenzen
sind, die durch das Ph1-Chromosom kodiert
werden, wurden im U.S. Pat. Nr. 4,999,290 von Lee beschrieben. In
diesen Verfahren wird eine RNA-DNA Heteroduplex ausgebildet, die
gegenüber
einem enzymatischen Abbau resistent ist, gefolgt von einer Polymerase
Kettenreaktions-(PCR) Amplifikation und DNA-Detektion, um die Anwesenheit anomaler
Gentranskripte anzuzeigen. Die komplementären DNA-Oligonukleotide beinhalten
bcr b2 und/oder b3 und abl-Sequenzen. DNA-Sequenzen und Hybridisationsverfahren
zur Detektion und Identifizieren chromosomaler Anomalitäten in Tumor-DNA,
die den ALL-1 Bruchpunktbereich des menschlichen Chromosoms 11 enthalten
(z.B., t(9;11) Translokationen), sind bekannt (siehe U.S. Pat. Nr.
5,567,586 und 5,633,136 von Croce et al.).
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Verfahren,
die Verbindungssonden verwenden, um Translokationen zu detektieren,
können
als Folge von spezifischen Fusionsereignissen nur DNA oder mRNA
detektieren, da jede Sonde gegen eine spezifische Bruchpunktverbindung
gerichtet ist. Für
Translokationen, wie zum Beispiel mit CML in Verbindung stehende Ereignisse,
die irgendeine von vielen innerhalb eines kleinen bcr-Bereiches
auftretenden Bruchpunkten verwenden können, würde ein Nachweis von Fusions-mRNA
die Verwendung von vielen unterschiedlichen Bruchpunktverbindungssonden
erforderlich machen. Ebenso sind Punktmutationen, welche die Sondenhybridisierung
begrenzen können,
manchmal innerhalb einiger Basen entfernt von einer Spleißverbindung
angeordnet. Darüber
hinaus können
chromosomale Umordnungen, wie zum Beispiel Deletionen oder Insertionen
innerhalb des bcr-Gens weniger übliche
mit CML in Verbindung stehende anomale Transkripte erzeugen, die
durch Verwendung einer Bruchpunktverbindungssonde nicht detektiert
werden würden.
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U.S.
Pat. Nr. 5,487,970 von Rowley et al. offenbart Verfahren zur Detektion
von Chromosom 11 (11q22) Translokationen mittels einer Bruchpunktverbindungssonde
oder der Verwendung von der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisation (FISH).
Im FISH-Verfahren werden zwei fluoreszierend markierte Sonden, die
gegen einen 11q22 chromosomalen Bereich, der einen als üblich bezeichneten
Bruchpunkt flankiert, gerichtet sind, in situ zu Chromosomen hybridisiert,
die dann mittels Fluoreszenzmikroskopie beobachtet werden. Zellen,
in denen der Marker nur auf Chromosom 11 vorhanden ist, werden als
normal klassifiziert, wohingegen Zellen, in denen der Marker auf
unterschiedlichen Chromosomen zu finden ist, als eine Translokation
besitzend identifiziert werden. Dieses Verfahren erfordert das Screenen
einer relativ großen
Zellpopulation, wenn nicht die Translokation in vielen Zellen in
der Probe vorhanden ist. Die Sonden beinhalten Restriktionsendonuklease-Fragmente, die mit
chromosomalen Translokationen, die das Chromosom 11 ALL-1 Gen (mittels
FISH oder Southern Blott) einschließen, hybridisieren können. Andere
FISH-Verfahren, die mit CML in Verbindung stehende Translokationen
detektieren, verwenden Sonden, die von Spezies-spezifischen DNA-Bereichen
zwischen Wiederholungssegmenten („inter-Alu"-Sequenzen) abstammen, wie in U.S. Pat.
5,538,869 von Siciliano et al. beschrieben.
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Die
zuvor genannten Verfahren beruhen auf der direkten Detektion der
chimärischen
RNA oder DNA durch Nukleinsäurehybridisation
ohne Signal- oder Targetamplifikation. Daher erfordern diese Detektionsverfahren
eine relativ große
Anzahl von Targetzellen, welche die chromosomale Umordnung in der
Probe tragen, z.B., Gewebe, Blut oder eine andere Körperflüssigkeit.
Eine große
Anzahl von abnormalen Zellen jedoch sind im Allgemeinen in einer
Probe nicht vorhanden, wenn die Erkrankung in der Remission zu sein
scheint oder sich in einem chronischen nicht akutem Stadium befindet.
Daher können,
wenn eine ausreichenden Anzahl von die genetischen Abnormalitäten tragenden
Zellen vorhanden sind, um eine direkte Detektion zu ermöglichen,
die Möglichkeiten
zur Behandlung eines Patienten deutlich begrenzt werden.
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Andere
Verfahren zur Nukleinsäuredetektion
verwenden eine Amplifikation, um viele Kopien eine Target-Nukleinsäure (entweder
einer oder beide komplementären
Stränge)
oder eines Reportermoleküls
zu erhalten, um die Detektionsempfindlichkeit zu erhöhen. Eine
Vielzahl von Nukleinsäureamplifikations verfahren
sind gut bekannt (z.B., siehe Persing, D.H., „In Vitro Nucleic Acid Amplification
Techniques" in Diagnostic
Medical Microbiology: Principles and Applications 51 (Persing et
al., Herausgeber, 1993)), wie weiter unten kurz beschrieben.
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Eskola
et al. (Clinical Biochemistry, Vol.27, Nr.5, 5.373-379, 1994) offenbart
ein Verfahren zur Detektion von Translokationen zwischen dem menschlichen
abl-Gen des Chromosoms 9 und dem bcr-Gen des Chromosoms 22 unter
Verwendung einer Reversen Transkriptase Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR),
um einen Teil der Translokationssequenz zu amplifizieren, gefolgt
von der Detektion der amplifizierten Nukleinsäure mittels eines Verfahrens,
das mindestens zwei Sonden zur Detektion erfordert. Eine der zwei
Sonden ist biotinyliert und bindet 5' von der Translokations-Spleißverbindung,
und die zweite Sonde ist Eu-markiert und bindet 3' von einer Spleißverbindung.
Die biotinylierte Sonde wird verwendet, um die Hybrid-Komplexe an
eine Streptavidin-beschichtete Kammer zu binden und die Eu-markierte Sonde wird
verwendet, um die Komplexe durch detektieren der Fluoreszenz in
den gewaschenen Kammern zu detektieren.
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WO
97/08339 offenbart Verfahren zur Detektion von mit CML in Verbindung
stehenden bcr-abl Translokationen durch Amplifizieren von RNA-Sequenzen
unter Verwendung von Amplifikationsprimern, die an Positionen hybridisieren,
welche die Spleißverbindung
flankieren, und ein mit der Transkription in Verbindung stehendes
Verfahren (z.B. 3SR oder NASBA) und nachfolgendem Detektieren der
Reaktionsprodukte, falls vorhanden, nach dem Einfangen auf einer
festen Phase, wie zum Beispiel einer Mikrokammer, mittels eines Agens
zum Einfangen. Der Detektionsschritt verwendet ein Agens zum Einfangen
und ein Agens zum Detektieren, um einen Target/Einfang Agens/Detektor
Agenskomplex, der innerhalb eine Kammer gebunden ist, auszubilden,
und ungebundenes Material wird weggewaschen. In einigen Ausführungsformen
der WO 97/08339 können
die Bindungsschritte des Agens zum Einfangen und des Agens zum Detektieren
der Reihe aufeinanderfolgend sein, wobei das Reaktionsprodukt an
die feste Phase gebunden wird, gewaschen wird und dann das Agens
zum Detektieren gebunden wird. In einem anderen sequentiellen Verfahren,
das in der WO 97/08339 offenbart wird, wird die amplifizierte Probe
an das Agens zum Detektieren gebunden und der Probe/Detektor-Agenskomplex wird
dann in der mit dem Agens zum Einfangen beschichteten Mikrokammer
gebunden. Eine andere Ausführungsform
der WO 97/08339 verwendet simultanes Anbinden, wobei die amplifizierte
Probe gleichzeitig mit dem Agens zum Einfangen und dem Agens zum
Detektieren vermengt wird und der Target/Einfang Agens/Detektor
Agenskomplex wird dann in eine Mikrokammer gegeben.
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DE-A-4447015
beschreibt ein Verfahren, das zum Isolieren und Reinigen von Nukleinsäuren aus
kleinen Mengen von stark kontaminierten Materialien geeignet ist,
das umfasst: (a) Lysieren des Materials mit einem Puffer, der ein
chaotropes Salz mit einer hohen Ionenstärke enthält; (b) Inkubieren des Lysates
mit einem fein verteilten, nicht porösem, nicht strukturiertem,
homogenen Silikatträger,
der eine Partikelgröße von 7–40 nm und
einer Oberfläche
von 50–300
m<2>/g aufweist; (c) Abtrennen
der Trägergebundenen
Nukleinsäure vom
Lysat; (d) Waschen des Trägers
mit einem Puffer, und (e) Eluieren der Nukleinsäure mit einem Puffer niedrigem
Salzgehaltes.
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Eine
Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ermöglicht die Detektion von kleinen
Mengen an in einer Probe vorhandenen DNA durch Amplifizieren der
DNA-Targets mittels zweier oder mehrerer Primer und wiederholten
Zyklen thermalen Denaturierens, Primer Anbindens und DNA-Synthese
(U.S. Pat. Nr. 4,683,195 von Mullis et al.; PCR Protocols: A Guide
to Methods and Applications, 1990, Innes, M.A. et al., Herausgeber
(Academic Press, Inc., San Diego, CA)). Üblicherweise hybridisiert ein
erster Primer mit einem spezifischen Bereich der Target-Nukleinsäure und
ein zweiter Primer hybridisiert an dem entgegengesetzten Strang
der Target-DNA 5' zur
Bindungsstelle des ersten Primers. Dann stellt die Polymerase in
einer Serie von Syntheseschritten Primer-Verlängerungsprodukte her, welche
den Bereich zwischen den Primern exponentiell amplifizieren.
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Die
Ligase-Kettenreaktion (LCR) verwendet zwei komplementäre Sätze von
kurzen DNA-Oligonukleotiden, die mit nebeneinanderliegenden Bereichen
einer Zielnukleinsäure
hybridisieren, und die Oligonukleotide werden dann mittels einer
DNA-Ligase (siehe Europäisches
Pat. Nr. 0320308) kovalent verknüpft.
Durch Verwenden von wiederholten Zyklen thermaler Denaturierung,
Hybridisation und Ligation kann ein angereichertes, doppelsträngiges,
ligiertes Oligonukleotidprodukt detektiert werden, um die Anwesenheit
der Target-Nukleinsäure
in einer Probe anzuzeigen.
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Die
Strangverdrängungs-Amplifikation
(engl. „strand
displacement amplification")
(Walker et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396) verwendet
Oligonukleotidprimer, die Restriktionsendonuklease-Spaltstellen
enthält
und mit gegenüberliegenden
Strängen
eines Target-Nukleinsäureduplexes
auf beiden Seiten der Sequenz hybridisiert, um amplifiziert zu werden.
Die DNA-Polymerase-vermittelte Primerverlängerung, die 3-Desoxynuleosidtriphosphate
(dNTP) und ein einzelnes dNTP[α]S
verwendet, stellt ein Duplex-Hemiphosphorthioat-Primer-Verlängerungsprodukt
her, welches eher gebrochen wird als durch eine Restriktionsendonuklease
zerschnitten. Dann wird das 3'-Ende
des Bruchs durch eine DNA Polymerase verlängert, die gleichzeitig den
nicht-Hemiphosphorthioat-Strang verdrängt. Jeder verdrängte Strang
eines Sinns kann als eine Matrize für das Anbinden von Oligonukleotidprimern
des entgegengesetzten Sinns dienen, was zur geometrischen Ansammlung
von doppelsträngigen
Nukleinsäuren
führt.
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Ein
anderes Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren
verwendet eine RNA-Replikase (Qβ Replikase), die
im Stande ist die Sonde selber zu amplifizieren (siehe U.S. Pat.
5,112,734 von Kramer et al.).
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Auf
Transkription basierende Amplifikationssysteme verwenden eine RNA-Polymerase,
um RNA-Transkripte eines Targetbereiches herzustellen (siehe U.S.
Pat. Nr. 5,480,784 und 5,399,491 von Kacian et al.). Ein Verfahren
genannt Transkriptions-vermittelte Amplifikation (TMA) verwendet
einen Promotor-Primer, der mit einer Target-Nukleinsäure hybridisiert.
In Anwesenheit einer Reversen Transkriptase wird doppelsträngige DNA
ausgebildet, die einen doppelsträngigen
Promotor ausbildet. Dann stellt eine RNA-Polymerase RNA-Transkripte
her, die zu Matrizen für
weitere Runden TMA in Anwesenheit eines zweiten Primers, der mit den
RNA-Transkripten hybridisieren kann, werden. Anders als bei der
PCR und anderen Verfahren, die eine Hitzedenaturierung erfordern,
ist die TMA ein isothermales Amplifikationsverfahren, das eine RNAse
H Aktivität
verwendet, um den RNA-Strang eines RNA-DNA Hybrids zu verdauen,
wodurch der DNA-Strang für
die Hybridisation mit einem Primer oder Promotor-Primer zugänglich gemacht
wird. Üblicherweise
wird die RNAse H Aktivität
durch eine Retrovirale Reverse Transkriptase, welche für die Amplifikation
bereitgestellt wird, versorgt.
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Chromosomale
Translokationen und ihre Transkriptionsprodukte sind mittels Verfahren,
die eine Nukleinsäureamplifikation
beinhalten, detektiert worden. Ein auf PCR basierendes Verfahren
zur Detektion von Zellen, die genomische DNA mit t(14q32;18q21)
chromosomalen Translokationen enthalten, die mit follikulären Lymphomen
und besonders mit minimalen Rest- oder Rezidiverkrankungen in Verbindung
gebracht werden, durch Amplifizieren von Sequenzen, die einen Bruchpunkt-Cluster-Bereich
umgeben, wurde im U.S. Pat. Nr. 5,024,934 von Lee beschrieben. PCR-Primer
und cDNA Amplifikationsverfahren zum Identifizieren von t(9;11)
Translokationen im Gewebe eines Patienten wurden im U.S. Pat. Nr.
5,633,135 von Croce et al. beschrieben. Verfahren zur Detektion
von Krebsmetastasen (eine in 10.000 bis 100.000 Zellen), die eine PCR-Amplifikation
von Target-Nukleinsäuren
einschließen,
wurden von Green et al. im Europäischen
Patent Veröffentlichungsnr.
EP 520794 beschrieben.
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Auf ähnliche
Weise ist eine PCR-Amplifikation verwendet worden, um chimärische mRNA,
die mit ALL in Verbindung steht (U.S. Pat. Nr. 5,057,410 von Kawasaki
et al.), und RNA Transkripte, die von einer t(8;21) Translokation
in Leukämiezellen
abstammen (U.S. Pat. Nr. 5,547,838 von Nisson et al.), zu detektieren.
U.S. Pat. Nr. 5,057,410 offenbart PCR Verfahren zur Detektion chimärischer
mRNA, die Exon-Exon Verbindungen enthält. In diesem Verfahren wird
mRNA, die von der Targetzelle extrahiert wird, umgekehrt transkribiert,
um cDNA herzustellen, die durch PCR amplifiziert wird, um ein doppelsträngiges DNA-Amplifikationsprodukt
herzustellen. Dieses Amplifikationsprodukt wird dann denaturiert
und einer der sich daraus ergebenden Stränge wird durch hybridisieren
einer Oligonukleotidsonde mit der Bruchpunktverbindung detektiert.
Individuelle Sonden hybridisieren an bestimmte bcr-abl Verbindungsspezies,
die mit CML und ALL in Verbindung gebracht werden.
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Sooknanan
et al. (Experimental Hematol. 21:1719-1724, 1993) beschreibt ein
Verfahren zur Detektion einer für
CML charakteristischen bcr-abl mRNA durch Extrahieren von RNA aus
FICOLLTM-fraktionierten peripheralen Blutleukozyten
und Amplifizieren einer Target-Nukleinsäure mittels eines isothermalen
Amplifikationsverfahrens, das eine Transkription einschließt. Fortlaufende
Reaktionen, die vier Amplifikationsprimer (ein primäres Paar
in der ersten Reaktion und ein ineinandergesetztes Paar in der zweiten
Reaktion) verwenden, waren essentiell für die Amplifikation und Detektion.
Die amplifizierte Nukleinsäure,
die durch dieses Verfahren hergestellt wurde, war vom gleichen Sinn
wie die original mRNA und wurde mittels zwei verschiedener bcr-abl-Verbindungssonden
zum Detektieren von zwei Spleißverbindungen
detektiert. Sonden für
die Bruchpunktverbindungen unterschieden normale bcr und/oder abl
mRNA von chimärischer
bcr-abl mRNA in einer Patientenprobe.
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Auf
PCR basierende Verfahren wurden zum Detektieren anderer Translokationen,
die mit Krebs oder deren Transkriptionsprodukten in Verbindung gebracht
werden, verwendet. Sonden und PCR-Primer zum Detektieren von t(2;13)
Translokationen, die mit dem alveolären Rhabdomyosarcom in Verbindung
stehen, wurden im U.S. Pat. Nr. 5,650,278 von Barr et al. beschrieben.
Eine Nukleinsäuresequenz,
die für
ein Fusionsprotein codiert (anaplastische Lymphomkinase oder ALK),
das mit t(2;5) Lymphomen in Verbindung steht, wurde im U.S. Pat.
Nr. 5,529,925 von Morris et al. offenbart.
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Es
besteht im Stand der Technik weiterhin ein Bedarf für ein einfaches,
empfindliches und schnelles Verfahren zur Detektion von chimärischen
Nukleinsäuren,
insbesondere chimärischer
mRNA, die von biologischen Proben, wie zum Beispiel Blut, Mark,
Plasma, Biopsiegewebe, Sputum, Urin, Fäkalien, Samenflüssigkeit oder
anderen Körperflüssigkeiten
erhalten wird. Bevorzugt würden
solche Verfahren ein Minimum an technischer Expertise durch Laborpersonal
und ein Minimum an spezieller Laborausrüstung (z.B., Zentrifugen, Temperaturwechsel
und Elektrophoreseausrüstung)
erfordern und würden
relativ preiswerte Reagenzien verwenden. Darüber hinaus besteht ein Bedarf
für ein
Assay zum Detektieren chimärischer
mRNA, das ein Ergebnis bereitstellen würde, das mit einem Minimum
an Qualifikation durch, zum Beispiel, Verringern der Möglichkeiten von
falsch positiven und falsch negativen Ergebnissen interpretiert
werden kann.
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Im
Stand der Technik wird ebenso ein einfaches und schnelles Verfahren
für das
Zubereiten cytoplasmatischer Nukleinsäuren, insbesondere mRNA, für die Verwendung
als potentielles Target in diagnostischen Nukleinsäurehybridisationsassays
oder als Matrize für
eine Nukleinsäureamplifikation
benötigt.
Derart vereinfachte präparative
Verfahren verringern die Notwendigkeit von vollständigen Extraktions-
und Reinigungsverfahren.
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Ein
kritisches Element von Verfahren zur Detektion von RNA (oder daraus
hergestellten Amplifikationsprodukten), insbesondere mRNA, ist die
Art und Weise mit der RNA aus den Zellen extrahiert wird. Wegen der
ubiquitären
Anwesenheit von zahlreichen RNasen müssen die Extraktionsverfahren
die geringe Menge an Target-RNA, die in einer Probe vorhanden sein
könnte,
erhalten. Extraktionsverfahren, die alle Nukleinsäuren (kernständige Nukleinsäuren mit
eingeschlossen) aus der Targetzelle freisetzten, erzeugen Proben,
die nicht nur die Target-mRNA aber auch die sie kodierende DNA enthalten,
was falsch positive Ergebnisse in vielen auf Nukleinsäure basierenden
Assays erzeugt.
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Bekannte
Extraktionstechniken verwenden im Allgemeinen ein chaotropisches
Agens, wie zum Beispiel Guanidinium, um die Zellen zu lysieren.
Die weitere Verarbeitung schließt üblicherweise
das mechanische Scheren der DNA, eine Phenol- und Chloroformextraktion und eine Ethanol
oder LiCl Präzipitation
der RNA aus dem Guanidinium ein. Zusätzliche Verfahren der mRNA
Zubereitung verwenden oligo-dT (d.h. Polythymin), das an Resten
immobilisiert ist, um Poly-A mRNA zu immobilisieren.
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Es
wäre in
diagnostischen Verfahren, die gereifte cytoplasmatische RNA detektieren,
von Vorteil wenn man Zellen permeabilisieren könnte, um gereifte RNA-Arten
in den Extraktionspuffer freizusetzen, während kernständiges Material
zusehends nicht freigesetzt wird. Dadurch würden DNA und ungereifte kernständige RNA-Arten
nicht mit der gewünschten
Target-Nukleinsäure
vermengt werden. Durch das Ausschließen von anfänglichem Vermischen der gewünschten
RNA-Arten und Kontaminanten, welche die gleichen oder komplementäre Sequenzen
enthalten und/oder die Viskosität
erhöhen,
können
zusätzliche
Schritte, die zum Eliminieren chromosomaler DNA und sich daraus
ergebender falsch positiver Ergebnisse erforderlich sind, verhindert werden.
Ein schnelles, einfaches Lyseverfahren, das cytoplasmatische RNA-Arten
freisetzten wird, während Prä-mRNA oder
DNA nicht signifikant freigesetzt werden, und das kein hohes Niveau
an spezialisierten Fertigkeiten oder Schulung erfordert, ist für die Verwendung
in kommerziellen Assays und Kits wünschenswert. Es besteht ein
Bedarf für
ein schnelles, einfaches Lyseverfahren, das RNA liefert, die für eine qualitative und/oder
quantitative Nukleinsäureamplifikation
oder eine direkte Detektion von spezifischen Nukleinsäuren geeignet
ist.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung ist auf Assayverfahren zur Detektion von Fusionsnukleinsäuren, insbesondere
chimärischen
mRNA-Arten, in einer biologischen Probe gerichtet.
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Gemäß eines
Aspektes der Erfindung wird ein Verfahren zur Detektion einer Fusionsnukleinsäure in einer
Probe bereitgestellt, das die Schritte zum Bereitstellen einer Probe,
die eine erste einzelsträngige
Fusionsnukleinsäure
enthält,
die eine bcr-abl-Spleißverbindungsstelle
einschließt;
in Kontakt bringen der ersten einzelsträngigen Fusionsnukleinsäure, eines
ersten Promotor-Primers, der spezifisch mit der Fusionsnukleinsäure an einer
ersten Primer-Bindungsstelle
hybridisiert, die 3' zur
Spleißverbindungsstelle
und in einer abl-Sequenz angeordnet ist, und zumindest eine Nukleinsäure-Polymeraseaktivität unter
Nukleinsäureamplifizierungsbedingungen
einschließt.
Dann schließt
das Verfahren das Amplifizieren der Fusionsnukleinsäure in einer
Reaktion zur Nukleinsäureamplifizierung
unter Verwendung des ersten Primers zur Herstellung einer Vielzahl
von zweiten Nukleinsäuresträngen, die
zumindest mit einem Abschnitt der ersten einzelsträngigen Fusionsnukleinsäure, welche
die Spleißverbindungsstelle
enthält,
komplementär
sind, ein. Jeder zweite Nukleinsäurestrang
schließt
eine komplementäre
Spleißverbindungsstelle,
eine erste Sonden-Bindungsstelle in einer bcr-Sequenz, die 3' angeordnet ist und
sie nicht mit der komplementären
Spleißverbindungsstelle überlappt, und
eine zweite Sonden-Bindungsstelle in einer abl-Sequenz, die 5' angeordnet ist und
die nicht mit der komplementären
Spleißverbindungsstelle überlappt,
wobei die zweite Sonden-Bindungsstelle überlappt
oder 3' zur Sequenz
angeordnet ist, die komplementär
zur ersten Primer-Bindungsstelle ist, ein. Das Verfahren schließt dann
die Schritte des Hybridisierens des zweiten Nukleinsäurestranges
unter Hybridisierungsbedingungen mit einer Oligonukleotidsonde,
die spezifisch mit der ersten oder zweiten Sonden-Bindungsstelle
hybridisiert, wodurch ein Sonden:Target-Hybrid ausgebildet wird,
und das Detektieren des Sonden:Target-Hybrids in einem homogenen
Assayformat als ein Nachweis der Anwesenheit der Fusionsnukleinsäure in der
Probe, ein. In einer Ausführungsform
des Verfahrens ist die erste einzelsträngige Fusionsnukleinsäure eine
mRNA, die Polymeraseaktivität
ist eine RNA-Polymeraseaktivität
und die Oligonukleotidsonde weist den gleichen Sinn auf, wie die
mRNA und hybridisiert spezifisch mit der ersten Sonden-Bindungsstelle.
In einer anderen Ausführungsform des
Verfahrens ist die erste einzelsträngige Fusionsnukleinsäure eine
mRNA, die zweiten Nukleinsäurestränge bestehen
aus komplementärer
RNA und der Amplifizierungsschritt schließt weiter das in-Kontakt-bringen
der zweiten Nukleinsäurestränge mit
einem zweiten Primer oder Promotor-Primer, der spezifisch mit einer
zweiten Primer-Bindungsstelle
in einer bcr-Sequenz, die 3' sowohl
zur komplementären
Spleißverbindungs-
als auch zur ersten Sonden-Bindungsstelle
angeordnet ist, hybridisiert, ein und verwendet beim synthetisieren
von Amplifizierungsprodukten eine RNA-Polymeraseaktivität, eine
DNA-gerichtete DNA-Polymeraseaktivität und eine RNA-gerichtete DNA-Polymeraseaktivität. In einer
Ausführungsform
hybridisiert die Oligonukleotidsonde spezifisch mit der zweiten
Sonden-Bindungsstelle
und ist nicht in der Lage, einen stabilen Hybridisierungskomplex mit
der ersten einzelsträngigen
Fusionsnukleinsäure
auszubilden. Das Verfahren kann in einem ersten Schritt auch das
Zubereiten cytoplasmatischer RNA aus eukaryotischen Zellen in der
Probe durch in-Kontakt-bringen einer biologischen Probe, welche
die Fusionsnukleinsäure
mit einer Lösung,
die den Puffer mit einem pH in einem Bereich von etwa 6,5 bis etwa
8,5, ein lösliches
Salz mit einer Ionenstärke
im Bereich von etwa 150 mM bis etwa 1M, ein chelatbildendes Agens
mit einer Konzentration von etwa 5 mM und ein nicht-ionisches Detergens
im Bereich von etwa 0,5% bis etwa 1,5% (v/v) enthält, wobei
RNA aus in der Probe vorhandenen Zellen freigesetzt wird, umfassen.
Der Schritt des Zubereitens der Probe kann weiterhin die Schritte
des in-Kontakt-bringens
der Probe mit einem Trägermaterial,
das mit einem immobilisierten Oligonukleotid, das eine Nukleotidbasensequenz
einschließt,
die unter Hybridisierungsbedingungen direkt oder indirekt einen
stabilen Hybridisationskomplex mit einer einzelsträngigen in
der Probe vorhandenen Fusionsnukleinsäure ausbildet, verbunden ist,
und das Abtrennen des mit dem Trägermaterial
verbundenen Hybridisationskomplexes von anderen Probenbestandteilen,
einschließen.
In bevorzugten Ausführungsformen
ist die gereinigte Fusionsnukleinsäure eine mRNA und die Nukleotidbasensequenz
des immobilisierten Oligonukleotids schließt eine Poly-T Sequenz ein.
In einer anderen Ausführungsform
des Verfahrens ist die Fusionsnukleinsäure ein Fusions-mRNA-Transkript,
das aus einer genetischen t(9;22) Translokation, die zwei chromosomale
Bereiche der Chromosoms 9 und Chromosoms 22 an einer Spleißverbindungsstelle
miteinander verbindet, hergestellt worden ist; beim Schritt des
In-Kontakt-Bringens
hybridisiert der erste Promotor-Primer spezifisch mit dem Fusions-mRNA-Transkript
an einer ersten Primer-Bindungsstelle, die von einem ersten chromosomalen
Bereich in einer abl-Sequenz, die 3' zur Spleißverbindungsstelle angeordnet
ist, abgeleitet ist; und im Amplifizierungsschritt leitet sich die
erste Sonden-Bindungsstelle
von einem zweiten chromosomalen Bereich in einer bcr-Sequenz ab
und die zweite Sonden-Bindungsstelle leitet sich von einem dritten
chromosomalen Bereich in einer abl-Sequenz ab, die überlappt
oder 3' zu einer
Sequenz angeordnet ist, die zur ersten Primer-Bindungsstelle komplementär ist; und
im Hybridisierungsschritt hybrisiert die Oligonukleotidsonde mit
den zweiten Nukleinsäuresträngen an
der ersten oder zweiten Sonden-Bindungsstelle, ist jedoch nicht
in der Lage mit dem Fusions-mRNA-Transkript zu hybridisieren. In
einer Ausführungsform
zum Detektieren von Fusions-mRNA-Transkripten wird im Amplifizierungsschritt
ein erster Primer, der ein Promotor-Primer ist, und ein Enzym mit
einer RNA-Polymeraseaktivität
verwendet und im Hybridisierungsschritt wird eine Oligonukleotidsonde,
die spezifisch mit der ersten Sonden-Bindungsstelle hybridisiert,
verwendet. In einer anderen Ausführungsform
schließt der
Amplifizierungsschritt einen zweiten Primer oder Promotor-Primer ein, der unter
Amplifikationsbedingungen spezifisch mit einer Nukleotidsequenz
einer mRNA hybridisiert, die komplementär zum Fusions-RNA-Transkript
ist und eine RNA-Polymeraseaktivität, eine DNA-gerichtete DNA-Polymeraseaktivität, und eine
RNA-gerichtete DNA-Polymeraseaktitvtät und eine RNA-gerichtete DNA-Polymeraseaktivität verwendet. In
einer bevorzugten Ausführungsform
werden die RNA-gerichtete DNA-Polymeraseaktivität und die DNA-gerichtete DNA-Polymeraseaktivität durch
eine Reverse Transkriptase zur Verfügung gestellt. Das Verfahren kann
ebenso die Detektion eines internen Kontroll-Transkripts einschließen, in
dem der Amplifizierungsschritt weiter das Amplifizieren eines internen Kontroll-Transkripts
durch Verwendung des ersten Promotor-Primers, der ebenso spezifisch mit dem
internen Kontroll-Transkript
hybridisiert, einschleißt,
dann schließt
der Hybridisierungsschritt weiter eine zweite Oligonukleotidsonde,
die spezifisch mit einer Sequenz hybridisiert, die komplementär zum internen
Kontroll-Transkript ist, ein, wodurch ein interner Kontroll-Hybridisationskomplex
ausgebildet wird, und der Detektionsschritt schließt weiter
das Detektieren des internen Kontroll-Hybridisationskomplexes ein.
Im Allgemeinen werden die ersten und zweiten Sonden-Bindungsstellen von
unterschiedlichen Bereichen eines Chromosoms abgeleitet, oder die
erste Sonden-Bindungsstelle wird von einem ersten Chromosom abgeleitet
und die zweite Sonden-Bindungsstelle wird von einen zweiten Chromosom
abgeleitet. Zum Beispiel kann ein Fusions-mRNA-Transkript das Ergebnis
einer Translokation von menschlichen Chromosomen sein, die aus der
Gruppe ausgewählt
werden, die besteht aus: t(1;19), t(2;5), t(2;13), t(4;11), t(6;9),
t(8;21), t(9;11), t(9;22), t(11;14), t(11;19), t(11;22), t(12;21),
t(14;18) und t(15;17). Gemäß der vorliegenden
Erfindung ist das Fusions-mRNA-Transkript
ein Ergebnis einer t(9;22) Translokation und die Oligonukleotidsonde schließt eine
von bcr abgeleitete Sequenz oder eine von abl abgeleitete Sequenz
ein. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform bindet die Oligonukleotidsonde
spezifisch an eine von bcr abgeleitete Nukleotidbasensequenz in
den zweiten Nukleinsäuresträngen. Die
Erfindung schließt
ebenso ein oder mehrere Oligonukleotide für die Verwendung im Verfahren
zur Detektion eines Fusions-mRNA-Transkripts
mit einer Sequenz, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus SEQ ID NO:9
bis SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:26 und SEQ ID NO:27 besteht, ein. Bevorzugt
hat der zweite Primer für
die Verwendung im Verfahren zur Detektion einer Fusionsnukleinsäure in einer
Probe die Sequenz der SEQ ID NO:5. Darüber hinaus wird bevorzugt,
dass das zweite Oligonukleotid für
die Verwendung im Verfahren zur Detektion einer Fusionsnukleinsäure in einer
Probe die Sequenz der SEQ ID NO:16 hat.
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Die
vorliegende Erfindung schließt
in einer bevorzugten Ausführungsform
im Bereitstellungsschritt des Verfahrens zum Detektieren einer Fusionsnukleinsäure in einer
Probe weiter ein Verfahren zum Zubereiten von RNA aus einer Probe
ein, das die Schritte des Bereitstellens einer Probe, die ungereinigte
RNA enthält, Vermengen
der Probe mit einer Lösung,
die einen Puffer mit einem pH im Bereich von etwa 6,5 bis etwa 8,5 enthält, ein
lösliches
Salz mit einer Ionenstärke
von mindestens etwa 150 mM, ein nichtionisches Detergens in einer
wirksamen Menge, die ausreichend ist, um cytoplasmatische RNA aus
einer Zelle freizusetzen, ohne eine erhöhte Viskosität in der
Probe aufgrund des Freisetzens von chromosomaler DNA aus der Zelle
zu verursachen und ein Trägermaterial,
das mit einem immobilisierten Oligonukleotid verbunden ist, dass
eine Nukleotidbasensequenz enthält,
die direkt oder indirekt mit in der Probe vorhandener RNA hybridisiert,
wobei unter Hybridisierungsbedingungen ein stabiler Hybridisationskomplex
hergestellt wird, einschließt.
Dann schließt das
Verfahren die Schritte des Abtrennens des mit dem Trägermaterial
verbundenen Hybridisationskomplexes von anderen Probenbestandteilen,
das Waschen des mit dem Trägermaterial
verbundenen Hybridisationskomplexes mit einer Waschlösung, die
eine ausreichende Ionenstärke
aufweist, damit der Hybridisationskomplex mit dem Trägermaterial
verbunden bleibt, und wiedergewinnen des mit dem Trägermaterial
verbundenen Hybridisationskomplexes aus der Waschlösung, ein.
In bevorzugten Ausführungsformen
ist die Probe unkoaguliertes Blut, Plasma, oder Knochenmark oder
eine Suspension von eukaryotischen Zellen. In anderen Ausführungsformen
liegt die wirksame Menge des nichtionischen Detergens zwischen etwa
0,5% bis etwa 1,5% (v/v).
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Die
Erfindung wird mit bevorzugten Ausführungsformen, die in den Figuren
und Beispielen dargestellt werden, in der detaillierten Beschreibung
im Folgenden noch ausführlicher
beschrieben.
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Kurze Beschreibung der
Figuren
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1A ist
eine schematische Darstellung der Detektion eines Fusionstranskriptes,
das aus einer Translokation zwischen dem bcr b3 Bereich und dem
abl-Gen mittels eines T7-abl Promotor-Primers („T7-abl Primer") mit entgegengesetztem
Sinn zur Target-Nukleinsäure
und einem Primer, der im wesentlichen identisch mit einer Sequenz
im bcr b2 Bereich („CML-1") ist, für die Amplifikation
und einer Sonde, die im wesentlichen identisch mit einer Sequenz
innerhalb von bcr b2 („b2-Sonde") ist, hergestellt
worden ist. Der dunkle Abschnitt des Balkens zur Linken der vertikalen
Linie stellt die bcr b2-Sequenz dar, der dunkle Abschnitt zur Rechten
der vertikalen Linie stellt die bcr b3-Sequenz dar, und der helle
Abschnitt stellt die abl-Sequenz dar.
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1B ist
eine schematische Darstellung der Detektion eines Fusionstranskripts,
das aus einer Translokation zwischen dem bcr b2-Abschnitt und dem
abl-1-Gen mittels der gleichen Kombination von Primern und Sonde
wie in 1A hergestellt worden ist; der
dunkle Abschnitt des Balkens stellt die bcr b2-Sequenz dar und der
helle Abschnitt stellt die abl-Sequenz dar.
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1C ist
eine schematische Darstellung der Detektion der normalen abl-mRNA
mittels eines T7-abl Promotor-Primers („T7-abl Primer") mit entgegengesetzten
Sinn zur Target-Nukleinsäure und
einem „abl-1" Primer des gleichen
Sinns wie die Target-Nukleinsäure
und einer „abl-Sonde" die im wesentlichen
identisch zu einer abl-Targetsequenz ist, die hier an einem Ort
dargestellt wird, der eine potentielle Bruchpunktverbindung (dargestellt
als vertikale Linie im Balken) in der abl-Sequenz überlappt.
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2 zeigt
die 5' bis 3' DNA-Basensequenz
des Bereichs, der die bcr-abl-Spleißverbindung umgibt, wie schematisch
in 1A dargestellt, wobei der unterstrichene Bereich
(Reste 1 bis 126) die bcr b2-Seugenz darstellt, welche die Sequenz,
die komplementär
zu einer Primer-Bindungsstelle (fettgedruckte Reste 65 bis 88) ist,
und die Sequenz, die komplementär
zur b2-Sonden-Bindungsstelle (fettgedruckt und kursiv geschriebene
Reste 89 bis 113) ist, enthält.
Der doppelt unterstrichene Bereich (Reste 127 bis 201) stellen die
bcr b3-Sequenz dar, die Spleißverbindung
tritt zwischen den Basen 201 und 202 auf und die verbleibende Sequenz
ist der A2 Bereich von abl, der die abl Primer-Bindungsstelle (fettgedruckt)
enthält.
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3 zeigt
die 5' bis 3' DNA-Basensequenz
des Bereichs, der eine potentielle Spleißverbindung in einem normalen
abl-Transkript umgibt,
wobei: Reste 1 bis 151 eine abl-1b-Exonsequenz darstellen, die einen Bereich
enthält,
der komplementär
mit einer abl Primer-Bindungsstelle (Reste 84-103, fettgedruckt) ist; der doppelt
unterstrichene Bereich (Reste 102 bis 119) ist das Komplement einer
abl-spezifischen Sonden-Bindungsstelle, welche die Spleißverbindung
von abl-b1 und abl-b2 flankiert; der unterstrichene Bereich (Reste 142
bis 165) ist das Komplement einer zweiten Sonden-Bindungsstelle, die potentielle Spleißverbindungen überlappt;
und die Reste 175 bis 201 (fettgedruckt) stellen eine normale abl-Sequenz
dar, die eine andere Primer-Bindungsstelle enthält.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
schließt
die vorliegende Erfindung im Bereitstellungsschritt im Verfahren
zur Detektion einer Fusionsnukleinsäure in einer Probe eine Verfahren
für die
Zubereitung von RNA-Proben, die von biologischen Proben, wie zum
Beispiel Körperflüssigkeiten,
Gewebe oder eukaryotischen Zellen abgeleitet werden, ein. Das relativ
einfache Verfahren der RNA-Zubereitung stellt RNA bereit, die für Analysen
und zur Detektion von mRNA-Arten, die in relativ geringen Mengen
in biologischen Proben auftreten, geeignet ist. Die vorliegende
Erfindung schließt
ebenso Verfahren zur Detektion von chimärischen RNA-Arten, insbesondere
mRNA-Arten, die in relativ geringen Mengen in aus biologischen Quellen
zubereiteten RNA-Proben auftreten, ein. Diese Verfahren, die in
der Humanmedizin und im veterinären
Bereich verwendbar sind, sind für
medizinische Diagnosen und klinische Überwachung der Reaktion eines
Patienten auf eine Therapie, in der eine Erkrankung oder ein medizinischer
Zustand mit einer bestimmten Art und/oder Niveau einer in einer
biologischen Probe vorhandenen mRNA in Verbindung steht, verwendbar.
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Zusätzlich zu
den anderswo bereitgestellten Definitionen in der Beschreibung haben
die folgenden Begriffe die folgende Bedeutung, falls nicht anders
angegeben. Andere hier verwendete wissenschaftliche und technische
Begriffe haben die gleiche Bedeutung wie sie sie für gewöhnlich auch
für den
entsprechenden Durchschnittsfachmann haben. Allgemeine Definitionen
von vielen hier verwendeten Begriffen werden zum Beispiel im Dictionary
of Microbiology and Molecular Biology, 2. Ausgabe (Singleton et
al., 1994, John Wiley & Sons,
New York, NY), The Harper Collins Dictionary of Biology (Hale & Marham, 1991,
Harper Perennial, New York, NY) und Dorland's Illustrated Medical Dictionary, 27.
Ausgabe (W.A. Dorland, 1988, W.B. Saunders Co., Philadelphia, PA)
bereitgestellt.
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Mit „Nukleotidsequenz" ist die Sequenz
von Stickstoffbasen entlang eines linearen Informationen-enthaltenden
Moleküls
gemeint, das zur Wasserstoffbrückenbindung
mit einer DNA oder RNA, die eine komplementäre Basensequenz aufweist, in
der Lage ist. Der Begriff soll nicht diese Informationen-enthaltenden
Molekülen
auf Polymere von Nukleotiden begrenzen, er schließt jedoch
ebenso Moleküle
ein, die ein oder mehrere Nukleotidanaloga enthalten. Zum Beispiel
können
Analoga Untereinheiten enthalten, die einen Zuckerrest oder Substituenten
mit Ausnahme von Ribose oder Desoxyribiose (z.B., 2'Halogenid- oder Methoxy-substituierte
Pentosezucker) und/oder bekannte Verknüpfungen mit Ausnahme von Phosphordiesterverknüpfungen (z.B.,
Phosphorthioat, Methylphosphonat und Peptidverknüpfungen) enthalten. Ein Wasserstoff-gebundener Nukleinsäureduplex
enthält
zwei komplementäre
Nukleinsäurestränge. Man
sagt, dass diese verwandten Stränge
von entgegengesetztem „Sinn" sind weil die Nukleotidsequenz
von beiden der zwei perfekt komplementären Stränge automatisch die Nukleotidsequenz
des anderen Stranges diktiert, auch wenn die Nukleotidsequenz jedes
Stranges sich von dem anderen unterscheidet. Für gewöhnlich wird ein Strang willkürlich als der
(+)Strang bezeichnet und der andere verwandte Strang wird als der
(-)Strang bezeichnet.
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Mit „Oligonukleotid" ist eine Polymerkette
von mindestens zwei, für
gewöhnlich
zwischen etwa 5 und etwa 100 chemischen Untereinheiten gemeint,
wobei jede Untereinheit einen Nukleotidbasenrest, einen Zuckerrest
und Verknüpfungsrest,
der die Untereinheiten in einer linearen räumlichen Konfiguration verbindet, umfasst.
Bekannte Nukleotidbasenreste sind Guanin (G), Adenin (A), Cytosin
(C), Thymin (T) und Uracil (U), auch andere seltene oder modifizierte
Nukleotidbasen, die zur Wasserstoffbrückenbindung in der Lage sind, sind
dem Durchschnittsfachmann gut bekannt. Bekannte Zuckerreste sind
Ribose und Desoxyribose, auch 2'-O-Methylribose,
halogenierte Zucker und andere modifizierte und unterschiedliche
Zucker sind im Stand der Technik bekannt. Für gewöhnlich ist die Verknüpfungsgruppe
ein Rest der Phosphor enthält,
am häufigsten eine
Phosphordiesterverknüpfung,
auch andere Verknüpfungen,
wie zum Beispiel Phosphorthioat, Methylphosphonat und Verknüpfungen
die kein Phosphor enthalten, wie zum Beispiel Peptid ähnliche
Verknüpfungen,
sind im Stand der Technik bekannt wie es auch Oligonukleotide sind,
die solche Verknüpfungen
(„Peptidnukleinsäuren" oder PNA) umfassen.
PNA werden von dieser Definition eines Oligonukleotids umfasst.
Nukleotidbasenreste können
ebenso modifiziert sein, z.B., durch die Addition von Propingruppen, solange
wie die modifizierten Basenreste die Fähigkeit behalten eine nicht-kovalente
Verbindung mit G, A, C, T oder U auszubilden und ein Oligonukleotid,
das mindestens einen modifizierten Nukleotidbasenrest umfasst, nicht-sterisch von
der Hybridisierung mit einer einzelsträngigen Nukleinsäure abgehalten
wird. Ein Oligonukleotid hat eine Sequenz von Nukleotidbasenresten,
die Informationen bereitstellen, welche es dem Oligonukleotid ermöglichen,
mit einem komplementären
Nukleinsäurestrang
zu hybridisieren.
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Mit „Nukleinsäureamplifikationsbedingungen" sind Umweltbedingungen
gemeint, welche die Salzkonzentration, die Temperatur (Temperaturkonstant
und Temperaturwechsel eingeschlossen), mindestens eine Nukleinsäurepolymerase,
Nukleosidtriphophate und Cofaktoren, die eine Amplifikation einer
Target-Nukleinsäure
unter Verwendung eines gegebenen Nukleinsäureamplifikationsverfahrens
ermöglichen,
einschließt. Ein
Amplifikationsprodukt wird auch als „Amplicon" bezeichnet.
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Mit „Primer" ist ein Oligonukleotid
gemeint, das an einen Bereich einer Target-Nukleinsäure (d.h.,
der „Target-Bindebereich" oder die „Target-Bindungsstelle" des Primers) bindet
und die Nukleinsäureamplifikation der
Target-Nukleinsäure fördert. Für gewöhnlich hat
ein Primer ein 3' Ende,
das durch eine Nukleinsäurepolymerase
verlängert
wird. Ein Promotorprimer ist ein Oligonukleotid, das eine Promotorsequenz
einschließt,
die 5' zum Target-Bindungsbereich
angeordnet ist. Unter bestimmten Umständen kann das 3' Ende eines Promotorprimers
oder eine Subpopulation von Promotorprimern modifiziert werden,
um die Primerverlängerung
zu blockieren oder zu verringern.
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Mit „Targetsequenz" ist die Nukleotidbasensequenz
eines Nukleinsäurestranges
(RNA oder DNA) gemeint, wobei zumindest ein Abschnitt davon mittels
einer markierten Sonde, die an ihrer 3' Seite durch eine Primer-Bindungsstelle
gebunden ist, detektiert werden kann, oder die genau komplementäre RNA oder
DNA Basensequenz.
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Mit „RNA Äquivalent" ist eine RNA mit
der gleichen Nukleotidbasensequenz wie eine DNA gemeint, mit der
Ausnahme, dass U durch T ersetzt ist.
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Ein „Trägermaterial" ist ein im Wesentlichen
unlösliches
Material unter den gegebenen Lösungsmittel und
Temperaturbedingungen, die chemische Gruppen umfassen, die sich
mit einem Oligonukleotid oder einer Nukleinsäure verbinden. Insbesondere
ist ein Trägermaterial
bevorzugt, das kovalent an ein Oligonukleotid gekoppelt ist, das
direkt oder indirekt eine Target-Nukleinsäure bindet. Wenn die Target-Nukleinsäure eine
mRNA ist, umfasst das gekoppelte Oligonukleotid bevorzugt eine poly-T-Nukleotidbasensequenz.
Das Trägermaterial ist
bevorzugt ein Partikel (z.B., Partikel oder Kugel) im Mikrometer
oder Submikrometer Größenbereich.
Ein Trägermaterial
kann aus einem oder mehreren der folgenden Materialien hergestellt
worden sein: Siliciumdioxid, Polyacrylat, Polyacrylamid, ein Metall,
Polystyren, Latex, Nitrocellulose, Polypropylen und Nylon und wird bevorzugt
durch ein magnetisches Feld (z.B., durch Enthalten eines Kerns aus
Magnetit) angezogen.
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Mit „Nukleotidsequenz" ist die lineare
Sequenz von stickstoffhaltigen Basen in einem Informationen-enthaltenden
Molekül
gemeint, das über
Wasserstoffbrückenbindung
mit einer DNA oder RNA, die eine komplementäre Basensequenz aufweist, bindet.
Der Begriff ist nicht auf solche Informationen-enthaltenden Molekülen wie Polymere von Nukleotiden
begrenzt, schließt
jedoch Moleküle
ein, die ein oder mehrere Nukleotidanaloga enthalten. Zum Beispiel
können
Analoga Untereinheiten enthalten, die einen Zuckerrest oder Substituenten
mit Ausnahme von Ribose oder Desoxyribiose (z.B., 2'Halogenid- oder Methoxy-substituierte
Pentosezucker) und/oder bekannte Verknüpfungen mit Ausnahme von Phosphordiesterverknüpfungen
(z.B., Phosphorthioat, Methylphosphonat und Peptidverknüpfungen)
enthalten.
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Mit „Spleißverbindungssonde" ist gemeint, dass
die Sonde eine Sequenz enthält,
die ausreichend komplementär
ist, um mit Sequenzen auf den 5' und
3' Seiten eines
Spleißpunktes
zu hybridisieren. In ähnlicher
Weise enthält
eine „Bruchpunkt-Verbindungssonde" eine Sequenz, die
ausreichend komplementär
ist, um mit Sequenzen auf den 5' und
3' Seiten einer
chimärischen
Nukleinsäure
zu hybridisieren. Das heißt,
das die Sonden-Bindungsstelle einer Spleißverbindungssonde oder Bruchpunkt-Verbindungssonde
die Verbindung überspannt,
die Sequenzen zusammen bringt, die normalerweise nicht zusammenhängend sind.
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Mit „Spleißverbindungsstelle" ist die Position
in der Nukleotidbasensequenz einer Nukleinsäure oder eines Oligonukleotids
(oder seines komplementären
Stranges) gemeint, an der die Sequenz, die 5' zur Spleißstelle auf einem Strang der
Nukleinsäure
angeordnet ist, von einem ersten Nukleinsäurebereich abgeleitet ist, und
die Sequenz, die 3' zur
Spleißstelle
(im Bezug auf den gleichen Strang) angeordnet ist, von einem zweiten Nukleinsäurebereich
abgeleitet ist, wobei die ersten und zweiten Bereiche normalerweise
nicht zusammenhängend
sind.
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Mit
einer „Fusions-" oder „chimärischen-" Nukleinsäure ist
eine Nukleinsäure
oder ein Oligonukleotid gemeint, das benachbarte oder zusammenhängende Sequenzen
enthält,
die von einem ersten und einem zweiten Nukleinsäurebereich abgeleitet werden,
wobei die ersten und zweiten Bereiche normalerweise nicht benachbart
oder zusammenhängend
in der zellulären
DNA vorliegen. Im Allgemeinen wird chimärische Nukleinsäure in Nukleinsäure von
abnormalen Zellen gefunden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
schließt
die vorliegende Erfindung im Bereitstellungsschritt im Verfahren
zur Detektion einer Fusionsnukleinsäure in einer Probe eine vereinfachtes
und schnelles Verfahren für
die Zubereitung von RNA aus einer biologischen Probe, insbesondere
aus dem Cytoplasma von eukaryotischen Zellen, die für die Verwendung in
einem Amplifikations- und Detektionsassay geeignet sind, ein. Dieses Verfahren
kann ebenso verwendet werden, um virale RNA aus einer biologischen
Probe (z.B., Plasma) zuzubereiten. Dieses Verfahren erfordert keine übermäßige Extraktion,
das Scheren von chromosomaler DNA, um die Viskosität zu reduzieren,
oder die Verwendung von potentiell schädlichen Reagenzien (z.B., Phenol
oder Chloroform) um RNA zuzubereiten. Darüber hinaus minimiert das Verfahren
die Proben Zubereitungsschritte, wodurch der Probenverlust und die
Variabilität
während
der Zubereitung verringert wird. Diese erhöhte Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit
bei der RNA-Zubereitung
ist insbesondere für
Assays verwendbar, die RNA-Arten
mit geringen vorkommen, wie zum Beispiel Fusions- oder chimärische RNA-Arten
detektieren. Die Erfindung schließt ebenso eine Verfahren zur
Detektion oder Quantifizierung von Fusions- oder chimärischen RNA-Arten
ein. Dieses Verfahren schließt
einen anfänglichen
Schritt des In-Kontakt-Bringens unter Nukleinsäureamplifikationsbedingungen
ein: (1) eine erste einzelsträngige
Fusionsnukleinsäure,
die eine Spleißverbindungsstelle
einschließt,
(2) einen ersten Promotor-Primer, der mit der Fusionsnukleinsäure an einer
Primer-Bindungsstelle, die 3' zur
Spleißverbindungsstelle
angeordnet ist, hybridisieren kann, und (3) mindestens eine Nukleinsäurepolymeraseaktivität. Dann
fährt das
Verfahren mit dem Amplifizieren der Fusionsnukleinsäure in einer
Nukleinsäureamplifikationsreaktion
fort, wobei mehrere zweite Nukleinsäurestränge hergestellt werden, von
denen jeder einen Bereich einschließt, der mit einem Bereich der
anfänglichen
einzelsträngigen
Fusionsnukleinsäure,
welche die Spleißverbindungsstelle,
eine erste Sonden-Bindungsstelle in einer bcr-Sequenz, die 3' angeordnet und die
Spleißverbindungsstelle
nicht überlappt,
und eine zweite Sonden-Bindungsstelle in einer abl-Sequenz, die
5' angeordnet und
die Spleißverbindungsstelle
nicht überlappt,
einschließt, komplementär ist.
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Die
zweite Sonden-Bindungsstelle kann überlappen oder an der 3' Seite der ersten
Primer-Bidungsstelle angeordnet sein. Dann schließt das Verfahren
das Hybridisieren des komplementären
zweiten Nukleinsäurestranges
unter Hybridisationsbedingungen mit einer Oligonukleotidsonde, die
mit der ersten oder zweiten Sonden-Bindungsstelle hybridisieren
kann, wobei ein Sonden-Targethybrid ausgebildet wird (d.h., ein
Hybridisationskomplex, der durch komplementäre Basenpaarung zwischen der
Basensequenz der Sonde und der Basensequenz des Targets ausgebildet
wird) ein. Das Sonden:Target-Hybrid wird in einem homogenen Assayformat
als ein Hinweis auf die Anwesenheit der Fusionsnukleinsäure in der
Probe, aus der die einzelsträngige Fusionsnukleinsäure erhalten
worden ist, angesehen, detektiert. Wenn die Fusionsnukleinsäure in diesem
Verfahren eine RNA ist, ist die Oligonukleotidsonde vom gleichen
Sinn wie die einzelsträngige
Fusionsnukleinsäure.
Wenn nur ein Primer (oder Promotor-Primer) im Amplifizierungsschritt verwendet
wird, dann zielt die Sonde auf die erste Sonden-Bindungsstelle.
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Es
ist wichtig darauf hinzuweisen, dass dieses Verfahren keine verschachtelten
Primer (engl. nested primer) verwendet oder fortlaufende Amplifikationsreaktionen
erfordert. Bevorzugt verwendet das Verfahren ein Transkriptionsvermitteltes
Amplifikationssystem, das zuvor detailliert in U.S. Pat. Nr. 5,480,784,
5,399,491 und 5,554,516 von Kacian et al. beschrieben worden ist.
In einer Ausführungsform
des vorliegenden Verfahrens werden zwei Oligonukleotide in dem Amplifikationsverfahren
verwendet: ein Promotor-Primer mit entgegengesetztem Sinn zu der
zu detektierenden Fusions-RNA und ein Primer des gleichen Sinns
wie die Fusions-RNA in einer Anordnung 5' zu beiden der Bindungsstelle des Promotor-Primers
und der Spleißverbindung.
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Ein „Promotor-Primer" ist, wie hier verwendet,
ein Oligonukleotid, das mindestens zwei unterschiedliche Nukleotidbasensequenzen
enthält.
Die erste Sequenz ist die Primersequenz, die mit einer Bindungsstelle der
Fusions-RNA in einer Anordnung 3' zur
Spleißverbindung
hybridisiert. Die zweite Sequenz ist eine Promotorsequenz, die 5' zur Primersequenz
angeordnet ist, die eine bevorzugte Bindungsstelle für eine RNA-Polymerase
bereitstellt, um die Transkription zu beginnen wenn die Promotorsequenz
doppelsträngig
ist. Daher ermöglicht
die Promotorsequenz eine Transkription der Nukleotidbasensequenz,
an die der Promotor-Primer
hybridisiert ist (d.h., RNA-Synthese mittels der chimärischen
RNA als Matrize). Ein Beispiel für
einen Promotor-Primer ist die SEQ ID NO:1 in denen die Reste 1 bis
27 eine funktionelle T7-Promotorsequenz bereitstellen, wenn sie
doppelsträngig
gemacht wurden, und die Reste 28 bis 54 stellen eine Primersequenz
zur Verfügung, die
an eine komplementäre
Nukleinsäurebasensequenz
bindet.
-
In
einer anderen Ausführungsform
verwendet das Assay ein einzelnes Amplifikationsoligonukleotid, das
ein Promotor-Primer
ist. Wenn ein einzelner Promotor-Primer mit keinem Primer von entgegengesetztem Sinn
eingesetzt wird, wird die chimärische
DNA mittels einer Sonde des gleichen Sinns wie die chimärische RNA
detektiert, die mit einem Nukleotidbasensequenzbereich, der 3' zur Spleißverbindungsstelle
auf der amplifizierten komplementären Nukleinsäure angeordnet
ist, hybridisiert. Auf diese Art und Weise wird nur die amplifizierte
chimärische
RNA detektiert. Nukleinsäureamplifikationsverfahren,
die einen einzelnen Promotor-Primer einsetzen, wurden detailliert
in U.S. Pat. Nr. 5,554,516 von Kacian et al. beschrieben.
-
Bevorzugt
sind die Primer (Promotor-Primer eingeschlossen) und Sonden gegen
Bereiche gerichtet, die normalerweise innerhalb der chromosomalen
DNA unterbrochen vorliegen. Zum Beispiel umfassen in einer bevorzugten
Ausführungsform
des Verfahrens die Bereiche Nukleotidbasensequenzen, die normalerweise
auf unterschiedlichen Chromosomen vorhanden sind. Desgleichen sind
zum Detektieren von Nukleinsäuren,
die sowohl von viral (d.h., Provirus) als auch von eukaryotischen
Nukleinsäuren
abgeleitete Bereiche umfassen, die in diesen individuellen Bereichen
enthaltenen Sequenzen normalerweise nicht durchgehend. Außerdem können die
zu detektierenden Bereiche jene sein, die normalerweise auf getrennten
Teilen des gleichen Chromosoms vorhanden sind, jedoch so weit voneinander
getrennt sind, dass sie durch herkömmliche Amplifikationsverfahren
in Abwesenheit eines Spleißing-
oder interchromosomalen Translokationsereignisses nicht koamplifiziert
würden.
-
In
einer Ausführungsform,
in der zwei Primer verwendet werden, kann die Detektionssonde gegen eine
Nukleotidbasensequenz, die auf beiden Seiten der Spleißverbindungsstelle
angeordnet ist, gerichtet sein. In diesem Aspekt der vorliegenden
Erfindung muss die Sonde den gleichen Sinn aufweisen wie die chimärische RNA.
Die amplifizierten Nukleinsäuren
entgegengesetzten Sinnes werden detektiert, wodurch das Absondern
von „normaler" mRNA (die nicht
amplifiziert ist) von abnormaler gespleißter RNA (die amplifiziert
worden ist) ermöglicht
wird. Da die Sonde darüber
hinaus nicht gegen die Spleißverbindung
gerichtet ist, dafür jedoch
an eine flankierenden Sequenz, die außerhalb des Bruchpunkt- oder
Spleißbereichs
angeordnet ist, bindet, kann eine einzelne Sonde mehrere gespleißte Formen
detektieren, die von unterschiedlichen Spleißereignissen herrühren können.
-
Mit „flankieren" der Stelle der Translokation
ist gemeint, dass die Oligonukleotidbindungsstellen in Positionen
auf beiden Seiten der Spleißverbindung
oder des Bruchpunkt-Cluster-Bereichs
(breakpoint cluster region) angeordnet sind. In vielen Erkrankungen
und Zuständen,
die mit chromosomalen Translokationen in Verbindung stehen, kann
es viele mögliche
Arten chimärischer
RNA geben. In jeder chimärischen
RNA hat eine bekannte Spleißverbindung
eine bestimmte Nukleotidsequenz, an die eine Sonde spezifisch binden
kann, jedoch erfordert diese Art der Detektion das Einbeziehen von möglicherweise
vielen Spleißverbindungssonden, wobei
jede gegen eine bekannte chimärische
RNA-Art, sowohl herkömmliche
als auch seltene, gerichtet ist.
-
Viele
charakterisierte Translokationen haben Bruchpunkte, die in diskreten
bekannten Bereichen, die mit gegebenen Erkrankungen oder Zuständen in
Verbindung gebracht werden, geclustert sind. Um eine Translokation
als einen Marker für
einen gegebenen Zustand oder Erkrankung zu detektieren, ist es nicht
notwendig jede Art von chimärischer
RNA zu detektieren oder zu charakterisieren. Stattdessen ist es
mittels der vorliegenden Erfindung nur notwendig zu detektieren,
ob eine mit einem Translokationsereignis in Verbindung stehende
RNA durch die Targetzelle hergestellt und amplifiziert worden ist.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
weist die Fähigkeit
der Target-mRNA amplifiziert zu werden darauf hin, dass eine Translokation
in einer Zelle aufgetreten ist. In einer anderen Ausführungsform,
wie zum Beispiel im Amplifikationsverfahren, das einen einzelnen
Promotor-Primer verwendet, werden sowohl normale als auch gespleißte Transkripte
amplifiziert, jedoch hybridisiert die Sonde nicht mit den Nukleinsäuren, die
von dem normalen Transkript amplifiziert worden sind. In beiden
Fällen
kann zur Detektion der amplifizierten RNA jegliche von einer Vielzahl
von bekannten Methoden, wie zum Beispiel Gelelektrophorese, erhöhte Lichtabsorption,
hyperchromatische Verlagerung oder die Verwendung einer detektierbaren
Sonde, bevorzugt einer markierten Oligonukleotidsonde, verwenden
werden. Geeignete Marker schließen
Enzyme, Enzymsubstrate, Fluoreszenz-, Lumineszenz-, Chemilumineszenz-
und Elektrochemilumineszenzmoleküle,
Radionukleide und Fluoreszenzatome ein. Bevorzugte Marker sind ein
Fluoreszenz- oder
Chemilumineszenzmarker und am meisten bevorzugt ein Akridiniumester.
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Die
Sonden können
gegen jeden Bereich der amplifizierten Nukleinsäure gerichtet sein, solange
wie die Sonde mit der amplifizierten Nukleinsäure spezifisch hybridisiert. Bevorzugte
Sonden detektieren Sequenzen außerhalb
der Spleißverbindung
(d.h., flankierende Sonden), wodurch die Anzahl der unterschiedlich
gespleißten
Nukleinsäuren,
die unter Verwendung dieses Verfahrens detektiert werden können, gesteigert
wird.
-
Ein
Beispiel für
solch ein Assay ist in den 1A bis 1C,
die zwei Fusionstargetnukleinsäuren (1A und 1B)
und eine normale Target-Nukleinsäure
(1C) zeigen, schematisch dargestellt. Die Detektion
der normalen Target-Nukleinsäure
ist als eine optionale interne Kontrolle für die Amplifikation und das
Detektionsverfahren eingeschlossen. Bezugnehmend auf die 1A und 1B werden
die Fusionstargetnukleinsäuren
(dargestellt durch die geschwärzten
und offenen Balken) unter Verwendung von Primern amplifiziert und
die Amplicons werden mit einer Sonde detektiert, die gegen eine
Nukleotidbasensequenz gerichtet ist, welche die Spleißverbindung
(die Verbindung der geschwärzten
und offenen Balken) flankiert, um auf die Anwesenheit der gespleißten Nukleinsäure in der
biologischen Probe hinzuweisen. Dieses Assayformat kann die gesamte
Familie von potentiell gespleißten
Nukleinsäuren
detektieren, da die Sonde nicht an die gespleißte Verbindung bindet. 1C zeigt
eine interne Kontrolle (oder „nicht-Target" Nukleinsäure) in
einem Assay, in dem eine normale Target-Nukleinsäure ebenso amplifiziert und
in der Probe detektiert wird. Die interne Kontrolle weist darauf
hin, dass die Nukleinsäuren
in der Probe amplifiziert und durch eine Sonde (d.h., die Abwesenheit
von Kontaminanten, die einen oder beide dieser Assayschritte inhibieren
würde)
detektiert werden können.
-
Wie
in den 1A und 1B dargestellt,
muss die Amplifikation von Target-Nukleinsäuren auf eine einzelne Größe oder
Kategorie eines Spleißereignisses
begrenzt werden. In den 1A und 1B sind
die Target-Nukleinsäuren
Fusionsprodukte aus zwei verschiedenen bcr-abl-Translokationen,
eine davon verbindet bcr-b3 mit abl (1A) und
die andere verbindet bcr-b2 mit abl (1B). Die
Target-Nukleinsäuren
werden unter Verwendung von Primern amplifiziert, die gegen Stellen
auf normalerweise nicht-proximalen Abschnitten der Nukleinsäure, wie
zum Beispiel Stellen, die normalerweise auf unterschiedlichen Chromosomen
liegen (z.B., die auf dem menschlichen Chromosom 22 angeordnete
bcr Stelle, die durch den „CML-1"-Primer erkannt wird
und die auf dem menschlichen Chromosom 9 angeordnete abl Stelle,
die durch den „T7-abl-Primer" erkannt wird), gerichtet
sind.
-
Wie
in den 1A und 1B gezeigt,
verwendet die Amplifikation von Target-Nukleinsäuren einen Primer, der für eine der
im chimärischen
Spleißereignis
(z.B., der „T7-abl-Primer", der spezifisch
für eine abl-Sequenz
ist) involvierten Nukleinsäuren
spezifisch ist, und eine zweiten Primer, der für die andere Nukleinsäure, die
in das chimärische
Spleißereignis
(z.B., der „CML-1"-Primer, der für die bcr-Sequenz
spezifisch ist) involviert ist, spezifisch ist. Die amplifizierten
Targetsequenzen werden mittels einer Sonde detektiert, die für eine der
beiden Sequenzen (z.B., die „b2-Sonde", die für den bcr-Partner
in den in den 1A und 1B gezeigten
Spleißereignissen
spezifisch ist) spezifisch ist. Diese Kombination von Primern und
Sonde kann mehr als ein chimärisches
Spleißereignis
detektieren, da die gleichen Primer unterschiedlich große Produkte, die
ein Ergebnis der unterschiedlichen Spleißereignisse sind, von denen
alle mit der gleichen Sonde detektierbar sind, amplifizieren können. Man
vergleiche zum Beispiel die relativ langen amplifizierten Produkte,
die mittels der CML-1 und T7-abl-Primer mit dem Fusionsprodukt der 1A erhalten
wurden, mit den relativ kurzen amplifizierten Produkten, die mittels
der gleichen Primer mit dem Fusionsprodukt der 1B erhalten
wurden, wo beide amplifizierten Produkte mit der b2-Sonde detektiert
werden. Daher sind die Fusionstranskripte, die sich von jeglichen
einer Vielzahl von abnormalen Spleißereignissen ergeben, detektierbar,
unabhängig
von den bestimmten Sequenzen der Bruchpunkt-Verbindungen.
-
Das
Assay kann optional die Amplifikation und Detektion einer internen
Kontroll-(nicht-Target) Nukleinsäure
mittels eines Primers einschließen,
der ebenso für
die Amplifikation der Target-Nukleinsäuren (z.B., der T7-abl-Primer
in den 1A bis 1C) verwendet
werden. Ein für
die interne Kontrollamplifikation verwendeter zweiter Primer muss
sich vom zum Amplifizieren von Targetsequenzen verwendeten zweiten
Primer unterscheiden und ist normalerweise gegen einen naheliegenden
Bereich auf der anderen Seite des Bereichs, der einen oder mehrere
potentielle Spleißverbindungen
enthält
(z.B., der abl-1 Primer, wie in 1C gezeigt), gerichtet.
Bevorzugt ist dieser zweite Primer dazu in der Lage, die internen
Kontrollnukleinsäuresequenzen
an einer Nahe dem Bruchpunktbereich liegenden Stelle zu amplifizieren,
um die Möglichkeit
zu eliminieren, dass ein abnormales Spleißereignis als normale Nukleinsäure missverstanden
wird. Das heißt,
aufgrund der Nähe des
zweiten Primers zum potentiellen Spleißverbindungsbereich wird das
Amplifikationsprodukt der internen Kontrollnukleinsäure eine
Sequenz für
eine Sondenhybridisation einschließen, die häufig durch abnormale Spleißereignisse
eliminiert wird. Wie in 1C dargestellt,
verwendet die Amplifikation einer nicht-Target, normalen abl-Nukleinsäure Primer
für Sequenzen,
die normalerweise auf einer nicht-Fusionsnukleinsäure (z.B., der „abl-1" Primer und der „T7-abl
Primer") zusammenhängend sein
würden.
Eine Zweite Sonde wird für
die Detektion der amplifizierten internen Kontrollnukleinsäuren (z.B.,
die „abl-Sonde" in 1C)
benötigt.
Diese Sonde ist einzigartig für
die interne Kontrollsequenz auf der gleichen Seite des potentiellen
Spleißverbindungsbereiches
wie der nicht-Target-spezifische Primer. Das Verhältnis dieser
Sequenzbereiche wird im Detail in den 2 und 3 gezeigt. 2 zeigt
die 5' bis 3' DNA-Sequenz (SEQ ID NO:24)
des Bereichs, der eine bcr-abl Spleißverbindung umgibt, wie schematisch
in 1A dargestellt, wobei der unterstrichene Bereich (Reste
1 bis 126) die bcr-b2 Sequenz repräsentiert, welche die Sequenz,
die komplementär
zur CML-1 Primer-Bindungsstelle (fettgedruckte Reste 65 bis 88;
SEQ ID NO:5) ist und die Sequenz, die zur b2 Sonden-Bindungsstelle
(fettgedruckt und kursiv geschriebene Reste 89 bis 113; SEQ ID NO:9)
komplementär
ist, enthält. Der
doppelt unterstrichene Bereich (Reste 127 bis 201) repräsentiert
eine bcr-b3 Sequenz, die eine Spleißverbindung zwischen den Resten
201 und 202 enthält.
Vom Rest 202 bis zum Ende der in 2 gezeigten
Sequenz liegt der abl-A2 Bereich, der die Primer-Bindungsstelle
(fettgedruckt; SEQ ID NO:22) für
den T7-abl Primer der 1A bis 1C enthält.
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3 zeigt
die 5' bis 3' DNA-Sequenz (SEQ
ID NO:25), die einen potentiellen Spleißverbindungsbereich in einer
normalen abl-DNA umgibt. Die Reste 1 bis 151 stellen eine abl-1b
Exonsequenz dar und enthalten einen Bereich, der zur Bindungsstelle
(fettgedruckte Reste 84 bis 103; SEQ ID NO:13) des abl-1 Primers der 1C komplementär ist. Der
doppelt unterstrichene Bereich (Reste 102 bis 119; SEQ ID NO:26)
ist komplementär
zu einer Sonden-Bindungsstelle, welche den Spleißverbindungsbereich flankiert.
Der unterstrichene Bereich (Reste 142 bis 165; SEQ ID NO:16) schließt die potentiellen
Spleißverbindungen
ein und ist das Komplement einer Sonden-Bindungsstelle der abl-Sonde der 1C.
Reste 152 bis 299 stellen eine normale abl-Sequenz dar, die eine
Primer-Bindungsstelle
(fettgedruckte Reste 175 bis 201; SEQ ID NO:22) für den T7-abl
Primer der 1A bis 1C enthält.
-
Das
in der vorliegenden Erfindung bevorzugte Amplifikationsverfahren
stellt eine amplifizierte Nukleinsäure („Amplicon") her, die eine RNA ist, und noch mehr
bevorzugt stellt es überwiegend
amplifizierte RNA her, die zur Targetsequenz komplementär ist (d.h.,
den entgegengesetzten Sinn zur Targetsequenz aufweist). Mit „überwiegend" ist gemeint, das
mindestens 50% des Produkts und bevorzugt mehr als 55% komplementäre RNA sind.
Wenn demnach das Target mRNA ist, die willkürlich als (+) Sinn-Strang bezeichnet
wird, dann sind die Amplifikationsprodukte bevorzugt (-)Sinn-Stränge. Mittels
Transkriptions-verbundener Amplifikationsverfahren, wie zuvor in
U.S. Pat. Nr. 5,480,784 und 5,399,491 beschrieben, ist der Promotor-Primer
vom (-) Sinn und die Matrizen-Target-Nukleinsäure ist vom (+) Sinn, die Amplicons
herstellen, die vom (-) Sinn sind. Auch wenn die Sonde jede Sequenz
sein kann, die Amplifikationsprodukte binden kann, ist die Sonde
bevorzugt vom (+) Sinn zum Hybridisieren an (-) Sinn-Amplifikationsprodukte.
Wenn ein erster Primer gemeinsam für die Amplifikation sowohl
der Target als auch der internen Kontrollnukleinsäuren verwendet
wird, dann wird auch das gleiche Verhältnis der Primer, Amplifikationsprodukte
und Sonden für
die Kontrollnukleinsäureamplifikation
und Detektion verwendet.
-
Diese
Verfahren sind nützlich
zum Detektieren von jeglichen einer Vielzahl von bekannten genetischen oder
physiologischen Ereignissen, die gespleißte oder anders umgestaltete
Nukleinsäuren
zur Folge haben. Diese Verfahren sind insbesondere für das Detektieren
der Anwesenheit an Fusionstranskripten oder chimärischen Transkripten verwendbar,
die sich aus genetischen Translokationen, besonders solchen, die
mit pathologischen Zuständen
oder Erkrankungen in Verbindung stehen, ergeben. Diese Verfahren
sind für
das Detektieren einer Vielzahl von bekannten Translokationen, die
mit Krebs, bestimmten Formen von Leukämie wie der, als Beispiele,
CML und ALL in Verbindung stehen, in einer biologischen Probe geeignet.
-
Die
Verfahren der vorliegenden Erfindung sind für das Detektieren aller einer
Vielfalt von bekannten Translokationen geeignet, die im Menschen
auftreten, wobei nur das Design der Primer und Sonden für bekannte
Sequenzen, die mit den Translokationen in Verbindung stehen (Übersicht
dazu von Mitelman et al., Cytogenet. Cell. Genet. 55:358-386, 1990), erforderlich
ist. Detektierbare Translokationen schließen ein, sind jedoch nicht
begrenzt auf t(9;22), t(4;11), insbesondere t(4;11)(q21;q23), t(9;11),
insbesondere t(9;11)(p22;q23), t(11;19), insbesondere t(11;19)(q23;p13),
t(8;21), t(1;19), insbesondere in pro-B-Zellen, t(11;14), t(2;5),
insbesondere t(2;5)(p23;q35), t(11;22), insbesondere t(11;22)(q24;q12),
t(15;17), t(6;9), t(14;18) t(12;21) und t(2;13) Translokationen.
Targetsequenzen zum Detektieren der Translokationen sind in den
im Stand der Technik bekannten Sequenzen eingeschlossen, wie beschrieben
in: Bakhshi et al., Cell 41:899-906, 1985; Bakhshi et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 84:2396-2400, 1987; Barr et al., Genomics 11:941,
1991; Chen et al., Blood 78:2498-2504, 1991; Cleary et al., Proc.
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Crescenzi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4869-4873, 1988;
Domer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7884-7888, 1993; Dragon-Durey
et al., Leukemia 12(7):1159-1162,
1998; Groffen et al., Cell 36:93-99, 1984; Gu et al., Cancer Res.
54:2327-2330, 1994; Hermans et al., Cell 51:33-40, 1987; Kakizuka
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Kawasaki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5698-5702; LeBeau
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246:379-382, 1989; Mitelman et al., Cytogenet. Cell. Genet. 55(1-4):358-386,
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1993; Nourse et al., Cell 60:535-545, 1990; Sacchi et al., Science
231:379-382, 1986;
Sarris et al., Leuk. Lymphoma 29(5-6):507-514, 1998; Sawyers et
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21:1719-1724, 1993; Tkachuk et al., Science 250:559-562, 1990; Tsujimoto et
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Biol. 12:1687-1697, 1992; Zhao et al., Am. J. Hum. Genet. 47:A119,
1980; und Zemin-VanDerPoel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10735-10739, 1991;
U.S. Pat. Nr. 5,057,410 von Kawasaki et al.; U.S. Pat. Nr. 5,459,251
von Tsujimoto et al.; U.S. Pat. Nr. 5,538,846 von Meeker; U.S. Pat.
Nr. 5,149,628, 5,198,338, 5,202,429 und 5,242,759 von Croce et al.;
U.S. Pat. Nr. 5,547,838 von Nisson et al.
-
Falls
nicht anders beschrieben, sind die hier beschriebenen Techniken
dem Durchschnittsfachmann gut bekannte Standardmethodiken. Die folgenden
Beispiele zu den Ausführungsformen
werden nur zur Illustration bereitgestellt.
-
Beispiel 1
-
Lyse von biologischen
Proben und Isolation von mRNA
-
Das
folgende Verfahren wurde zur Isolation von mRNA aus biologischen
Proben verwendet. In diesem Beispiel wurden Blut und Knochenmarkszellen
einzeln in den Lyse- und mRNA Isolationsverfahren verwendet. Dieses
Verfahren arbeitet ebenso gut mit anderen Geweben, wenn die Zellen
in individuelle Zellen oder kleine Klumpen von Zellen mittels Standardzerkleinern,
Siebauftrennung und/oder Proteolyseverfahren separiert werden, um
die Anzahl der in den Klumpen vorhandenen Zelle zu begrenzen. Das
Lyseverfahren umfasst das in-Kontakt-bringen einer Suspension von
Targetzellen mit einer Lyselösung,
die mindestens 150 mM eines löslichen
Salzes, bevorzugt ein Lithiumhalogenidsalz (z.B., LiCl), ein chelatbildendes
Agens (z.B., Ethylendiamin Tetraacetatsäure (EDTA)) und eine Menge
eines nicht-ionischen Detergens, das die cytoplasmatische Membran
der Zelle wirksam lysieren kann, ohne die Inhalte des Kerns im Wesentlichen
freizusetzen, enthält.
Im Allgemeinen war das nicht-ionische Detergens in der Lyselösung ein
Octylphenoxypolyethoxyethanol (ein TRITON®-artiges
Detergens), auch andere nicht-ionische Detergenzien (z.B., TWEEN®-artige
und NP-artige Detergenzien) arbeiten äquivalent. Mit „wirksamer
Menge" eines nicht-ionischen Detergenzes
ist eine Menge gemeint, die ausreichend ist, um zur Lyse oder Permeabilisation
der cytoplasmatischen Membran zu führen, ohne eine substantielle
Freisetzung an kernständiger
DNA oder RNA zu verursachen, für
gewöhnlich
zwischen etwa 0,5% (v/v) bis etwa 2,0% (v/v). Eine bevorzugte Lyselösung enthält etwa
1% (v/v) TRITON® X-102.
-
In
einem typischen Verfahren wurden etwa 250 μl an unkoaguliertem Blut oder
Knochenmark zu etwa 750 μl
der Lyselösung
gegeben. Mit „unkoaguliert" ist gemeint, dass
das Blut oder Knochenmark nach dem Einsammeln mit etwa 2 mM bis
etwa 20 mM EDTA oder einer effektiven Menge an Heparin oder vergleichbaren im
Stand der Technik bekannten Antikoagulanzien behandelt wurde. Das
Verhältnis
der Probe zur Lyselösung ist
nicht kritisch, jedoch kann für
gewöhnlich
ein Verhältnis
von etwa 1:1 bis etwa 1:3 der Bestandteile (Probe:Lyselösung) die
Probe lysieren. Im Allgemeinen besteht die Lyselösung aus 50 mM HEPES (pH 7,5),
1 M LiCl, 5 mM EDTA, und 1% TRITON® X-102.
Der pH des Puffers kann in einem Bereich über und unter dem neutralen
(pH 7,0) liegen, er liegt bevorzugt in einem pH-Bereich von etwa
6,5 bis etwa 8,5 und am meisten bevorzugt bei etwa pH 7,5, um das
Einfangen der mRNA durch Hybridisation, wie weiter unten beschrieben, zu
erleichtern. Überraschend
war nach dem Vermengen der Probe und des Lysepuffers die freigesetzte
RNA in der Lyse-Mixtur stabil und kann bei Raumtemperatur für mindestens
etwa 2 Stunden ohne signifikanten Abbau der RNA, auch in Abwesenheit
von zusätzlichen
RNAse Inhibitoren, gelagert werden. Keiner der Bestandteile HEPES,
LiCl, EDTA oder TRITON® X-102 der Lyselösung waren
für sich
genommen beim Verhinderung des allgemeinen sofortigen Abbaus der
RNA wirksam. Daher war es überraschend,
dass die Kombination der Bestandteile beim Inhibieren des RNA-Abbaus
wirksam war.
-
Für eine mRNA-Isolation
(oder Einfangen des Targets) wurden Partikel zum Einfangen zu der
oben beschriebenen Lyse-Mixtur
gegeben. Etwa 30 μl
einer Suspension an superparamagnetischen Partikeln (ca. 300 μg) an die
poly-T (in einem Bereich zwischen dT14 bis
dT30) in einer Dichte von zwischen etwa
1 bis 100 pmol pro mg kovalent geknüpft wurde, wurden zu etwa 1
ml der Lyse-Mixtur gegeben. Partikel mit dT14,
dT20, dT25 oder
dT30 Oligomeren sind alle in diesem Verfahren
verwendet worden. Für
gewöhnlich
hatten die Partikel zwischen etwa 10 bis 100 pmol an poly-dT pro
mg gebunden, am häufigsten
hatten die Partikel etwa 10 bis 50 pmol an poly-dT pro mg an Partikeln
gebunden. Diese Partikel werden in standardgepufferter Salzlösung (PBS),
pH 7,4 suspendiert, der 140 mM NaCl für die Zugabe zur Lyse-Mixtur
enthält.
-
Üblicherweise
bestanden die verwendeten Partikel aus einem Magnetitkern, der mit
Latex oder Siliciumdioxid, die kommerziell erhältlich sind, beschichtet ist,
an diese wurden poly-dT Oligonukleotide („Schwänze") angebunden. Auch wenn es nicht entscheidend
ist, das die Partikel magnetisch oder paramagnetisch sind, hilft
die magnetische Eigenschaft beim Wiedergewinnen der Partikel nach
der Hybridisierung der freigesetzten mRNA auf den Partikeln über die
poly-dT Schwänze.
Der Durchschnittsfachmann wird sich bewusst sein, dass nicht-magnetische
Partikel (z.B., Cellulose) mit poly-dT mittels Standardsedimentations-
oder Filtrationsverfahren substituiert und abgetrennt werden können. Für das Verkuppeln
mit dem poly-dT weisen underivatisierte Partikel freie Gruppen auf,
wie zum Beispiel Amin, Hydroxyl, Carboxyl, Estergruppen oder Mischungen
aus diesen Gruppen. Geeignete Partikel können bereits derivatisiert
mit poly-dT-Schwänzen
(z.B., Serodyn, Dynal, Novagen) erhalten werden. Alternativ dazu
können
underivatisierte Partikel erstanden werden (z.B., von Seradyne)
und mit poly-dT Oligonukleotiden mittels gut bekannter Kopplungschemie
(Lund et al., Nuc. Acids Res. 16:10861-10880, 1988) verbunden werden.
-
Die
Lyse-Mixtur und die poly-dT Partikel wurden durch Vortexen und anschließendem Inkubieren
bei zwischen etwa 22°C
bis etwa 42°C
für etwa
30 Minuten behutsam vermengt. Die Partikel wurden aus dem Rückstand
der Mixtur durch Anlegen eines magnetischen Feldes zum Wiedergewinnen
der Partikel abgetrennt; der Überstand
wurde verworfen. Der Durchschnittsfachmann könnte den magnetischen Separationsschritt
leicht durch eine Sedimentation (z.B., Zentrifugation) ersetzen.
Separierte Partikel wurden in etwa 1 ml einer Waschlösung aus
50 mM HEPES (pH 7,5), 5 mM EDTA, 150 mM NaCl und 0,1% (w/v) Natriumdodecylsulfat
(SDS) durch Vermengen mit einem Vortex für etwa 3 bis 5 Sekunden gewaschen,
um die Partikel zu suspensieren, die dann, wie oben beschrieben,
aus dem Überstand
abgetrennt wurden, und der Waschüberstand wurde
verworfen. Die Waschprozedur wurde zweimal wiederholt und die Partikel
wurden am Ende in 250 μl eines
Puffers, der aus 10 mM HEPES (pH 7,5) und 1 mM EDTA besteht, suspendiert.
Diese Suspension wurde entweder bei –30°C für eine spätere Verwendung gelagert oder
sofort verwendet. Die so hergestellte RNA wurde für über ein
Jahr eingefroren, wobei keine erkennbare Verringerung in der strukturellen
oder funktionellen Integrität
der RNA auftrat.
-
Wenn
die isolierte RNA sofort verwendet wird, kann sie entweder von den
Partikeln zum Einfangen (z.B., mittels eines Standard-Niedrigsalz-Elutionsprozesses)
freigesetzt werden, oder sie kann durch Verwendung eines Amplifikationsverfahrens,
welches das Erfordernis der Elution umgeht, amplifiziert werden,
ohne sie von den Partikeln freizusetzen. Dies wird zum Beispiel
durch das Verwenden von Primern erreicht, die an Bereiche der isolierten
Nukleinsäure
binden, die nicht an der Basenpaarung mit dem poly-dT oder in anderen Wechselwirkungen
mit der Matrix der festen Phase, die mRNA binden könnte ohne
sie von den Partikeln freizusetzen, beteiligt sind.
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Der
Durchschnittsfachmann wird erkennen, dass die exakten Volumina und
Verhältnisse,
die oben beispielhaft erläutert
wurden, für
die Erfindung nicht entscheidend sind. Es ist jedoch wichtig, dass
aus biologischem Gewebe abgeleitete Proben, die für eine Koagulation
anfällig
sind (z.B., Blut, Knochenmark, Plasma oder Zellsuspension) behandelt
werden, um eine Koagulation vorzubeugen. Es ist für zelluläre Proben ebenso wichtig,
dass die Ionenstärke
der Lyselösung
bei mindestens etwa 150 mM liegt, bevorzugt in einem Bereich zwischen
etwa 150 mM bis etwa 1 M, um die Lyse der Zellmembran einer Targetzelle
ohne eine gleichzeitige Freisetzung von kernständiger DNA zu ermöglichen.
Bei Ionenstärken
von weniger als 150 mM, kontaminierte das freigesetzte kernständige Material
die freigesetzten cytoplasmatischen Nukleinsäuren, zum Beispiel mit chromosomaler
DNA. Obwohl die Bindung an eine Theorie oder an einen Mechanismus
nicht gewünscht
wird, ist es wahrscheinlich, dass bei einer Ionenstärke von
etwa 150 mM die nukleäre
Membran ausreichend intakt bleibt, um eine wesentliche Freisetzung
von chromosomaler DNA vorzubeugen. Kontaminierende chromosomale
DNA erhöhte
die Viskosität
der Mixtur, was bei einer Verwendung der cytoplasmatischen RNA in
einem darauffolgenden Assay, zum Beispiel durch Querreagieren und
Erzeugen von falsch-positiven Reaktionen, durch Maskieren der RNA
und/oder Primer, und/oder durch Verhindern des Vermengens der Reaktanden,
zu Wechselwirkungen führen
könnte.
Eine Lyselösung,
die Lithiumsalze enthält,
wird für
das Unterbinden des RNA-Abbaus bevorzugt, trotzdem wird von Puffern,
die andere lösliche
Salze (z.B., NaCl) und einen bekannten RNAse Inhibitor enthalten,
erwartet, dass sie in diesem selektiven Lyseverfahren solange gleichermaßen wirksam
sind, wie die Ionenstärke
bei mindestens 150 mM liegt.
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Nukleinsäuren, die
durch das oben beschriebene Lyseverfahren zubereitet werden, können mit
anderen Verfahren zum Selektieren und Immobilisieren einer Target-Nukleinsäure verwendet
werden. Ein solches Verfahren beinhaltet ein Mediator-Oligonukleotid,
das in Lösung
mit einer spezifischen Target-Nukleinsäure hybridisiert, wie im U.S.
Pat. Nr. 4,751,177 von Stabinsky beschrieben. Andere Verfahren zur
Immobilisation sind in U.S. Pat. Nr. 4,486,539 und 4,563,419 von
Ranki et al., EP Pat.-Veröffentlichungsnr.
159719 von Rabbani et al., EP Pat.-Veröffentlichungsnr. 128332 von
Pergolizzi et al., U.S. Pat. Nr. 5,476,769 von Soderlund et al., U.S.
Pat. Nr. 5,474,895 von Ishii et al. und EP Pat.-Veröffentlichungsnr.
444120 von Hornes et al., beschrieben worden.
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Das
vorhandene Lyseverfahren ist für
die Zubereitung von Nukleinsäuren
aus Zellen, die in einer Vielzahl von Geweben enthalten sind, verwendbar.
Zum Beispiel können
Zellen, die aus festem Gewebe stammen, wie zum Beispiel festes Tumorgewebe,
mittels Standardverfahren zerkleinert und mit Trypsin behandelt
werden, um eine Zellsuspension herzustellen, die dann, wie oben
beschrieben, lysiert wird. Andere geeignete Verfahren um Zellen
in Suspension zu bringen, sind im Stand der Technik gut bekannt.
Wie unten gezeigt, können ebenso
Zellen, die in einer Gewebekultur oder flüssigem Medium gewachsen sind,
verwendet werden.
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Auch
wenn das Vermengen der Reagenzien durch Vortexen für die Anwendung
des Verfahrens im kleinen Maßstab
bevorzugt wird, können
wir für
Anwendungen im großen
Maßstab
andere weniger arbeitsintensive, im Stand der Technik bekannte Vermengungsverfahren
vorteilhaft sein. Bekannte Verfahren, die ein vollständiges und
kräftiges
Vermengen ermöglichen,
liegen innerhalb der Schutzumfangs der Erfindung.
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Auch
wenn vor dem Amplifizieren der eingefangenen Target-Nukleinsäure für gewöhnlich drei
Waschschritte durchgeführt
worden sind, kann die Anzahl der Waschschritte, die dem Verknüpfen der
Target-Nukleinsäuren
an die Partikel folgt, variiert werden. Waschschritte sind wichtig,
nicht nur um kontaminierende Proteine und Nukleinsäuren aus
der cytoplasmatischen Nukleinsäurezubereitung
zu entfernen, sondern auch für das
Entfernen von Lithium, das dafür
bekannt ist, dass es mindestens eine enzymatische Aktivität (RNA gerichtete
DNA-Polymerase, DNA gerichtete DNA-Polymerase, RNAse H und RNA-Polymerase)
hemmt, die im bevorzugten Transkriptions-verbundenen Amplifikationsverfahren
verwendet wird (siehe U.S. Pat. Nr. 5,480,784 und 5,399,491 von
Kacian et al.). Lithiumsalze mögen
andere Enzyme nicht hemmen und daher mag das Austauschen des Kations
nach der Lyse nicht notwendig sein, wenn andere Amplifikationsverfahren verwendet
werden.
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Partikel,
die bei der Auswahl der Target-Nukleinsäure verwendet werden, können aus
dem Überstand durch
eine Vielzahl von bekannten Verfahren, wie zum Beispiel Filtration,
Präzipitation
und Zentrifugation, abgetrennt werden. Die Partikel, wie oben beschriebenen,
können
Nukleinsäure-Einfangsonden aufweisen,
die an sie gebunden sind, um spezifisch an eine bestimmte cytoplasmatische
Nukleinsäure
zu binden. Alternativ dazu, auch wenn weniger bevorzugt, kann die
feste Phase die Target-Nukleinsäure
unspezifisch binden, wie, zum Beispiel, durch Verwendung von polykationischen
Trägern
(siehe U.S. Pat. Nr. 5,599,667 von Arnold et al.).
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Das
nächste
Beispiel beschreibt die Amplifikation einer Nukleinsäure, die
mittels des Lyseverfahrens aus diesem Beispiel isoliert worden ist.
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Beispiel 2
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Amplifikation einer Nukleinsäure aus
einer biologischen Probe und Detektion eines amplifizierten Produktes
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Für die Transkriptions-verbundene
Amplifikation einer aus einer biologischen Probe isolierten Nukleinsäure wurden
50 μl einer
Partikelsuspension, die, wie in Beispiel 1 beschrieben, aus dem
Blut eines CML positiven Patienten isolierte Nukleinsäuren enthält, in ein
Röhrchen
gegeben, das 25 μl
eines Amplifikationsreagenzes enthält. Für jede Reaktion enthielt das
Amplifikationsreagenz 160 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM MgCl2, 70 mM KCl, 20% (w/v) Polyvinylpyrrolidon,
16 mM von jedem der vier Ribonukleosidtriphosphate ATP, GTP, CTP
und UTP, 4 mM von jedem der vier Desoxyribonukleosidtriphosphate
dATP, dGTP, dCTP und dTTP, 400 nM (15 pmol) eines Promotor-Primers, mit der
Nukleotidbasensequenz der SEQ ID NO:1 (TAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACTCAGACCCTGAGGCTCAAAGTCAGA)
und 400 nM (15 pmol) eines Primers, der die Nukleotidbasensequenz der
SEQ ID NO:5 (GACCAACTCGTGTGTGAAACTCCA) hat. Nach dem Vermengen wurde
das Röhrchen
für zehn
Minuten bei 60°C
inkubiert. Im Allgemeinen ist jede Temperatur, die zum Schmelzen
der intramolekularen Basenpaarungen in der Target-Nukleinsäure geeignet
ist, in diesem Schritt zulässig.
Bevorzugt liegt die Inkubationstemperatur zwischen etwa 60°C und 70°C, am meisten bevorzugt
zwischen etwa 65°C
und etwa 67°C.
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Als
nächstes
wurde das Röhrchen
bei etwa 42°C
für 5 Minuten
inkubiert. Dann wurde ein Enzymreagenz (25 μl, die 2000 Einheiten (U) einer
rekombinanten MMLV Reversen Transkriptase, 2000 Einheiten einer rekombinanten
T7-RNA Polymerase, 8 mM HEPES (pH 7,5), 50 mM N-acetyl-L-cystein,
0,04 mM Zinkacetat, 80 mM Trehalose, 140 mM Tris-HCl (pH 8,0), 70
mM KCl, 1 mM EDTA, 0,01% (w/v) Phenol rot, 10% (v/v) TRITON® X-102
und 20% (v/v) Glycerol enthält)
zur Reaktionsmixtur zugegeben. Das Röhrchen wurde behutsam gemischt
und für
etwa 1 h bei 42°C
inkubiert. Dieses Amplifikationsverfahren stellte amplifizierte
RNA mit einem Sinn her, der dem der Target-RNA entgegengesetzt ist.
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Die
amplifizierte RNA wurde mittels 100 μ1 eines Sondenreagenzes detektiert,
das 100 mM Lithiumsuccinat (pH 4,7), 1,2 M LiCl, 15 mM Aldrithiol-2,2%
(w/v) Lithiumlaurylsulfat (LLS), 20 mM EDTA, 20 mM Ethylenglykol-bis-(β-aminoethylether)N,N,N',N'-Tetraacetatsäure (EGTA),
3% Ethanol und 7,5 nM einer Hybridisationssonde, die mit einem chemilumineszierenden
Acridiniumester (AE) markiert ist, enthält. Die für die bcr-b2-Sequenz-Detektion
spezifische synthetische DNA hatte die Sequenz der SEQ ID NO:9 (GACTGTCCACAGCATTCCGCTGACC),
die mit dem AE-Marker mittels eines nicht-Nukleotidlinkers und Verfahren,
die zuvor bereits in U.S. Pat. Nr. 5,585,481 von Arnold et al. beschrieben
worden ist, verknüpft
wurde. Diese Detektionslösung
wurde zur Reaktionsmischung gegeben und bei 60°C für 30 Minuten inkubiert, um
das Hybridisieren der Sonde mit dem amplifizierten Target zu ermöglichen.
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Die
Sonde wurde in einem homogenen Assay-Format, wie zum Beispiel das
homogene Schutz-Assay (HPA), das im Detail in U.S. Pat. Nr. 5,283,174
von Arnold et al. beschrieben worden ist, detektiert. Kurz beschrieben,
es wurden 300 μl
einer basischen Lösung,
die 600 mM Natriumborat (pH 8,5) und 1% (v/v) TRITON® X-100
enthält,
wurden zur oben beschriebenen Mischung gegeben, um den in der ungebunden
Sonde vorhandenen AE-Marker zu hydrolisieren. Der AE-Marker auf
der hybridisierten Sonde wird durch seine Verbindung mit einer Doppelhelix
vor der Hydrolyse geschützt,
wo hingegen ein AE-Marker
auf einer unhybridisierten Sonde nicht vor der Hydrolyse geschützt wird.
Dadurch wird die unhybridisierte Sonde bevorzugt undetektierbar gemacht.
Die Lösung
wurde bei 60°C
für 10
Minuten inkubiert, für
5 Minuten auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 200 μl einer Lösung, die
30 mM Wasserstoffperoxid und 1 mM Salpetersäure enthält, vermengt, sofort gefolgt
durch die Zugabe von 200 μl
einer Lösung,
die 1 M NaOH und 2% (w/v) ZWITTERGENT® 3–14, enthält. Die
Chemilumineszenz wurde mittels eines Luminometers (z.B., LEADER® 1,
LEADER® 50,
LEADER® 450 oder
LEADER® HC,
alle von Gen-Probe, Inc., San Diego, CA) detektiert. Der Chemilumineszenzoutput
wurde gemessen und in relativen Lichteinheiten („RLU") ausgegeben.
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Obgleich
das hier exemplarisch dargestellte Verfahren spezifische Detektionsformate
zum Detektieren einer Nukleinsäuresonde
verwendet, könnte
der Durchschnittsfachmann einfach andere Marker als AE verwenden,
wie zum Beispiel radioaktive Marker, Fluoreszenz und andere chemilumineszierende
Marker zum Detektieren hybridisierter Sonden mittels Standardverfahren.
Obwohl homogene Assaysysteme ebenso bestimmte eindeutige Vorteile
gegenüber
heterogenen Assays haben (d.h., solche, die eine physikalische Trennung
erfordern, um das Signal einer hybridisierten Sonde von einem Signal
in Folge einer unhybridisierten Sonde zu differenzieren), ist der
homogene Detektionsaspekt nicht entscheidend für das Verfahren.
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Beispiel 3
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Amplifizierung von isolierter
gespleißter
Nukleinsäure
und Detektion eines amplifizierten Produktes
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In
diesem Assay wurde eine gespleißte
Target-Nukleinsäure,
die eine Folge einer bcr-abl Translokation ist, amplifiziert und
mit einer Sonde, die gegen eine Sequenz gerichtet ist, welche die
Spleißverbindung
flankiert, detektiert, als ein Hinweis auf die Anwesenheit des Fusionsproduktes
in der biologische Probe. Das für die
Amplifikation und Detektion des Fusionsproduktes verwendete allgemeine
Verfahren wird in 1A bis 1C dargestellt.
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Die
verwendete biologische Probe bestand aus Blutzellen, die aus Patienten
erhalten wurden, die bekanntermaßen CML-positiv sind, aus Ihnen wurde poly-A
RNA mittels des im Wesentlichen wie in Beispiel 1 beschriebenen
Lyseverfahrens isoliert. Die Amplifikation der RNA wurde im Wesentlichen
wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt, jedoch unter Verwendung
des Promotor-Primers der SEQ ID NO:1, des Primers der SEQ ID NO:5
und 400 mM eines abl-spezifischen DNA-Primers mit der Sequenz der
SEQ ID NO:13 (CAAAGGAGCAGGGAAGAAGG). Dieser abl-spezifische Primer
hat den gleichen Sinn wie die Target-Nukleinsäure.
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Vor
der Detektion wurden die amplifizierten Nukleinsäuren in zwei Aliquots aufgeteilt.
Die bcr-spezifische AE-markierte Sonde der SEQ ID NO:9 wurde für die im
Wesentlichen wie im Beispiel 2 beschriebene Detektion zum ersten
Aliquot zugegeben. Die bcr-spezifische AE-markierte Sonde ist funktionsgemäß die gleiche wie
die b2-Sonde, die mit Bezug zu die 1A und 1B beschrieben
wurde, und die Fusionsnukleinsäure wurde
durch Messen der RLU, wie in Beispiel 2 beschrieben, detektiert.
Eine AE-markierte abl- spezifische Sonde
mit der Sequenz der SEQ ID NO:16 (GTGGAACATGAAGCCCTTCAGCGG) wurde
zum zweiten Aliquot zugegeben und die Mixtur wurde für die Detektion
der Chemilumineszenz, im Wesentlichen wie in Beispiel 2 beschrieben,
weiter bearbeitet. Diese abl-spezifische Sonde kann mit dem menschlichen
abl-Gen, das einen herkömmlich
verwendeten Spleißverbindungsbereich überspannt,
hybridisieren, obgleich eine gegen den 5' des Spleißverbindungsbereiches gerichtete
Sonde ebenso verwendet werden kann (siehe Beispiel 6). Da die in
diesem Beispiel verwendeten Primer konstruiert wurden, um jedes
Fusionstarget und die normalen abl-Nukleinsäuren, die in der Amplifikationsmixtur
vorhanden sind, zu amplifizieren, koamplifizierten sie beide Arten von
Nukleinsäuren
in der Amplifikations-Reaktionsmixtur, waren jedoch in den zwei
Aliquots des Detektionsschritts getrennt detektierbar.
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Die
Chemilumineszenz von jedem der zwei Aliquots wurde im Wesentlichen
wie in Beispiel 2 beschrieben detektiert, obgleich die Volumina
der Reagenzien entsprechend angepasst wurden, um die Tatsache zu berücksichtigen,
dass die Amplifikationsmixtur getrennt worden ist (d.h., halbe Volumina
wurden verwendet).
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Alternative
Verfahren können
verwendet werden, um jedes der Target- und nicht Target-Amplicons
zu detektieren. Ein derartiges alternatives Verfahren verwendet
zwei Chemilumineszenzmarker mit unterschiedlichen Eigenschaften,
wie zum Beispiel unterschiedlichen Wellenlängen bei der Lichtemission,
unterschiedlichen optimalen Reaktions-pH-Werten oder unterschiedlichen
Chemilumineszenzreaktionskinetiken, wobei es diese Eigenschaften
ermöglichen,
zwei verschiedene Amplicons im gleichen Reaktionsgefäß durch
den Einsatz von Sonden, die mit dem entsprechenden Marker unterschiedlich
markiert worden sind, zu detektieren. Solche Verfahren sind zuvor
bereits im Detail in der PCT Int. Pat. Veröffentlichungsnr. WO 96/13612
und PCT Int. Pat. Veröffentlichungsnr.
WO 91/00511 offenbart worden.
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Beispiel 4
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Amplifikation mittels
eines einzelnen Promotor-Primers und selektive Detektion von amplifizierten
Nukleinsäuren
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Dieses
Beispiel demonstriert die Nukleinsäureamplifikation mittels eines
einzelnen Promotor-Primers, der für die Herstellung von amplifizierten
Nukleinsäuren
mit einem Sinn, der dem des Targets entgegengesetzt ist, mit der
Target-Nukleinsäure hybridisieren
können.
Sowohl die normalen als auch die Fusionsnukleinsäuren wurden mittels eines Primers
amplifiziert, jedoch wurden die amplifizierten Nukleinsäuren mittels
einer bcr-Sonde, die auf eine Position gerichtet ist, die auf der
5'-Seite (relativ
zur Target-Nukleinsäure)
der Bruchpunkt-Verbindung angeordnet ist, und eine abl-Sonde, die
auf eine abl-Sequenz gerichtet ist, die in einer Fusionsnukleinsäure fehlen
würde,
getrennt detektiert.
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Zum
Vergleich wurden drei unterschiedliche Quellen an poly-dT magnetischen
Partikeln in diesem Beispiel verwendet, im Wesentlichen wie in Beispiel
1 beschrieben. Kommerziell erhältliche
Partikel mit angeknüpften
25-mer poly-dT's
wurden erstanden (dT25 Partikel, von Novagen)
und zwei Sätze
synthetischer Partikeln wurden durch Koppeln von poly-dT an underivatisierte
Partikel (erstanden von Seradyne) zubereitet. Ein Satz von Partikel
wurde an ein homopolymerische 14-mer Oligonukleotid („dT14-Partikel") gekoppelt, und ein zweiter Satz von
Partikel wurde an ein homopolymerisches 30-mer Oligonukleotid („dT30-Partikel") gekoppelt. Jede Art von Partikel war,
im Wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben, in einer Suspension
vorhanden.
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Cytoplasmatische
mRNA wurde aus K562 Zellen gewonnen, die in einer Standardgewebskultur
bis zu einer Dichte von etwa 5 × 106 Zellen/ml heranwuchsen und dann entsprechend
des Probenzubereitungsverfahrens wie in Beispiel 1 beschriebenen
behandelt wurden. Ungefähr
2 × 105 Zellen wurden für jede getestete Reaktionsmixtur
verwendet, die dann unverdünnt
oder in einer 1:10 Verdünnung
verwendet worden ist. In getrennten Reaktionsmixturen wurde pro
Nukleinsäureamplifikationsreaktion
60 μl jeder
gewaschenen Partikelzubereitung verwendet. Kontrollproben wurden
keine Partikel zugesetzt, um eine Hintergrundmessung (Daten nicht
dargestellt) bereitzustellen, die von den Probenergebnissen, zu
denen Partikel zugegeben worden sind, abgezogen wurden. Die Nukleinsäureamplifikation
wurde im Wesentlichen wie in Beispiel 2 beschrieben und im U.S.
Pat. Nr. 5,554,516 von Kacian et al. durchgeführt, mit der Ausnahme, dass
ein einzelner Promotor-Primer der SEQ ID NO:1 (30 pmol) in der Amplifikationsreaktion
verwendet wurde. Keine Primer des gleichen Sinns wie die Target-Nukleinsäure wurden
verwendet.
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Amplifikationsreaktionen
ließ man
für eine
Stunde laufen. Dann wurde jede Probe in zwei ungleiche Aliquots
aufgeteilt, ein Aliquot enthält
ein Drittel von jeder Amplifikationsreaktion für die Detektion mit der bcr-spezifischen AE-markierten
Sonde der SEQ ID NO:9 und das andere Aliquot enthält zwei
Drittel der Amplifikationsreaktion für die Detektion mit der abl-spezifische
AE-markierten Sonde der SEQ ID NO:16. Die Sondenhybridisation wurde
im Wesentliche wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Die
Detektion der hybridisierten Sonden wurde im Wesentlichen wie in
Beispiel 2 beschrieben durchgeführt,
wobei die Volumina der Detektionsreagenzien dem Volumen der verwendeten
Proben entsprechend angepasst wurden. Das durch die Marker emittierte
Licht wurde in einem LEADER® 50 Luminometer in relativen
Lichteinheiten (RLU), wie zuvor bereits beschrieben, gemessen und
die Ergebnisse werden in Tabelle 1 dargestellt.
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Diese
Ergebnisse zeigen, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung
in einem Amplifikationsformat verwendet werden kann, das einen einzelnen
Promotor-Primer verwendet, der mit der Target-Nukleinsäure in einer
Position hybridisiert, die 3' zu
einem potentiellen Spleißverbindungsbereich
angeordnet ist. Die Amplifikation führt zur Akkumulation eines
Amplicons (komplementäres
RNA-Transkript)
mit dem entgegengesetzten Sinn wie der der Target-Nukleinsäure. Die
Ergebnisse zeigen ebenso, dass mit 14-mer poly-dT Oligonukleotiden
gekoppelte Partikel und kommerziell erhältliche (Novagen) Partikel
mit angebundenen poly-dT25 unter diesen
Assaybedingungen zum Einfangen von mRNA in Lösung wirksam waren. Synthetische
poly-dT30 Partikel waren ein wenig variabel
beim RNA Einfangen, basierend auf den in Tabelle 1 dargestellten
Ergebnissen. Wie durch diese Ergebnisse gezeigt wurde, kann eine
Amplifikationsreaktion mittels eines einzelnen Promotor-Primers
verwendet werden, um die Anwesenheit von zwei unterschiedlichen
Nukleinsäuretranskripten in
der gleichen biologischen Probe durch Verwendung unterschiedlicher
Sonden spezifisch zu detektieren. In diesem Fall wurde ein Transkript
durch die bcr-Sonde detektiert und ein anderes wurde durch die abl-Sonde detektiert.
Ergebnisse aus anderen Experimenten zeigten keine Querreaktionen
zwischen diesen beiden Sonden. Daher kann die Detektion eines Transkripts
(z.B., des abl-Transkriptes) als eine interne Kontrolle in den Probenzubereitungs,
Amplifikations- und Detektionsschritten des Verfahrens dienen.
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Beispiel 5
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Amplifikation und Detektion
von normalen abl-Transkripten in peripheren Blutzellen
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Eine
Amplifikation wurde mit Nukleinsäuren,
die aus peripheren Blutzellen isoliert worden sind, durchgeführt und
vor der Verwendung, im Wesentlichen wie in den Beispielen 1 und
2 beschrieben, gelagert. Mit EDTA behandeltes Vollblut wurde wie
in Beispiel 1 beschrieben verarbeitet und die Partikel, an die cytoplasmatische
RNA band, wurden vor der Verwendung gelagert. Dieses Beispiel zeigt
die Verwendung des Probenzubereitungsverfahrens, für die Zubereitung
von normaler abl mRNA, und des Amplifikationsverfahrens, um die
Detektion von normaler abl mRNA zu ermöglichen. Dieses Beispiel zeigt
auch, dass unterschiedliche Quellen von immobilisierten dT mit unterschiedlichen
dT-Längen
für die
Target-Isolation wirksam sind.
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Die
für die
Isolation des natürlich
auftretenden abl-Genproduktes verwendeten Partikel waren von derselben
Art wie die in Beispiel 4 verwendeten, und die Isolation der cytoplasmatischen
Nukleinsäuren
wurde im Wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Die
Blutproben wurden unverdünnt
oder mit einer Verdünnung
von 1:10 oder 1:100 verwendet. Die Partikel mit eingefangener Target-Nukleinsäure (60 μg und 6 μg) wurden
in dem Transkriptions-vermittelten Amplifikationsverfahren, im Wesentlichen
wie in Beispiel 2 beschrieben, unter Verwendung eines Promotor-Primers
mit der Sequenz der SEQ ID NO:1 und eines Primers mit der Sequenz
der SEQ ID NO:13 verwendet. Nach der Amplifikation wurden die Amplifikationsprodukte
mittels einer abl-spezifischen Sonde mit der Sequenz der SEQ ID
NO:16 unter Verwendung der Detektionsverfahren, im Wesentlichen
wie in Beispiel 2 beschrieben, detektiert. In RLU gemessene Chemilumineszenzergebnisse
werden in Tabelle 2 dargestellt. Die negativ-Kontrolle („kein-Target") repräsentiert
die Hintergrund-RLU.
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Die
Daten der Tabelle 2 zeigen, dass das vorliegende Probezubereitungsverfahren
geeignet ist, um spezifischen Nukleinsäurearten einzufangen, die dann
mit Targetspezifischen Primern amplifiziert und mittels einer Targetspezifischen
Sonde detektiert werden können.
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Beispiel 6
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Amplifikation und Detektion
normaler abl-Transkripte und Fusions-bcr-abl-Transkripte in aus
CML-Patienten isolierter RNA
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Dieses
Beispiel demonstriert, dass bcr-abl-Transkripte zweier unterschiedlicher
Arten (bcr b2-abl und bcr b3-abl) mittels unterschiedlicher bcr-Sonden
in Amplifikationsprodukten von RNA, die aus CML-Patienten erhalten
worden sind, detektiert werden können.
Es zeigt weiter, dass die Amplifikation und Detektion von abl-RNA
als eine interne Kontrolle dient.
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Die
in diesem Experimenten verwendeten Quellen an RNA waren: (1) die
RNA aus CML-Patienten, die von drei Individuen erhalten worden sind,
(2) synthetische RNA-Transkripte zur Kontrolle, hergestellt durch Standard
in vitro Transkriptionsverfahren aus einem abl-Genklon (geklont
aus der RNA eines Patienten mittels Standard cDNA-Klonierungsverfahren)
hergestellt worden ist, und (3) synthetische RNA-Transkripte stellten einen
Klon mit einer bcr b3-abl Translokations-Bruchpunkt-Verbindung (geklont
aus der K562 Zelllinie) her. Die drei CML-Patienten (Patienten A,
B und C) zeigten unterschiedliche Phasen der Erkrankung Patient
A und B hatten aktive CML-Symptome und Patient C wurde nach der
Durchführung
einer Knochenmarktransplantation untersucht und zeigte wenig oder
keine CML-Symptompe. Für
jeden Patienten wurde die gesamt-RNA aus dem Leukozytenfilm von
Blutproben mittels eines Standard-Guanidinum-Isothiocyanatverfahrens
(Chirgwin, et al., 1979, Biochem. 18:5294-5299) isoliert. Die für jedes
Assay für
jeden Patienten verwendete gesamt-RNA-Menge lag bei etwa 10 ng (etwa 1000
Zellen entsprechend). Die synthetische RNA zur Kontrolle wurde mittels
Kopienzahlen der Sequenz, die mittels Standardverfahren berechnet
worden sind, untersucht, mit der Kopienanzahl pro Assay wie in Tabelle
3 gezeigt. Bei den negativ-Kontrollen wurde keine RNA zu den Amplifikationsreaktionsmixturen
gegeben.
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Die
Amplifikation der gesamt-RNA der Patienten und der synthetischen
RNA-Transkripte zur Kontrolle wurde im Wesentlichen wie in Beispiel
2 beschrieben durchgeführt.
Die Detektion der amplifizierten Nukleinsäure wurde im Wesentlichen wie
in Beispiel 2 beschrieben ausgeführt,
wobei ein Amplifikationsaliquot unter Verwendung einer bcr b2-Sonde
(ein AE-markiertes Oligonukleotid mit der SEQ ID NO:9), einer bcr
b3-Sonde (ein AE-markiertes Oligonukleotid mit der SEQ ID NO:27)
und einer abl-Sonde (ein AE-markiertes Oligonukleotid mit der SEQ
ID NO:26) individuell detektiert worden ist. Die abl-Sonde ist auf
einen in 3 dargestellten (doppelt unterstrichene
Sequenz) Bereich gerichtet. Die Assays wurden dreifach durchgeführt und
die Durchschnitts (Mittelwert) RLU- Ergebnisse werden in Tabelle 3 („ND" bedeutet „nicht
durchgeführt") dargestellt.
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Die
Ergebnisse der Tabelle 3 zeigen, dass die bcr b2-spezifische Sonde in der Lage war, weniger
als 50 Kopien von bcr b2 (siehe Spalte 3, Datenzeile 8) zu detektieren
und das sie die Anwesenheit von bcr b2 in RNA von Patienten A und
B, jedoch nicht von Patient C (Spalte 3, Datenzeilen 1 bis 3, verglichen
mit der „keine RNA"-Kontrolle der Spalte
3, Datenzeile 9) detektierte. Die Ergebnisse zeigen ebenso, dass
die bcr b3-Sonde in der Lage war, weniger als 50 Kopien von bcr
b3 (siehe Spalte 4, Datenzeile 8) zu detektieren und das sie die
Anwesenheit von bcr b3 aus RNA von Patient A jedoch nicht aus RNA
von Patient B detektierte. Vom Patienten C wurden nicht erwartet,
dass er bcr b3 aufweist, da die Translokation in diesem Patienten
bereits das Target der bcr b2-Sonde entfernt hatte und daher ebenso
das Target der bcr b3-Sonde entfernt haben würde. Tabelle 3 zeigt ebenso,
dass die interne Kontrolle, abl, in allen drei Patienten detektiert
wurde, die vermutlich die Detektion von normalen abl-Transkripten (Spalte
2, Datenzeile 1–3)
verkörpern.
Andere Ergebnisse (nicht dargestellt) haben bestätigt, dass die bcr b2- und
bcr b3-Sonden mit abl-Amplicons nicht quer reagieren, und die abl-Sonde
nicht mit den bcr-Amplicons quer reagiert.
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