DE69918132T2 - Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von gespleißten Nukleinsäuren - Google Patents

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Description

  • Gegenstand der Erfindung
  • Diese Erfindung bezieht sich auf die Detektion und Messung von Nukleinsäuren, die von biologischen Quellen abstammen, und bezieht sich im Speziellen auf Verfahren zum spezifischen Detektieren von gespleißter mRNA, die normal gespleißte mRNA, die ein Ergebnis der intrazellulären Verarbeitung ist, und atypisch gespleißte mRNA, die ein Ergebnis der chromosomalen Translokationsereignisse ist, wie sie z.B. in einigen Krebszellen auftritt, beinhaltet.
  • Hintergrund der Erfindung
  • In Eukaryoten liegt die genetische Information der DNA als Chromosomen vor, die in einem Kern enthalten sind. Einige Viren enthalten chromosomenähnliche genetische Strukturen. Die innerhalb eines DNA-Stranges enthaltende genetische Information hängt von der Sequenz an Basen (d.h., „Basensequenz" oder „Nukleotidsequenz") ab, wobei die Basen Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) und Thymin (T) sind. DNA kodiert für komplementäre Boten-Ribonukleinsäure-(mRNA) Sequenzen, in denen T durch Uracil (U) ersetzt ist und die 5' bis 3' Nukleotidsequenz die Aminosäuresequenz des kodierten Proteins spezifiziert. Eukaryotische Gene beinhalten im Allgemeinen nicht aneinanderliegende kodierende Bereiche („Exons"), die durch dazwischenliegende nichtkodierende Bereiche („Introns") voneinander getrennt werden. Die kernständige Transkription eines Gens synthetisiert eine Vorläufer-mRNA (prä-mRNA, die Introns und Exons beinhaltet), die komplementär zum kodierenden DNA-Strang ist. Das normale Verarbeiten der prä-mRNA eliminiert Introns durch Schneiden und Spleißen der RNA, um die Exons kovalent zu verknüpfen und die Introns gleichzeitig herauszuschneiden. Die sich daraus ergebende reife kernständige mRNA tritt in das Cytoplasma über, wo die Translation in Proteine stattfindet.
  • Das Spleißen von Nukleinsäure tritt ebenso im Lebenszyklus von vielen Viren auf. Einige Viren integrieren als Provirus mittels eines Spleißmechanismus, in dem die DNA des Wirtes zerschnitten und die virale Nukleinsäure in die DNA des Wirtes inseriert und legiert wird, in die DNA von Wirtszellen. Die virale Insertion tritt häufig im Chromosom der Wirtszelle an einem spezifischen Lokus oder verwandten Loki auf, die charakteristisch für das Virus oder die Virusfamilie sind. Pathogene Proviren, die in einer Target-Zellpopulation vorhanden sind, werden häufig mit einem speziellen Zustand oder Erkrankung in Verbindung gebracht. Die Insertion eines Provirus in das chromosomale Exon oder in die Nähe einer Intron-Exon-Grenze kann zur Herstellung einer abnormalen Version einer für gewöhnlich transkribierten mRNA und/oder translatierten Proteins, mit nachfolgenden schädlichen Wirkungen für die Zelle, führen.
  • Molekularbiologische Verfahren sind verwendet worden, um die genetische Basis für eine Erkrankung zu untersuchen und molekulare Ereignisse, z.B. anomales genetisches Spleißen, Deletionen, Insertionen, Substitutionen und Amplifikationen zu identifizieren, die für einige Erkrankungen, wie zum Beispiel Krebs, verantwortlich sind. Einige anomale genetische Spleißereignisse sind nicht zufällig und charakteristisch für bestimmte Erkrankungen.
  • Chromosomale Translokationen sind genetische Rekombinationsereignisse, die mit bestimmten Krebsarten, wie zum Beispiel einigen Leukämien und Lymphomen, in Verbindung gebracht werden. Bei einigen Translokationen setzten sich zwei unterschiedliche Chromosomen durch reziproken genetischen Austausch zwischen den Chromosomen wieder zusammen, die dann zwei Hybridchromosomen ausbilden, wobei ein jedes Abschnitte von zwei normalen Chromosomen beinhaltet. Andere Translokationen sind intrachromosomale Rekombinanten, in denen normalerweise nicht benachbarte Bereiche des gleichen Chromosoms miteinander verbunden werden. Eine „Bruchpunktverbindung" (engl. „breakpoint junction") einer Translokation bezieht sich auf einen Verbindungspunkt von Sequenzen, die von normalerweise voneinander getrennten Chromosomalen Orten abstammen. Bruchpunktverbindungen können an konservierten Orten innerhalb eines oder beider Chromosomen angehäuft werden. Translokationen, die innerhalb eines genetisch kodierenden Bereiches auftreten, können abnormale mRNA mit diskreten Bereichen, z.B., einen 5'-Abschnitt, der von einem chromosomalen Ort abstammt und einem 3'-Abschnitt, der von einem anderen chromosomalen Ort abstammt, ergeben. Solche abnormalen Transkripte sind als „Fusions-Transkripte" oder „Fusions-mRNA" bekannt.
  • Eine Familie von Translokationen ist charakteristisch für Patienten mit chronischer myelogener Leukämie („CML"). Mit CML in Verbindung stehende Translokationen treten zwischen den menschlichen Chromosomen 9 und 22 (bezeichnet als „t(9:22)") auf und das sich daraus ergebende verkürzte Chromosom 22 ist als das Philadelphia-Chromosom (oder Ph1) bekannt. Die t(9;22) Ereignisse verbinden Abschnitte des abl-Gens des Chromosoms 9 und des „Bruchpunkt-Cluster-Bereichs" (engl. „breakpoint cluster region") oder bcr-Gen des Chromosoms 22. Eine cDNA, die aus einer Fusions-mRNA (von etwa 8kb), die aus einer Ph1-positiven Zelllinie isoliert worden ist, angefertigt worden ist, wurde sequenziert, was eine Translokation zwischen dem abl-Exon 2 und dem bcr-b3-Bereich offenbarte, der für ein Fusionsprotein mit einer Tyrosin-Kinase-Aktivität kodiert (Shtivelman et al., Nature 315:550-554, 1985). Eine Antikörperdetektion eines veränderten abl-Proteins mit einem höheren Molekulargewicht als das eines normalen abl-Proteins, ist verwendet worden, um Ph1-positive Zellen, Diagnostik der CML (siehe U.S. Pat. Nr. 4,599,305 von Witte et al.), zu detektieren.
  • Eine andere Translokation zwischen den Chromosomen 22 und 9 innerhalb eines bcr-Bereiches, der etwa 50 kb 5' des mit CML in Verbindung stehenden bcr-Bereiches liegt, ist für die akute lymphoplastische Leukämie (ALL) charakteristisch. Mit ALL in Verbindung stehende Translokationen treten innerhalb des mutmaßlich ersten Introns des bcr-Bereichs auf, die eine chimärische mRNA erzeugen, die das bcr b1 des Chromosoms 22 und das abl Exon 2 des Chromosoms 9 spleißt, was wiederum ein Fusionsprotein erzeugt (Hermans et al., Cell 51:33-40, 1987). Mit ALL in Verbindung stehende Translokationen auf Chromosom 22 sind mit für einen Abschnitt des bcr-Gens (siehe Europäisches Patentpublikation Nr. EP 0 364 953 von Nakamura et al.) spezifischen Sonden detektiert worden.
  • Chromosomale Translokationen, die menschliche Chromosomen 8 und 21 einschließen sind mit etwa 40% der pediatrisch akuten myelogenen Leukämie („AML"), welche die FAB-M2 Morphologie aufweist, in Verbindung gebracht worden. Die Bruchpunkte auf beiden Chromosomen sind variabel, führen jedoch im Allgemeinen zu einem einfachen Fusionstranskript, das 5'-Abschnitte des AML1-Gens von Chromosom 21 und 3'- Abschnitte des ETO-Gens des Chromosoms 8 enthält, die ein Fusionsprotein erzeugen (siehe U.S. Pat. Nr. 5,580,727 von Ohki et al.).
  • Andere chromosomale Translokationen, die mit Erkrankungen wie zum Beispiel Lymphomen und Leukämie in Verbindung stehen, sind die mit ALL in Verbindung stehende t(15;17) Translokation und die mit AML in Verbindung stehenden t(12;21), t(4;11) und die t(1;19) Translokationen.
  • Die Detektion von chimärischen DNA und/oder RNA und/oder Fusionsproteinen, die mit abnormalen Zuständen oder Erkrankungen, wie zum Beispiel den weiter oben beispielhaft dargestellten, in Verbindung stehen, ist wertvoll zur Bestätigung einer anfänglichen Diagnose, zum Überwachen der Reaktion eine Patienten auf eine Behandlung und zur Bereitstellung einer Frühwarnung vor dem Wiederauftreten der Erkrankung nach der Remission. Die Fähigkeit, chimärische Nukleinsäuren oder Proteine zu detektieren, ist durch die extrem kleine Anzahl von Zellen, die in unterschiedlichen Stufen einer Erkrankung vorhanden sind, z.B. im Anschluss an eine Remission oder in einer nicht akuten Phase, begrenzt. Die Prognose von Zuständen eines Patienten, die mit chromosomalen Translokationen in Verbindung stehen, das Wiederauftreten der Zustände eingeschlossen, ist bei einer frühen Diagnose für gewöhnlich günstiger. Im Allgemeinen sind immunologische Techniken nicht empfindlich genug, um sehr kleine Mengen des Analyten in einer Probe zu detektieren.
  • Von Verfahren zur Diagnose von Zuständen, die mit chromosomalen Translokationen, wie zum Beispiel CML und ALL in Verbindung stehen, ist berichtet worden. Das U.S. Pat. Nr. 4,681,840 von Stephenson et al. und die PCT Veröffentlichung Nr. WO 85/03297 offenbaren DNA- und Hybridisationsverfahren zur Detektion von mit CML in Verbindung stehenden Ph1-Abnormalitäten mittels einer chromosomalen von DNA abstammenden Sonde, die komplementär zum bcr-Bereich ist. Mit CML in Verbindung stehende t(9:22) Translokationen, die bcr b2 oder b3 mit dem abl-Exon 2 verbinden, können durch Amplifizieren der Fusions-mRNA und anschließendem Hybridisieren synthetischer Oligonukleotidsonden, die für diese gespleißten Sequenzen spezifisch sind, für die amplifizierten Nukleinsäuresequenz (siehe U.S. Pat. Nr. 4,874,853 von Rossi et al. und Europäische Pat. Veröffentlichungsnr. 0338713) detektiert werden. Verfahren zur Detektion einzigartiger anomaler Gentranskripte durch Hybridisieren der RNA mit einem oder mehreren synthetischen DNA-Oligonukleotiden, die komplementär zu Sequenzen sind, die durch das Ph1-Chromosom kodiert werden, wurden im U.S. Pat. Nr. 4,999,290 von Lee beschrieben. In diesen Verfahren wird eine RNA-DNA Heteroduplex ausgebildet, die gegenüber einem enzymatischen Abbau resistent ist, gefolgt von einer Polymerase Kettenreaktions-(PCR) Amplifikation und DNA-Detektion, um die Anwesenheit anomaler Gentranskripte anzuzeigen. Die komplementären DNA-Oligonukleotide beinhalten bcr b2 und/oder b3 und abl-Sequenzen. DNA-Sequenzen und Hybridisationsverfahren zur Detektion und Identifizieren chromosomaler Anomalitäten in Tumor-DNA, die den ALL-1 Bruchpunktbereich des menschlichen Chromosoms 11 enthalten (z.B., t(9;11) Translokationen), sind bekannt (siehe U.S. Pat. Nr. 5,567,586 und 5,633,136 von Croce et al.).
  • Verfahren, die Verbindungssonden verwenden, um Translokationen zu detektieren, können als Folge von spezifischen Fusionsereignissen nur DNA oder mRNA detektieren, da jede Sonde gegen eine spezifische Bruchpunktverbindung gerichtet ist. Für Translokationen, wie zum Beispiel mit CML in Verbindung stehende Ereignisse, die irgendeine von vielen innerhalb eines kleinen bcr-Bereiches auftretenden Bruchpunkten verwenden können, würde ein Nachweis von Fusions-mRNA die Verwendung von vielen unterschiedlichen Bruchpunktverbindungssonden erforderlich machen. Ebenso sind Punktmutationen, welche die Sondenhybridisierung begrenzen können, manchmal innerhalb einiger Basen entfernt von einer Spleißverbindung angeordnet. Darüber hinaus können chromosomale Umordnungen, wie zum Beispiel Deletionen oder Insertionen innerhalb des bcr-Gens weniger übliche mit CML in Verbindung stehende anomale Transkripte erzeugen, die durch Verwendung einer Bruchpunktverbindungssonde nicht detektiert werden würden.
  • U.S. Pat. Nr. 5,487,970 von Rowley et al. offenbart Verfahren zur Detektion von Chromosom 11 (11q22) Translokationen mittels einer Bruchpunktverbindungssonde oder der Verwendung von der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisation (FISH). Im FISH-Verfahren werden zwei fluoreszierend markierte Sonden, die gegen einen 11q22 chromosomalen Bereich, der einen als üblich bezeichneten Bruchpunkt flankiert, gerichtet sind, in situ zu Chromosomen hybridisiert, die dann mittels Fluoreszenzmikroskopie beobachtet werden. Zellen, in denen der Marker nur auf Chromosom 11 vorhanden ist, werden als normal klassifiziert, wohingegen Zellen, in denen der Marker auf unterschiedlichen Chromosomen zu finden ist, als eine Translokation besitzend identifiziert werden. Dieses Verfahren erfordert das Screenen einer relativ großen Zellpopulation, wenn nicht die Translokation in vielen Zellen in der Probe vorhanden ist. Die Sonden beinhalten Restriktionsendonuklease-Fragmente, die mit chromosomalen Translokationen, die das Chromosom 11 ALL-1 Gen (mittels FISH oder Southern Blott) einschließen, hybridisieren können. Andere FISH-Verfahren, die mit CML in Verbindung stehende Translokationen detektieren, verwenden Sonden, die von Spezies-spezifischen DNA-Bereichen zwischen Wiederholungssegmenten („inter-Alu"-Sequenzen) abstammen, wie in U.S. Pat. 5,538,869 von Siciliano et al. beschrieben.
  • Die zuvor genannten Verfahren beruhen auf der direkten Detektion der chimärischen RNA oder DNA durch Nukleinsäurehybridisation ohne Signal- oder Targetamplifikation. Daher erfordern diese Detektionsverfahren eine relativ große Anzahl von Targetzellen, welche die chromosomale Umordnung in der Probe tragen, z.B., Gewebe, Blut oder eine andere Körperflüssigkeit. Eine große Anzahl von abnormalen Zellen jedoch sind im Allgemeinen in einer Probe nicht vorhanden, wenn die Erkrankung in der Remission zu sein scheint oder sich in einem chronischen nicht akutem Stadium befindet. Daher können, wenn eine ausreichenden Anzahl von die genetischen Abnormalitäten tragenden Zellen vorhanden sind, um eine direkte Detektion zu ermöglichen, die Möglichkeiten zur Behandlung eines Patienten deutlich begrenzt werden.
  • Andere Verfahren zur Nukleinsäuredetektion verwenden eine Amplifikation, um viele Kopien eine Target-Nukleinsäure (entweder einer oder beide komplementären Stränge) oder eines Reportermoleküls zu erhalten, um die Detektionsempfindlichkeit zu erhöhen. Eine Vielzahl von Nukleinsäureamplifikations verfahren sind gut bekannt (z.B., siehe Persing, D.H., „In Vitro Nucleic Acid Amplification Techniques" in Diagnostic Medical Microbiology: Principles and Applications 51 (Persing et al., Herausgeber, 1993)), wie weiter unten kurz beschrieben.
  • Eskola et al. (Clinical Biochemistry, Vol.27, Nr.5, 5.373-379, 1994) offenbart ein Verfahren zur Detektion von Translokationen zwischen dem menschlichen abl-Gen des Chromosoms 9 und dem bcr-Gen des Chromosoms 22 unter Verwendung einer Reversen Transkriptase Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), um einen Teil der Translokationssequenz zu amplifizieren, gefolgt von der Detektion der amplifizierten Nukleinsäure mittels eines Verfahrens, das mindestens zwei Sonden zur Detektion erfordert. Eine der zwei Sonden ist biotinyliert und bindet 5' von der Translokations-Spleißverbindung, und die zweite Sonde ist Eu-markiert und bindet 3' von einer Spleißverbindung. Die biotinylierte Sonde wird verwendet, um die Hybrid-Komplexe an eine Streptavidin-beschichtete Kammer zu binden und die Eu-markierte Sonde wird verwendet, um die Komplexe durch detektieren der Fluoreszenz in den gewaschenen Kammern zu detektieren.
  • WO 97/08339 offenbart Verfahren zur Detektion von mit CML in Verbindung stehenden bcr-abl Translokationen durch Amplifizieren von RNA-Sequenzen unter Verwendung von Amplifikationsprimern, die an Positionen hybridisieren, welche die Spleißverbindung flankieren, und ein mit der Transkription in Verbindung stehendes Verfahren (z.B. 3SR oder NASBA) und nachfolgendem Detektieren der Reaktionsprodukte, falls vorhanden, nach dem Einfangen auf einer festen Phase, wie zum Beispiel einer Mikrokammer, mittels eines Agens zum Einfangen. Der Detektionsschritt verwendet ein Agens zum Einfangen und ein Agens zum Detektieren, um einen Target/Einfang Agens/Detektor Agenskomplex, der innerhalb eine Kammer gebunden ist, auszubilden, und ungebundenes Material wird weggewaschen. In einigen Ausführungsformen der WO 97/08339 können die Bindungsschritte des Agens zum Einfangen und des Agens zum Detektieren der Reihe aufeinanderfolgend sein, wobei das Reaktionsprodukt an die feste Phase gebunden wird, gewaschen wird und dann das Agens zum Detektieren gebunden wird. In einem anderen sequentiellen Verfahren, das in der WO 97/08339 offenbart wird, wird die amplifizierte Probe an das Agens zum Detektieren gebunden und der Probe/Detektor-Agenskomplex wird dann in der mit dem Agens zum Einfangen beschichteten Mikrokammer gebunden. Eine andere Ausführungsform der WO 97/08339 verwendet simultanes Anbinden, wobei die amplifizierte Probe gleichzeitig mit dem Agens zum Einfangen und dem Agens zum Detektieren vermengt wird und der Target/Einfang Agens/Detektor Agenskomplex wird dann in eine Mikrokammer gegeben.
  • DE-A-4447015 beschreibt ein Verfahren, das zum Isolieren und Reinigen von Nukleinsäuren aus kleinen Mengen von stark kontaminierten Materialien geeignet ist, das umfasst: (a) Lysieren des Materials mit einem Puffer, der ein chaotropes Salz mit einer hohen Ionenstärke enthält; (b) Inkubieren des Lysates mit einem fein verteilten, nicht porösem, nicht strukturiertem, homogenen Silikatträger, der eine Partikelgröße von 7–40 nm und einer Oberfläche von 50–300 m<2>/g aufweist; (c) Abtrennen der Trägergebundenen Nukleinsäure vom Lysat; (d) Waschen des Trägers mit einem Puffer, und (e) Eluieren der Nukleinsäure mit einem Puffer niedrigem Salzgehaltes.
  • Eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ermöglicht die Detektion von kleinen Mengen an in einer Probe vorhandenen DNA durch Amplifizieren der DNA-Targets mittels zweier oder mehrerer Primer und wiederholten Zyklen thermalen Denaturierens, Primer Anbindens und DNA-Synthese (U.S. Pat. Nr. 4,683,195 von Mullis et al.; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, 1990, Innes, M.A. et al., Herausgeber (Academic Press, Inc., San Diego, CA)). Üblicherweise hybridisiert ein erster Primer mit einem spezifischen Bereich der Target-Nukleinsäure und ein zweiter Primer hybridisiert an dem entgegengesetzten Strang der Target-DNA 5' zur Bindungsstelle des ersten Primers. Dann stellt die Polymerase in einer Serie von Syntheseschritten Primer-Verlängerungsprodukte her, welche den Bereich zwischen den Primern exponentiell amplifizieren.
  • Die Ligase-Kettenreaktion (LCR) verwendet zwei komplementäre Sätze von kurzen DNA-Oligonukleotiden, die mit nebeneinanderliegenden Bereichen einer Zielnukleinsäure hybridisieren, und die Oligonukleotide werden dann mittels einer DNA-Ligase (siehe Europäisches Pat. Nr. 0320308) kovalent verknüpft. Durch Verwenden von wiederholten Zyklen thermaler Denaturierung, Hybridisation und Ligation kann ein angereichertes, doppelsträngiges, ligiertes Oligonukleotidprodukt detektiert werden, um die Anwesenheit der Target-Nukleinsäure in einer Probe anzuzeigen.
  • Die Strangverdrängungs-Amplifikation (engl. „strand displacement amplification") (Walker et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396) verwendet Oligonukleotidprimer, die Restriktionsendonuklease-Spaltstellen enthält und mit gegenüberliegenden Strängen eines Target-Nukleinsäureduplexes auf beiden Seiten der Sequenz hybridisiert, um amplifiziert zu werden. Die DNA-Polymerase-vermittelte Primerverlängerung, die 3-Desoxynuleosidtriphosphate (dNTP) und ein einzelnes dNTP[α]S verwendet, stellt ein Duplex-Hemiphosphorthioat-Primer-Verlängerungsprodukt her, welches eher gebrochen wird als durch eine Restriktionsendonuklease zerschnitten. Dann wird das 3'-Ende des Bruchs durch eine DNA Polymerase verlängert, die gleichzeitig den nicht-Hemiphosphorthioat-Strang verdrängt. Jeder verdrängte Strang eines Sinns kann als eine Matrize für das Anbinden von Oligonukleotidprimern des entgegengesetzten Sinns dienen, was zur geometrischen Ansammlung von doppelsträngigen Nukleinsäuren führt.
  • Ein anderes Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren verwendet eine RNA-Replikase (Qβ Replikase), die im Stande ist die Sonde selber zu amplifizieren (siehe U.S. Pat. 5,112,734 von Kramer et al.).
  • Auf Transkription basierende Amplifikationssysteme verwenden eine RNA-Polymerase, um RNA-Transkripte eines Targetbereiches herzustellen (siehe U.S. Pat. Nr. 5,480,784 und 5,399,491 von Kacian et al.). Ein Verfahren genannt Transkriptions-vermittelte Amplifikation (TMA) verwendet einen Promotor-Primer, der mit einer Target-Nukleinsäure hybridisiert. In Anwesenheit einer Reversen Transkriptase wird doppelsträngige DNA ausgebildet, die einen doppelsträngigen Promotor ausbildet. Dann stellt eine RNA-Polymerase RNA-Transkripte her, die zu Matrizen für weitere Runden TMA in Anwesenheit eines zweiten Primers, der mit den RNA-Transkripten hybridisieren kann, werden. Anders als bei der PCR und anderen Verfahren, die eine Hitzedenaturierung erfordern, ist die TMA ein isothermales Amplifikationsverfahren, das eine RNAse H Aktivität verwendet, um den RNA-Strang eines RNA-DNA Hybrids zu verdauen, wodurch der DNA-Strang für die Hybridisation mit einem Primer oder Promotor-Primer zugänglich gemacht wird. Üblicherweise wird die RNAse H Aktivität durch eine Retrovirale Reverse Transkriptase, welche für die Amplifikation bereitgestellt wird, versorgt.
  • Chromosomale Translokationen und ihre Transkriptionsprodukte sind mittels Verfahren, die eine Nukleinsäureamplifikation beinhalten, detektiert worden. Ein auf PCR basierendes Verfahren zur Detektion von Zellen, die genomische DNA mit t(14q32;18q21) chromosomalen Translokationen enthalten, die mit follikulären Lymphomen und besonders mit minimalen Rest- oder Rezidiverkrankungen in Verbindung gebracht werden, durch Amplifizieren von Sequenzen, die einen Bruchpunkt-Cluster-Bereich umgeben, wurde im U.S. Pat. Nr. 5,024,934 von Lee beschrieben. PCR-Primer und cDNA Amplifikationsverfahren zum Identifizieren von t(9;11) Translokationen im Gewebe eines Patienten wurden im U.S. Pat. Nr. 5,633,135 von Croce et al. beschrieben. Verfahren zur Detektion von Krebsmetastasen (eine in 10.000 bis 100.000 Zellen), die eine PCR-Amplifikation von Target-Nukleinsäuren einschließen, wurden von Green et al. im Europäischen Patent Veröffentlichungsnr. EP 520794 beschrieben.
  • Auf ähnliche Weise ist eine PCR-Amplifikation verwendet worden, um chimärische mRNA, die mit ALL in Verbindung steht (U.S. Pat. Nr. 5,057,410 von Kawasaki et al.), und RNA Transkripte, die von einer t(8;21) Translokation in Leukämiezellen abstammen (U.S. Pat. Nr. 5,547,838 von Nisson et al.), zu detektieren. U.S. Pat. Nr. 5,057,410 offenbart PCR Verfahren zur Detektion chimärischer mRNA, die Exon-Exon Verbindungen enthält. In diesem Verfahren wird mRNA, die von der Targetzelle extrahiert wird, umgekehrt transkribiert, um cDNA herzustellen, die durch PCR amplifiziert wird, um ein doppelsträngiges DNA-Amplifikationsprodukt herzustellen. Dieses Amplifikationsprodukt wird dann denaturiert und einer der sich daraus ergebenden Stränge wird durch hybridisieren einer Oligonukleotidsonde mit der Bruchpunktverbindung detektiert. Individuelle Sonden hybridisieren an bestimmte bcr-abl Verbindungsspezies, die mit CML und ALL in Verbindung gebracht werden.
  • Sooknanan et al. (Experimental Hematol. 21:1719-1724, 1993) beschreibt ein Verfahren zur Detektion einer für CML charakteristischen bcr-abl mRNA durch Extrahieren von RNA aus FICOLLTM-fraktionierten peripheralen Blutleukozyten und Amplifizieren einer Target-Nukleinsäure mittels eines isothermalen Amplifikationsverfahrens, das eine Transkription einschließt. Fortlaufende Reaktionen, die vier Amplifikationsprimer (ein primäres Paar in der ersten Reaktion und ein ineinandergesetztes Paar in der zweiten Reaktion) verwenden, waren essentiell für die Amplifikation und Detektion. Die amplifizierte Nukleinsäure, die durch dieses Verfahren hergestellt wurde, war vom gleichen Sinn wie die original mRNA und wurde mittels zwei verschiedener bcr-abl-Verbindungssonden zum Detektieren von zwei Spleißverbindungen detektiert. Sonden für die Bruchpunktverbindungen unterschieden normale bcr und/oder abl mRNA von chimärischer bcr-abl mRNA in einer Patientenprobe.
  • Auf PCR basierende Verfahren wurden zum Detektieren anderer Translokationen, die mit Krebs oder deren Transkriptionsprodukten in Verbindung gebracht werden, verwendet. Sonden und PCR-Primer zum Detektieren von t(2;13) Translokationen, die mit dem alveolären Rhabdomyosarcom in Verbindung stehen, wurden im U.S. Pat. Nr. 5,650,278 von Barr et al. beschrieben. Eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Fusionsprotein codiert (anaplastische Lymphomkinase oder ALK), das mit t(2;5) Lymphomen in Verbindung steht, wurde im U.S. Pat. Nr. 5,529,925 von Morris et al. offenbart.
  • Es besteht im Stand der Technik weiterhin ein Bedarf für ein einfaches, empfindliches und schnelles Verfahren zur Detektion von chimärischen Nukleinsäuren, insbesondere chimärischer mRNA, die von biologischen Proben, wie zum Beispiel Blut, Mark, Plasma, Biopsiegewebe, Sputum, Urin, Fäkalien, Samenflüssigkeit oder anderen Körperflüssigkeiten erhalten wird. Bevorzugt würden solche Verfahren ein Minimum an technischer Expertise durch Laborpersonal und ein Minimum an spezieller Laborausrüstung (z.B., Zentrifugen, Temperaturwechsel und Elektrophoreseausrüstung) erfordern und würden relativ preiswerte Reagenzien verwenden. Darüber hinaus besteht ein Bedarf für ein Assay zum Detektieren chimärischer mRNA, das ein Ergebnis bereitstellen würde, das mit einem Minimum an Qualifikation durch, zum Beispiel, Verringern der Möglichkeiten von falsch positiven und falsch negativen Ergebnissen interpretiert werden kann.
  • Im Stand der Technik wird ebenso ein einfaches und schnelles Verfahren für das Zubereiten cytoplasmatischer Nukleinsäuren, insbesondere mRNA, für die Verwendung als potentielles Target in diagnostischen Nukleinsäurehybridisationsassays oder als Matrize für eine Nukleinsäureamplifikation benötigt. Derart vereinfachte präparative Verfahren verringern die Notwendigkeit von vollständigen Extraktions- und Reinigungsverfahren.
  • Ein kritisches Element von Verfahren zur Detektion von RNA (oder daraus hergestellten Amplifikationsprodukten), insbesondere mRNA, ist die Art und Weise mit der RNA aus den Zellen extrahiert wird. Wegen der ubiquitären Anwesenheit von zahlreichen RNasen müssen die Extraktionsverfahren die geringe Menge an Target-RNA, die in einer Probe vorhanden sein könnte, erhalten. Extraktionsverfahren, die alle Nukleinsäuren (kernständige Nukleinsäuren mit eingeschlossen) aus der Targetzelle freisetzten, erzeugen Proben, die nicht nur die Target-mRNA aber auch die sie kodierende DNA enthalten, was falsch positive Ergebnisse in vielen auf Nukleinsäure basierenden Assays erzeugt.
  • Bekannte Extraktionstechniken verwenden im Allgemeinen ein chaotropisches Agens, wie zum Beispiel Guanidinium, um die Zellen zu lysieren. Die weitere Verarbeitung schließt üblicherweise das mechanische Scheren der DNA, eine Phenol- und Chloroformextraktion und eine Ethanol oder LiCl Präzipitation der RNA aus dem Guanidinium ein. Zusätzliche Verfahren der mRNA Zubereitung verwenden oligo-dT (d.h. Polythymin), das an Resten immobilisiert ist, um Poly-A mRNA zu immobilisieren.
  • Es wäre in diagnostischen Verfahren, die gereifte cytoplasmatische RNA detektieren, von Vorteil wenn man Zellen permeabilisieren könnte, um gereifte RNA-Arten in den Extraktionspuffer freizusetzen, während kernständiges Material zusehends nicht freigesetzt wird. Dadurch würden DNA und ungereifte kernständige RNA-Arten nicht mit der gewünschten Target-Nukleinsäure vermengt werden. Durch das Ausschließen von anfänglichem Vermischen der gewünschten RNA-Arten und Kontaminanten, welche die gleichen oder komplementäre Sequenzen enthalten und/oder die Viskosität erhöhen, können zusätzliche Schritte, die zum Eliminieren chromosomaler DNA und sich daraus ergebender falsch positiver Ergebnisse erforderlich sind, verhindert werden. Ein schnelles, einfaches Lyseverfahren, das cytoplasmatische RNA-Arten freisetzten wird, während Prä-mRNA oder DNA nicht signifikant freigesetzt werden, und das kein hohes Niveau an spezialisierten Fertigkeiten oder Schulung erfordert, ist für die Verwendung in kommerziellen Assays und Kits wünschenswert. Es besteht ein Bedarf für ein schnelles, einfaches Lyseverfahren, das RNA liefert, die für eine qualitative und/oder quantitative Nukleinsäureamplifikation oder eine direkte Detektion von spezifischen Nukleinsäuren geeignet ist.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung ist auf Assayverfahren zur Detektion von Fusionsnukleinsäuren, insbesondere chimärischen mRNA-Arten, in einer biologischen Probe gerichtet.
  • Gemäß eines Aspektes der Erfindung wird ein Verfahren zur Detektion einer Fusionsnukleinsäure in einer Probe bereitgestellt, das die Schritte zum Bereitstellen einer Probe, die eine erste einzelsträngige Fusionsnukleinsäure enthält, die eine bcr-abl-Spleißverbindungsstelle einschließt; in Kontakt bringen der ersten einzelsträngigen Fusionsnukleinsäure, eines ersten Promotor-Primers, der spezifisch mit der Fusionsnukleinsäure an einer ersten Primer-Bindungsstelle hybridisiert, die 3' zur Spleißverbindungsstelle und in einer abl-Sequenz angeordnet ist, und zumindest eine Nukleinsäure-Polymeraseaktivität unter Nukleinsäureamplifizierungsbedingungen einschließt. Dann schließt das Verfahren das Amplifizieren der Fusionsnukleinsäure in einer Reaktion zur Nukleinsäureamplifizierung unter Verwendung des ersten Primers zur Herstellung einer Vielzahl von zweiten Nukleinsäuresträngen, die zumindest mit einem Abschnitt der ersten einzelsträngigen Fusionsnukleinsäure, welche die Spleißverbindungsstelle enthält, komplementär sind, ein. Jeder zweite Nukleinsäurestrang schließt eine komplementäre Spleißverbindungsstelle, eine erste Sonden-Bindungsstelle in einer bcr-Sequenz, die 3' angeordnet ist und sie nicht mit der komplementären Spleißverbindungsstelle überlappt, und eine zweite Sonden-Bindungsstelle in einer abl-Sequenz, die 5' angeordnet ist und die nicht mit der komplementären Spleißverbindungsstelle überlappt, wobei die zweite Sonden-Bindungsstelle überlappt oder 3' zur Sequenz angeordnet ist, die komplementär zur ersten Primer-Bindungsstelle ist, ein. Das Verfahren schließt dann die Schritte des Hybridisierens des zweiten Nukleinsäurestranges unter Hybridisierungsbedingungen mit einer Oligonukleotidsonde, die spezifisch mit der ersten oder zweiten Sonden-Bindungsstelle hybridisiert, wodurch ein Sonden:Target-Hybrid ausgebildet wird, und das Detektieren des Sonden:Target-Hybrids in einem homogenen Assayformat als ein Nachweis der Anwesenheit der Fusionsnukleinsäure in der Probe, ein. In einer Ausführungsform des Verfahrens ist die erste einzelsträngige Fusionsnukleinsäure eine mRNA, die Polymeraseaktivität ist eine RNA-Polymeraseaktivität und die Oligonukleotidsonde weist den gleichen Sinn auf, wie die mRNA und hybridisiert spezifisch mit der ersten Sonden-Bindungsstelle. In einer anderen Ausführungsform des Verfahrens ist die erste einzelsträngige Fusionsnukleinsäure eine mRNA, die zweiten Nukleinsäurestränge bestehen aus komplementärer RNA und der Amplifizierungsschritt schließt weiter das in-Kontakt-bringen der zweiten Nukleinsäurestränge mit einem zweiten Primer oder Promotor-Primer, der spezifisch mit einer zweiten Primer-Bindungsstelle in einer bcr-Sequenz, die 3' sowohl zur komplementären Spleißverbindungs- als auch zur ersten Sonden-Bindungsstelle angeordnet ist, hybridisiert, ein und verwendet beim synthetisieren von Amplifizierungsprodukten eine RNA-Polymeraseaktivität, eine DNA-gerichtete DNA-Polymeraseaktivität und eine RNA-gerichtete DNA-Polymeraseaktivität. In einer Ausführungsform hybridisiert die Oligonukleotidsonde spezifisch mit der zweiten Sonden-Bindungsstelle und ist nicht in der Lage, einen stabilen Hybridisierungskomplex mit der ersten einzelsträngigen Fusionsnukleinsäure auszubilden. Das Verfahren kann in einem ersten Schritt auch das Zubereiten cytoplasmatischer RNA aus eukaryotischen Zellen in der Probe durch in-Kontakt-bringen einer biologischen Probe, welche die Fusionsnukleinsäure mit einer Lösung, die den Puffer mit einem pH in einem Bereich von etwa 6,5 bis etwa 8,5, ein lösliches Salz mit einer Ionenstärke im Bereich von etwa 150 mM bis etwa 1M, ein chelatbildendes Agens mit einer Konzentration von etwa 5 mM und ein nicht-ionisches Detergens im Bereich von etwa 0,5% bis etwa 1,5% (v/v) enthält, wobei RNA aus in der Probe vorhandenen Zellen freigesetzt wird, umfassen. Der Schritt des Zubereitens der Probe kann weiterhin die Schritte des in-Kontakt-bringens der Probe mit einem Trägermaterial, das mit einem immobilisierten Oligonukleotid, das eine Nukleotidbasensequenz einschließt, die unter Hybridisierungsbedingungen direkt oder indirekt einen stabilen Hybridisationskomplex mit einer einzelsträngigen in der Probe vorhandenen Fusionsnukleinsäure ausbildet, verbunden ist, und das Abtrennen des mit dem Trägermaterial verbundenen Hybridisationskomplexes von anderen Probenbestandteilen, einschließen. In bevorzugten Ausführungsformen ist die gereinigte Fusionsnukleinsäure eine mRNA und die Nukleotidbasensequenz des immobilisierten Oligonukleotids schließt eine Poly-T Sequenz ein. In einer anderen Ausführungsform des Verfahrens ist die Fusionsnukleinsäure ein Fusions-mRNA-Transkript, das aus einer genetischen t(9;22) Translokation, die zwei chromosomale Bereiche der Chromosoms 9 und Chromosoms 22 an einer Spleißverbindungsstelle miteinander verbindet, hergestellt worden ist; beim Schritt des In-Kontakt-Bringens hybridisiert der erste Promotor-Primer spezifisch mit dem Fusions-mRNA-Transkript an einer ersten Primer-Bindungsstelle, die von einem ersten chromosomalen Bereich in einer abl-Sequenz, die 3' zur Spleißverbindungsstelle angeordnet ist, abgeleitet ist; und im Amplifizierungsschritt leitet sich die erste Sonden-Bindungsstelle von einem zweiten chromosomalen Bereich in einer bcr-Sequenz ab und die zweite Sonden-Bindungsstelle leitet sich von einem dritten chromosomalen Bereich in einer abl-Sequenz ab, die überlappt oder 3' zu einer Sequenz angeordnet ist, die zur ersten Primer-Bindungsstelle komplementär ist; und im Hybridisierungsschritt hybrisiert die Oligonukleotidsonde mit den zweiten Nukleinsäuresträngen an der ersten oder zweiten Sonden-Bindungsstelle, ist jedoch nicht in der Lage mit dem Fusions-mRNA-Transkript zu hybridisieren. In einer Ausführungsform zum Detektieren von Fusions-mRNA-Transkripten wird im Amplifizierungsschritt ein erster Primer, der ein Promotor-Primer ist, und ein Enzym mit einer RNA-Polymeraseaktivität verwendet und im Hybridisierungsschritt wird eine Oligonukleotidsonde, die spezifisch mit der ersten Sonden-Bindungsstelle hybridisiert, verwendet. In einer anderen Ausführungsform schließt der Amplifizierungsschritt einen zweiten Primer oder Promotor-Primer ein, der unter Amplifikationsbedingungen spezifisch mit einer Nukleotidsequenz einer mRNA hybridisiert, die komplementär zum Fusions-RNA-Transkript ist und eine RNA-Polymeraseaktivität, eine DNA-gerichtete DNA-Polymeraseaktivität, und eine RNA-gerichtete DNA-Polymeraseaktitvtät und eine RNA-gerichtete DNA-Polymeraseaktivität verwendet. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die RNA-gerichtete DNA-Polymeraseaktivität und die DNA-gerichtete DNA-Polymeraseaktivität durch eine Reverse Transkriptase zur Verfügung gestellt. Das Verfahren kann ebenso die Detektion eines internen Kontroll-Transkripts einschließen, in dem der Amplifizierungsschritt weiter das Amplifizieren eines internen Kontroll-Transkripts durch Verwendung des ersten Promotor-Primers, der ebenso spezifisch mit dem internen Kontroll-Transkript hybridisiert, einschleißt, dann schließt der Hybridisierungsschritt weiter eine zweite Oligonukleotidsonde, die spezifisch mit einer Sequenz hybridisiert, die komplementär zum internen Kontroll-Transkript ist, ein, wodurch ein interner Kontroll-Hybridisationskomplex ausgebildet wird, und der Detektionsschritt schließt weiter das Detektieren des internen Kontroll-Hybridisationskomplexes ein. Im Allgemeinen werden die ersten und zweiten Sonden-Bindungsstellen von unterschiedlichen Bereichen eines Chromosoms abgeleitet, oder die erste Sonden-Bindungsstelle wird von einem ersten Chromosom abgeleitet und die zweite Sonden-Bindungsstelle wird von einen zweiten Chromosom abgeleitet. Zum Beispiel kann ein Fusions-mRNA-Transkript das Ergebnis einer Translokation von menschlichen Chromosomen sein, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die besteht aus: t(1;19), t(2;5), t(2;13), t(4;11), t(6;9), t(8;21), t(9;11), t(9;22), t(11;14), t(11;19), t(11;22), t(12;21), t(14;18) und t(15;17). Gemäß der vorliegenden Erfindung ist das Fusions-mRNA-Transkript ein Ergebnis einer t(9;22) Translokation und die Oligonukleotidsonde schließt eine von bcr abgeleitete Sequenz oder eine von abl abgeleitete Sequenz ein. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform bindet die Oligonukleotidsonde spezifisch an eine von bcr abgeleitete Nukleotidbasensequenz in den zweiten Nukleinsäuresträngen. Die Erfindung schließt ebenso ein oder mehrere Oligonukleotide für die Verwendung im Verfahren zur Detektion eines Fusions-mRNA-Transkripts mit einer Sequenz, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus SEQ ID NO:9 bis SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:26 und SEQ ID NO:27 besteht, ein. Bevorzugt hat der zweite Primer für die Verwendung im Verfahren zur Detektion einer Fusionsnukleinsäure in einer Probe die Sequenz der SEQ ID NO:5. Darüber hinaus wird bevorzugt, dass das zweite Oligonukleotid für die Verwendung im Verfahren zur Detektion einer Fusionsnukleinsäure in einer Probe die Sequenz der SEQ ID NO:16 hat.
  • Die vorliegende Erfindung schließt in einer bevorzugten Ausführungsform im Bereitstellungsschritt des Verfahrens zum Detektieren einer Fusionsnukleinsäure in einer Probe weiter ein Verfahren zum Zubereiten von RNA aus einer Probe ein, das die Schritte des Bereitstellens einer Probe, die ungereinigte RNA enthält, Vermengen der Probe mit einer Lösung, die einen Puffer mit einem pH im Bereich von etwa 6,5 bis etwa 8,5 enthält, ein lösliches Salz mit einer Ionenstärke von mindestens etwa 150 mM, ein nichtionisches Detergens in einer wirksamen Menge, die ausreichend ist, um cytoplasmatische RNA aus einer Zelle freizusetzen, ohne eine erhöhte Viskosität in der Probe aufgrund des Freisetzens von chromosomaler DNA aus der Zelle zu verursachen und ein Trägermaterial, das mit einem immobilisierten Oligonukleotid verbunden ist, dass eine Nukleotidbasensequenz enthält, die direkt oder indirekt mit in der Probe vorhandener RNA hybridisiert, wobei unter Hybridisierungsbedingungen ein stabiler Hybridisationskomplex hergestellt wird, einschließt. Dann schließt das Verfahren die Schritte des Abtrennens des mit dem Trägermaterial verbundenen Hybridisationskomplexes von anderen Probenbestandteilen, das Waschen des mit dem Trägermaterial verbundenen Hybridisationskomplexes mit einer Waschlösung, die eine ausreichende Ionenstärke aufweist, damit der Hybridisationskomplex mit dem Trägermaterial verbunden bleibt, und wiedergewinnen des mit dem Trägermaterial verbundenen Hybridisationskomplexes aus der Waschlösung, ein. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Probe unkoaguliertes Blut, Plasma, oder Knochenmark oder eine Suspension von eukaryotischen Zellen. In anderen Ausführungsformen liegt die wirksame Menge des nichtionischen Detergens zwischen etwa 0,5% bis etwa 1,5% (v/v).
  • Die Erfindung wird mit bevorzugten Ausführungsformen, die in den Figuren und Beispielen dargestellt werden, in der detaillierten Beschreibung im Folgenden noch ausführlicher beschrieben.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1A ist eine schematische Darstellung der Detektion eines Fusionstranskriptes, das aus einer Translokation zwischen dem bcr b3 Bereich und dem abl-Gen mittels eines T7-abl Promotor-Primers („T7-abl Primer") mit entgegengesetztem Sinn zur Target-Nukleinsäure und einem Primer, der im wesentlichen identisch mit einer Sequenz im bcr b2 Bereich („CML-1") ist, für die Amplifikation und einer Sonde, die im wesentlichen identisch mit einer Sequenz innerhalb von bcr b2 („b2-Sonde") ist, hergestellt worden ist. Der dunkle Abschnitt des Balkens zur Linken der vertikalen Linie stellt die bcr b2-Sequenz dar, der dunkle Abschnitt zur Rechten der vertikalen Linie stellt die bcr b3-Sequenz dar, und der helle Abschnitt stellt die abl-Sequenz dar.
  • 1B ist eine schematische Darstellung der Detektion eines Fusionstranskripts, das aus einer Translokation zwischen dem bcr b2-Abschnitt und dem abl-1-Gen mittels der gleichen Kombination von Primern und Sonde wie in 1A hergestellt worden ist; der dunkle Abschnitt des Balkens stellt die bcr b2-Sequenz dar und der helle Abschnitt stellt die abl-Sequenz dar.
  • 1C ist eine schematische Darstellung der Detektion der normalen abl-mRNA mittels eines T7-abl Promotor-Primers („T7-abl Primer") mit entgegengesetzten Sinn zur Target-Nukleinsäure und einem „abl-1" Primer des gleichen Sinns wie die Target-Nukleinsäure und einer „abl-Sonde" die im wesentlichen identisch zu einer abl-Targetsequenz ist, die hier an einem Ort dargestellt wird, der eine potentielle Bruchpunktverbindung (dargestellt als vertikale Linie im Balken) in der abl-Sequenz überlappt.
  • 2 zeigt die 5' bis 3' DNA-Basensequenz des Bereichs, der die bcr-abl-Spleißverbindung umgibt, wie schematisch in 1A dargestellt, wobei der unterstrichene Bereich (Reste 1 bis 126) die bcr b2-Seugenz darstellt, welche die Sequenz, die komplementär zu einer Primer-Bindungsstelle (fettgedruckte Reste 65 bis 88) ist, und die Sequenz, die komplementär zur b2-Sonden-Bindungsstelle (fettgedruckt und kursiv geschriebene Reste 89 bis 113) ist, enthält. Der doppelt unterstrichene Bereich (Reste 127 bis 201) stellen die bcr b3-Sequenz dar, die Spleißverbindung tritt zwischen den Basen 201 und 202 auf und die verbleibende Sequenz ist der A2 Bereich von abl, der die abl Primer-Bindungsstelle (fettgedruckt) enthält.
  • 3 zeigt die 5' bis 3' DNA-Basensequenz des Bereichs, der eine potentielle Spleißverbindung in einem normalen abl-Transkript umgibt, wobei: Reste 1 bis 151 eine abl-1b-Exonsequenz darstellen, die einen Bereich enthält, der komplementär mit einer abl Primer-Bindungsstelle (Reste 84-103, fettgedruckt) ist; der doppelt unterstrichene Bereich (Reste 102 bis 119) ist das Komplement einer abl-spezifischen Sonden-Bindungsstelle, welche die Spleißverbindung von abl-b1 und abl-b2 flankiert; der unterstrichene Bereich (Reste 142 bis 165) ist das Komplement einer zweiten Sonden-Bindungsstelle, die potentielle Spleißverbindungen überlappt; und die Reste 175 bis 201 (fettgedruckt) stellen eine normale abl-Sequenz dar, die eine andere Primer-Bindungsstelle enthält.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • In einer bevorzugten Ausführungsform schließt die vorliegende Erfindung im Bereitstellungsschritt im Verfahren zur Detektion einer Fusionsnukleinsäure in einer Probe eine Verfahren für die Zubereitung von RNA-Proben, die von biologischen Proben, wie zum Beispiel Körperflüssigkeiten, Gewebe oder eukaryotischen Zellen abgeleitet werden, ein. Das relativ einfache Verfahren der RNA-Zubereitung stellt RNA bereit, die für Analysen und zur Detektion von mRNA-Arten, die in relativ geringen Mengen in biologischen Proben auftreten, geeignet ist. Die vorliegende Erfindung schließt ebenso Verfahren zur Detektion von chimärischen RNA-Arten, insbesondere mRNA-Arten, die in relativ geringen Mengen in aus biologischen Quellen zubereiteten RNA-Proben auftreten, ein. Diese Verfahren, die in der Humanmedizin und im veterinären Bereich verwendbar sind, sind für medizinische Diagnosen und klinische Überwachung der Reaktion eines Patienten auf eine Therapie, in der eine Erkrankung oder ein medizinischer Zustand mit einer bestimmten Art und/oder Niveau einer in einer biologischen Probe vorhandenen mRNA in Verbindung steht, verwendbar.
  • Zusätzlich zu den anderswo bereitgestellten Definitionen in der Beschreibung haben die folgenden Begriffe die folgende Bedeutung, falls nicht anders angegeben. Andere hier verwendete wissenschaftliche und technische Begriffe haben die gleiche Bedeutung wie sie sie für gewöhnlich auch für den entsprechenden Durchschnittsfachmann haben. Allgemeine Definitionen von vielen hier verwendeten Begriffen werden zum Beispiel im Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2. Ausgabe (Singleton et al., 1994, John Wiley & Sons, New York, NY), The Harper Collins Dictionary of Biology (Hale & Marham, 1991, Harper Perennial, New York, NY) und Dorland's Illustrated Medical Dictionary, 27. Ausgabe (W.A. Dorland, 1988, W.B. Saunders Co., Philadelphia, PA) bereitgestellt.
  • Mit „Nukleotidsequenz" ist die Sequenz von Stickstoffbasen entlang eines linearen Informationen-enthaltenden Moleküls gemeint, das zur Wasserstoffbrückenbindung mit einer DNA oder RNA, die eine komplementäre Basensequenz aufweist, in der Lage ist. Der Begriff soll nicht diese Informationen-enthaltenden Molekülen auf Polymere von Nukleotiden begrenzen, er schließt jedoch ebenso Moleküle ein, die ein oder mehrere Nukleotidanaloga enthalten. Zum Beispiel können Analoga Untereinheiten enthalten, die einen Zuckerrest oder Substituenten mit Ausnahme von Ribose oder Desoxyribiose (z.B., 2'Halogenid- oder Methoxy-substituierte Pentosezucker) und/oder bekannte Verknüpfungen mit Ausnahme von Phosphordiesterverknüpfungen (z.B., Phosphorthioat, Methylphosphonat und Peptidverknüpfungen) enthalten. Ein Wasserstoff-gebundener Nukleinsäureduplex enthält zwei komplementäre Nukleinsäurestränge. Man sagt, dass diese verwandten Stränge von entgegengesetztem „Sinn" sind weil die Nukleotidsequenz von beiden der zwei perfekt komplementären Stränge automatisch die Nukleotidsequenz des anderen Stranges diktiert, auch wenn die Nukleotidsequenz jedes Stranges sich von dem anderen unterscheidet. Für gewöhnlich wird ein Strang willkürlich als der (+)Strang bezeichnet und der andere verwandte Strang wird als der (-)Strang bezeichnet.
  • Mit „Oligonukleotid" ist eine Polymerkette von mindestens zwei, für gewöhnlich zwischen etwa 5 und etwa 100 chemischen Untereinheiten gemeint, wobei jede Untereinheit einen Nukleotidbasenrest, einen Zuckerrest und Verknüpfungsrest, der die Untereinheiten in einer linearen räumlichen Konfiguration verbindet, umfasst. Bekannte Nukleotidbasenreste sind Guanin (G), Adenin (A), Cytosin (C), Thymin (T) und Uracil (U), auch andere seltene oder modifizierte Nukleotidbasen, die zur Wasserstoffbrückenbindung in der Lage sind, sind dem Durchschnittsfachmann gut bekannt. Bekannte Zuckerreste sind Ribose und Desoxyribose, auch 2'-O-Methylribose, halogenierte Zucker und andere modifizierte und unterschiedliche Zucker sind im Stand der Technik bekannt. Für gewöhnlich ist die Verknüpfungsgruppe ein Rest der Phosphor enthält, am häufigsten eine Phosphordiesterverknüpfung, auch andere Verknüpfungen, wie zum Beispiel Phosphorthioat, Methylphosphonat und Verknüpfungen die kein Phosphor enthalten, wie zum Beispiel Peptid ähnliche Verknüpfungen, sind im Stand der Technik bekannt wie es auch Oligonukleotide sind, die solche Verknüpfungen („Peptidnukleinsäuren" oder PNA) umfassen. PNA werden von dieser Definition eines Oligonukleotids umfasst. Nukleotidbasenreste können ebenso modifiziert sein, z.B., durch die Addition von Propingruppen, solange wie die modifizierten Basenreste die Fähigkeit behalten eine nicht-kovalente Verbindung mit G, A, C, T oder U auszubilden und ein Oligonukleotid, das mindestens einen modifizierten Nukleotidbasenrest umfasst, nicht-sterisch von der Hybridisierung mit einer einzelsträngigen Nukleinsäure abgehalten wird. Ein Oligonukleotid hat eine Sequenz von Nukleotidbasenresten, die Informationen bereitstellen, welche es dem Oligonukleotid ermöglichen, mit einem komplementären Nukleinsäurestrang zu hybridisieren.
  • Mit „Nukleinsäureamplifikationsbedingungen" sind Umweltbedingungen gemeint, welche die Salzkonzentration, die Temperatur (Temperaturkonstant und Temperaturwechsel eingeschlossen), mindestens eine Nukleinsäurepolymerase, Nukleosidtriphophate und Cofaktoren, die eine Amplifikation einer Target-Nukleinsäure unter Verwendung eines gegebenen Nukleinsäureamplifikationsverfahrens ermöglichen, einschließt. Ein Amplifikationsprodukt wird auch als „Amplicon" bezeichnet.
  • Mit „Primer" ist ein Oligonukleotid gemeint, das an einen Bereich einer Target-Nukleinsäure (d.h., der „Target-Bindebereich" oder die „Target-Bindungsstelle" des Primers) bindet und die Nukleinsäureamplifikation der Target-Nukleinsäure fördert. Für gewöhnlich hat ein Primer ein 3' Ende, das durch eine Nukleinsäurepolymerase verlängert wird. Ein Promotorprimer ist ein Oligonukleotid, das eine Promotorsequenz einschließt, die 5' zum Target-Bindungsbereich angeordnet ist. Unter bestimmten Umständen kann das 3' Ende eines Promotorprimers oder eine Subpopulation von Promotorprimern modifiziert werden, um die Primerverlängerung zu blockieren oder zu verringern.
  • Mit „Targetsequenz" ist die Nukleotidbasensequenz eines Nukleinsäurestranges (RNA oder DNA) gemeint, wobei zumindest ein Abschnitt davon mittels einer markierten Sonde, die an ihrer 3' Seite durch eine Primer-Bindungsstelle gebunden ist, detektiert werden kann, oder die genau komplementäre RNA oder DNA Basensequenz.
  • Mit „RNA Äquivalent" ist eine RNA mit der gleichen Nukleotidbasensequenz wie eine DNA gemeint, mit der Ausnahme, dass U durch T ersetzt ist.
  • Ein „Trägermaterial" ist ein im Wesentlichen unlösliches Material unter den gegebenen Lösungsmittel und Temperaturbedingungen, die chemische Gruppen umfassen, die sich mit einem Oligonukleotid oder einer Nukleinsäure verbinden. Insbesondere ist ein Trägermaterial bevorzugt, das kovalent an ein Oligonukleotid gekoppelt ist, das direkt oder indirekt eine Target-Nukleinsäure bindet. Wenn die Target-Nukleinsäure eine mRNA ist, umfasst das gekoppelte Oligonukleotid bevorzugt eine poly-T-Nukleotidbasensequenz. Das Trägermaterial ist bevorzugt ein Partikel (z.B., Partikel oder Kugel) im Mikrometer oder Submikrometer Größenbereich. Ein Trägermaterial kann aus einem oder mehreren der folgenden Materialien hergestellt worden sein: Siliciumdioxid, Polyacrylat, Polyacrylamid, ein Metall, Polystyren, Latex, Nitrocellulose, Polypropylen und Nylon und wird bevorzugt durch ein magnetisches Feld (z.B., durch Enthalten eines Kerns aus Magnetit) angezogen.
  • Mit „Nukleotidsequenz" ist die lineare Sequenz von stickstoffhaltigen Basen in einem Informationen-enthaltenden Molekül gemeint, das über Wasserstoffbrückenbindung mit einer DNA oder RNA, die eine komplementäre Basensequenz aufweist, bindet. Der Begriff ist nicht auf solche Informationen-enthaltenden Molekülen wie Polymere von Nukleotiden begrenzt, schließt jedoch Moleküle ein, die ein oder mehrere Nukleotidanaloga enthalten. Zum Beispiel können Analoga Untereinheiten enthalten, die einen Zuckerrest oder Substituenten mit Ausnahme von Ribose oder Desoxyribiose (z.B., 2'Halogenid- oder Methoxy-substituierte Pentosezucker) und/oder bekannte Verknüpfungen mit Ausnahme von Phosphordiesterverknüpfungen (z.B., Phosphorthioat, Methylphosphonat und Peptidverknüpfungen) enthalten.
  • Mit „Spleißverbindungssonde" ist gemeint, dass die Sonde eine Sequenz enthält, die ausreichend komplementär ist, um mit Sequenzen auf den 5' und 3' Seiten eines Spleißpunktes zu hybridisieren. In ähnlicher Weise enthält eine „Bruchpunkt-Verbindungssonde" eine Sequenz, die ausreichend komplementär ist, um mit Sequenzen auf den 5' und 3' Seiten einer chimärischen Nukleinsäure zu hybridisieren. Das heißt, das die Sonden-Bindungsstelle einer Spleißverbindungssonde oder Bruchpunkt-Verbindungssonde die Verbindung überspannt, die Sequenzen zusammen bringt, die normalerweise nicht zusammenhängend sind.
  • Mit „Spleißverbindungsstelle" ist die Position in der Nukleotidbasensequenz einer Nukleinsäure oder eines Oligonukleotids (oder seines komplementären Stranges) gemeint, an der die Sequenz, die 5' zur Spleißstelle auf einem Strang der Nukleinsäure angeordnet ist, von einem ersten Nukleinsäurebereich abgeleitet ist, und die Sequenz, die 3' zur Spleißstelle (im Bezug auf den gleichen Strang) angeordnet ist, von einem zweiten Nukleinsäurebereich abgeleitet ist, wobei die ersten und zweiten Bereiche normalerweise nicht zusammenhängend sind.
  • Mit einer „Fusions-" oder „chimärischen-" Nukleinsäure ist eine Nukleinsäure oder ein Oligonukleotid gemeint, das benachbarte oder zusammenhängende Sequenzen enthält, die von einem ersten und einem zweiten Nukleinsäurebereich abgeleitet werden, wobei die ersten und zweiten Bereiche normalerweise nicht benachbart oder zusammenhängend in der zellulären DNA vorliegen. Im Allgemeinen wird chimärische Nukleinsäure in Nukleinsäure von abnormalen Zellen gefunden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform schließt die vorliegende Erfindung im Bereitstellungsschritt im Verfahren zur Detektion einer Fusionsnukleinsäure in einer Probe eine vereinfachtes und schnelles Verfahren für die Zubereitung von RNA aus einer biologischen Probe, insbesondere aus dem Cytoplasma von eukaryotischen Zellen, die für die Verwendung in einem Amplifikations- und Detektionsassay geeignet sind, ein. Dieses Verfahren kann ebenso verwendet werden, um virale RNA aus einer biologischen Probe (z.B., Plasma) zuzubereiten. Dieses Verfahren erfordert keine übermäßige Extraktion, das Scheren von chromosomaler DNA, um die Viskosität zu reduzieren, oder die Verwendung von potentiell schädlichen Reagenzien (z.B., Phenol oder Chloroform) um RNA zuzubereiten. Darüber hinaus minimiert das Verfahren die Proben Zubereitungsschritte, wodurch der Probenverlust und die Variabilität während der Zubereitung verringert wird. Diese erhöhte Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit bei der RNA-Zubereitung ist insbesondere für Assays verwendbar, die RNA-Arten mit geringen vorkommen, wie zum Beispiel Fusions- oder chimärische RNA-Arten detektieren. Die Erfindung schließt ebenso eine Verfahren zur Detektion oder Quantifizierung von Fusions- oder chimärischen RNA-Arten ein. Dieses Verfahren schließt einen anfänglichen Schritt des In-Kontakt-Bringens unter Nukleinsäureamplifikationsbedingungen ein: (1) eine erste einzelsträngige Fusionsnukleinsäure, die eine Spleißverbindungsstelle einschließt, (2) einen ersten Promotor-Primer, der mit der Fusionsnukleinsäure an einer Primer-Bindungsstelle, die 3' zur Spleißverbindungsstelle angeordnet ist, hybridisieren kann, und (3) mindestens eine Nukleinsäurepolymeraseaktivität. Dann fährt das Verfahren mit dem Amplifizieren der Fusionsnukleinsäure in einer Nukleinsäureamplifikationsreaktion fort, wobei mehrere zweite Nukleinsäurestränge hergestellt werden, von denen jeder einen Bereich einschließt, der mit einem Bereich der anfänglichen einzelsträngigen Fusionsnukleinsäure, welche die Spleißverbindungsstelle, eine erste Sonden-Bindungsstelle in einer bcr-Sequenz, die 3' angeordnet und die Spleißverbindungsstelle nicht überlappt, und eine zweite Sonden-Bindungsstelle in einer abl-Sequenz, die 5' angeordnet und die Spleißverbindungsstelle nicht überlappt, einschließt, komplementär ist.
  • Die zweite Sonden-Bindungsstelle kann überlappen oder an der 3' Seite der ersten Primer-Bidungsstelle angeordnet sein. Dann schließt das Verfahren das Hybridisieren des komplementären zweiten Nukleinsäurestranges unter Hybridisationsbedingungen mit einer Oligonukleotidsonde, die mit der ersten oder zweiten Sonden-Bindungsstelle hybridisieren kann, wobei ein Sonden-Targethybrid ausgebildet wird (d.h., ein Hybridisationskomplex, der durch komplementäre Basenpaarung zwischen der Basensequenz der Sonde und der Basensequenz des Targets ausgebildet wird) ein. Das Sonden:Target-Hybrid wird in einem homogenen Assayformat als ein Hinweis auf die Anwesenheit der Fusionsnukleinsäure in der Probe, aus der die einzelsträngige Fusionsnukleinsäure erhalten worden ist, angesehen, detektiert. Wenn die Fusionsnukleinsäure in diesem Verfahren eine RNA ist, ist die Oligonukleotidsonde vom gleichen Sinn wie die einzelsträngige Fusionsnukleinsäure. Wenn nur ein Primer (oder Promotor-Primer) im Amplifizierungsschritt verwendet wird, dann zielt die Sonde auf die erste Sonden-Bindungsstelle.
  • Es ist wichtig darauf hinzuweisen, dass dieses Verfahren keine verschachtelten Primer (engl. nested primer) verwendet oder fortlaufende Amplifikationsreaktionen erfordert. Bevorzugt verwendet das Verfahren ein Transkriptionsvermitteltes Amplifikationssystem, das zuvor detailliert in U.S. Pat. Nr. 5,480,784, 5,399,491 und 5,554,516 von Kacian et al. beschrieben worden ist. In einer Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens werden zwei Oligonukleotide in dem Amplifikationsverfahren verwendet: ein Promotor-Primer mit entgegengesetztem Sinn zu der zu detektierenden Fusions-RNA und ein Primer des gleichen Sinns wie die Fusions-RNA in einer Anordnung 5' zu beiden der Bindungsstelle des Promotor-Primers und der Spleißverbindung.
  • Ein „Promotor-Primer" ist, wie hier verwendet, ein Oligonukleotid, das mindestens zwei unterschiedliche Nukleotidbasensequenzen enthält. Die erste Sequenz ist die Primersequenz, die mit einer Bindungsstelle der Fusions-RNA in einer Anordnung 3' zur Spleißverbindung hybridisiert. Die zweite Sequenz ist eine Promotorsequenz, die 5' zur Primersequenz angeordnet ist, die eine bevorzugte Bindungsstelle für eine RNA-Polymerase bereitstellt, um die Transkription zu beginnen wenn die Promotorsequenz doppelsträngig ist. Daher ermöglicht die Promotorsequenz eine Transkription der Nukleotidbasensequenz, an die der Promotor-Primer hybridisiert ist (d.h., RNA-Synthese mittels der chimärischen RNA als Matrize). Ein Beispiel für einen Promotor-Primer ist die SEQ ID NO:1 in denen die Reste 1 bis 27 eine funktionelle T7-Promotorsequenz bereitstellen, wenn sie doppelsträngig gemacht wurden, und die Reste 28 bis 54 stellen eine Primersequenz zur Verfügung, die an eine komplementäre Nukleinsäurebasensequenz bindet.
  • In einer anderen Ausführungsform verwendet das Assay ein einzelnes Amplifikationsoligonukleotid, das ein Promotor-Primer ist. Wenn ein einzelner Promotor-Primer mit keinem Primer von entgegengesetztem Sinn eingesetzt wird, wird die chimärische DNA mittels einer Sonde des gleichen Sinns wie die chimärische RNA detektiert, die mit einem Nukleotidbasensequenzbereich, der 3' zur Spleißverbindungsstelle auf der amplifizierten komplementären Nukleinsäure angeordnet ist, hybridisiert. Auf diese Art und Weise wird nur die amplifizierte chimärische RNA detektiert. Nukleinsäureamplifikationsverfahren, die einen einzelnen Promotor-Primer einsetzen, wurden detailliert in U.S. Pat. Nr. 5,554,516 von Kacian et al. beschrieben.
  • Bevorzugt sind die Primer (Promotor-Primer eingeschlossen) und Sonden gegen Bereiche gerichtet, die normalerweise innerhalb der chromosomalen DNA unterbrochen vorliegen. Zum Beispiel umfassen in einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens die Bereiche Nukleotidbasensequenzen, die normalerweise auf unterschiedlichen Chromosomen vorhanden sind. Desgleichen sind zum Detektieren von Nukleinsäuren, die sowohl von viral (d.h., Provirus) als auch von eukaryotischen Nukleinsäuren abgeleitete Bereiche umfassen, die in diesen individuellen Bereichen enthaltenen Sequenzen normalerweise nicht durchgehend. Außerdem können die zu detektierenden Bereiche jene sein, die normalerweise auf getrennten Teilen des gleichen Chromosoms vorhanden sind, jedoch so weit voneinander getrennt sind, dass sie durch herkömmliche Amplifikationsverfahren in Abwesenheit eines Spleißing- oder interchromosomalen Translokationsereignisses nicht koamplifiziert würden.
  • In einer Ausführungsform, in der zwei Primer verwendet werden, kann die Detektionssonde gegen eine Nukleotidbasensequenz, die auf beiden Seiten der Spleißverbindungsstelle angeordnet ist, gerichtet sein. In diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung muss die Sonde den gleichen Sinn aufweisen wie die chimärische RNA. Die amplifizierten Nukleinsäuren entgegengesetzten Sinnes werden detektiert, wodurch das Absondern von „normaler" mRNA (die nicht amplifiziert ist) von abnormaler gespleißter RNA (die amplifiziert worden ist) ermöglicht wird. Da die Sonde darüber hinaus nicht gegen die Spleißverbindung gerichtet ist, dafür jedoch an eine flankierenden Sequenz, die außerhalb des Bruchpunkt- oder Spleißbereichs angeordnet ist, bindet, kann eine einzelne Sonde mehrere gespleißte Formen detektieren, die von unterschiedlichen Spleißereignissen herrühren können.
  • Mit „flankieren" der Stelle der Translokation ist gemeint, dass die Oligonukleotidbindungsstellen in Positionen auf beiden Seiten der Spleißverbindung oder des Bruchpunkt-Cluster-Bereichs (breakpoint cluster region) angeordnet sind. In vielen Erkrankungen und Zuständen, die mit chromosomalen Translokationen in Verbindung stehen, kann es viele mögliche Arten chimärischer RNA geben. In jeder chimärischen RNA hat eine bekannte Spleißverbindung eine bestimmte Nukleotidsequenz, an die eine Sonde spezifisch binden kann, jedoch erfordert diese Art der Detektion das Einbeziehen von möglicherweise vielen Spleißverbindungssonden, wobei jede gegen eine bekannte chimärische RNA-Art, sowohl herkömmliche als auch seltene, gerichtet ist.
  • Viele charakterisierte Translokationen haben Bruchpunkte, die in diskreten bekannten Bereichen, die mit gegebenen Erkrankungen oder Zuständen in Verbindung gebracht werden, geclustert sind. Um eine Translokation als einen Marker für einen gegebenen Zustand oder Erkrankung zu detektieren, ist es nicht notwendig jede Art von chimärischer RNA zu detektieren oder zu charakterisieren. Stattdessen ist es mittels der vorliegenden Erfindung nur notwendig zu detektieren, ob eine mit einem Translokationsereignis in Verbindung stehende RNA durch die Targetzelle hergestellt und amplifiziert worden ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Fähigkeit der Target-mRNA amplifiziert zu werden darauf hin, dass eine Translokation in einer Zelle aufgetreten ist. In einer anderen Ausführungsform, wie zum Beispiel im Amplifikationsverfahren, das einen einzelnen Promotor-Primer verwendet, werden sowohl normale als auch gespleißte Transkripte amplifiziert, jedoch hybridisiert die Sonde nicht mit den Nukleinsäuren, die von dem normalen Transkript amplifiziert worden sind. In beiden Fällen kann zur Detektion der amplifizierten RNA jegliche von einer Vielzahl von bekannten Methoden, wie zum Beispiel Gelelektrophorese, erhöhte Lichtabsorption, hyperchromatische Verlagerung oder die Verwendung einer detektierbaren Sonde, bevorzugt einer markierten Oligonukleotidsonde, verwenden werden. Geeignete Marker schließen Enzyme, Enzymsubstrate, Fluoreszenz-, Lumineszenz-, Chemilumineszenz- und Elektrochemilumineszenzmoleküle, Radionukleide und Fluoreszenzatome ein. Bevorzugte Marker sind ein Fluoreszenz- oder Chemilumineszenzmarker und am meisten bevorzugt ein Akridiniumester.
  • Die Sonden können gegen jeden Bereich der amplifizierten Nukleinsäure gerichtet sein, solange wie die Sonde mit der amplifizierten Nukleinsäure spezifisch hybridisiert. Bevorzugte Sonden detektieren Sequenzen außerhalb der Spleißverbindung (d.h., flankierende Sonden), wodurch die Anzahl der unterschiedlich gespleißten Nukleinsäuren, die unter Verwendung dieses Verfahrens detektiert werden können, gesteigert wird.
  • Ein Beispiel für solch ein Assay ist in den 1A bis 1C, die zwei Fusionstargetnukleinsäuren (1A und 1B) und eine normale Target-Nukleinsäure (1C) zeigen, schematisch dargestellt. Die Detektion der normalen Target-Nukleinsäure ist als eine optionale interne Kontrolle für die Amplifikation und das Detektionsverfahren eingeschlossen. Bezugnehmend auf die 1A und 1B werden die Fusionstargetnukleinsäuren (dargestellt durch die geschwärzten und offenen Balken) unter Verwendung von Primern amplifiziert und die Amplicons werden mit einer Sonde detektiert, die gegen eine Nukleotidbasensequenz gerichtet ist, welche die Spleißverbindung (die Verbindung der geschwärzten und offenen Balken) flankiert, um auf die Anwesenheit der gespleißten Nukleinsäure in der biologischen Probe hinzuweisen. Dieses Assayformat kann die gesamte Familie von potentiell gespleißten Nukleinsäuren detektieren, da die Sonde nicht an die gespleißte Verbindung bindet. 1C zeigt eine interne Kontrolle (oder „nicht-Target" Nukleinsäure) in einem Assay, in dem eine normale Target-Nukleinsäure ebenso amplifiziert und in der Probe detektiert wird. Die interne Kontrolle weist darauf hin, dass die Nukleinsäuren in der Probe amplifiziert und durch eine Sonde (d.h., die Abwesenheit von Kontaminanten, die einen oder beide dieser Assayschritte inhibieren würde) detektiert werden können.
  • Wie in den 1A und 1B dargestellt, muss die Amplifikation von Target-Nukleinsäuren auf eine einzelne Größe oder Kategorie eines Spleißereignisses begrenzt werden. In den 1A und 1B sind die Target-Nukleinsäuren Fusionsprodukte aus zwei verschiedenen bcr-abl-Translokationen, eine davon verbindet bcr-b3 mit abl (1A) und die andere verbindet bcr-b2 mit abl (1B). Die Target-Nukleinsäuren werden unter Verwendung von Primern amplifiziert, die gegen Stellen auf normalerweise nicht-proximalen Abschnitten der Nukleinsäure, wie zum Beispiel Stellen, die normalerweise auf unterschiedlichen Chromosomen liegen (z.B., die auf dem menschlichen Chromosom 22 angeordnete bcr Stelle, die durch den „CML-1"-Primer erkannt wird und die auf dem menschlichen Chromosom 9 angeordnete abl Stelle, die durch den „T7-abl-Primer" erkannt wird), gerichtet sind.
  • Wie in den 1A und 1B gezeigt, verwendet die Amplifikation von Target-Nukleinsäuren einen Primer, der für eine der im chimärischen Spleißereignis (z.B., der „T7-abl-Primer", der spezifisch für eine abl-Sequenz ist) involvierten Nukleinsäuren spezifisch ist, und eine zweiten Primer, der für die andere Nukleinsäure, die in das chimärische Spleißereignis (z.B., der „CML-1"-Primer, der für die bcr-Sequenz spezifisch ist) involviert ist, spezifisch ist. Die amplifizierten Targetsequenzen werden mittels einer Sonde detektiert, die für eine der beiden Sequenzen (z.B., die „b2-Sonde", die für den bcr-Partner in den in den 1A und 1B gezeigten Spleißereignissen spezifisch ist) spezifisch ist. Diese Kombination von Primern und Sonde kann mehr als ein chimärisches Spleißereignis detektieren, da die gleichen Primer unterschiedlich große Produkte, die ein Ergebnis der unterschiedlichen Spleißereignisse sind, von denen alle mit der gleichen Sonde detektierbar sind, amplifizieren können. Man vergleiche zum Beispiel die relativ langen amplifizierten Produkte, die mittels der CML-1 und T7-abl-Primer mit dem Fusionsprodukt der 1A erhalten wurden, mit den relativ kurzen amplifizierten Produkten, die mittels der gleichen Primer mit dem Fusionsprodukt der 1B erhalten wurden, wo beide amplifizierten Produkte mit der b2-Sonde detektiert werden. Daher sind die Fusionstranskripte, die sich von jeglichen einer Vielzahl von abnormalen Spleißereignissen ergeben, detektierbar, unabhängig von den bestimmten Sequenzen der Bruchpunkt-Verbindungen.
  • Das Assay kann optional die Amplifikation und Detektion einer internen Kontroll-(nicht-Target) Nukleinsäure mittels eines Primers einschließen, der ebenso für die Amplifikation der Target-Nukleinsäuren (z.B., der T7-abl-Primer in den 1A bis 1C) verwendet werden. Ein für die interne Kontrollamplifikation verwendeter zweiter Primer muss sich vom zum Amplifizieren von Targetsequenzen verwendeten zweiten Primer unterscheiden und ist normalerweise gegen einen naheliegenden Bereich auf der anderen Seite des Bereichs, der einen oder mehrere potentielle Spleißverbindungen enthält (z.B., der abl-1 Primer, wie in 1C gezeigt), gerichtet. Bevorzugt ist dieser zweite Primer dazu in der Lage, die internen Kontrollnukleinsäuresequenzen an einer Nahe dem Bruchpunktbereich liegenden Stelle zu amplifizieren, um die Möglichkeit zu eliminieren, dass ein abnormales Spleißereignis als normale Nukleinsäure missverstanden wird. Das heißt, aufgrund der Nähe des zweiten Primers zum potentiellen Spleißverbindungsbereich wird das Amplifikationsprodukt der internen Kontrollnukleinsäure eine Sequenz für eine Sondenhybridisation einschließen, die häufig durch abnormale Spleißereignisse eliminiert wird. Wie in 1C dargestellt, verwendet die Amplifikation einer nicht-Target, normalen abl-Nukleinsäure Primer für Sequenzen, die normalerweise auf einer nicht-Fusionsnukleinsäure (z.B., der „abl-1" Primer und der „T7-abl Primer") zusammenhängend sein würden. Eine Zweite Sonde wird für die Detektion der amplifizierten internen Kontrollnukleinsäuren (z.B., die „abl-Sonde" in 1C) benötigt. Diese Sonde ist einzigartig für die interne Kontrollsequenz auf der gleichen Seite des potentiellen Spleißverbindungsbereiches wie der nicht-Target-spezifische Primer. Das Verhältnis dieser Sequenzbereiche wird im Detail in den 2 und 3 gezeigt. 2 zeigt die 5' bis 3' DNA-Sequenz (SEQ ID NO:24) des Bereichs, der eine bcr-abl Spleißverbindung umgibt, wie schematisch in 1A dargestellt, wobei der unterstrichene Bereich (Reste 1 bis 126) die bcr-b2 Sequenz repräsentiert, welche die Sequenz, die komplementär zur CML-1 Primer-Bindungsstelle (fettgedruckte Reste 65 bis 88; SEQ ID NO:5) ist und die Sequenz, die zur b2 Sonden-Bindungsstelle (fettgedruckt und kursiv geschriebene Reste 89 bis 113; SEQ ID NO:9) komplementär ist, enthält. Der doppelt unterstrichene Bereich (Reste 127 bis 201) repräsentiert eine bcr-b3 Sequenz, die eine Spleißverbindung zwischen den Resten 201 und 202 enthält. Vom Rest 202 bis zum Ende der in 2 gezeigten Sequenz liegt der abl-A2 Bereich, der die Primer-Bindungsstelle (fettgedruckt; SEQ ID NO:22) für den T7-abl Primer der 1A bis 1C enthält.
  • 3 zeigt die 5' bis 3' DNA-Sequenz (SEQ ID NO:25), die einen potentiellen Spleißverbindungsbereich in einer normalen abl-DNA umgibt. Die Reste 1 bis 151 stellen eine abl-1b Exonsequenz dar und enthalten einen Bereich, der zur Bindungsstelle (fettgedruckte Reste 84 bis 103; SEQ ID NO:13) des abl-1 Primers der 1C komplementär ist. Der doppelt unterstrichene Bereich (Reste 102 bis 119; SEQ ID NO:26) ist komplementär zu einer Sonden-Bindungsstelle, welche den Spleißverbindungsbereich flankiert. Der unterstrichene Bereich (Reste 142 bis 165; SEQ ID NO:16) schließt die potentiellen Spleißverbindungen ein und ist das Komplement einer Sonden-Bindungsstelle der abl-Sonde der 1C. Reste 152 bis 299 stellen eine normale abl-Sequenz dar, die eine Primer-Bindungsstelle (fettgedruckte Reste 175 bis 201; SEQ ID NO:22) für den T7-abl Primer der 1A bis 1C enthält.
  • Das in der vorliegenden Erfindung bevorzugte Amplifikationsverfahren stellt eine amplifizierte Nukleinsäure („Amplicon") her, die eine RNA ist, und noch mehr bevorzugt stellt es überwiegend amplifizierte RNA her, die zur Targetsequenz komplementär ist (d.h., den entgegengesetzten Sinn zur Targetsequenz aufweist). Mit „überwiegend" ist gemeint, das mindestens 50% des Produkts und bevorzugt mehr als 55% komplementäre RNA sind. Wenn demnach das Target mRNA ist, die willkürlich als (+) Sinn-Strang bezeichnet wird, dann sind die Amplifikationsprodukte bevorzugt (-)Sinn-Stränge. Mittels Transkriptions-verbundener Amplifikationsverfahren, wie zuvor in U.S. Pat. Nr. 5,480,784 und 5,399,491 beschrieben, ist der Promotor-Primer vom (-) Sinn und die Matrizen-Target-Nukleinsäure ist vom (+) Sinn, die Amplicons herstellen, die vom (-) Sinn sind. Auch wenn die Sonde jede Sequenz sein kann, die Amplifikationsprodukte binden kann, ist die Sonde bevorzugt vom (+) Sinn zum Hybridisieren an (-) Sinn-Amplifikationsprodukte. Wenn ein erster Primer gemeinsam für die Amplifikation sowohl der Target als auch der internen Kontrollnukleinsäuren verwendet wird, dann wird auch das gleiche Verhältnis der Primer, Amplifikationsprodukte und Sonden für die Kontrollnukleinsäureamplifikation und Detektion verwendet.
  • Diese Verfahren sind nützlich zum Detektieren von jeglichen einer Vielzahl von bekannten genetischen oder physiologischen Ereignissen, die gespleißte oder anders umgestaltete Nukleinsäuren zur Folge haben. Diese Verfahren sind insbesondere für das Detektieren der Anwesenheit an Fusionstranskripten oder chimärischen Transkripten verwendbar, die sich aus genetischen Translokationen, besonders solchen, die mit pathologischen Zuständen oder Erkrankungen in Verbindung stehen, ergeben. Diese Verfahren sind für das Detektieren einer Vielzahl von bekannten Translokationen, die mit Krebs, bestimmten Formen von Leukämie wie der, als Beispiele, CML und ALL in Verbindung stehen, in einer biologischen Probe geeignet.
  • Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind für das Detektieren aller einer Vielfalt von bekannten Translokationen geeignet, die im Menschen auftreten, wobei nur das Design der Primer und Sonden für bekannte Sequenzen, die mit den Translokationen in Verbindung stehen (Übersicht dazu von Mitelman et al., Cytogenet. Cell. Genet. 55:358-386, 1990), erforderlich ist. Detektierbare Translokationen schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf t(9;22), t(4;11), insbesondere t(4;11)(q21;q23), t(9;11), insbesondere t(9;11)(p22;q23), t(11;19), insbesondere t(11;19)(q23;p13), t(8;21), t(1;19), insbesondere in pro-B-Zellen, t(11;14), t(2;5), insbesondere t(2;5)(p23;q35), t(11;22), insbesondere t(11;22)(q24;q12), t(15;17), t(6;9), t(14;18) t(12;21) und t(2;13) Translokationen. Targetsequenzen zum Detektieren der Translokationen sind in den im Stand der Technik bekannten Sequenzen eingeschlossen, wie beschrieben in: Bakhshi et al., Cell 41:899-906, 1985; Bakhshi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2396-2400, 1987; Barr et al., Genomics 11:941, 1991; Chen et al., Blood 78:2498-2504, 1991; Cleary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7439-7443, 1985; Cleary et al., Cell 47:19-28, 1986; Crescenzi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4869-4873, 1988; Domer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7884-7888, 1993; Dragon-Durey et al., Leukemia 12(7):1159-1162, 1998; Groffen et al., Cell 36:93-99, 1984; Gu et al., Cancer Res. 54:2327-2330, 1994; Hermans et al., Cell 51:33-40, 1987; Kakizuka et al., Cell 66:663-674, 1991; Kamps et al., Cell 60:547-555, 1990; Kawasaki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5698-5702; LeBeau et al., Leukemia 3(12):866-870, 1989; Mellentin et al., Science 246:379-382, 1989; Mitelman et al., Cytogenet. Cell. Genet. 55(1-4):358-386, 1990; Nakamura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4631-4635, 1993; Nourse et al., Cell 60:535-545, 1990; Sacchi et al., Science 231:379-382, 1986; Sarris et al., Leuk. Lymphoma 29(5-6):507-514, 1998; Sawyers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:563-567, 1990; Selleri et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:887-891, 1991; Shtivelman et al., Nature 315:550-554, 1985; Sooknanan et al., Experimental Hematol. 21:1719-1724, 1993; Tkachuk et al., Science 250:559-562, 1990; Tsujimoto et al., Science 224:1403-1406, 1984; von Lindern et al., Mol. Cell. Biol. 12:1687-1697, 1992; Zhao et al., Am. J. Hum. Genet. 47:A119, 1980; und Zemin-VanDerPoel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10735-10739, 1991; U.S. Pat. Nr. 5,057,410 von Kawasaki et al.; U.S. Pat. Nr. 5,459,251 von Tsujimoto et al.; U.S. Pat. Nr. 5,538,846 von Meeker; U.S. Pat. Nr. 5,149,628, 5,198,338, 5,202,429 und 5,242,759 von Croce et al.; U.S. Pat. Nr. 5,547,838 von Nisson et al.
  • Falls nicht anders beschrieben, sind die hier beschriebenen Techniken dem Durchschnittsfachmann gut bekannte Standardmethodiken. Die folgenden Beispiele zu den Ausführungsformen werden nur zur Illustration bereitgestellt.
  • Beispiel 1
  • Lyse von biologischen Proben und Isolation von mRNA
  • Das folgende Verfahren wurde zur Isolation von mRNA aus biologischen Proben verwendet. In diesem Beispiel wurden Blut und Knochenmarkszellen einzeln in den Lyse- und mRNA Isolationsverfahren verwendet. Dieses Verfahren arbeitet ebenso gut mit anderen Geweben, wenn die Zellen in individuelle Zellen oder kleine Klumpen von Zellen mittels Standardzerkleinern, Siebauftrennung und/oder Proteolyseverfahren separiert werden, um die Anzahl der in den Klumpen vorhandenen Zelle zu begrenzen. Das Lyseverfahren umfasst das in-Kontakt-bringen einer Suspension von Targetzellen mit einer Lyselösung, die mindestens 150 mM eines löslichen Salzes, bevorzugt ein Lithiumhalogenidsalz (z.B., LiCl), ein chelatbildendes Agens (z.B., Ethylendiamin Tetraacetatsäure (EDTA)) und eine Menge eines nicht-ionischen Detergens, das die cytoplasmatische Membran der Zelle wirksam lysieren kann, ohne die Inhalte des Kerns im Wesentlichen freizusetzen, enthält. Im Allgemeinen war das nicht-ionische Detergens in der Lyselösung ein Octylphenoxypolyethoxyethanol (ein TRITON®-artiges Detergens), auch andere nicht-ionische Detergenzien (z.B., TWEEN®-artige und NP-artige Detergenzien) arbeiten äquivalent. Mit „wirksamer Menge" eines nicht-ionischen Detergenzes ist eine Menge gemeint, die ausreichend ist, um zur Lyse oder Permeabilisation der cytoplasmatischen Membran zu führen, ohne eine substantielle Freisetzung an kernständiger DNA oder RNA zu verursachen, für gewöhnlich zwischen etwa 0,5% (v/v) bis etwa 2,0% (v/v). Eine bevorzugte Lyselösung enthält etwa 1% (v/v) TRITON® X-102.
  • In einem typischen Verfahren wurden etwa 250 μl an unkoaguliertem Blut oder Knochenmark zu etwa 750 μl der Lyselösung gegeben. Mit „unkoaguliert" ist gemeint, dass das Blut oder Knochenmark nach dem Einsammeln mit etwa 2 mM bis etwa 20 mM EDTA oder einer effektiven Menge an Heparin oder vergleichbaren im Stand der Technik bekannten Antikoagulanzien behandelt wurde. Das Verhältnis der Probe zur Lyselösung ist nicht kritisch, jedoch kann für gewöhnlich ein Verhältnis von etwa 1:1 bis etwa 1:3 der Bestandteile (Probe:Lyselösung) die Probe lysieren. Im Allgemeinen besteht die Lyselösung aus 50 mM HEPES (pH 7,5), 1 M LiCl, 5 mM EDTA, und 1% TRITON® X-102. Der pH des Puffers kann in einem Bereich über und unter dem neutralen (pH 7,0) liegen, er liegt bevorzugt in einem pH-Bereich von etwa 6,5 bis etwa 8,5 und am meisten bevorzugt bei etwa pH 7,5, um das Einfangen der mRNA durch Hybridisation, wie weiter unten beschrieben, zu erleichtern. Überraschend war nach dem Vermengen der Probe und des Lysepuffers die freigesetzte RNA in der Lyse-Mixtur stabil und kann bei Raumtemperatur für mindestens etwa 2 Stunden ohne signifikanten Abbau der RNA, auch in Abwesenheit von zusätzlichen RNAse Inhibitoren, gelagert werden. Keiner der Bestandteile HEPES, LiCl, EDTA oder TRITON® X-102 der Lyselösung waren für sich genommen beim Verhinderung des allgemeinen sofortigen Abbaus der RNA wirksam. Daher war es überraschend, dass die Kombination der Bestandteile beim Inhibieren des RNA-Abbaus wirksam war.
  • Für eine mRNA-Isolation (oder Einfangen des Targets) wurden Partikel zum Einfangen zu der oben beschriebenen Lyse-Mixtur gegeben. Etwa 30 μl einer Suspension an superparamagnetischen Partikeln (ca. 300 μg) an die poly-T (in einem Bereich zwischen dT14 bis dT30) in einer Dichte von zwischen etwa 1 bis 100 pmol pro mg kovalent geknüpft wurde, wurden zu etwa 1 ml der Lyse-Mixtur gegeben. Partikel mit dT14, dT20, dT25 oder dT30 Oligomeren sind alle in diesem Verfahren verwendet worden. Für gewöhnlich hatten die Partikel zwischen etwa 10 bis 100 pmol an poly-dT pro mg gebunden, am häufigsten hatten die Partikel etwa 10 bis 50 pmol an poly-dT pro mg an Partikeln gebunden. Diese Partikel werden in standardgepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,4 suspendiert, der 140 mM NaCl für die Zugabe zur Lyse-Mixtur enthält.
  • Üblicherweise bestanden die verwendeten Partikel aus einem Magnetitkern, der mit Latex oder Siliciumdioxid, die kommerziell erhältlich sind, beschichtet ist, an diese wurden poly-dT Oligonukleotide („Schwänze") angebunden. Auch wenn es nicht entscheidend ist, das die Partikel magnetisch oder paramagnetisch sind, hilft die magnetische Eigenschaft beim Wiedergewinnen der Partikel nach der Hybridisierung der freigesetzten mRNA auf den Partikeln über die poly-dT Schwänze. Der Durchschnittsfachmann wird sich bewusst sein, dass nicht-magnetische Partikel (z.B., Cellulose) mit poly-dT mittels Standardsedimentations- oder Filtrationsverfahren substituiert und abgetrennt werden können. Für das Verkuppeln mit dem poly-dT weisen underivatisierte Partikel freie Gruppen auf, wie zum Beispiel Amin, Hydroxyl, Carboxyl, Estergruppen oder Mischungen aus diesen Gruppen. Geeignete Partikel können bereits derivatisiert mit poly-dT-Schwänzen (z.B., Serodyn, Dynal, Novagen) erhalten werden. Alternativ dazu können underivatisierte Partikel erstanden werden (z.B., von Seradyne) und mit poly-dT Oligonukleotiden mittels gut bekannter Kopplungschemie (Lund et al., Nuc. Acids Res. 16:10861-10880, 1988) verbunden werden.
  • Die Lyse-Mixtur und die poly-dT Partikel wurden durch Vortexen und anschließendem Inkubieren bei zwischen etwa 22°C bis etwa 42°C für etwa 30 Minuten behutsam vermengt. Die Partikel wurden aus dem Rückstand der Mixtur durch Anlegen eines magnetischen Feldes zum Wiedergewinnen der Partikel abgetrennt; der Überstand wurde verworfen. Der Durchschnittsfachmann könnte den magnetischen Separationsschritt leicht durch eine Sedimentation (z.B., Zentrifugation) ersetzen. Separierte Partikel wurden in etwa 1 ml einer Waschlösung aus 50 mM HEPES (pH 7,5), 5 mM EDTA, 150 mM NaCl und 0,1% (w/v) Natriumdodecylsulfat (SDS) durch Vermengen mit einem Vortex für etwa 3 bis 5 Sekunden gewaschen, um die Partikel zu suspensieren, die dann, wie oben beschrieben, aus dem Überstand abgetrennt wurden, und der Waschüberstand wurde verworfen. Die Waschprozedur wurde zweimal wiederholt und die Partikel wurden am Ende in 250 μl eines Puffers, der aus 10 mM HEPES (pH 7,5) und 1 mM EDTA besteht, suspendiert. Diese Suspension wurde entweder bei –30°C für eine spätere Verwendung gelagert oder sofort verwendet. Die so hergestellte RNA wurde für über ein Jahr eingefroren, wobei keine erkennbare Verringerung in der strukturellen oder funktionellen Integrität der RNA auftrat.
  • Wenn die isolierte RNA sofort verwendet wird, kann sie entweder von den Partikeln zum Einfangen (z.B., mittels eines Standard-Niedrigsalz-Elutionsprozesses) freigesetzt werden, oder sie kann durch Verwendung eines Amplifikationsverfahrens, welches das Erfordernis der Elution umgeht, amplifiziert werden, ohne sie von den Partikeln freizusetzen. Dies wird zum Beispiel durch das Verwenden von Primern erreicht, die an Bereiche der isolierten Nukleinsäure binden, die nicht an der Basenpaarung mit dem poly-dT oder in anderen Wechselwirkungen mit der Matrix der festen Phase, die mRNA binden könnte ohne sie von den Partikeln freizusetzen, beteiligt sind.
  • Der Durchschnittsfachmann wird erkennen, dass die exakten Volumina und Verhältnisse, die oben beispielhaft erläutert wurden, für die Erfindung nicht entscheidend sind. Es ist jedoch wichtig, dass aus biologischem Gewebe abgeleitete Proben, die für eine Koagulation anfällig sind (z.B., Blut, Knochenmark, Plasma oder Zellsuspension) behandelt werden, um eine Koagulation vorzubeugen. Es ist für zelluläre Proben ebenso wichtig, dass die Ionenstärke der Lyselösung bei mindestens etwa 150 mM liegt, bevorzugt in einem Bereich zwischen etwa 150 mM bis etwa 1 M, um die Lyse der Zellmembran einer Targetzelle ohne eine gleichzeitige Freisetzung von kernständiger DNA zu ermöglichen. Bei Ionenstärken von weniger als 150 mM, kontaminierte das freigesetzte kernständige Material die freigesetzten cytoplasmatischen Nukleinsäuren, zum Beispiel mit chromosomaler DNA. Obwohl die Bindung an eine Theorie oder an einen Mechanismus nicht gewünscht wird, ist es wahrscheinlich, dass bei einer Ionenstärke von etwa 150 mM die nukleäre Membran ausreichend intakt bleibt, um eine wesentliche Freisetzung von chromosomaler DNA vorzubeugen. Kontaminierende chromosomale DNA erhöhte die Viskosität der Mixtur, was bei einer Verwendung der cytoplasmatischen RNA in einem darauffolgenden Assay, zum Beispiel durch Querreagieren und Erzeugen von falsch-positiven Reaktionen, durch Maskieren der RNA und/oder Primer, und/oder durch Verhindern des Vermengens der Reaktanden, zu Wechselwirkungen führen könnte. Eine Lyselösung, die Lithiumsalze enthält, wird für das Unterbinden des RNA-Abbaus bevorzugt, trotzdem wird von Puffern, die andere lösliche Salze (z.B., NaCl) und einen bekannten RNAse Inhibitor enthalten, erwartet, dass sie in diesem selektiven Lyseverfahren solange gleichermaßen wirksam sind, wie die Ionenstärke bei mindestens 150 mM liegt.
  • Nukleinsäuren, die durch das oben beschriebene Lyseverfahren zubereitet werden, können mit anderen Verfahren zum Selektieren und Immobilisieren einer Target-Nukleinsäure verwendet werden. Ein solches Verfahren beinhaltet ein Mediator-Oligonukleotid, das in Lösung mit einer spezifischen Target-Nukleinsäure hybridisiert, wie im U.S. Pat. Nr. 4,751,177 von Stabinsky beschrieben. Andere Verfahren zur Immobilisation sind in U.S. Pat. Nr. 4,486,539 und 4,563,419 von Ranki et al., EP Pat.-Veröffentlichungsnr. 159719 von Rabbani et al., EP Pat.-Veröffentlichungsnr. 128332 von Pergolizzi et al., U.S. Pat. Nr. 5,476,769 von Soderlund et al., U.S. Pat. Nr. 5,474,895 von Ishii et al. und EP Pat.-Veröffentlichungsnr. 444120 von Hornes et al., beschrieben worden.
  • Das vorhandene Lyseverfahren ist für die Zubereitung von Nukleinsäuren aus Zellen, die in einer Vielzahl von Geweben enthalten sind, verwendbar. Zum Beispiel können Zellen, die aus festem Gewebe stammen, wie zum Beispiel festes Tumorgewebe, mittels Standardverfahren zerkleinert und mit Trypsin behandelt werden, um eine Zellsuspension herzustellen, die dann, wie oben beschrieben, lysiert wird. Andere geeignete Verfahren um Zellen in Suspension zu bringen, sind im Stand der Technik gut bekannt. Wie unten gezeigt, können ebenso Zellen, die in einer Gewebekultur oder flüssigem Medium gewachsen sind, verwendet werden.
  • Auch wenn das Vermengen der Reagenzien durch Vortexen für die Anwendung des Verfahrens im kleinen Maßstab bevorzugt wird, können wir für Anwendungen im großen Maßstab andere weniger arbeitsintensive, im Stand der Technik bekannte Vermengungsverfahren vorteilhaft sein. Bekannte Verfahren, die ein vollständiges und kräftiges Vermengen ermöglichen, liegen innerhalb der Schutzumfangs der Erfindung.
  • Auch wenn vor dem Amplifizieren der eingefangenen Target-Nukleinsäure für gewöhnlich drei Waschschritte durchgeführt worden sind, kann die Anzahl der Waschschritte, die dem Verknüpfen der Target-Nukleinsäuren an die Partikel folgt, variiert werden. Waschschritte sind wichtig, nicht nur um kontaminierende Proteine und Nukleinsäuren aus der cytoplasmatischen Nukleinsäurezubereitung zu entfernen, sondern auch für das Entfernen von Lithium, das dafür bekannt ist, dass es mindestens eine enzymatische Aktivität (RNA gerichtete DNA-Polymerase, DNA gerichtete DNA-Polymerase, RNAse H und RNA-Polymerase) hemmt, die im bevorzugten Transkriptions-verbundenen Amplifikationsverfahren verwendet wird (siehe U.S. Pat. Nr. 5,480,784 und 5,399,491 von Kacian et al.). Lithiumsalze mögen andere Enzyme nicht hemmen und daher mag das Austauschen des Kations nach der Lyse nicht notwendig sein, wenn andere Amplifikationsverfahren verwendet werden.
  • Partikel, die bei der Auswahl der Target-Nukleinsäure verwendet werden, können aus dem Überstand durch eine Vielzahl von bekannten Verfahren, wie zum Beispiel Filtration, Präzipitation und Zentrifugation, abgetrennt werden. Die Partikel, wie oben beschriebenen, können Nukleinsäure-Einfangsonden aufweisen, die an sie gebunden sind, um spezifisch an eine bestimmte cytoplasmatische Nukleinsäure zu binden. Alternativ dazu, auch wenn weniger bevorzugt, kann die feste Phase die Target-Nukleinsäure unspezifisch binden, wie, zum Beispiel, durch Verwendung von polykationischen Trägern (siehe U.S. Pat. Nr. 5,599,667 von Arnold et al.).
  • Das nächste Beispiel beschreibt die Amplifikation einer Nukleinsäure, die mittels des Lyseverfahrens aus diesem Beispiel isoliert worden ist.
  • Beispiel 2
  • Amplifikation einer Nukleinsäure aus einer biologischen Probe und Detektion eines amplifizierten Produktes
  • Für die Transkriptions-verbundene Amplifikation einer aus einer biologischen Probe isolierten Nukleinsäure wurden 50 μl einer Partikelsuspension, die, wie in Beispiel 1 beschrieben, aus dem Blut eines CML positiven Patienten isolierte Nukleinsäuren enthält, in ein Röhrchen gegeben, das 25 μl eines Amplifikationsreagenzes enthält. Für jede Reaktion enthielt das Amplifikationsreagenz 160 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM MgCl2, 70 mM KCl, 20% (w/v) Polyvinylpyrrolidon, 16 mM von jedem der vier Ribonukleosidtriphosphate ATP, GTP, CTP und UTP, 4 mM von jedem der vier Desoxyribonukleosidtriphosphate dATP, dGTP, dCTP und dTTP, 400 nM (15 pmol) eines Promotor-Primers, mit der Nukleotidbasensequenz der SEQ ID NO:1 (TAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACTCAGACCCTGAGGCTCAAAGTCAGA) und 400 nM (15 pmol) eines Primers, der die Nukleotidbasensequenz der SEQ ID NO:5 (GACCAACTCGTGTGTGAAACTCCA) hat. Nach dem Vermengen wurde das Röhrchen für zehn Minuten bei 60°C inkubiert. Im Allgemeinen ist jede Temperatur, die zum Schmelzen der intramolekularen Basenpaarungen in der Target-Nukleinsäure geeignet ist, in diesem Schritt zulässig. Bevorzugt liegt die Inkubationstemperatur zwischen etwa 60°C und 70°C, am meisten bevorzugt zwischen etwa 65°C und etwa 67°C.
  • Als nächstes wurde das Röhrchen bei etwa 42°C für 5 Minuten inkubiert. Dann wurde ein Enzymreagenz (25 μl, die 2000 Einheiten (U) einer rekombinanten MMLV Reversen Transkriptase, 2000 Einheiten einer rekombinanten T7-RNA Polymerase, 8 mM HEPES (pH 7,5), 50 mM N-acetyl-L-cystein, 0,04 mM Zinkacetat, 80 mM Trehalose, 140 mM Tris-HCl (pH 8,0), 70 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,01% (w/v) Phenol rot, 10% (v/v) TRITON® X-102 und 20% (v/v) Glycerol enthält) zur Reaktionsmixtur zugegeben. Das Röhrchen wurde behutsam gemischt und für etwa 1 h bei 42°C inkubiert. Dieses Amplifikationsverfahren stellte amplifizierte RNA mit einem Sinn her, der dem der Target-RNA entgegengesetzt ist.
  • Die amplifizierte RNA wurde mittels 100 μ1 eines Sondenreagenzes detektiert, das 100 mM Lithiumsuccinat (pH 4,7), 1,2 M LiCl, 15 mM Aldrithiol-2,2% (w/v) Lithiumlaurylsulfat (LLS), 20 mM EDTA, 20 mM Ethylenglykol-bis-(β-aminoethylether)N,N,N',N'-Tetraacetatsäure (EGTA), 3% Ethanol und 7,5 nM einer Hybridisationssonde, die mit einem chemilumineszierenden Acridiniumester (AE) markiert ist, enthält. Die für die bcr-b2-Sequenz-Detektion spezifische synthetische DNA hatte die Sequenz der SEQ ID NO:9 (GACTGTCCACAGCATTCCGCTGACC), die mit dem AE-Marker mittels eines nicht-Nukleotidlinkers und Verfahren, die zuvor bereits in U.S. Pat. Nr. 5,585,481 von Arnold et al. beschrieben worden ist, verknüpft wurde. Diese Detektionslösung wurde zur Reaktionsmischung gegeben und bei 60°C für 30 Minuten inkubiert, um das Hybridisieren der Sonde mit dem amplifizierten Target zu ermöglichen.
  • Die Sonde wurde in einem homogenen Assay-Format, wie zum Beispiel das homogene Schutz-Assay (HPA), das im Detail in U.S. Pat. Nr. 5,283,174 von Arnold et al. beschrieben worden ist, detektiert. Kurz beschrieben, es wurden 300 μl einer basischen Lösung, die 600 mM Natriumborat (pH 8,5) und 1% (v/v) TRITON® X-100 enthält, wurden zur oben beschriebenen Mischung gegeben, um den in der ungebunden Sonde vorhandenen AE-Marker zu hydrolisieren. Der AE-Marker auf der hybridisierten Sonde wird durch seine Verbindung mit einer Doppelhelix vor der Hydrolyse geschützt, wo hingegen ein AE-Marker auf einer unhybridisierten Sonde nicht vor der Hydrolyse geschützt wird. Dadurch wird die unhybridisierte Sonde bevorzugt undetektierbar gemacht. Die Lösung wurde bei 60°C für 10 Minuten inkubiert, für 5 Minuten auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 200 μl einer Lösung, die 30 mM Wasserstoffperoxid und 1 mM Salpetersäure enthält, vermengt, sofort gefolgt durch die Zugabe von 200 μl einer Lösung, die 1 M NaOH und 2% (w/v) ZWITTERGENT® 3–14, enthält. Die Chemilumineszenz wurde mittels eines Luminometers (z.B., LEADER® 1, LEADER® 50, LEADER® 450 oder LEADER® HC, alle von Gen-Probe, Inc., San Diego, CA) detektiert. Der Chemilumineszenzoutput wurde gemessen und in relativen Lichteinheiten („RLU") ausgegeben.
  • Obgleich das hier exemplarisch dargestellte Verfahren spezifische Detektionsformate zum Detektieren einer Nukleinsäuresonde verwendet, könnte der Durchschnittsfachmann einfach andere Marker als AE verwenden, wie zum Beispiel radioaktive Marker, Fluoreszenz und andere chemilumineszierende Marker zum Detektieren hybridisierter Sonden mittels Standardverfahren. Obwohl homogene Assaysysteme ebenso bestimmte eindeutige Vorteile gegenüber heterogenen Assays haben (d.h., solche, die eine physikalische Trennung erfordern, um das Signal einer hybridisierten Sonde von einem Signal in Folge einer unhybridisierten Sonde zu differenzieren), ist der homogene Detektionsaspekt nicht entscheidend für das Verfahren.
  • Beispiel 3
  • Amplifizierung von isolierter gespleißter Nukleinsäure und Detektion eines amplifizierten Produktes
  • In diesem Assay wurde eine gespleißte Target-Nukleinsäure, die eine Folge einer bcr-abl Translokation ist, amplifiziert und mit einer Sonde, die gegen eine Sequenz gerichtet ist, welche die Spleißverbindung flankiert, detektiert, als ein Hinweis auf die Anwesenheit des Fusionsproduktes in der biologische Probe. Das für die Amplifikation und Detektion des Fusionsproduktes verwendete allgemeine Verfahren wird in 1A bis 1C dargestellt.
  • Die verwendete biologische Probe bestand aus Blutzellen, die aus Patienten erhalten wurden, die bekanntermaßen CML-positiv sind, aus Ihnen wurde poly-A RNA mittels des im Wesentlichen wie in Beispiel 1 beschriebenen Lyseverfahrens isoliert. Die Amplifikation der RNA wurde im Wesentlichen wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt, jedoch unter Verwendung des Promotor-Primers der SEQ ID NO:1, des Primers der SEQ ID NO:5 und 400 mM eines abl-spezifischen DNA-Primers mit der Sequenz der SEQ ID NO:13 (CAAAGGAGCAGGGAAGAAGG). Dieser abl-spezifische Primer hat den gleichen Sinn wie die Target-Nukleinsäure.
  • Vor der Detektion wurden die amplifizierten Nukleinsäuren in zwei Aliquots aufgeteilt. Die bcr-spezifische AE-markierte Sonde der SEQ ID NO:9 wurde für die im Wesentlichen wie im Beispiel 2 beschriebene Detektion zum ersten Aliquot zugegeben. Die bcr-spezifische AE-markierte Sonde ist funktionsgemäß die gleiche wie die b2-Sonde, die mit Bezug zu die 1A und 1B beschrieben wurde, und die Fusionsnukleinsäure wurde durch Messen der RLU, wie in Beispiel 2 beschrieben, detektiert. Eine AE-markierte abl- spezifische Sonde mit der Sequenz der SEQ ID NO:16 (GTGGAACATGAAGCCCTTCAGCGG) wurde zum zweiten Aliquot zugegeben und die Mixtur wurde für die Detektion der Chemilumineszenz, im Wesentlichen wie in Beispiel 2 beschrieben, weiter bearbeitet. Diese abl-spezifische Sonde kann mit dem menschlichen abl-Gen, das einen herkömmlich verwendeten Spleißverbindungsbereich überspannt, hybridisieren, obgleich eine gegen den 5' des Spleißverbindungsbereiches gerichtete Sonde ebenso verwendet werden kann (siehe Beispiel 6). Da die in diesem Beispiel verwendeten Primer konstruiert wurden, um jedes Fusionstarget und die normalen abl-Nukleinsäuren, die in der Amplifikationsmixtur vorhanden sind, zu amplifizieren, koamplifizierten sie beide Arten von Nukleinsäuren in der Amplifikations-Reaktionsmixtur, waren jedoch in den zwei Aliquots des Detektionsschritts getrennt detektierbar.
  • Die Chemilumineszenz von jedem der zwei Aliquots wurde im Wesentlichen wie in Beispiel 2 beschrieben detektiert, obgleich die Volumina der Reagenzien entsprechend angepasst wurden, um die Tatsache zu berücksichtigen, dass die Amplifikationsmixtur getrennt worden ist (d.h., halbe Volumina wurden verwendet).
  • Alternative Verfahren können verwendet werden, um jedes der Target- und nicht Target-Amplicons zu detektieren. Ein derartiges alternatives Verfahren verwendet zwei Chemilumineszenzmarker mit unterschiedlichen Eigenschaften, wie zum Beispiel unterschiedlichen Wellenlängen bei der Lichtemission, unterschiedlichen optimalen Reaktions-pH-Werten oder unterschiedlichen Chemilumineszenzreaktionskinetiken, wobei es diese Eigenschaften ermöglichen, zwei verschiedene Amplicons im gleichen Reaktionsgefäß durch den Einsatz von Sonden, die mit dem entsprechenden Marker unterschiedlich markiert worden sind, zu detektieren. Solche Verfahren sind zuvor bereits im Detail in der PCT Int. Pat. Veröffentlichungsnr. WO 96/13612 und PCT Int. Pat. Veröffentlichungsnr. WO 91/00511 offenbart worden.
  • Beispiel 4
  • Amplifikation mittels eines einzelnen Promotor-Primers und selektive Detektion von amplifizierten Nukleinsäuren
  • Dieses Beispiel demonstriert die Nukleinsäureamplifikation mittels eines einzelnen Promotor-Primers, der für die Herstellung von amplifizierten Nukleinsäuren mit einem Sinn, der dem des Targets entgegengesetzt ist, mit der Target-Nukleinsäure hybridisieren können. Sowohl die normalen als auch die Fusionsnukleinsäuren wurden mittels eines Primers amplifiziert, jedoch wurden die amplifizierten Nukleinsäuren mittels einer bcr-Sonde, die auf eine Position gerichtet ist, die auf der 5'-Seite (relativ zur Target-Nukleinsäure) der Bruchpunkt-Verbindung angeordnet ist, und eine abl-Sonde, die auf eine abl-Sequenz gerichtet ist, die in einer Fusionsnukleinsäure fehlen würde, getrennt detektiert.
  • Zum Vergleich wurden drei unterschiedliche Quellen an poly-dT magnetischen Partikeln in diesem Beispiel verwendet, im Wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben. Kommerziell erhältliche Partikel mit angeknüpften 25-mer poly-dT's wurden erstanden (dT25 Partikel, von Novagen) und zwei Sätze synthetischer Partikeln wurden durch Koppeln von poly-dT an underivatisierte Partikel (erstanden von Seradyne) zubereitet. Ein Satz von Partikel wurde an ein homopolymerische 14-mer Oligonukleotid („dT14-Partikel") gekoppelt, und ein zweiter Satz von Partikel wurde an ein homopolymerisches 30-mer Oligonukleotid („dT30-Partikel") gekoppelt. Jede Art von Partikel war, im Wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben, in einer Suspension vorhanden.
  • Cytoplasmatische mRNA wurde aus K562 Zellen gewonnen, die in einer Standardgewebskultur bis zu einer Dichte von etwa 5 × 106 Zellen/ml heranwuchsen und dann entsprechend des Probenzubereitungsverfahrens wie in Beispiel 1 beschriebenen behandelt wurden. Ungefähr 2 × 105 Zellen wurden für jede getestete Reaktionsmixtur verwendet, die dann unverdünnt oder in einer 1:10 Verdünnung verwendet worden ist. In getrennten Reaktionsmixturen wurde pro Nukleinsäureamplifikationsreaktion 60 μl jeder gewaschenen Partikelzubereitung verwendet. Kontrollproben wurden keine Partikel zugesetzt, um eine Hintergrundmessung (Daten nicht dargestellt) bereitzustellen, die von den Probenergebnissen, zu denen Partikel zugegeben worden sind, abgezogen wurden. Die Nukleinsäureamplifikation wurde im Wesentlichen wie in Beispiel 2 beschrieben und im U.S. Pat. Nr. 5,554,516 von Kacian et al. durchgeführt, mit der Ausnahme, dass ein einzelner Promotor-Primer der SEQ ID NO:1 (30 pmol) in der Amplifikationsreaktion verwendet wurde. Keine Primer des gleichen Sinns wie die Target-Nukleinsäure wurden verwendet.
  • Amplifikationsreaktionen ließ man für eine Stunde laufen. Dann wurde jede Probe in zwei ungleiche Aliquots aufgeteilt, ein Aliquot enthält ein Drittel von jeder Amplifikationsreaktion für die Detektion mit der bcr-spezifischen AE-markierten Sonde der SEQ ID NO:9 und das andere Aliquot enthält zwei Drittel der Amplifikationsreaktion für die Detektion mit der abl-spezifische AE-markierten Sonde der SEQ ID NO:16. Die Sondenhybridisation wurde im Wesentliche wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Die Detektion der hybridisierten Sonden wurde im Wesentlichen wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt, wobei die Volumina der Detektionsreagenzien dem Volumen der verwendeten Proben entsprechend angepasst wurden. Das durch die Marker emittierte Licht wurde in einem LEADER® 50 Luminometer in relativen Lichteinheiten (RLU), wie zuvor bereits beschrieben, gemessen und die Ergebnisse werden in Tabelle 1 dargestellt.
  • Tabelle 1
    Figure 00520001
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung in einem Amplifikationsformat verwendet werden kann, das einen einzelnen Promotor-Primer verwendet, der mit der Target-Nukleinsäure in einer Position hybridisiert, die 3' zu einem potentiellen Spleißverbindungsbereich angeordnet ist. Die Amplifikation führt zur Akkumulation eines Amplicons (komplementäres RNA-Transkript) mit dem entgegengesetzten Sinn wie der der Target-Nukleinsäure. Die Ergebnisse zeigen ebenso, dass mit 14-mer poly-dT Oligonukleotiden gekoppelte Partikel und kommerziell erhältliche (Novagen) Partikel mit angebundenen poly-dT25 unter diesen Assaybedingungen zum Einfangen von mRNA in Lösung wirksam waren. Synthetische poly-dT30 Partikel waren ein wenig variabel beim RNA Einfangen, basierend auf den in Tabelle 1 dargestellten Ergebnissen. Wie durch diese Ergebnisse gezeigt wurde, kann eine Amplifikationsreaktion mittels eines einzelnen Promotor-Primers verwendet werden, um die Anwesenheit von zwei unterschiedlichen Nukleinsäuretranskripten in der gleichen biologischen Probe durch Verwendung unterschiedlicher Sonden spezifisch zu detektieren. In diesem Fall wurde ein Transkript durch die bcr-Sonde detektiert und ein anderes wurde durch die abl-Sonde detektiert. Ergebnisse aus anderen Experimenten zeigten keine Querreaktionen zwischen diesen beiden Sonden. Daher kann die Detektion eines Transkripts (z.B., des abl-Transkriptes) als eine interne Kontrolle in den Probenzubereitungs, Amplifikations- und Detektionsschritten des Verfahrens dienen.
  • Beispiel 5
  • Amplifikation und Detektion von normalen abl-Transkripten in peripheren Blutzellen
  • Eine Amplifikation wurde mit Nukleinsäuren, die aus peripheren Blutzellen isoliert worden sind, durchgeführt und vor der Verwendung, im Wesentlichen wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben, gelagert. Mit EDTA behandeltes Vollblut wurde wie in Beispiel 1 beschrieben verarbeitet und die Partikel, an die cytoplasmatische RNA band, wurden vor der Verwendung gelagert. Dieses Beispiel zeigt die Verwendung des Probenzubereitungsverfahrens, für die Zubereitung von normaler abl mRNA, und des Amplifikationsverfahrens, um die Detektion von normaler abl mRNA zu ermöglichen. Dieses Beispiel zeigt auch, dass unterschiedliche Quellen von immobilisierten dT mit unterschiedlichen dT-Längen für die Target-Isolation wirksam sind.
  • Die für die Isolation des natürlich auftretenden abl-Genproduktes verwendeten Partikel waren von derselben Art wie die in Beispiel 4 verwendeten, und die Isolation der cytoplasmatischen Nukleinsäuren wurde im Wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Die Blutproben wurden unverdünnt oder mit einer Verdünnung von 1:10 oder 1:100 verwendet. Die Partikel mit eingefangener Target-Nukleinsäure (60 μg und 6 μg) wurden in dem Transkriptions-vermittelten Amplifikationsverfahren, im Wesentlichen wie in Beispiel 2 beschrieben, unter Verwendung eines Promotor-Primers mit der Sequenz der SEQ ID NO:1 und eines Primers mit der Sequenz der SEQ ID NO:13 verwendet. Nach der Amplifikation wurden die Amplifikationsprodukte mittels einer abl-spezifischen Sonde mit der Sequenz der SEQ ID NO:16 unter Verwendung der Detektionsverfahren, im Wesentlichen wie in Beispiel 2 beschrieben, detektiert. In RLU gemessene Chemilumineszenzergebnisse werden in Tabelle 2 dargestellt. Die negativ-Kontrolle („kein-Target") repräsentiert die Hintergrund-RLU.
  • Tabelle 2
    Figure 00540001
  • Die Daten der Tabelle 2 zeigen, dass das vorliegende Probezubereitungsverfahren geeignet ist, um spezifischen Nukleinsäurearten einzufangen, die dann mit Targetspezifischen Primern amplifiziert und mittels einer Targetspezifischen Sonde detektiert werden können.
  • Beispiel 6
  • Amplifikation und Detektion normaler abl-Transkripte und Fusions-bcr-abl-Transkripte in aus CML-Patienten isolierter RNA
  • Dieses Beispiel demonstriert, dass bcr-abl-Transkripte zweier unterschiedlicher Arten (bcr b2-abl und bcr b3-abl) mittels unterschiedlicher bcr-Sonden in Amplifikationsprodukten von RNA, die aus CML-Patienten erhalten worden sind, detektiert werden können. Es zeigt weiter, dass die Amplifikation und Detektion von abl-RNA als eine interne Kontrolle dient.
  • Die in diesem Experimenten verwendeten Quellen an RNA waren: (1) die RNA aus CML-Patienten, die von drei Individuen erhalten worden sind, (2) synthetische RNA-Transkripte zur Kontrolle, hergestellt durch Standard in vitro Transkriptionsverfahren aus einem abl-Genklon (geklont aus der RNA eines Patienten mittels Standard cDNA-Klonierungsverfahren) hergestellt worden ist, und (3) synthetische RNA-Transkripte stellten einen Klon mit einer bcr b3-abl Translokations-Bruchpunkt-Verbindung (geklont aus der K562 Zelllinie) her. Die drei CML-Patienten (Patienten A, B und C) zeigten unterschiedliche Phasen der Erkrankung Patient A und B hatten aktive CML-Symptome und Patient C wurde nach der Durchführung einer Knochenmarktransplantation untersucht und zeigte wenig oder keine CML-Symptompe. Für jeden Patienten wurde die gesamt-RNA aus dem Leukozytenfilm von Blutproben mittels eines Standard-Guanidinum-Isothiocyanatverfahrens (Chirgwin, et al., 1979, Biochem. 18:5294-5299) isoliert. Die für jedes Assay für jeden Patienten verwendete gesamt-RNA-Menge lag bei etwa 10 ng (etwa 1000 Zellen entsprechend). Die synthetische RNA zur Kontrolle wurde mittels Kopienzahlen der Sequenz, die mittels Standardverfahren berechnet worden sind, untersucht, mit der Kopienanzahl pro Assay wie in Tabelle 3 gezeigt. Bei den negativ-Kontrollen wurde keine RNA zu den Amplifikationsreaktionsmixturen gegeben.
  • Die Amplifikation der gesamt-RNA der Patienten und der synthetischen RNA-Transkripte zur Kontrolle wurde im Wesentlichen wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Die Detektion der amplifizierten Nukleinsäure wurde im Wesentlichen wie in Beispiel 2 beschrieben ausgeführt, wobei ein Amplifikationsaliquot unter Verwendung einer bcr b2-Sonde (ein AE-markiertes Oligonukleotid mit der SEQ ID NO:9), einer bcr b3-Sonde (ein AE-markiertes Oligonukleotid mit der SEQ ID NO:27) und einer abl-Sonde (ein AE-markiertes Oligonukleotid mit der SEQ ID NO:26) individuell detektiert worden ist. Die abl-Sonde ist auf einen in 3 dargestellten (doppelt unterstrichene Sequenz) Bereich gerichtet. Die Assays wurden dreifach durchgeführt und die Durchschnitts (Mittelwert) RLU- Ergebnisse werden in Tabelle 3 („ND" bedeutet „nicht durchgeführt") dargestellt.
  • Tabelle 3
    Figure 00560001
  • Die Ergebnisse der Tabelle 3 zeigen, dass die bcr b2-spezifische Sonde in der Lage war, weniger als 50 Kopien von bcr b2 (siehe Spalte 3, Datenzeile 8) zu detektieren und das sie die Anwesenheit von bcr b2 in RNA von Patienten A und B, jedoch nicht von Patient C (Spalte 3, Datenzeilen 1 bis 3, verglichen mit der „keine RNA"-Kontrolle der Spalte 3, Datenzeile 9) detektierte. Die Ergebnisse zeigen ebenso, dass die bcr b3-Sonde in der Lage war, weniger als 50 Kopien von bcr b3 (siehe Spalte 4, Datenzeile 8) zu detektieren und das sie die Anwesenheit von bcr b3 aus RNA von Patient A jedoch nicht aus RNA von Patient B detektierte. Vom Patienten C wurden nicht erwartet, dass er bcr b3 aufweist, da die Translokation in diesem Patienten bereits das Target der bcr b2-Sonde entfernt hatte und daher ebenso das Target der bcr b3-Sonde entfernt haben würde. Tabelle 3 zeigt ebenso, dass die interne Kontrolle, abl, in allen drei Patienten detektiert wurde, die vermutlich die Detektion von normalen abl-Transkripten (Spalte 2, Datenzeile 1–3) verkörpern. Andere Ergebnisse (nicht dargestellt) haben bestätigt, dass die bcr b2- und bcr b3-Sonden mit abl-Amplicons nicht quer reagieren, und die abl-Sonde nicht mit den bcr-Amplicons quer reagiert.
  • Sequenzliste
    Figure 00580001
  • Figure 00590001
  • Figure 00600001
  • Figure 00610001
  • Figure 00620001
  • Figure 00630001
  • Figure 00640001
  • Figure 00650001

Claims (13)

  1. Ein Verfahren zum Detektieren einer Fusionsnukleinsäure in einer Probe, welches die Schritte umfasst: a) Bereitstellen einer Probe, die eine erste einzelsträngige Fusionsnukleinsäure enthält, die eine bcr-abl-Spleißverbindung umfasst; b) In-Kontakt-Bringen unter Nukleinsäureamplifizierungsbedingungen: der ersten einzelsträngigen Fusionsnukleinsäure, eines ersten Promotor-Primers, der spezifisch mit der ersten einzelsträngigen Fusionsnukleinsäure an einer ersten Primer-Bindungsstelle hybridisiert, die 3' zur Spleißverbindungsstelle und in einer abl-Sequenz angeordnet ist, und zumindest einer Nukleinsäure-Polymeraseaktivität; c) Amplifizieren der ersten einzelsträngigen Fusionsnukleinsäure in einer Reaktion zur Nukleinsäureamplifizierung unter Verwendung des ersten Primers zur Herstellung einer Vielzahl von zweiten Nukleinsäuresträngen, die zumindest mit einem Abschnitt der ersten einzelsträngigen Fusionsnukleinsäure komplementär sind, wobei jeder zweite Nukleinsäurestrang umfasst: eine komplementäre Spleißverbindungsstelle, eine erste Sonden-Bindungsstelle in einer bcr-Sequenz, die 3' angeordnet ist und die nicht mit der komplementären Spleißverbindungsstelle überlappt, und eine zweite Sonden-Bindungsstelle in einer abl-Sequenz, die 5' angeordnet ist und die nicht mit der komplementären Spleißverbindungsstelle überlappt, wobei die zweite Sonden-Bindungsstelle überlappt oder 3' zur Sequenz angeordnet ist, die komplementär zur erste Primer-Bindungsstelle ist; d) Hybridisieren des zweiten Nukleinsäurestranges unter Hybridisierungsbedingungen mit einer Oligonukleotidsonde, die spezifisch entweder mit der ersten Sonden-Bindungsstelle oder mit der zweiten Sonden-Bindungsstelle hybridisiert, jedoch nicht mit beiden Stellen, wodurch ein Sonden:Target-Hybrid ausgebildet wird; und e) Detektieren des Sonden:Target-Hybrids in einem homogenen Assayformat als ein Nachweis auf die Anwesenheit der ersten einzelsträngigen Fusionsnukleinsäure in der Probe.
  2. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die erste einzelsträngige Fusionsnukleinsäure eine mRNA ist, die Polymeraseaktivität eine RNA-Polymeraseaktivität umfasst und die Oligonukleotidsonde den gleichen Sinn aufweist wie die mRNA und spezifisch mit der ersten Sonden-Bindungsstelle hybridisiert.
  3. Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die erste einzelsträngige Fusionsnukleinsäure eine mRNA ist, wobei die zweiten Nukleinsäurestränge aus komplementärer RNA bestehen und, wobei der Amplifizierungsschritt weiter das In-Kontakt-Bringen der zweiten Nukleinsäurstränge mit einem zweiten Primer oder Promotor-Primer, der spezifisch mit einer zweiten Primer-Bindungstelle in einer bcr-Sequenz, die 3' sowohl zur komplementären Spleißverbindungsstelle als auch zur ersten Sonden-Bindungsstelle angeordnet ist, hybridisiert und eine RNA-Polymeraseaktivität, eine DNA-gerichtete DNA-Polymeraseaktivität und eine RNA-gerichtete DNA-Polymeraseaktivität beim Synthetisieren von Amplifizierungsprodukten verwendet, beinhaltet.
  4. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Oligonukleotidsonde spezifisch mit der zweiten Sonden-Bindungsstelle hybridisiert und nicht in der Lage ist, einen stabilen Hybridisierungskomplex mit der ersten einzelsträngigen Fusionsnukleinsäure auszubilden.
  5. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Bereitstellungsschritt das Zubereiten cytoplasmatischer RNA aus eukaryotischen Zellen in der Probe durch In-Kontakt-Bringen einer biologischen Probe, welche die erste einzelsträngige Fusionsnukleinsäure in Zellen mit einer Lösung beinhaltet, die umfasst: einen Puffer mit einem pH in einem Bereich von etwa 6.5 bis 8.5, ein lösliches Salz mit einer Ionenstärke in einem Bereich von etwa 150 mM bis etwa 1 M, ein chelatbildendes Agens mit einer Konzentration von etwa 5 mM, und ein nicht-ionisches Detergens in einem Bereich von etwa 0.5% bis etwa 1.5% (v/v), wodurch cytoplasmatische RNA aus den in der Probe vorhandenen Zellen ohne Extraktion oder Verwendung von Phenol oder Chloroformreagenzien freigesetzt wird, und anschließendes Vermengen mit einem Trägermaterial, das mit einem immobilisierten Oligonukleotid verbunden ist, das eine Nukleotidbasensequenz umfasst, die direkt oder indirekt mit cytoplasmatischer RNA hybridisiert, die von den Zellen freigesetzt wird, wodurch unter Hybridisierungsbedingungen ein stabiler Hybridisationskomplex hergestellt wird; Abtrennen des mit dem Trägermaterial verbundenen Hybridisationskomplexes von anderen Probenbestandteilen; Waschen des mit dem Trägermaterial verbundenen Hybridisationskomplexes mit einer Waschlösung, die eine ausreichende Ionenstärke aufweist, damit der an dem Trägermaterial gebundene Hybridisationskomplex erhalten bleibt; und Wiedergewinnen des am Trägermaterial gebundenen Hybridisationskomplexes aus der Waschlösung, beinhaltet.
  6. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Bereitstellungsschritt das In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem Trägermaterial, das mit einem immobilisierten Oligonukleotid verbunden ist, das eine Nukleotidbasensequenz umfasst, die unter Hybridisierungsbedingungen direkt oder indirekt einen stabilen Hybridisationskomplex mit der in der Probe vorhandenen ersten einzelsträngigen Fusionsnukleinsäure ausbildet; und das Abtrennen des mit dem Trägermaterial verbundenen stabilen Hybridisationskomplexes von anderen Probenbestandteilen, wobei die erste einzelsträngige Fusionsnukleinsäure ohne Extraktion oder Verwendung von Phenol oder Chloroformreagenzien abgetrennt wird, beinhaltet.
  7. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei im Bereitstellungsschritt die erste einzelsträngige Fusionsnukleinsäure ein Fusions-mRNA-Transkript ist, das aus einer genetischen t(9;22) Translokation hergestellt worden ist, die zwei chromosomale Bereiche des Chromosoms 9 und Chromosoms 22 an einer Spleißverbindungsstelle miteinander verbindet; im Schritt des In-Kontakt-Bringens der erste Promotor-Primer spezifisch mit dem Fusions-mRNA-Transkript an der ersten Primer-Bindungsstelle, die von einem ersten chromosomalen Bereich in einer abl-Sequenz abgeleitet und 3' zu einer Spleißverbindungsstelle angeordnet ist, hybridisiert; im Amplifizierungsschritt die erste Sonden-Bindungsstelle von einem zweiten chromosomalen Bereich in einer bcr-Sequenz abgeleitet ist, und die zweite Sonden-Bindungsstelle von einem dritten chromosomalen Bereich in einer abl-Sequenz abgeleitet ist, die überlappt mit oder 3' zu einer Sequenz angeordnet ist, die zur ersten Primer-Bindungsstelle komplementär ist; im Hybridisierungsschritt die Oligonukleotidsonde spezifisch mit den zweiten Nukleinsäuresträngen entweder an der ersten Sonden-Bindungsstelle oder an der zweiten Sondenbindungsstelle hybridisiert, jedoch nicht in der Lage ist, mit dem Fusions-mRNA-Transkript zu hybridisieren, wodurch ein Hybridisationskomplex der Sonde und des zweiten Nukleinsäurestranges ausgebildet wird; und im Detektionsschritt der Hybridisationskomplex in einem homogenen Assayformat als ein Nachweis auf die Anwesenheit des Fusions-mRNA-Transkripts in der Probe detektiert wird.
  8. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Amplifizierungsschritt weiter das Amplifizieren eines internen Kontroll-Transkripts unter Verwendung des ersten Promotor-Primers, der ebenfalls spezifisch mit dem internen Kontroll-Transkript hybridisiert, beinhaltet, der Hybridisationsschritt eine zweite Oligonukleotidsonde, die spezifisch mit einer Sequenz hybridisiert, die komplementär zum internen Kontroll-Transkript ist, wodurch ein interner Kontroll-Hybridisationskomplex ausgebildet wird, verwendet, und der Detektionsschritt weiter das Detektieren der Anwesenheit des internen Kontroll-Hybridisationskomplexes mit einschließt.
  9. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Amplifizierungsschritt einen zweiten Primer oder Promotor-Primer, der unter Bedingungen zur Amplifizierung spezifisch mit einer Nukleotidsequenz einer RNA hybridisiert, die komplementär zur ersten einzelsträngigen Fusionsnukleinsäure ist, beinhaltet.
  10. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei die erste einzelsträngige Fusionsnukleinsäure ein von einer t(9;22) Translokation abgeleitetes Fusions-mRNA-Transkript ist und die Oligonukleotidsonde spezifisch mit einer von bcr- abgeleiteten Sequenz oder mit einer von abl-abgeleiteten Sequenz, jedoch nicht mit beiden Sequenzen, bindet.
  11. Ein zweiter Primer zur Verwendung im Verfahren gemäß einem. der Ansprüche 3 bis 10 mit einer Sequenz der SEQ ID Nr.:5.
  12. Eine Oligonukleotidsonde zur Verwendung im Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 mit der Sequenz der SEQ ID NR.:9, SEQ ID Nr.:16, SEQ ID Nr.:26 oder SEQ ID Nr.:27.
  13. Die zweite Oligonukleotidsonde zur Verwendung im Verfahren gemäß Anspruch 8 mit der Sequenz der SEQ ID Nr.:16.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7750142B2 (en) 2003-04-28 2010-07-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of glucagon receptor expression
US7399853B2 (en) 2003-04-28 2008-07-15 Isis Pharmaceuticals Modulation of glucagon receptor expression
WO2005003393A2 (en) * 2003-07-02 2005-01-13 Keygene N.V. Splice site aflp
BR112014006587B1 (pt) 2011-09-20 2021-07-27 Ionis Pharmaceuticals, Inc Composto compreendendo oligonucleotídeo que modula a expressão de gcgr, composição, bem como seu uso no tratamento ou prevenção de diabetes

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5283174A (en) * 1987-09-21 1994-02-01 Gen-Probe, Incorporated Homogenous protection assay
US5057410A (en) * 1988-08-05 1991-10-15 Cetus Corporation Chimeric messenger RNA detection methods
WO1991001384A1 (en) * 1989-07-11 1991-02-07 Gen-Probe, Incorporated Nucleic acid sequence amplification methods utilizing a transcription complex
US5459253A (en) * 1991-07-19 1995-10-17 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. M-RNA purification
DE4447015C2 (de) * 1994-12-30 1997-09-11 Invitek Gmbh Verfahren zur schnellen Isolierung und ggf. Lagerung von Ribonukleinsäuren
WO1995034569A1 (de) * 1994-06-14 1995-12-21 Invitek Gmbh Universelles verfahren zur isolierung und reinigung von nukleinsäuren aus extrem geringen mengen sowie sehr stark verunreinigten unterschiedlichsten ausgangsmaterialien
AU3417895A (en) * 1995-08-25 1997-03-19 Dade International Inc. Chronic myelogenous leukemia diagnostic assay
US5804384A (en) * 1996-12-06 1998-09-08 Vysis, Inc. Devices and methods for detecting multiple analytes in samples

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