ES2221750T3 - Metodo para la deteccion y medicion de acidos nucleicos cortados y empalmados. - Google Patents

Abstract

Un método para detectar un ácido nucleico de fusión en una muestra, comprendiendo los pasos de: a) proporcionar una muestra que contenga un primer ácido nucleico de fusión de cadena simple comprendiendo la zona de empalme bcr-abl; b) poner en contacto bajo condiciones de amplificación de ácidos nucleicos: el primer ácido nucleico de fusión de cadena simple, un primer cebador promotor que hibrida específicamente al primer ácido nucleico de fusión de cadena simple en un primer sitio de unión del cebador localizado 3¿ respecto el sitio de la zona de empalme y en la secuencia abl, y al menos una actividad polimerasa de ácido nucleico; c) amplificando el primer ácido nucleico de fusión de cadena simple en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos usando el primer cebador para producir varias hebras de ácidos nucleicos secundarias complementarias al menos a una porción del primer ácido nucleico de fusión de hebra simple, en donde cada segunda hebra de ácido nucleico comprende: un sitio dezona de empalme complementario, un primer sitio de unión a la sonda en una secuencia bcr localizada 3¿ y no solapando el sitio de zona de empalme complementario, y un segundo sitio de unión a la sonda en una secuencia abl localizada hacia 5¿ y no solapando el sitio de zona de empalme complementario, en donde el segundo sitio de unión a la sonda solapa o se localiza 3¿ a la secuencia complementaria al primer sitio de unión al cebador; d) hibridando las segundas hebras de ácido nucleico bajo condiciones de hibridación con una sonda de oligonucleótidos que hibrida específicamente al primer sitio de unión a la sonda o al segundo sitio de unión a la sonda pero no a ambos sitios, formando así un híbrido sonda:diana; y e) detectar el híbrido sonda:diana en formato de ensayo homogéneo como una indicación de la presencia del primer ácido nucleico de fusión de cadena simple en la muestra.

Description

Métodos para la detección y medición de ácidos nucléicos cortados y empalmados.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a la detección y medición de ácidos nucleicos derivados de fuentes biológicas, y específicamente se refiere a métodos para detectar específicamente mRNA cortado y empalmado, incluyendo mRNA cortado y empalmado de forma normal resultante del procesado intracelular y mRNA cortado y empalmado de forma atípica resultante de los eventos de translocación cromosómica como los que ocurren en algunas células cancerosas.

Antecedentes de la invención

En eucariotas, la información genética en DNA está presente en los cromosomas contenidos dentro del núcleo. Algunos virus contienen estructuras genéticas similares a cromosomas. La información genética contenida dentro de una cadena de DNA depende de la secuencia de las bases (es decir, "secuencia de bases" o "secuencia de nucleótidos") donde las bases son adenina (A), guanina (G), citosina (C) y timina (T). El DNA codifica secuencias de ácido ribonucleico mensajero complementario (mRNA), en las que la T se reemplaza por uracilo (U) y la secuencia de nucleótidos 5' a 3' especifica la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada. Los genes eucariotas generalmente incluyen regiones codificantes no contiguas ("exones") separadas por regiones no codificantes intermedias ("intrones"). La transcripción nuclear de un gen sintetiza un mRNA precursor (pre-mRNA, incluyendo intrones y exones) complementarios a la cadena codificante de DNA. El procesamiento normal del pre-mRNA elimina los intrones mediante corte y empalme del RNA para unir covalentemente los exones y escindir al mismo tiempo los intrones. El mRNA nuclear maduro resultante sale al citoplasma donde se da lugar la traducción a proteínas.

La maduración de los ácidos nucleicos también sucede en el ciclo vital de muchos virus. Algunos virus se integran en el DNA de una célula huésped en forma de provirus utilizando un mecanismo de corte y empalme en que el DNA huésped se escinde y el ácido nucleico viral se inserta y liga en el DNA huésped. La inserción viral a menudo sucede en un locus específico o loci relacionado, característico del virus o familia viral, en el cromosoma huésped. Los provirus patogénicos presentes en una población de células diana están a menudo asociados con una enfermedad o condición específica. La inserción de un provirus dentro de un exón cromosómico o cerca de un borde intrón-exón puede desencadenar la producción de una versión anormal de un mRNA transcrito de forma normal y/o de una proteína traducida, con los consecuentes efectos deletéreos sobre la célula.

Los métodos de biología molecular han sido utilizados para investigar la base genética de la enfermedad e identificar los eventos moleculares, pej., maduración genética aberrante, deleciones, inserciones, sustituciones y amplificaciones, que son responsables de algunas enfermedades, como el cáncer, algunos eventos de maduración genética aberrante no son aleatorios y característicos de algunas enfermedades.

Las translocaciones cromosómicas son eventos de recombinación genética asociados con ciertos tipos de cáncer, como algunas leucemias y linfomas. En algunas translocaciones, dos cromosomas diferentes se reensamblan mediante intercambio genético recíproco entre los cromosomas formando dos cromosomas híbridos, cada uno incluyendo porciones de dos cromosomas normales. Otras translocaciones son recombinaciones intracromosomales, en las que dos regiones normalmente no contiguas del mismo cromosoma se juntan. Un "empalme de punto de rotura", de una translocación se refiere a un punto de empalme de secuencias derivadas de localizaciones cromosómicas normalmente separadas. Un empalme de punto de rotura puede agruparse en localizaciones conservadas dentro de uno o ambos de los dos cromosomas. Las translocaciones que ocurren dentro de una región genética codificante puede resultar en un mRNA anormal teniendo porciones discretas, pej., una porción 5' derivada de una localización cromosómica y una porción 3' derivada de otra localización cromosómica. Tales transcritos anormales son conocidos como "transcritos de fusión" o "mRNA de fusión".

Una familia de translocaciones son características de pacientes que poseen leucemia mieloide crónica ("LMC"). Las translocaciones asociadas a LMC ocurren entre los cromosomas humanos 9 y 22 (referidas como "t(9;22)"), y el cromosoma 22 acortado resultante es conocido como el cromosoma Philadelphia (o Ph^{1}). Los eventos t(9;22) unen porciones del gen abl del cromosoma 9, y la "región agrupada de puntos de rotura" o gen bcr del cromosoma 22. Ha sido secuenciado un cDNA preparado de un mRNA de fusión (de alrededor de 8 kb) aislado de una línea celular
Ph^{1}-positiva, revelando una translocación entre el exón 2 abl y la región bcr b3 que codifica una proteína de fusión con una actividad tirosín-quinasa (Shtivelman et al., Nature 315:550-554, 1985). La detección de anticuerpos de una proteína alterada Abl con un peso molecular superior al de la proteína normal Abl se ha utilizado para detectar las células Ph^{1}-positiva, diagnóstico de LMC (ver Patente Estadounidense No 4.599.305 a Wiite et al.).

Otra translocación entre los cromosomas 22 y 9, dentro de una región bcr alrededor de 50 kb en 5' hacia la región bcr asociada a LMC, es característico de leucemia linfoblástica aguda (LLA). Las translocaciones asociadas a LLA suceden dentro del primer intrón putativo de la región bcr, produciendo un mRNA quimérico que empalma el bcrb1 del cromosoma 22 y el exón 2 abl del cromosoma 9, que a su vez produce una proteína de fusión (Hermans et al., Cell 51:33-40, 1987) Las translocaciones asociadas a LLA en el cromosoma 22 han sido detectadas con sondas específicas para una porción del gen bcr (ver Pub. de Patente Europea PE 0 364 953 por Nakamura et al.).

Las translocaciones cromosómicas que involucran a los cromosomas 8 y 21 han sido asociadas con alrededor de un 40% de leucemia mielógena aguda pediátrica ("AML") con la morfología FAB-M2. Los puntos de rotura en ambos cromosomas son variables, pero generalmente resultan en un transcrito común de fusión que contiene porciones 5' del gen AML1 del cromosoma 21 y porciones 3' del gen ETO del cromosoma 8, que produce una proteína de fusión (ver Patente Estadounidense No. 5.580.727 a Ohki et al.).

Otras translocaciones cromosómicas asociadas con enfermedades tales como linfomas y leucemias son la translocación t(15;17) asociada a LLA, y las translocaciones t(12;21), t(4;11) y t(1;19) asociadas a AML.

La detección de DNA quimérico y/o RNA y/o proteínas de fusión asociadas con condiciones o enfermedades anormales tales como las ejemplificadas anteriormente es útil para confirmar un diagnóstico inicial, para monitorizar la repuesta a un tratamiento de un paciente, y para proporcionar un aviso temprano de la recurrencia de la enfermedad tras la remisión. La capacidad de detectar ácidos nucleicos quiméricos o proteínas ha sido limitada por el extremadamente pequeño número de células presentes en diferentes estadios de una enfermedad, pej., tras la remisión o en una fase no aguda. El pronóstico de un paciente para enfermedades asociadas con las translocaciones cromosómicas, incluyendo recurrencia en la enfermedad, es normalmente más favorable con un diagnóstico precoz. Generalmente, las técnicas inmunológicas no son suficientemente sensibles para detectar cantidades muy pequeñas de analito en una muestra.

Los métodos para el diagnóstico de enfermedades asociadas con translocaciones cromosómicas, tales como LMC y LLA han sido descritos. La Pat. Estadounidense No. 4.681.840 a Stephenson et al. y la Pub. PCT No. WO 85/03297 presentan métodos de hibridación y DNA para detectar anormalidades Ph^{1} asociadas a LMC usando una sonda derivada de DNA complementaria a la región bcr. Las translocaciones t(9;22) asociadas a LMC que unen bcr b2 o b3 con el exón 2 de abl pueden detectarse mediante la amplificación del mRNA de fusión y entonces hibridar sondas de oligonucleótidos sintéticos específicos para estas secuencias empalmadas al ácido nucleico amplificado (ver Pat. Estadounidense No. 4.874.853 a Rossi et al y Pub. de Patente Europea No. 0338713). Los métodos de detección de transcritos génicos aberrantes únicos hibridando el RNA con uno o más oligonucleótidos de DNA sintéticos complementarios a las secuencias codificadas por el cromosoma Ph^{1} descrito en la Patente Estadounidense No. 4.999.290 a Lee. En estos métodos, se forma un heterodúplex de DNA-RNA que es resistente a la degradación enzimática, seguida por la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la detección de DNA para indicar la presencia de transcritos de genes aberrantes. Los oligonucleótidos de DNA complementarios incluyen las secuencias bcr b2 y/o b3 y secuencias abl. Las secuencias de DNA y los métodos de hibridación para detectar e identificar aberraciones cromosómicas en DNA de tumores que contienen la región del punto de rotura ALL-1 del cromosoma humano 11 (pej., translocaciones t(9;11)) son conocidas (ver Patente Estadounidense Nos. 5.567.586 y 5.633.136 a Croce
et al.).

Los métodos que usan sondas de empalme para detectar translocaciones pueden detectar sólo DNA o mRNA resultante de los eventos de fusión específicos debido a que cada sonda está dirigida a un empalme de punto de rotura específico. Para las translocaciones, tales como los eventos asociados a LMC, que pueden usar cualquiera de los puntos de rotura para ocurrir dentro de un región pequeña de bcr, la detección de mRNA de fusión requeriría el uso de muchas sondas diferentes de empalmes de punto de rotura. También, las mutaciones puntuales que pueden limitar la hibridación de sondas están algunas veces localizadas dentro de unas cuantas bases de una zona de empalme. Además, las reorganizaciones cromosómicas como las deleciones o inserciones dentro del gen bcr pueden producir transcritos asociados a LMC menos comunes que pueden no detectarse usando una sonda de empalme de punto de rotura.

La Patente Estadounidense No. 5.487.970 a Rowley et al. presenta métodos para detectar translocaciones del cromosoma 11 (11q22), usando una sonda de empalme de punto de rotura, o empleando hibridación fluorescente in situ (FISH). En el método FISH, dos sondas marcadas fluorescentemente dirigidas a las regiones cromosómicas 11q22 flanqueantes a un punto de rotura comúnmente encontrado se hibridan a cromosomas in situ que se observan entonces usando un microscopio de fluorescencia. Las células en las que la marca está presente sólo en el cromosoma 11 están clasificadas como normales, mientras que las células en que la marca aparece en diferentes cromosomas se identifican como poseedoras de una translocación. Este método requiere el cribaje de una población celular relativamente grande a menos que la translocación esté presente en muchas células de la muestra. Las sondas incluyen fragmentos de restricción de endonucleasa que pueden hibridar a translocaciones cromosómicas que involucran el gen ALL-1 del cromosoma 11 (usando FISH o Southern blotting). Otros métodos de FISH que detectan las translocaciones asociadas a LMC usan sondas derivadas de regiones de DNA específicas de especie entre segmentos repetidos (secuencias "inter-Alu") como se describe en la Patente Estadounidense No. 5.538.869 a Siciliano et al.

Los métodos anteriormente mencionados se refieren a la detección directa del RNA quimérico o DNA mediante hibridación de ácidos nucleicos sin amplificación de señal o diana. Por lo tanto, estos métodos de detección requieren un número relativamente grande de células diana portadoras del reordenamiento cromosómico en la muestra, pej., tejido, sangre, u otros fluidos corporales. Generalmente, no están presentes un gran número de células anormales en una muestra cuando la enfermedad parece estar en remisión o es un estado crónico no agudo. Así, cuando un número suficiente de células portadoras de anormalidades genéticas están presentes para permitir la detección dirigida, las opciones de tratamiento de un paciente pueden estar gravemente limitadas.

Otros métodos de detección de ácidos nucleicos utilizan la amplificación para obtener múltiples copias de un ácido nucleico diana (una o dos de las cadenas complementarias) o una molécula marcadora para aumentar la sensibilidad de detección. Una variedad de métodos de amplificación son bien conocidos (pej., ver Persing, D.H., "In Vitro Nucleic Acid Amplification Techniques" en Diagnostic Medical Microbiology: Principles and Applications 51 (Persing et al., Ed., 1993)), como se describe brevemente a continuación.

Eskola et al. (Clinical Biochemistry, Vol. 27, No. 5, págs. 373-379, 1994) revela un método para detectar translocaciones entre el gen abl del cromosoma 9 y el gen bcr del cromosoma 22 usando una reacción en cadena reversa de la polimerasa (RT-PCR) para amplificar parte de la secuencia de translocación, seguida por la detección del ácido nucleico amplificado usando un método que requiere al menos dos sondas para la detección. Una de dichas dos sondas está biotinilada y une 5' del empalme de translocación y la segunda sonda está Eu-marcada y une 3' de un empalme. La sonda biotinilada se usa para unir los complejos híbridos a un pozo recubierto de estreptavidina y la sonda Eu-marcada se utiliza para detectar los complejos por detección fluorescente en los pozos lavados.

WO 97/08339 revela métodos para detectar translocaciones bcr-abl asociadas con LMC por amplificación de las secuencias de RNA usando cebadores de amplificación que hibridan en posiciones flanqueantes a la zona de empalme y un método de transcripción asociado (pej., 3SR o NASBA), y detectando entonces el producto de reacción, si lo hay, tras capturarlo en una fase sólida tal como un micropocillo mediante agentes de captura. El paso de detección usa un agente de captura y un agente de detección para formar un complejo de agentes de detección/captura/diana unido al pocillo y se lava el material sin unir. En algunas realizaciones de WO 97/08339 los pasos de unión del agente de captura y del agente de detección pueden ser secuenciales, en los que el producto de reacción está acoplado a la fase sólida, lavado, y luego el agente de detección se une. En otro método secuencial revelado en WO 97/08339, la muestra amplificada está unida al agente de detección y el complejo agente de detección/muestra se une entonces al micropocillo recubierto por el agente de captura. Otra realización de WO 97/08339 usa unión simultánea, en que la muestra amplificada se mezcla simultáneamente con el agente de captura y el agente de detección y el complejo agentes de detección/captura/diana se aplica entonces a un
micropocillo.

La DE-A-4447015 describe un procedimiento adecuado para el aislamiento y purificación de ácidos nucleicos a partir de pequeñas cantidades de materiales altamente contaminados que comprende: (a) lisar el material con un tampón que contiene una sal caotrópica con una gran fuerza iónica; (b) incubar el lisado con un vehículo de gel de sílice homogéneo, no estructurado, no poroso y finamente dividido con un tamaño de partícula de 7-40 nm y un área de superficie 50-300m^{2}/g; (c) separar el ácido nucleico unido al vehículo del lisado; (d) lavar el vehículo con un tampón, y (e) eluir el ácido nucleico con un tampón de baja salinidad.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permite la detección de pequeñas cantidades de DNA presente en una muestra para amplificar el DNA diana usando dos o más cebadores y unos ciclos de repetición de desnaturalización térmica, hibridación de cebadores y síntesis de DNA (Patente Estadounidense No. 4.683.195 a Mullis et al.; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, 1990, Innes, M.A. et al., Eds. (Academic Press, Inc., San Diego, CA)). Generalmente, un primer cebador hibrida a una región específica del ácido nucleico diana, y un segundo cebador hibrida con la cadena opuesta del DNA diana 5' al sitio de unión del primer cebador. Entonces en una serie de pasos de síntesis, la polimerasa produce los productos de extensión de los cebadores que exponencialmente amplifican la región entre los cebadores.

La reacción en cadena de la ligasa (LCR) usa dos grupos complementarios de oligonucleótidos cortos de DNA que hibridan a dos regiones adyacentes de un ácido nucleico diana y los oligonucleótidos se unen covalentemente usando una ligasa de DNA (ver Patente Europea No. 0320308). Empleando ciclos repetidos de desnaturalización térmica, hibridación y ligación, un producto de oligonucleótido ligado de doble cadena acumulado puede detectarse para indicar la presencia de un ácido nucleico diana en una muestra.

La amplificación de desplazamiento de cadena (Walker et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:392-396), emplea cebadores de oligonucleótidos que contienen sitios de escisión por restricción de endonucleasa y se hibridan en las cadenas opuestas de un dúplex de ácido nucleico diana en cada lado de la secuencia a ser amplificada. La extensión de cebadores mediados por la polimerasa de DNA usando tres desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) y un dNTP[\alpha]S simple produce un dúplex de producto de extensión de cebadores hemifosforotioado, que está mellado en lugar de cortado por endonucleasas de restricción. Entonces, el extremo 3' de la muesca se extiende por una polimerasa de DNA que simultáneamente desplaza la cadena no hemifosforotioada. Cada cadena desplazada de un sentido puede servir como molde para la unión de cebadores oligonucleótidos de sentido opuesto, resultando en la acumulación geométrica de ácidos nucleicos de doble cadena.

Otro método de amplificación de ácidos nucleicos emplea una replicasa de RNA (Q\beta replicasa) capaz de amplificar la sonda en sí (ver Patente Estadounidense 5.112.734 a Kramer et al.).

Los sistemas de amplificación basados en la transcripción emplean una polimerasa de RNA para crear transcritos de una región diana (ver Patentes Estadounidenses Nos. 5.480.784 y 5.339.491 a Kacian et al.). Un método, llamado amplificación mediada por transcripción (TMA), usa un cebador promotor que hibrida con un ácido nucleico diana. En presencia de una transcriptasa reversa, se forma un DNA de doble cadena, formando un promotor de doble cadena. Entonces, una polimerasa de RNA produce transcritos de RNA que se convierten en moldes para las siguientes rondas de TMA en presencia de un segundo cebador capaz de hibridar con los transcritos de RNA. A diferencia de la PCR y otros métodos que requieren desnaturalización por calor, TMA es un método de amplificación isotérmico que usa la actividad RNAsa H para digerir la cadena de RNA o un híbrido de DNA-RNA, de este modo se hace disponible la cadena de DNA para hibridarse con un cebador o cebador promotor. Generalmente, la actividad RNAasa H se proporciona mediante una transcriptasa reversa proporcionada por amplificación.

Las translocaciones cromosómicas y sus productos de transcripción han sido detectados usando métodos que incluyen amplificación por ácidos nucleicos. Un método basado en PCR para detectar células que contienen DNA genómico con translocaciones cromosómicas t(14q32;18q21) asociadas con linfomas foliculares, y especialmente con recaídas y residuos mínimos de la enfermedad, por amplificación de secuencias que rodean una región de grupos de puntos de rotura, ha sido descrito en la Patente Estadounidense No 5.024.934 a Lee. Los cebadores PCR y los métodos de amplificación del cDNA para identificar las translocaciones t(9,11) en el tejido de un paciente han sido descritos en la Patente Estadounidense No. 5.633.135 a Croce et al. Los métodos para detectar metástasis de carcinoma (uno en 10.000 a 1000.000 células) que involucra la amplificación por PCR de ácidos nucleicos diana ha sido descrito por Green et al. en la Publicación de Pat. Europea No. 520794.

De forma similar, la amplificación por PCR ha sido utilizada para detectar mRNA quimérico asociado con LLA (Patente Estadounidense No. 5.057.410 a Kawasaki et al.) y transcritos de RNA originados de la translocación t(8;21) en células leucémicas (Patente Estadounidense No. 5.547.838 a Nisson et al.) La Patente Estadounidense No. 5.057.410 muestra métodos de PCR para detectar mRNA quimérico que contiene empalmes exón-exón. En este método, el mRNA extraído de la célula diana es transcrito de forma reversa para producir cDNA que está amplificado por PCR para realizar un producto de amplificación de DNA de doble cadena. Este producto de amplificación se desnaturaliza entonces y una de las cadenas resultantes es detectada por hibridación de una sonda de oligonucleótidos hacia el empalme del punto de rotura. Las sondas individuales hibridan con distintas especies de empalmes bcr-abl asociadas con LMC y LLA.

Sooknanan et al. (Experimental Hematol. 21:1719-1724,1993) describe un método para la detección de bcr-abl característico de LMC mediante extracción de RNA a partir de leucocitos de sangre periférica fraccionados con FICOLL^{TM} y amplificando un ácido nucleico diana usando un procedimiento de amplificación isotérmica que involucra la transcripción. Fueron esenciales para la amplificación y detección reacciones en serie usando cuatro cebadores de amplificación (una pareja primaria en la primera reacción y un par anidado en la segunda reacción). El ácido nucleico amplificado producido por este método fue del mismo sentido que el mRNA original y se detectó usando dos sondas de empalme bcr-abl diferentes para la detección de dos zonas de corte y empalme. Las sondas de las zonas de punto de rotura distinguen los mRNA abl y/o bcr normales de los mRNA bcr-abl quiméricos en una muestra de paciente.

Los métodos basados en PCR han sido utilizados para detectar otras translocaciones asociadas con el cáncer o sus productos de transcripción. Las sondas y los cebadores de PCR para la detección de translocaciones t(2;13) asociadas con rabdomiosarcoma han sido descritas en la Patente Estadounidense No. 5.650.278 a Barr et al. Una secuencia de ácido nucleico codificante de una proteína de fusión (ALK o quinasa de linfoma anaplástico) asociado con linfomas t(2;5) ha sido descrito en la Patente Estadounidense No. 5.529.925 a Morris et al.

Existe una necesidad en el campo para un método simple, sensible y rápido para la detección de ácidos nucleicos quiméricos, particularmente mRNA quimérico obtenido de muestras biológicas tales como sangre, médula ósea, plasma, tejido biopsiado, esputo, orina, heces, semen u otros fluidos corporales. Preferiblemente, tales métodos requerirán un mínimo de entrenamiento técnico del personal de laboratorio y un mínimo de equipamiento de laboratorio especializado (pej., centrífugas, termocicladores y equipamiento de electroforesis) y usará reactivos relativamente de bajo coste. Además, existe una necesidad para un ensayo para detectar mRNA quimérico que proporcionará un resultado capaz de ser interpretado con un mínimo de cualificación mediante, por ejemplo, la reducción las posibilidades de resultados falsos positivos y falsos negativos.

También es necesario en el campo un método simple y rápido para preparar ácidos nucleicos citoplasmáticos, particularmente mRNA, para usarlo como diana potencial en ensayos de hibridación de ácidos nucleicos para diagnóstico o como molde para la amplificación de ácidos nucleicos. Tales métodos preparativos simplificados reducen la necesidad para la extracción exhaustiva y procesos de purificación.

Un elemento crucial de métodos para detectar RNA (o productos de amplificación hechos de eso), particularmente mRNA, es la forma de extraer RNA de las células. Debido a la presencia ubicua de varias RNAsas, los métodos de extracción pueden preservar las pequeñas cantidades de RNA diana que pueden estar presentes en una muestra. Los métodos de extracción que liberan todos los ácidos nucleicos (incluyendo ácidos nucleicos nucleares) de la célula diana, producen muestras que contienen no solo el mRNA diana sino también el DNA que lo codifica que puede producir resultados falsos positivos en muchos ensayos basados en ácidos nucleicos.

Las técnicas de extracción conocidas generalmente usan un agente caotrópico tales como guanidinio para lisar las células. Un procesamiento posterior normalmente incluye cizallamiento mecánico del DNA, extracción con fenol y cloroformo, y precipitación con etanol o LiCl del RNA a partir del guanidinio. Métodos adicionales de la preparación de mRNA utiliza oligo-dT (es decir, politimina) inmovilizada en resinas para capturar mRNA poli-A.

Será ventajoso que los métodos diagnósticos que detectan RNA citoplasmático maduro sean capaces de permeabilizar células para liberar especies de RNA maduras en el tampón de extracción, mientras que no se libere de forma apreciable el material nuclear. Así, el DNA y las especies de RNA nuclear inmaduro no serán mezcladas con el ácido nucleico diana deseado. Mediante exclusión de la mezcla inicial de las especies de RNA deseados y contaminantes que contienen las mismas secuencias o complementarias y/o viscosidad incrementada, son necesarios pasos adicionales para eliminar el DNA cromosómico y así se pueden evitar los falsos positivos. Un método de lisis simple y rápido que liberará las especies de RNA, a pesar de que no libera significativamente DNA o pre-mRNA, y que no requiere un alto nivel de habilidad especializada o entrenamiento es particularmente deseable para el uso en equipos y ensayos comerciales. Existe una necesidad para un método de lisis simple y rápido que proporciona RNA adecuado para la amplificación de ácidos nucleicos cualitativa y/o cuantitativa o detección directa de ácidos nucleicos específicos.

Resumen de la invención

La presente invención está dirigida a métodos de ensayo para detectar ácidos nucleicos de fusión, particularmente especies de mRNA quimérico, en una muestra biológica.

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un método para detectar un ácido nucleico de fusión en una muestra incluyendo los pasos de proporcionar una muestra que contiene un primer ácido nucleico de fusión de cadena simple que incluye un sitio de empalmes bcr-abl; contactando bajo condiciones de amplificación de ácidos nucleicos el primer ácido nucleico de fusión de cadena simple, un primer cebador promotor que hibrida específicamente al ácido nucleico de fusión en el primer sitio de unión de cebador localizado en 3' del sitio de empalme y en una secuencia abl, y al menos una actividad polimerasa de ácido nucleico. Entonces, el método incluye amplificar el ácido nucleico de fusión en una reacción de amplificación de ácido nucleico usando el primer cebador promotor para producir una pluralidad de segundas cadenas de ácido nucleico complementarias al menos a una porción del primer ácido nucleico de fusión de cadena simple que contiene el sitio de empalme. Cada segunda cadena de ácido nucleico incluye un sitio de empalme complementario, un primer lugar de unión a sondas en una secuencia bcr localizada en 3' y que no se solapa con el sitio de empalme complementario, y un segundo lugar de unión a sondas en una secuencia abl localizada en 5' y que no se solapa con el sitio de empalme complementario, en donde el segundo lugar de unión a sondas se solapa o está localizado 3' hacia la secuencia complementaria del primer lugar de unión a cebadores. El método incluye entonces los pasos de hibridación de las segundas cadenas de ácidos nucleicos bajo condiciones de hibridación con una sonda de oligonucleótidos que hibrida específicamente con el primer o segundo sitio de unión a sondas, formando así un híbrido sonda:diana, y detectando el híbrido sonda:diana en un formato de ensayo homogéneo como indicación de la presencia de ácidos nucleicos de fusión en la muestra. En una realización del método, el primer ácido nucleico de fusión de cadena sencilla es un mRNA, la actividad polimerasa es una polimerasa de RNA, y la sonda de oligonucleótido es del mismo sentido que el mRNA y se hibrida específicamente con el primer sitio de unión a sondas. En otra realización del método, el primer ácido nucleico de fusión de cadena sencilla es un mRNA, las segundas cadenas de ácido nucleico son RNA complementarias, y el paso de amplificación además incluye el contacto de las segundas cadenas de ácido nucleico con un segundo cebador o cebador de promotor que hibrida específicamente con un segundo sitio de unión a cebador en una secuencia bcr localizada 3' hacia tanto el sitio de empalme complementario como el primer sitio de unión de la sonda, y utiliza una actividad polimerasa de RNA, una actividad polimerasa de DNA dirigida por DNA y una actividad polimerasa de DNA dirigida por RNA en los productos de amplificación sintetizados. En una realización, la sonda de oligonucleótidos hibrida específicamente con el segundo lugar de unión a sondas y es incapaz de formar un complejo de hibridación estable con el primer ácido nucleico de fusión de cadena sencilla. El método también puede incluir, en el primer paso, la preparación de RNA citoplasmático a partir de células eucariotas en la muestra mediante el contacto de una muestra biológica que comprende el ácido nucleico de fusión con una solución que contiene un tampón, que posee un pH en un rango de alrededor de 6,5 a alrededor de 8,5, una sal soluble con una fuerza iónica en el rango de alrededor de 150 mM a alrededor de 1 M, un agente quelante en una concentración de alrededor de 5 mM y un detergente no iónico en el rango de alrededor de 0,5% a alrededor de 1,5% (v/v), liberando de este modo RNA de las células presentes en la muestra. El paso de preparación de la muestra puede además incluir los pasos de contactar la muestra con un soporte sólido que está unido a un oligonucleótido inmovilizado que incluye una secuencia de bases de nucleótidos que bajo condiciones de hibridación forma, directa o indirectamente, un complejo de hibridación estable con un ácido nucleico de fusión de cadena sencilla presente en la muestra, y separando el complejo de hibridación unido al soporte sólido de otros componentes de la muestra. En realizaciones preferidas el ácido nucleico de fusión preferida es mRNA y la secuencia de bases de nucleótidos del oligonucleótido inmovilizado incluye una secuencia poli-T. En otra realización del método, el ácido nucleico de fusión es un transcrito de fusión de mRNA producido a partir de una translocación genética t(9;22) que une dos regiones cromosómicas del cromosoma 9 y el cromosoma 22 en un lugar de acumulación de empalmes; en el paso de contacto, el primer cebador promotor hibrida específicamente con el transcrito de fusión de mRNA en un primer sitio de unión a cebador derivado de una primera región cromosómica en una secuencia abl que está localizada 3' del sitio de empalmes; y en el paso de amplificación, el primer sitio de unión a sonda deriva de la segunda región cromosómica en una secuencia bcr y el segundo sitio de unión a sonda deriva de una tercera región cromosómica en una secuencia abl que se solapa o está localizada 3' a la secuencia complementaria del primer sitio de unión a cebador; y, en el paso de hibridación, la sonda de oligonucleótidos hibrida con la segunda cadena de ácido nucleico en el primer o segundo lugar de unión a sondas pero es incapaz de hibridar con el transcrito de fusión de mRNA. En una realización para detectar los transcritos de fusión de mRNA, el paso de amplificación usa un primer cebador que es un cebador promotor y un enzima que posee una actividad polimerasa de RNA, y el paso de hibridación usa una sonda de oligonucleótido que hibrida específicamente al primer lugar de unión a sonda. En otra realización, el paso de amplificación incluye un segundo cebador o cebador promotor que bajo condiciones de amplificación hibrida específicamente a una secuencia de nucleótidos de un RNA complementario al transcrito RNA de fusión y utiliza una actividad polimerasa de RNA, una actividad polimerasa de DNA dirigida por DNA, y una actividad polimerasa de DNA dirigida por RNA. En una realización preferida, la actividad polimerasa de DNA dirigida por RNA y la actividad polimerasa de DNA dirigida por DNA está proporcionada por una transcriptasa reversa. El método puede también incluir la detección de un transcrito de control interno, en que el paso de amplificación además incluye la amplificación de un transcrito de control interno, entonces el paso de hibridación además incluye una segunda sonda de oligonucleótidos que hibrida específicamente a una secuencia complementaria al transcrito de control interno, por esta razón formando un complejo de hibridación de control interno, y el paso de detección además incluye la detección del complejo de hibridación de control interno. Generalmente, el primer y segundo lugares de unión a sonda pueden derivar de las diferentes regiones de un cromosoma, o el primer sitio de unión a sonda deriva de un primer cromosoma y el segundo sitio de unión a sonda deriva de un segundo cromosoma. Por ejemplo, un transcrito de fusión de mRNA puede resultar de una translocación de cromosomas humanos seleccionados del grupo consistente de t(1;19), t(2;5), t(2;13), t(4;11), t(6;9), t(8;21), t(9;11), t(9;22), t(11;14), t(11;19), t(11;22), t(12;21), t(14;18) y t(15;17). De acuerdo con la presente invención, el transcrito de fusión de mRNA resulta de una translocación t(9;22) y la sonda de oligonucleótidos incluye una secuencia derivada de bcr o una secuencia derivada de abl. En otra realización preferida, la sonda de oligonucleótidos se une específicamente a la secuencia de bases derivada de bcr en la segunda cadena de ácido nucleico. La invención también incluye uno o más oligonucleótidos para el uso en el método de detección de un transcrito de fusión de mRNA, teniendo una secuencia se selecciona del grupo consistente de ID de SEC No: 9 a ID de SEC No: 16, ID de SEC No: 26 a ID de SEC No: 27. Preferiblemente, el segundo cebador para el uso en el método de detección de un ácido nucleico de fusión en una muestra posee la secuencia de ID de SEC No: 5. Además, se prefiere que el segundo oligonucleótido para el uso en el método de detección de un ácido nucleico de fusión en una muestra posee la secuencia de ID de SEC No: 16.

La presente invención además involucra en una realización preferida en el paso proporcionado en el método para detectar un ácido nucleico de fusión en una muestra un procedimiento de preparación de RNA de una muestra que incluye los pasos de proporcionar una muestra que contiene RNA sin purificar, mezclando la muestra con una solución que contiene un tampón con un pH en el rango de alrededor de 6,5 a alrededor de 8,5, una sal soluble con una fuerza iónica de al menos de alrededor de 150 mM, un detergente no iónico en una cantidad efectiva suficiente para liberar RNA citoplasmático de una célula sin causar un aumento de la viscosidad en la muestra debido a la liberación del DNA cromosomal de la célula, y un soporte sólido que está unido a un oligonucleótido inmovilizado que contiene una secuencia de bases de nucleótido que hibrida directamente o indirectamente, al RNA presente en la muestra, produciendo de este modo bajo las condiciones de hibridación un complejo de hibridación estable. El procedimiento entonces incluye los pasos de separación del complejo de hibridación unido al soporte sólido de otros componentes de la muestra, lavar el complejo de hibridación unido al soporte sólido con una solución de lavado con una suficiente fuerza iónica para mantener el complejo de hibridación unido al soporte sólido, y recuperando el complejo de hibridación unido al soporte sólido de la solución de lavado. En realizaciones preferidas, la muestra es sangre sin coagular, plasma o médula ósea, o una suspensión de células eucariotas. En otras realizaciones, la cantidad efectiva del detergente no iónico está entre alrededor de 0,5% a alrededor de 1,5% (v/v).

La invención está mejor descrita en la descripción detallada que sigue, con realizaciones preferidas ilustradas en las figuras y ejemplos.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1A es una descripción esquemática de la detección de un transcrito de fusión producido de una translocación entre la región bcr b3 y el gen abl, usando un cebador promotor abl T7 ("cebador abl T7") del sentido opuesto del ácido nucleico diana y un cebador que es sustancialmente idéntico a una secuencia en la región bcr b2 ("CML-1") para la amplificación y una sonda que es sustancialmente idéntico a una secuencia dentro de bcr b2,("sonda b2"). La porción oscura de la barra a la izquierda de la línea vertical representa la secuencia bcr b2, la porción oscura a la derecha de la línea vertical representa la secuencia bcr b3, y la porción luminosa representa la secuencia abl.

Fig. 1B es una descripción esquemática de la detección de un transcrito de fusión producido de una translocación entre la región bcr b2 y el gen abl-1, usando la misma combinación de cebadores y sondas que en la Fig. 1A; la porción oscura de la barra representa la secuencia bcr b2 y la porción luminosa representa la secuencia abl.

Fig. 1C es una descripción esquemática de la detección del mRNA normal de abl usando un cebador promotor T7 abl ("cebador abl T7") del sentido opuesto del ácido nucleico diana y un cebador "abl-1" del mismo sentido que el ácido nucleico diana, aquí se muestra en una localización solapante a una zona de empalme de punto de rotura potencial (mostrado como una línea vertical en la barra) en la secuencia abl.

Fig. 2 muestra la secuencia de bases de DNA 5' a 3' de la región circundante al lugar de empalme bcr-abl, como se muestra esquemáticamente en la Fig. 1A, donde la región subrayada (residuos 1 a 126) representa la secuencia bcr b2 conteniendo la secuencia complementaria a un lugar de unión a cebador (residuos remarcados 65 a 88) y la secuencia complementaria al lugar de unión a sonda b2 (residuos remarcados y en cursiva 89 a 113). La región subrayada doblemente (residuos 127 a 201) representa la secuencia bcr b3, el empalme ocurre entre las bases 201 y 202, y la secuencia restante es la región A2 del abl que contiene el lugar de unión a cebador (remarcado).

Fig. 3 muestra la secuencia de bases de DNA 5' a 3' de la región circundante a la zona de empalme potencial en un transcrito abl normal donde: los residuos 1 a 151 son la secuencia del exón abl 1b que contiene una región complementaria a un lugar de unión a cebador (residuos 84-103, remarcados); la región subrayada doblemente (residuos 102 a 119) es el complemento de un lugar de unión a sonda abl específica que flanquea la zona de empalme de ablb1 y ablb2; la región subrayada (residuos 142 a 165) es el complemento de un segundo lugar de unión a sonda que se solapa con zonas de empalme potenciales; y los residuos 175 a 201 (resaltados) son la secuencia abl normal que contiene otro lugar de unión a cebador.

Descripción detallada de la invención

En una realización preferida, la presente invención incluye en el paso proporcionado en el método para detectar un ácido nucleico de fusión en una muestra un procedimiento para preparar muestras de RNA derivadas de muestras biológicas, tales como fluidos corporales, tejido o células eucariotas. Este procedimiento relativamente simple de preparación de RNA proporciona RNA adecuada para análisis y detección de especies de RNA que suceden en abundancia relativamente baja en muestras biológicas. La presente invención también incluye métodos para detectar especies de RNA quiméricas, particularmente especies de mRNA que suceden en abundancia relativamente baja en muestras de RNA preparadas a partir de muestras biológicas. Estos métodos, útiles en los campos médicos y veterinarios, son útiles para el diagnóstico médico y monitorización clínica de la respuesta de un paciente a terapia donde una enfermedad o condición médica está asociada con un tipo particular y/o nivel de mRNA presente en una muestra biológica.

Además de las definiciones proporcionadas en cualquier otro lugar de la especificación, los siguientes términos poseen los siguientes significados a menos que se indique de otra manera. Otros términos técnicos y científicos usados aquí poseen el mismo significado como se entiende de forma común por aquellos entendidos en la materia. Las definiciones generales de muchos de los términos usados aquí se proporcionan, por ejemplo, en Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2nd Ed. (Singleton et al., 1994, John Wiley & Sons, New York, NY), The Harper Collins Dictionary of Biology (Hale & Marham, 1991, Harper Perennial, New York, NY), y Dorland's Illustrated Medical Dictionary, 27ª Ed. (W.A. Dorland, 1988, W.B. Saunders Co., Philadelphia, PA).

Por "secuencia de nucleótidos" se entiende la secuencia de bases nitrogenadas a lo largo de una molécula lineal que contiene información que es capaz de hacer puentes de hidrógeno con un DNA o RNA que contiene una secuencia de bases complementarias. El término no se indica para limitar tales moléculas que contienen información a polímeros de nucleótidos, sino que también incluye moléculas que contienen uno o más análogos de nucleótidos. Por ejemplo, los análogos pueden contener subunidades que contienen una porción de azúcar o sustituto diferente de ribosa o desoxiribosa (pej., azúcares de pentosa 2'haluro- o metoxi-sustituidos), y/o enlaces conocidos diferentes de los enlaces fosfodiéster (pej., enlaces fosforotioato, metilfosfonato, y peptídicos). Un dúplex de ácido nucleico unido a hidrógeno contiene dos cadenas de ácido nucleico complementario. Estas cadenas referidas se dice que son de "sentido" opuesto, porque la secuencia de nucleótidos de cada una de ellas es perfectamente complementaria a la otra y automáticamente dicta la secuencia de nucleótidos de la otra cadena, aún cuando la secuencia de nucleótidos de cada cadena difiere de la otra. Convencionalmente, una cadena se designa de forma arbitraria como cadena (+) y la otra cadena se designa como cadena (-).

Por "oligonucleótido" se entiende una cadena polimérica de al menos dos, generalmente entre alrededor de cinco y alrededor de 100, subunidades químicas, cada subunidad comprendiendo una porción de bases de nucleótidos, una porción de azúcar y una porción enlazante que une las subunidades en una configuración espacial lineal. Las porciones de bases de nucleótidos comunes son guanina (G), adenina (A), citosina (C), timina (T) y uracilo (U), aunque otras bases de nucleótidos raras o modificadas capaces de unirse a hidrógeno son bien conocidos por aquellos adiestrados en el campo. Porciones de azúcar comunes son ribosa y desoxiribosa, aunque 2'-O-metil ribosa, azúcares halogenados, y otros azúcares diferentes y modificados son conocidos en el campo. Normalmente, el grupo enlazante es una porción que contiene fósforo, más comúnmente un enlace fosfodiéster, aunque otros enlaces, tales como por ejemplo, fosforotioatos, metilfosfonatos, y enlaces que no contienen fósforo tales como enlaces similares a los peptídicos son conocidos en el campo, así como los oligonucleótidos que contienen tales enlaces ("péptidos de ácidos nucleicos") o PNA). Los PNA están incluidos dentro de esta definición de un oligonucleótido. De forma similar, las porciones de bases de nucleótidos pueden modificarse, pej., mediante la adición de grupos propino, siempre que la porción de bases modificadas retenga la capacidad de formar una asociación no covalente con G, A, C, T o U y un oligonucleótido que comprende al menos una porción de bases de nucleótidos modificadas no está estéricamente impedida de hibridar con un ácido nucleico de cadena sencilla. Un oligonucleótido tiene una secuencia de porción de bases de nucleótidos que proporciona información que permite al oligonucleótido hibridar con una cadena de ácido nucleico
complementario.

Por "condiciones de amplificación de ácidos nucleicos" se entienden las condiciones ambientales que incluyen la concentración de sal, temperatura (incluyendo ciclación de temperatura o isotérmica), al menos una polimerasa de ácido nucleico, nucleósidos trifosfato, y cofactores que permiten la amplificación de un ácido nucleico diana usando un determinado método de amplificación de ácido nucleico. El producto de amplificación también es referido como "amplicón".

Por "cebador" se entiende un oligonucleótido que se une a la región de un ácido nucleico diana (es decir, el "sitio de unión a diana" o "región de unión a diana" del cebador) y promueve la amplificación de ácido nucleico del ácido nucleico diana. Normalmente, un cebador posee el extremo 3' que se extiende mediante una polimerasa de ácido nucleico. Un cebador promotor es un oligonucleótido que incluye una secuencia promotora localizada en 5' de la región de unión a diana. Bajo ciertas circunstancias el extremo 3' de un cebador promotor, o una subpoblación de cebadores promotores, pueden ser modificadas para bloquear o reducir la extensión del cebador.

Por "secuencia diana" se entiende la secuencia de bases de nucleótidos de una cadena de ácidos nucleicos (RNA o DNA), al menos una porción de la cual que es detectable usando una sonda marcada, que está unida a su lado 3' mediante un sitio de unión a cebador, o la secuencia de bases de DNA o RNA exactamente complementaria.

Por "equivalente de RNA" se entiende un RNA que tiene la misma secuencia de bases de nucleótidos como DNA, excepto que U está sustituida por T.

Un "soporte sólido" es esencialmente un material insoluble, bajo las temperaturas y solventes proporcionados, que comprende los grupos químicos que se unen con un oligonucleótido o un ácido nucleico. Particularmente preferido es un soporte sólido covalentemente acoplado a un oligonucleótido que se une directa o indirectamente a un ácido nucleico diana. Cuando el ácido nucleico diana es un mRNA, el oligonucleótido acoplado preferiblemente comprende una secuencia de bases de nucleótidos poli-T. Preferiblemente, el soporte sólido es una partícula (pej., cuenta o esfera) en el rango de tamaño del micrón o submicrón. Un soporte sólido debe estar construido de uno o más de los siguientes materiales, sílice, poliacrilato, poliacrilamida, un metal, poliestireno, látex, nitrocelulosa, polipropileno y nylon, y preferiblemente está atraído por un campo magnético (pej., conteniendo un núcleo de magnetita).

Por "secuencia de nucleótido" se entiende la secuencia lineal de bases nitrogenadas en una molécula que contiene información que enlaza hidrógeno con un DNA o RNA que tiene una secuencia de bases complementarias. El término no se limita a tales moléculas que contienen información como polímeros de nucleótidos sino que incluye moléculas que contienen uno o más análogos de nucleótidos. Los análogos de nucleótidos pueden contener una o más subunidades que contienen una porción de azúcar o sustituto diferente de ribosa o desoxiribosa (pej., azúcares de pentosa 2'haluro- o metoxi-sustituidos), y/o enlaces conocidos diferentes de los enlaces fosfodiéster (pej., enlaces fosforotioato, metilfosfonato, y peptídicos).

Por "sonda de zona de empalme" se entiende la sonda que contiene una secuencia que es suficientemente complementaria para hibridar con secuencias en los sitios 5' y 3' de un punto de empalme. De forma similar, una "sonda de empalme de punto de rotura" contiene una secuencia que es suficientemente complementaria para hibridar con las secuencias en los sitios 5' y 3' de un ácido nucleico quimérico. Esto es, el sitio de unión a sonda de una sonda de empalme o una sonda de empalme de punto de rotura abarca la zona que une las secuencias que normalmente no son contiguas.

Por "sitio de empalme" se entiende la posición, en la secuencia de bases de nucleótidos de un ácido nucleico u oligonucleótido (o su cadena complementaria), en la que la secuencia localizada en 5' del sitio de empalme en una cadena del ácido nucleico deriva de una primera región de ácido nucleico y la secuencia localizada 3' del sitio de empalme (con referencia a la misma cadena) deriva de una segunda región de ácido nucleico, en donde la primera y segunda región normalmente no están contiguas.

Por ácido nucleico de "fusión" o "quimérico" se entiende un ácido nucleico u oligonucleótido que contiene secuencia adyacentes o contiguas que derivan de una primera y segunda región de ácidos nucleicos, en donde la primera y segunda región normalmente no están adyacentes o contiguas en el DNA celular. Generalmente, el ácido nucleico quimérico se encuentra en ácidos nucleicos de células anormales.

En una realización preferida, la presente invención incluye en el paso proporcionado en el método para detectar un ácido nucleico de fusión en una muestra, un procedimiento rápido y simplificado para la preparación de RNA de una muestra biológica, particularmente del citoplasma de células eucariotas, que es adecuado para el uso en un ensayo de amplificación y detección. Este procedimiento también se puede utilizar para preparar RNA viral de una muestra biológica (pej., plasma). Este procedimiento no requiere extracción extensiva, cizallamiento de DNA cromosómico para reducir la viscosidad, o el uso de reactivos potencialmente peligrosos (pej, fenol o cloroformo) para preparar RNA. Además el procedimiento minimiza los pasos de preparación de muestras, limitando así la pérdida de muestra y la variabilidad durante la preparación. Este incremento de la fiabilidad y reproducibilidad en la preparación de RNA es particularmente útil para ensayos que detectan baja abundancia de especies de RNA, tales como especies de RNA de fusión o quiméricas. La invención también incluye un método para detectar o cuantificar las especies de RNA de fusión o quiméricas. Este método incluye un paso inicial de contacto, bajo condiciones de amplificación de ácidos nucleicos: (1) un primer ácido nucleico de fusión de cadena sencilla que incluye un sitio de empalme, (2) un primer cebador promotor capaz de hibridar al ácido nucleico de fusión en un sitio de unión a cebador localizado en 3' del sitio de empalme, y (3) al menos una actividad de polimerasa de ácido nucleico. Entonces, el método procede a amplificar el ácido nucleico de fusión en una reacción de amplificación de ácido nucleico, produciendo así múltiples cadenas de ácidos nucleicos secundarias, incluyendo cada una de ellas una región complementaria a una región del ácido nucleico de fusión inicial que incluye el sitio de empalme, un primer sitio de unión a sonda en una secuencia bcr localizada en 3' y que no se solapa con el sitio de empalme, y un segundo sitio de unión a sonda en una secuencia abl localizada en 5' y que no se solapa con el sitio de
empalme.

El segundo sitio de unión a sonda se puede solapar o estar localizado en el lado 3' del primer sitio de unión a sonda. Entonces, el método incluye hibridar la segunda cadena de ácido nucleico complementaria bajo condiciones de hibridación con una sonda de oligonucleótidos capaz de hibridar con el primer o segundo sitio de unión a sonda, formando así un híbrido sonda:diana (es decir, un complejo de hibridación formado por emparejamiento de pares de bases entre la secuencia de bases de la sonda y la secuencia de bases de la diana). El híbrido sonda:diana se detecta en un ensayo homogéneo como indicador de la presencia del ácido nucleico de fusión en una muestra de la que se obtiene el ácido nucleico de fusión de cadena sencilla. En este método, si el ácido nucleico de fusión es RNA, la sonda de oligonucleótidos es del mismo sentido que el ácido nucleico de fusión de cadena sencilla. Si sólo un cebador (o cebador promotor) se utiliza en el paso de amplificación, entonces la sonda se dirige hacia el primer sitio de unión a sonda.

Es importante remarcar que este método no utiliza cebadores anidados o necesita de reacciones de amplificación seriadas. Preferiblemente, el método utiliza un sistema de amplificación mediado por transcripción que ha sido descrito previamente en detalle en las Patentes Estadounidenses Nos. 5.480.784, 5.399.491 y 5.554.516 a Kacian et al. En una realización del presente método, se utilizan dos oligonucleótidos en el proceso de amplificación: un cebador promotor de sentido opuesto del RNA de fusión a detectar y un cebador del mismo sentido que el RNA en la localización 5' del sitio de unión del cebador promotor y del sitio de empalme.

Tal como se usa aquí, un "cebador promotor" es un oligonucleótido que contiene al menos dos secuencias distintas de bases de nucleótidos. La primera secuencia es la secuencia cebadora que hibrida con un sitio de unión del RNA de fusión en la localización 3' de la zona de empalme. La segunda secuencia es una secuencia promotora, localizada 5' a la secuencia cebadora, que proporciona un sitio de unión preferido para una polimerasa de RNA para empezar la transcripción cuando la secuencia promotora es de doble cadena. Así, la secuencia promotora permite la transcripción de la secuencia de bases de nucleótidos a la que el cebador promotor está hibridado (es decir, síntesis de RNA usando el RNA quimérico como molde). Un ejemplo de un cebador promotor es el ID de SEC No: 1 en que los residuos 1 a 27 proporcionan una secuencia promotora funcional T7 cuando es de doble cadena, y los residuos 28 a 54 proporcionan una secuencia cebadora que se une a una secuencia de bases de nucleótidos.

En otra realización, el ensayo utiliza un oligonucleótido de amplificación sencilla que es un cebador promotor. Cuando un cebador promotor sencillo se emplea sin cebador de sentido opuesto, el RNA quimérico se detecta usando una sonda del mismo sentido que el RNA quimérico que hibrida con una región de secuencia de bases de nucleótidos localizada 3' del sitio de empalme en el ácido nucleico amplificado complementario. De esta forma, sólo se detecta el RNA quimérico amplificado. Los métodos de amplificación de ácidos nucleicos que emplean un cebador promotor sencillo han sido descritos en detalle en la Patente Estadounidense No. 5.554.516 a Kacian et al.

Preferiblemente, los cebadores (incluyendo los cebadores promotores) y las sondas están dirigidas a regiones que están normalmente discontinuas dentro del DNA cromosómico. Por ejemplo, en una realización preferida del método, las regiones comprenden secuencias de bases de nucleótidos que están normalmente presentes diferentes cromosomas. De forma parecida, para detectar ácidos nucleicos que comprenden regiones derivadas tanto de virus (pej., provirus) y ácidos nucleicos eucariotas, las secuencias contenidas en estas regiones individuales no son normalmente continuas. también, las regiones a detectar deben ser aquellas que están normalmente presentes en partes separadas del mismo cromosoma, pero que están tan ampliamente separadas que no se coamplificarán mediante métodos de amplificación en ausencia de un evento de corte y empalme o translocación intracromosomal.

En una realización en que se utilizan dos cebadores, la sonda de detección puede dirigirse a una secuencia de bases de nucleótidos en cualquier lado del sitio de empalme. En este aspecto de la presente invención, la sonda debe ser del mismo sentido al del RNA quimérico. Los ácidos nucleicos amplificados de sentido opuesto son detectados, permitiendo así la discriminación entre los mRNA "normal" (que no está amplificado) y los RNA empalmados de forma anormal (que ha sido amplificado). Además, ya que la sonda no está dirigida hacia la zona de empalme, pero se une a una secuencia flanqueante fuera del punto de rotura o región de empalme, una sonda sencilla puede detectar múltiples formas de corte y empalme que pueden resultar de los diferentes eventos de corte y
empalme.

Por "flanqueante" se entiende el sitio de translocación a los que los sitios de unión a oligonucleótidos están localizados en las posiciones de cada lado del sitio de empalme o de la región de agrupación de puntos de rotura. En muchas enfermedades y condiciones asociadas con translocaciones cromosómicas, deben haber múltiples especies posibles de RNA quimérico. En cada RNA quimérico, una zona de empalme conocida posee una secuencia de nucleótidos particular a la que una sonda puede unirse de forma específica, pero este tipo de detección requiere la inclusión de sondas potencialmente de muchas zonas de empalme, cada una dirigida a una especie de RNA quimérica conocida, tanto comunes como raras.

Muchas translocaciones caracterizadas poseen agrupaciones de puntos de rotura en regiones concretas conocidas que están asociadas con la enfermedad o condición dada. Para detectar una translocación como marcador de una enfermedad o condición dada, no es necesario detectar o caracterizar cada especie de RNA quimérico. En su lugar, usando el presente método, sólo es necesario para detectar si un RNA asociado con un evento de translocación se ha producido por la célula diana y se ha amplificado.

En una realización preferida, la capacidad del mRNA diana a ser amplificado indica que ha sucedido una translocación en una célula. En otra realización, tales como en el método de amplificación empleando un cebador promotor sencillo, ambos transcritos normales y empalmados se amplifican, pero la sonda no hibrida con los ácido nucleico amplificados del transcrito normal. En ambos casos, la detección del RNA amplificado puede usar cualquiera de los diferentes métodos conocidos tales como electroforesis en gel, aumento de absorción de luz, cambio hipercromático, o el uso de una sonda detectable, preferiblemente una sonda de oligonucleótido marcada. Marcadores adecuados incluyen, enzimas, sustratos de enzima, moléculas fluorescentes, luminiscentes, quimioluminiscentes y electroquimioluminiscentes, radionúcleos, y átomos fluorescentes. Marcas preferidas son las marcas fluorescentes o quimioluminiscentes, y más preferiblemente éster de acridinio.

Las sondas pueden dirigirse a cualquier región del ácido nucleico amplificado, siempre que la sonda hibride específicamente con el ácido nucleico amplificado. Las sondas preferidas detectan secuencias fuera del sitio de empalme (es decir, sondas flanqueantes), incrementando así el número de ácidos nucleicos cortados y empalmados de forma diferente que pueden ser detectados por este método.

Un ejemplo de dicho ensayo se muestra esquemáticamente en las Figs. 1A a 1C, que muestran dos ácidos nucleicos de fusión diana (Figs. 1A y 1B) y un ácido nucleico normal (Fig. 1C). La detección del ácido nucleico diana normal está incluido como un control interno opcional para el método de amplificación y detección. Refiriéndose a las Figs. 1A y 1B, los ácidos nucleicos de fusión diana (representados por las barras oscura y clara) se amplifican usando cebadores y los amplicones se detectan con una sonda dirigida a una secuencia de bases de nucleótidos que flanquea la zona de empalme (la unión de las barras oscura y clara) para indicar la presencia de un ácido nucleico empalmado en la muestra biológica. Este formato de ensayo es capaz de detectar cualquiera de una familia de ácidos nucleicos cortados y empalmados potencialmente, debido a que la sonda no se une a la zona de empalme. La Fig. 1C muestra un control interno (o ácido nucleico "no diana") en un ensayo donde un ácido nucleico diana normal también es amplificado y detectado en la muestra. El control interno indica que los ácidos nucleicos en la muestra fueron capaces de ser amplificados y detectados por una sonda (es decir, la ausencia de contaminantes que pudieran inhibir uno o más de estos pasos de ensayo).

Tal como se ilustra en las Figs. 1A y 1B, la amplificación de ácidos nucleicos diana no necesita ser confinada a un evento de corte y empalme de tamaño o categoría sencilla. En las Figs. 1A y 1B, los ácidos nucleicos diana son productos de fusión de dos translocaciones bcr-abl diferentes, una que une bcr b3 con abl (Fig. 1A), y la otra une bcr b2 con abl (Fig. 1B). Los ácidos nucleicos diana son amplificados usando cebadores dirigidos a sitios donde porciones normalmente no próximas de ácidos nucleicos, tales como sitios normalmente contenidos en diferentes cromosomas (pej., el sitio bcr localizado en el cromosoma humano 22 que es reconocido por el cebador "CML-1", y el sitio abl localizado en el cromosoma humano 9 que es reconocido por el "cebador T7-abl").

Tal como se muestra en las Figs. 1A y 1B, la amplificación de ácidos nucleicos usa un cebador específico para uno de los ácidos nucleicos involucrado en los eventos de corte y empalme quiméricos (pej., el "cebador T7-abl" específico para una secuencia abl) y un segundo cebador específico de otro ácido nucleico involucrados en los eventos de corte y empalme quiméricos (pej., el cebador "CML-1" específico para una secuencia bcr). Las secuencias diana amplificadas se detectan utilizando una sonda específica para una de las dos secuencias (pej., la "sonda b2" específica para una pareja bcr en los eventos de corte y empalme mostrados en las Figs. 1A y 1B). Esta combinación de cebadores y sondas son capaces de detectar más de un evento de corte y empalme quimérico debido a que los mismos cebadores pueden amplificar productos de diferente tamaño que son el resultado de diferentes eventos de corte y empalme, todos los cuales son detectables con la misma sonda. Por ejemplo, comparar el producto amplificado relativamente largo obtenido usando los cebadores CML-1 y T7-abl con el producto de fusión de la Fig. 1A con el producto amplificado relativamente corto obtenido usando los mismos cebadores que el producto de fusión de la Fig. 1B, donde ambos productos amplificados son detectados con la sonda b2. Así, los transcritos de fusión resultantes de cualquiera de los eventos de corte y empalme son detectables, independientemente de las secuencias particulares de las zonas de punto de rotura.

El ensayo puede opcionalmente incluir la amplificación y la detección de un ácido nucleico de control interno (no diana) usando un cebador que también se usa para la amplificación de ácidos nucleicos diana (pej., el cebador T7-abl en las Figs. 1A a 1C). Un segundo cebador usado para la amplificación de control interno debe ser diferente del segundo cebador utilizado en la amplificación de las secuencias diana y está dirigido a una región normalmente proximal al otro lado de la región que contiene uno o más sitios de corte y empalme potenciales (pej., el cebador abl-1 como se muestra en la Fig. 1C). Preferiblemente, este segundo cebador es capaz de amplificar los ácidos nucleicos de control interno en un sitio cercano a la región de punto de rotura para eliminar la posibilidad de que un evento de corte y empalme anormal sea confundido por los ácidos nucleicos normales. Esto es, debido a la proximidad del segundo cebador a la región potencial de la zona de empalme, el producto de amplificación del ácido nucleico de control interno incluirá una secuencia para la hibridación de sondas que será eliminada a menudo por eventos de corte y empalme anormales. Tal como se ilustra en la Fig. 1C, la amplificación del ácido nucleico abl normal no diana, utiliza cebadores para secuencias que podrían ser normalmente contiguas o ácidos nucleicos de no fusión (pej., el cebador "abl-1" y el "cebador T7-abl"). Una segunda sonda es necesaria para la detección de los ácidos nucleicos de control interno amplificados (pej., la "sonda abl" en la Fig. 1C). Esta sonda es única para la secuencia de control interno en el mismo lado de la región de corte y empalme como el cebador específico de no diana.

Las relaciones de estas regiones de secuencias se muestran en mayor detalle en las Figs. 2 y 3. La Fig. 2 muestra la secuencia de DNA 5' a 3' (ID de SEC No: 24) de la región circundante a una zona de empalme bcr-abl, tal como se muestra de forma esquemática en la Fig. 1A, en donde la región subrayada (residuos 1 a 126) representa la secuencia bcr b2 que contiene la secuencia complementaria al sitio de unión a cebador CML-1 (residuos remarcados 65 a 88; ID de SEC No: 5) y la secuencia complementaria al sitio de unión a sonda b2 (residuos remarcados y en negrita 89 a 113; ID de SEC No: 9). La región doblemente subrayada (residuos 127 a 201) representa la secuencia bcr b3 que contiene una secuencia de empalme entre los residuos 201 y 202. Desde el residuo 202 al final de la secuencia mostrada en la Fig.2 es la región abl A2 que contiene el sitio de unión a cebador (remarcado; ID de SEC No: 22) para el cebador T7-abl de las Figs. 1A a 1C.

La Fig. 3 muestra la secuencia de DNA 5' a 3' (ID de SEC No: 25) circundante a una zona de empalme potencial de región de corte y empalme en un DNA normal de abl. Los residuos 1 a 151 son secuencia del exón abl 1b y contienen una región complementaria al sitio de unión (residuos remarcados 84 a 103; ID de SEC No: 13) del cebador abl-1 de la Fig. 1C. La región doblemente subrayada (residuos 102 a 119; ID de SEC No: 26) son complementarios a un sitio de unión a sonda que flanquea la región de corte y empalme. La región subrayada (residuos 142 a 165; ID de SEC No: 16) incluye las zonas potenciales de corte y empalme, y es el complemento de un sitio de unión a sonda para la sonda abl de la Fig. 1C. Los residuos 152 a 299 son una secuencia normal de abl que contiene un sitio de unión a cebador (residuos resaltados 175 a 201; ID de SEC No: 22) para el cebador T7-abl de las Figs. 1A a 1C.

El método de amplificación preferido usado en la presente invención produce un ácido nucleico amplificado ("amplicón") que es un RNA, y más preferiblemente produce RNA predominantemente amplificado que es complementario con la secuencia diana (es decir, del sentido opuesto al de la secuencia diana). Por "predominantemente" se entiende al menos el 50% del producto, y preferiblemente más del 55%, es RNA complementario. Así, si la diana es mRNA, que arbitrariamente se designa como cadena de sentido (+), entonces los productos de amplificación son preferiblemente cadenas de sentido (-). Usando métodos de amplificación asociados a la transcripción como se ha descrito previamente los Nos. de Pat. Estadounidense 5.480.784 y 5.399.491, el cebador promotor es de sentido (-) y el ácido nucleico molde es de sentido (+), produciendo amplicones que son de sentido (-). Aunque la sonda puede ser cualquier secuencia capaz de unirse a productos de amplificación, preferiblemente la sonda de sentido (+) para hibridar a productos del sentido (-). Si un primer cebador se utiliza en común para la amplificación de ambos ácidos nucleicos de control interno, entonces la misma relación de cebadores, productos de amplificación y sondas es también utilizada para la amplificación y detección de ácido nucleico control.

Estos métodos son útiles para la detección de cualquier variedad de eventos fisiológicos o genéticos conocidos que resultan en ácidos nucleicos cortados y empalmados o reubicados de cualquier otra manera. Estos métodos son particularmente útiles para detectar la presencia de transcritos de fusión o transcritos quiméricos que resultan de translocaciones genéticas, especialmente aquellas asociadas con condiciones patológicas o enfermedades. Estos métodos son adecuados para la detección en una muestra biológica una variedad de translocaciones conocidas que están asociadas con cáncer, formas particularmente de leucemia tales como, por ejemplo, LMC y LLA.

Los métodos de la presente invención son adecuados para la detección de cualquiera de las translocaciones conocidas que pasan en humanos, requiriendo sólo el diseño de cebadores y sondas para las secuencias conocidas involucradas en las translocaciones (revisado en Mitelman et al. Cytogenet. Cell. Genet. 55:358-386, 1990). Las translocaciones detectables incluyen, pero no se limitan a las t(9;22), t(4;11), particularmente t(4;11)(q21;q23), t(9;11), particularmente t(9;11)(p22;q23), t(11;19), particularmente t(11;19)(q23;p13), t(8;21), t(1;19), particularmente en células pre-B, t(11;14), t(2;5), particularmente t(2;5)(p23;q35), t(11;22), particularmente translocaciones t(11;22)(q24;q12), t(15;17), t(6;9), t(14;18), t(12;21) y t(2;13). Las secuencias diana para la detección de estas translocaciones están incluidas en las secuencias conocidas en la materia, como se describe en: Bakhshi et al., Cell 41:899-906, 1985; Bakhshi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2396-2400, 1987; Barr et al., Genomics 11:941, 1991; Chen et al., Blood 78:2498-2504, 1991; Cleary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7439-7443, 1985, Cleary et al., Cell 47:19-28, 1986; Crescenzi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4869-4873, 1988, Domer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7884-7888, 1993, Dragon-Durey et al., Leukemia 12(7): 1159-1162, 1998; Groffen et al., Cell 36:93-99, 1984; Gu et al., Cancer Res 54:2327-2330, 1994; Hermans et al., Cell 51:33-40, 1987; Kakizuka et al., Cell 66:663-674, 1991; Kamps et al., Cell 60:547-555, 1990; Kawasaki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5698-5702; LeBeau et al., Leukemia 3(12): 866-870, 1989; Mellentin et al., Science 246: 379-382, 1989; Mitelman et al., Cytogenet. Cell. Genet .55(1-4):358-386, 1990, Nakamura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4631-4635, 1993; Nourse et al., Cell 60:535-545, 1990; Sacchi et al., Science 231:379-382, 1986, Sarris et al., Leuk. Lymphoma 29(5-6):507-514, 1998; Sawyers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:563-567, 1990; Selleri et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:887-891, 1991; Shtivelman et al., Nature 315:550-554, 1985; Sooknanan et al., Experimental Hematol. 21:1719-1724, 1993; Tkachuk et al., Science 250:559-562, 1990; Tsujimoto et al., Science 224: 1403-1406, 1984; von Lindern et al., Mol. Cell. Biol. 12:1687-1697, 1992; Zhao et al., Am. J. Hum. Genet. 47:A119, 1980; y Zemin-VanDerPoel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10735-10739, 1991; Pat. Estadounidense No. 5.057.410 a Kawasaki et al., Pat. Estadounidense No. 5.459.251 a Tsujimoto et al., Pat. Estadounidense No. 5.538.846 a Meeker, Pat. Estadounidenses Nos. 5.149.628, 5.198.338, 5.202.429 y 5.242.795 a Croce et al.; y Pat. Estadounidense No 5.547.838 a Nisson et al.

A menos que se describa de otra manera, las técnicas descritas aquí son metodologías estándar bien conocidas por aquellos entendidos en la materia. Los ejemplos de las realizaciones que siguen se proporcionan sólo para ilustración.

Ejemplo 1 Lisis de muestras biológicas y aislamiento de mRNA

El siguiente procedimiento se utiliza para aislar mRNA de muestras biológicas. En este ejemplo, las células de médula ósea y sangre se utilizan de forma individual en los procesos de lisis y aislamiento de mRNA. El procedimiento funciona igualmente bien sobre tejidos si las células se separan en células individuales o pequeños acúmulos de células usando métodos de picadura estándar en trocitos, separación en pantalla y/o proteolisis para limitar el número de células presentes en acúmulos. El procedimiento de lisis comprende el contacto de una suspensión de células diana con una solución de lisis que contiene al menos 150 mM de una sal soluble, preferiblemente una sal de haluro de litio (pej., LiCl), un agente quelante (pej., ácido etilendiamina tetraacético (EDTA)) y una cantidad de un detergente no iónico efectivo para lisar la membrana del citoplasma de la célula sin liberar sustancialmente el contenido del núcleo. Generalmente, el detergente no iónico en la solución de lisis fue un octilfenoxipolietoxietanol (un detergente de tipo TRITON®), aunque otros detergentes no iónicos (pej., detergentes de tipo TWEEN® y NP) funcionan de forma equivalente. Por "cantidad efectiva" de un detergente no iónico se entiende una cantidad suficiente para causar la lisis o permeabilización de la membrana del citoplasma sin provocar la liberación sustancial del DNA o RNA del núcleo, generalmente entre alrededor de 0,5% (v/v) a alrededor de 2,0% (v/v). Una solución de lisis preferida contiene alrededor del 1% (v/v) de TRITON®X-102.

En un procedimiento típico, alrededor de 250 \mul de sangre sin coagular o médula ósea se añadió a 750 \mul de la solución de lisis. Por "sin coagular" se entiende que la sangre o médula ósea se trató en la recolección con alrededor de 2 mM a alrededor de 20 mM de EDTA, o una cantidad efectiva de heparina o anticoagulante similar conocido en el campo. Las proporciones de muestra para la solución de lisis no son críticas, pero generalmente una relación de 1:1 a alrededor de 1:3 de los componentes (muestra:solución de lisis) es capaz de lisar la muestra. Generalmente, la solución de lisis consiste en HEPES 50 mM (pH 7,5), LiCl 1M, EDTA 5 mM, y 1% de TRITON®X-102. El pH del tampón puede estar en un rango alrededor del neutro (pH 7,0), preferiblemente está en un rango de pH de alrededor de 6,5 a alrededor de 8,5, y más preferiblemente está alrededor de pH 7,5, para facilitar la captura del mRNA mediante hibridación, tal como se describe más abajo.

Sorprendentemente, tras mezclar la muestra y la solución de lisis, el RNA liberado en la mezcla de lisis fue estable y pudo almacenarse a temperatura ambiente durante al menos 2 horas sin una degradación significativa del RNA, aún en ausencia de inhibidores adicionales de RNAasa. Ninguno de los componentes de la solución de lisis HEPES, LiCl, EDTA o TRITON®X-102 fueron efectivos de forma individual en la prevención de la degradación casi inmediata del RNA. Así, fue sorprendente que la combinación de componentes fue efectiva en inhibir la degradación de RNA.

Para el aislamiento de mRNA (o captura de diana), se añadieron partículas de captura a la mezcla de lisis explicada anteriormente. Alrededor de 30 \mul de una suspensión de partículas superparamagnéticas (aproximadamente 300 \mug) al que se unió covalentemente el poli-T (en un rango de dT_{14} a dT_{30}) en una densidad de entre alrededor de 1 a 100 pmoles por mg se añadieron a alrededor de 1 ml de la mezcla de lisis. Las partículas que poseen los oligómeros dT_{14}, dT_{20}, dT_{25}o dT_{30} han sido utilizadas en estos procedimientos. Generalmente, las partículas se habían unido entre alrededor de 10 a 100 pmoles de poli-dT por mg, y más comúnmente se han unieron entre alrededor de 10 a 50 pmoles de poli-dT por mg de partículas. Las partículas se suspendieron en tampón fosfato salino estándar (PBS), pH 7,4, conteniendo 140 mM de NaCl para añadir a la mezcla de lisis.

Normalmente, las partículas usadas fueron un núcleo de magnetita recubierto de látex o sílice, que están comercialmente disponibles, a los que están unidos oligonucleótidos de poli-dT ("colas"). Aunque no es crucial que las partículas sean magnéticas o paramagnéticas, la propiedad magnética ayuda en la recuperación de las partículas tras la hibridación del mRNA liberado en las partículas mediante las colas de poli-dT. Aquellos entendidos en el campo apreciarán que las partículas no magnéticas (pej., celulosa) con poli-dT pueden ser sustituidas y separadas usando sedimentación estándar o los métodos de filtración. Para acoplar a los poli-dT, las partículas sin derivar poseen grupos libres como amina, hidroxilo, carboxilo, grupos éster o mezclas de estos grupos. Se pueden obtener partículas apropiadas ya derivadas con colas de poli-dT (pej, Serodyn, Dynal, Novagen). Alternativamente, las partículas sin derivar pueden comprarse (pej., de Seradyne) y unirse a oligonucleótidos de poli-dT utilizando la química bien conocida de acoplamiento (Lund et al., Nuc. Acids Res. 16:10861-10880, 1988).

La mezcla de lisis y las partículas de poli-dT se mezclaron enérgicamente mediante un vórtice y luego se incubaron a alrededor de 22ºC a 42ºC a alrededor de 30 min. Las partículas se separaron del resto de la mezcla mediante aplicación de un campo magnético para retener las partículas; se descartó el sobrenadante. Aquellos entendidos en la materia podrán sustituir fácilmente la sedimentación (pej., centrifugación) por el paso de separación del campo magnético. Las partículas separadas se lavaron en alrededor de 1 ml de una solución de lavado de HEPES 50 mM (pH 7,5), EDTA 5 mM, NaCl 150 mM y 0,1% (p/v) de (SDS) sodio dodecil sulfato, mezclando con un vórtice durante alrededor de 3 a 5 segundos para suspender las partículas que se separaron entonces del sobrenadante tal como se ha descrito antes, y el sobrenadante fue descartado. El procedimiento de lavado se repitió dos veces y las partículas finalmente se suspendieron en 250 ml de un tampón consistente de 10 \muM de HEPES (pH 7,5) y EDTA 1 mM. Esta suspensión se uso inmediatamente o se guardó a -30ºC para posterior utilización. El RNA preparado de esta manera se almacenó congelado durante un año sin notar una disminución en la integridad funcional o estructural del RNA.

Si el RNA aislado se debe usar inmediatamente, puede liberarse tanto de las partículas de captura (pej., usando un proceso estándar de elución con bajo nivel de sales) o puede ser amplificado sin separarlo de las partículas usando un procedimiento de amplificación que obvia la necesidad de elución. Esto se alcanza, por ejemplo, usando cebadores que se une a regiones del ácido nucleico aislado que no está involucrado en el emparejamiento de bases con el poli-dT o en otras interacciones con la matriz de fase sólida que puede unir mRNA sin soltarlo de las partículas.

Una persona experimentada en el campo reconocerá que los volúmenes exactos y las proporciones ejemplificadas antes no son críticas para la invención. Es importante, no obstante, que las muestras derivadas de los tejidos biológicos susceptibles de coagulación (pej., sangre, médula ósea, plasma o suspensiones celulares) se traten para prevenir la coagulación. También es importante para las muestras celulares que la fuerza iónica de la solución de lisis sea al menos de alrededor de 150 mM, preferiblemente en un rango entre alrededor de 150 mM a alrededor de 1M, para permitir la lisis de la membrana celular de una célula diana sin la liberación concomitante del DNA nuclear. En fuerzas iónicas menores de 150 mM, el material nuclear liberado contaminó los ácidos nucleicos citoplasmáticos liberados, por ejemplo, con DNA cromosomal. Aunque no se desea adherirse a una teoría o mecanismo, es probable que a alrededor de 150 mM o mayor fuerza iónica, la membrana nuclear se mantenga lo suficientemente intacta como para prevenir la liberación del DNA cromosómico. El DNA cromosómico contaminante aumenta la viscosidad de la mezcla que puede interferir al usar el RNA citoplasmático en un posterior ensayo, por ejemplo, por reacción cruzada y produciendo reacciones de falsos positivos, secuestrando el RNA y/o los cebadores, y/o previniendo la mezcla de los reactivos. Una solución de lisis que contiene sales de litio es preferida para prevenir la degradación de RNA, aunque los tampones que contienen otras sales solubles (pej., NaCl) y un inhibidor conocido de RNAsas se espera que sean igualmente efectivos en este procedimiento de lisis selectiva siempre que la fuerza iónica sea al menos de
150 mM.

Los ácidos nucleicos preparados por el procedimiento de lisis antes descrito puede utilizarse con otros métodos de selección e inmovilizando un ácido nucleico diana. Uno de tales métodos incluye un oligonucleótido mediador que hibrida en solución con un ácido nucleico diana específico tal como se describe en la Pat. Estadounidense No. 4.751.177 a Stabinsky. Otros métodos de inmovilización han sido descritos en las Pat. Estadounidenses Nos. 4.486.539 y 4.563.419 a Ranki et al., Publicación de Pat. PE No. 159719 por Rabanni et al., Publicación de Pat. PE No. 128332 por Pergolizzi et al., Pat. Estadounidense No. 5.476.769 a Soderlund et al., Pat. Estadounidense No. 5.474.895 a Ishi et al., y Publicación de Pat. PE No. 444120 por Hornes et al.

El presente método de lisis es útil para la preparación de ácidos nucleicos de células contenidas en varios tejidos. Por ejemplo, células originadas en un tejido sólido, como un tejido de tumor sólido, puede ser troceado y tratado con tripsina usando los métodos estándar para realizar una suspensión celular que se lisa entonces como se ha descrito antes. Tal como se muestra a continuación, las células pueden crecer en cultivo de tejidos o también puede usarse medio líquido.

Aunque mezclar los reactivos mediante el vórtice es preferido para el uso a pequeña escala del método, para el uso a gran escala, pueden ser ventajosos el uso de otros métodos de mezcla conocidos en el arte menos trabajosos. Los métodos conocidos que proporciona una mezcla minuciosa y vigorosa están dentro del alcance de la invención.

Aunque normalmente se utilizaron tres pasos de lavado antes de amplificar los ácidos nucleicos capturados, el número de pasos de lavado tras la unión de los ácidos nucleicos diana a las partículas puede variar. Los pasos de lavado son importantes, no sólo para eliminar las proteínas contaminantes y los ácidos nucleicos de la preparación citoplásmica de ácidos nucleicos, sino también para eliminar el litio que se ha encontrado que inhibe al menos una actividad enzimática (polimerasa de DNA dirigida a RNA, polimerasa de DNA dirigida a DNA, RNAsa H, y polimerasa de RNA) utilizados en el método de amplificación asociado a transcripción (ver Pat. Estadounidense Nos. 5.480.784 y 5.399.491 a Kacian et al.). Las sales de litio pueden no inhibir otros enzimas, y así intercambiando el catión después de la lisis puede que no sea necesario si se utilizan otros métodos de amplificación.

Las partículas utilizadas en la selección del ácido nucleico diana puede separarse del sobrenadante mediante una variedad de procedimientos conocidos como filtración, precipitación y centrifugación. Las partículas, tal como se ha descrito antes, pueden tener sondas de captura de ácidos nucleicos unidas a ellos para unir específicamente a un ácido nucleico citoplasmático en particular. Alternativamente, aunque menos preferido, la fase sólida puede no unirse específicamente al ácido nucleico diana, como, por ejemplo, usando soportes policatiónicos (ver Pat. Estadounidense Nos. 5.599.667 a Arnold et al.).

El siguiente ejemplo describe la amplificación de ácidos nucleicos que han sido aislados usando el método de lisis de este ejemplo.

Ejemplo 2 Amplificación de ácidos nucleicos aislados de una muestra biológica y detección del producto amplificado

Para la amplificación asociada a la transcripción de ácidos nucleicos aislados de una muestra biológica, 50 \mul de una suspensión de partículas que contienen ácidos nucleicos aislados, como se describe en el Ejemplo 1, de la sangre de un paciente positivo de LMC, se añadió a un tubo que contenía 25 \mul de un reactivo de amplificación. Para cada reacción, el reactivo de amplificación contenía 160 mM de tris-HCl (pH 7,5), 100 mM de MgCl_{2} 70 mM KCl, 20% (p/v) polivinilporrilidona, 16 mM de cada uno de los cuatro ribonucleósidos trifosfatos ATP, GTP, CTP, y UTP, 4 mM de cada uno de los cuatro desoxiribonucleósidos trifosfatos dATP, dGTP, dCTP, y dTTP, 400 nM (15 pmoles) de un cebador promotor con la secuencia de bases de nucleótidos del ID de SEC No: 1 (TAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACTCAGACCCTGAGGCTCAAAGT-CAGA), y 400 nM (15 pmoles) de un cebador con la secuencia de bases de nucleótidos del ID de SEC No: 5 (GACCAACTCGTGTGTGAAACTCCA). Tras mezclar, el tubo se incubó durante 10 min a 60ºC. Generalmente, cualquier temperatura que es adecuada para disolver el emparejamiento de bases intramoleculares en el ácido nucleico diana es permisible en este paso. Preferiblemente, la temperatura de incubación está entre alrededor de 60ºC y 70ºC, más preferiblemente entre 65ºC y alrededor de 67ºC.

A continuación, el tubo se incubó a alrededor de 42ºC durante 5 min. Entonces, se añadió un reactivo enzimático (25 \mul que contiene 2000 unidades de transcriptasa reversa MMLV recombinante, 2000 unidades de polimerasa de RNA T7 recombinante, HEPES 8mM (pH 7,5), N-acetil-L-cisteina 50 mM, acetato de zinc 0,04 mM, trehalosa 80 mM, Tris-HCl 140 mM (pH 8,0), KCl 70 mM, EDTA 1 mM, rojo fenol 0,01% (p/v), TRITON®X-102 (v/v) 10% y glicerol (v/v) 20%) a la mezcla de reacción. El tubo se mezclo vigorosamente y se incubó durante alrededor de 1 hora a 42ºC. Este método de amplificación produjo RNA amplificado de un sentido opuesto al del RNA diana.

El RNA amplificado se detectó usando 100 \mul de un reactivo sonda que contiene succinato de litio 100 mM (pH 4,7), LiCl 1,2 M, alditriol-2 15 mM, lauril-sulfato de litio (LLS) 2% (p/v), EDTA 20 mM, ácido etilenglicol-bis-(b-amino etil éter)N, N, N', N'-tetraacético 20 mM, etanol 3%, y 7,5 nm de una sonda de hibridación marcada con un éster de acridinio quimioluminiscente (AE). La sonda de DNA sintética específica para la detección de la secuencia bcr b2 posee el ID de SEC No: 9 (GACTGTCCACAGCATTCCGCTGACC) que se unió a la marca AE usando enlazantes no nucleótidos y métodos previamente descritos en la Pat. Estadounidense No. 5.585.481 a Arnold et al. Esta solución de detección se añadió a la mezcla de reacción y se incubó a 60ºC durante 30 min. para permitir la hibridación de la sonda a la diana amplificada.

La sonda se detectó en un formato de ensayo homogéneo, tal como el ensayo de protección homogéneo (HPA) descrito en detalle en la Pat. Estadounidense No. 5.283.174, a Arnold et al. Brevemente, se añadieron 300 \mul de una solución alcalina que contiene borato sódico 600 mM (pH 8,5) y 1% (v/v) de TRITON® X-100 a la mezcla descrita antes para hidrolizar la marca AE presente en la sonda sin unir. La marca AE en la sonda hibridada está protegida de hidrólisis por su asociación con una doble hélice, mientras que la sonda no hibridada no está protegida de la hidrólisis. Así, la sonda sin hibridar se hace preferentemente indetectable. La solución se incubó a 60ºC durante 10 min, se enfrió a temperatura ambiente durante 5 min y se mezcló con 200 \mul de una solución que contiene peróxido de hidrógeno 30 mM y ácido nítrico 1 mM, seguido inmediatamente por la adición de 200 \mul de una solución que contiene NaOH 1 M y 2% (p/v) de ZWITTERGENT® 3-14. Se detectó la quimioluminiscencia usando un luminómetro (pej., LEADER®1, LEADER®50, LEADER®450 o LEADER®HC, todos de Gen-Probe, Inc, San Diego, CA). La quimioluminiscencia se midió y registró en unidades de luz relativa ("RLU").

Aunque el método ejemplificado aquí emplea formatos de detección específica para detectar una sonda de ácido nucleico, aquellos conocedores de la materia pueden usar fácilmente marcajes diferentes a AE, tal como marcaje radioactivo, marcajes fluorescentes y quimioluminiscentes para detectar la sonda hibridada usando métodos estándar. De forma similar, aunque los sistemas de ensayo homogéneo poseen ciertas ventajas claras sobre los ensayos heterogéneos (es decir., aquellos que necesitan la separación física para diferenciar la señal de la sonda hibridada de la señal debida a la sonda sin hibridar), los aspectos de la detección homogénea no es crítica para el método.

Ejemplo 3 Amplificación de ácidos nucleicos cortados y empalmados aislados y detección del producto amplificado

En este ensayo, un ácido nucleico diana empalmado resultado de una translocación bcr-abl se amplificó y detectó con una sonda dirigida a una secuencia que flanquea la zona de empalme para indicar la presencia del producto de fusión en la muestra biológica. El método general usado para la amplificación y detección del producto de fusión se ilustra en las Figs. 1A a 1C.

La muestra biológica usada fueron células sanguíneas obtenidas de pacientes que se sabe que son positivos para LMC, de los que se aisló RNA poli-A usando el método de lisis sustancialmente como se describe en el Ejemplo 1. La amplificación del RNA se dirigió sustancialmente tal como se describe en el Ejemplo 2, pero usando el cebador promotor del ID de SEC No: 1, el cebador de ID de SEC No: 5 y 400 nM de un cebador DNA específico de abl que tiene la secuencia del ID de SEC No: 13 (CAAAGGAGCAGGGAAGAAGG). Este cebador específico de abl es del mismo sentido que el ácido nucleico diana.

Antes de la detección, los ácidos nucleicos amplificados se dividieron en dos alícuotas. La sonda marcada con AE específica de bcr del ID de SEC No: 9 se añadió a la primera alícuota para la detección sustancialmente como se describe en el Ejemplo 2. La sonda marcada con AE específica de bcr es funcionalmente la misma que la sonda b2 descrita con referencia a las Figs. 1A y 1B, y el ácido nucleico de fusión se detectó midiendo la RLU tal como se describe en el Ejemplo 2. Una sonda marcada con AE específica de bcr con el ID de SEC No: 16 (GTGGAACATGAAGCCCTTCAGCGG) se añadió a la segunda alícuota y la mezcla se procesó para la detección de quimioluminiscencia sustancialmente tal como se describe en el Ejemplo 2. Esta sonda específica de abl es capaz de hibridar con el gen humano abl que abarca una región de corte y empalme comúnmente utilizada, aunque una sonda dirigida hacia el 5' de la región de empalme puede también utilizarse (ver Ejemplo 6). Ya que los cebadores utilizados en este ejemplo se diseñaron para amplificar cada una de las dianas de fusión y los ácidos nucleicos abl normales presentes en la mezcla de amplificación, coamplificaron ambos tipos de ácidos nucleicos en la reacción de la mezcla de amplificación pero fueron detectables de forma separada en las dos alícuotas del paso de detección.

La quimioluminiscencia de cada una de las dos alícuotas se detectó sustancialmente tal como se describe en el ejemplo 2, aunque los volúmenes de los reactivos se ajustó de forma apropiada para contar con el hecho de que la mezcla de amplificación había sido dividida (es decir, se usaron medios volúmenes).

Se pueden utilizar procesos alternativos para detectar cada uno de los amplicones diana y no diana. Uno de tales procesos alternativos hace uso de dos marcas quimioluminiscentes con diferentes características, tales como diferentes longitudes de onda de emisión de luz, diferentes valores de pH de reacción óptima, o diferentes cinéticas de reacción quimioluminiscente, cuyas características hacen posible la detección de dos amplicones en el mismo recipiente de reacción empleando sondas diferentemente marcadas con el marcaje adecuado. Tales procedimientos han sido previamente publicados en detalle en la Publicación de Pat. Internacional PCT No. WO 96/13612 y Publicación de Pat. Internacional PCT No. WO 91/00511.

Ejemplo 4 Amplificación usando un cebador promotor simple y detección selectiva de los del ácidos nucleicos amplificados

Este ejemplo demuestra la amplificación de ácidos nucleicos usando un cebador promotor simple capaz de hibridar al ácido nucleico diana para la producción de ácidos nucleicos amplificados de un sentido opuesto a la de la diana. Ambos ácidos nucleicos de fusión y normales se amplificaron usando un cebador, pero los ácidos nucleicos amplificados se detectaron de forma separada usando una sonda bcr dirigida a la posición localizada en el lado 5' (relativo al ácido nucleico diana) de la zona de punto de rotura, y una sonda abl dirigida a una secuencia abl dirigida que podrá perderse en un ácido nucleico de fusión.

Para comparar, tres fuentes diferentes de partículas magnéticas de poli-dT se utilizaron en este ejemplo esencialmente como se describe en el Ejemplo 1. Se compraron las partículas comercialmente disponibles con poli-dT 25-mero unido (cuentas dT_{25}, de Novagen) y dos juegos de partículas sintetizadas se prepararon acoplando poli-dT a partículas sin derivar (obtenidas de Seradyne). Un juego de cuentas que se acopló a un oligonucleótido 14-mero homopolimérico "cuentas dT_{14}", y un segundo juego de cuentas que se acopló a un oligonucleótido 30-mero homopolimérico "cuentas dT_{30}". Cada tipo de cuenta estaba presente en una suspensión sustancialmente como se describe en el Ejemplo 1.

El mRNA citoplasmático se preparó de células K562, crecido en cultivo de tejido estándar en una densidad de alrededor de 5 x 10^{6} céls/ml y entonces se trataron de acuerdo con el método de preparación de muestras descrito en el Ejemplo 1. Aproximadamente 2x10^{5} células se usaron para cada mezcla de reacción probada que se utilizó entonces sin diluir o en una dilución 1:10. En mezclas de reacción separadas, se utilizaron 60 \mul de cada preparación de cuentas lavadas. las muestras control no tenían cuentas añadidas, para proporcionar una medida de fondo (datos no mostrados) que se sustrajo de los resultados de las muestras a los que se añadieron las cuentas. La amplificación de ácidos nucleicos se realizó sustancialmente como se describe en el Ejemplo 2 y en la Pat. Estadounidense No. 5.554.516, a Kacian et al., excepto que se utilizó un cebador promotor simple del ID de SEC No: 1 (30 pmoles) en la reacción de amplificación. No se utilizaron cebadores del mismo sentido que los ácidos nucleicos
diana.

Las reacciones de amplificación se dejaron proceder durante 1 hora. Entonces cada muestra se dividió en dos alícuotas distintas, una alícuota que contiene un tercio de cada reacción de amplificación para la detección de la sonda AE marcada específica de bcr del ID de SEC No: 9, y la otra alícuota contiene dos tercios de cada reacción de amplificación para la detección de la sonda AE marcada específica de abl del ID de SEC No: 16. La hibridación de la sonda se realizó sustancialmente como se describe en el Ejemplo 2. La detección de las sondas hibridadas se realizó sustancialmente como se describe en el Ejemplo 2, con los volúmenes de los reactivos de detección ajustados proporcionalmente al volumen de la muestra usada. La luz emitida por las marcas se midió en un luminómetro LEADER®50 en unidades de luz relativa (RLU) tal como se ha descrito previamente y los resultados se muestran en la tabla 1.

TABLA 1

1

Estos resultados indican que el método de la presente invención pueden utilizarse en un formato de amplificación que usa un cebador promotor simple que hibrida con el ácido nucleico diana en una posición localizada 3' de la región potencial de empalme. La amplificación resulta en la acumulación de un amplicón (transcrito de RNA complementario) que posee el sentido opuesto que el del ácido nucleico diana. Los resultados también muestran las partículas acopladas con los oligonucleótidos 14-mero poli-dT y partículas obtenidas comercialmente (Novagen) con poli-dT_{25} unidos fueron efectivos bajo estas condiciones de ensayo para capturar mRNA en solución. Las partículas poli-dT_{30} sintetizadas variaron un tanto para la captura de RNA basado en los resultados de la Tabla 1. Tal como se muestra para estos resultados, una reacción de amplificación usando un cebador promotor simple puede ser utilizado para detectar específicamente la presencia de dos transcritos de ácidos nucleicos diferentes en la misma muestra biológica usando diferentes sondas. En este caso, se detectó un transcrito mediante la sonda de bcr, y otro se detectó mediante la sonda abl. Los resultados de otros experimentos no mostraron reacción cruzada entre estas dos sondas. Así, la detección de un transcrito (pej., el transcrito abl) puede servir como control interno en los pasos de preparación de las muestras, amplificación y detección del método.

Ejemplo 5 Amplificación y detección de transcritos abl en células de sangre periféricas

La amplificación se llevó a cabo sobre ácidos nucleicos aislados de células de sangre periférica y se almacenó antes de usar, sustancialmente como se describe en los Ejemplos 1 y 2. Se procesó la sangre entera tratada con EDTA como se describe en el Ejemplo 1, y las partículas a las que el RNA citoplasmático se unió se almacenaron antes de usar. Este ejemplo muestra el uso del método de preparación de muestras para preparar mRNA de abl normal y del método de amplificación que permite la detección de mRNA de abl normal. Este ejemplo también muestra que las diferentes fuentes de dT inmovilizada, con diferentes longitudes de dT, son efectivos para aislar dianas.

Las partículas usadas para el aislamiento del producto génico natural abl fueron del mismo tipo que las usadas en el Ejemplo 4, y el aislamiento de los ácidos nucleicos citoplasmáticos se realizó sustancialmente como se describe en el Ejemplo 1. Las muestras de sangre se usaron sin diluir o en una dilución de 1:10 o 1:100. Las partículas con ácido nucleico diana capturado (60 \mug y 6 \mug) se utilizaron en el procedimiento de amplificación mediada por transcripción sustancialmente como se describe en el Ejemplo 2, usando un cebador promotor con el ID de SEC No: 1 y un cebador con la secuencia del ID de SEC No: 13. Tras la amplificación, los productos de amplificación se detectaron usando una sonda específica de abl con la secuencia del ID de SEC No: 16, usando los procedimientos de detección sustancialmente como se describe en el Ejemplo 2. Los resultados de quimioluminiscencia, medidos en RLU, se muestran en la Tabla 2. El control negativo ("Sin diana") representa el RLU de fondo.

TABLA 2

2

Los datos de la tabla 2 muestran que el presente método de preparación de muestras es adecuado para la captura de especies de ácidos nucleicos específicos que pueden entonces ser amplificadas con cebadores específicos de diana y detectarse usando una sonda específica de diana.

Ejemplo 6 Amplificación y detección de transcritos abl normales y transcritos bcr-abl de fusión en RNA aislado de pacientes con LMC

Este ejemplo demuestra que los transcritos bcr-abl de dos tipos distintos (bcr b2-abl y bcr b3-abl) pueden detectarse usando diferentes sondas de bcr en los productos de amplificación de RNA obtenido de los pacientes de LMC. Además muestra que la amplificación y detección del RNA de abl sirve como control interno.

Las fuentes de RNA utilizadas en estos experimentos fueron: (1) RNA de pacientes de LMC obtenido de tres individuos, (2) transcritos de RNA sintético control producido mediante métodos de transcripción estándar in vitro a partir de un clon del gen abl (clonado a partir del RNA de pacientes usando métodos de clonaje estándar de cDNA), y (3) transcritos de RNA sintéticos produjeron un clon que contiene un punto de rotura con translocación bcr b3-abl (clonado de la línea celular K562). Tres pacientes de LMC (Pacientes A, B y C) presentaron diferentes fases de la enfermedad: los Pacientes A y B poseen síntomas activos de LMC, y el paciente C se probó antes de recibir un transplante de médula ósea y no presentó síntomas de LMC o éstos fueron pequeños. Para cada paciente, se aisló el RNA total de la capa de leucocitos de la muestra de sangre usando un método estándar de isotiocianato de guanidino (Chirgwin, et al., 1979, Biochem. 18:5294-5299). El RNA total usado para cada ensayo para cada paciente fue de alrededor de 10 ng (equivalente a alrededor de 1000 células). El RNA sintético control se probó usando números de copias de la secuencia calculada usando procedimientos estándar, con el número de copias por ensayo mostrado en la Tabla 3. Los controles negativos no tienen añadido RNA en las mezclas de reacción de amplificación.

La amplificación del RNA total de los pacientes y los transcritos de RNA control sintetizados se realizó esencialmente como se describe en el Ejemplo 2. La detección de los ácidos nucleicos amplificados se realizó esencialmente como se describe en el Ejemplo 2, detectando individualmente una alícuota de amplificación usando una sonda de bcr-b2 (un oligonucleótido marcado con AE con el ID de SEC No: 9), una sonda bcr-b3 (un oligonucleótido marcado con AE con el ID de SEC No: 27), y una sonda abl (un oligonucleótido marcado con AE con el ID de SEC No: 26). La sonda abl apunta hacia una región mostrada en la Fig. 3 (secuencia doble subrayada). Los ensayos se realizaron por triplicado y los resultados de la media de RLU se presentan en la Tabla 3 ("NR" indica "no realizado").

TABLA 3

3

Los resultados de la Tabla 3 muestran que la sonda específica de bcr-b2 fue capaz de detectar tan poco como 50 copias de bcr-b2 (ver columna 3, línea de datos 8) y se detectó la presencia de bcr-b2 en RNA de los Pacientes A y B pero no del Paciente C (columna 3, líneas de datos 1 a 3 comparado con el control "sin RNA" de la columna 3, línea de datos 9). Los resultados también muestran que la sonda bcr-b3 fue capaz de detectar tan poco como 50 copias de bcr-b3 (ver columna 4, línea de datos 8) y se detectó la presencia de bcr-b3 en RNA del Paciente A, pero no en RNA del Paciente B. El Paciente C no se esperó que presentara bcr-b3 ya que la translocación en el paciente ya se había eliminado de la diana de la sonda bcr-b2, y por lo tanto se había eliminado también la diana de la sonda bcr-b3. La Tabla 3 también muestra que el control interno, abl, se detectó en los tres pacientes, presumiblemente representando la detección de transcritos normales de abl (columna 2, líneas de datos 1 a 3). Otros resultados (no mostrados) han confirmado que las sondas bcr-b2 y bcr-b3 no reaccionan de forma cruzada con los amplicones abl y la sonda abl no reacciona de forma cruzada con los amplicones bcr.

<110> GEN-PROBE INCORPORATED

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<120> MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN Y MEDICIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS CORTADOS Y EMPALMADOS

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<130> GP091PCT

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<140> PCT/US99/16832

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<141> 1999-07-23

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<150> US 09/121.239

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<151> 1998-07-23

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<160> 27

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<170> PatentIn ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 54

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador promotor sintético incluyendo la secuencia promotor T7 en los residuos 1-27

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<400> 1

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\hskip-.1em\dddseqskip

taaattaata cgactcacta tagggagact cagaccctga ggctcaaagt caga

\hfill

54

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<210> 2

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<211> 54

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<212> RNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Versión de RNA del ID de SEC No: 1

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<400> 2

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\hskip-.1em\dddseqskip

uaaauuaaua cgacucacua uagggagacu cagacccuga ggcucaaagu caga

\hfill

54

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<210> 3

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<211> 54

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Complemento reverso del ID de SEC No: 1

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

tctgactttg agcctcaggg tctgagtctc cctatagtga gtcgtattaa ttta

\hfill

54

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<210> 4

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<211> 54

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<212> RNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: Versión de RNA del ID de SEC No: 3:

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

ucugacuuug agccucaggg ucugagucuc ccuauaguga gucguauuaa uuua

\hfill

54

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<210> 5

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<211> 24

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético

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<400> 5

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\hskip-.1em\dddseqskip

gaccaactcg tgtgtgaaac tcca

\hfill

24

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<210> 6

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<211> 24

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<212> RNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Versión de RNA del ID de SEC No: 5

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

gaccaacucg ugugugaac ucca

\hfill

24

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<210> 7

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<211> 24

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Complemento reverso del ID de SEC No: 5

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<400> 7

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\hskip-.1em\dddseqskip

tggagtttca cacacgagtt ggtc

\hfill

24

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<210> 8

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<211> 24

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<212> RNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Versión de RNA del ID de SEC No: 7

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<400> 8

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\hskip-.1em\dddseqskip

uggaguuuca cacacgaguu gguc

\hfill

24

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<210> 9

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sonda para la secuencia bcr-b2

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<400> 9

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\hskip-.1em\dddseqskip

gactgrccac agcattccgc tgacc

\hfill

25

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<210> 10

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<211> 25

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<212> RNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Versión de RNA del ID de SEC No: 9

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<400> 10

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\hskip-.1em\dddseqskip

gacuguccac agcauucgc ugacc

\hfill

25

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<210> 11

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Complemento reverso del ID de SEC No: 9

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<400> 11

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggtcagcgga atgctgga cagtc

\hfill

25

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<210> 12

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<211> 25

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<212> RNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Versión de RNA del ID de SEC No: 11

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<400> 12

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggucagcgga augcugugga caguc

\hfill

25

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<210> 13

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<211> 20

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia de cebador para abl-1

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<400> 13

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\hskip-.1em\dddseqskip

caaaggagca gggaagaagg

\hfill

20

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<210> 14

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<211> 20

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: Complemento reverso del ID de SEC No: 13

\newpage

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<400> 14

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\hskip-.1em\dddseqskip

ccttcttccc tgctcctttg

\hfill

20

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<210> 15

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<211> 20

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<212> RNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Versión de RNA del ID de SEC No: 14:

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<400> 15

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\hskip-.1em\dddseqskip

ccuucuuccc ugcuccuuug

\hfill

20

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<210> 16

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<211> 24

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sonda para la secuencia abl:

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<400> 16

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\hskip-.1em\dddseqskip

gtggaacatg aagcccttca gcgg

\hfill

24

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<210> 17

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<211> 24

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<212> RNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Versión de RNA del ID de SEC No: 16:

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<400> 17

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\hskip-.1em\dddseqskip

guggaacaug aagcccuuca gcgg

\hfill

24

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<210> 18

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<211> 24

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: Complemento reverso del ID de SEC No: 16:

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<400> 18

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\hskip-.1em\dddseqskip

ccgctgaagg gcttcatgtt ccac

\hfill

24

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<210> 19

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<211> 24

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<212> RNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: Versión de RNA del ID de SEC No: 18:

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<400> 19

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\hskip-.1em\dddseqskip

ccgcugaagg gcuucauguu ccac

\hfill

24

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<210> 20

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<211> 27

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: Secuencia del cebador igual que en el ID de SEC No: 1 pero sin la secuencia del promotor T7

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<400> 20

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\hskip-.1em\dddseqskip

actcagaccc tgaggctcaa agtcaga

\hfill

27

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<210> 21

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<211> 27

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<212> RNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: Versión de RNA del ID de SEC No: 20:

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<400> 21

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acucagaccc ugaggcucaa agucaga

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27

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<210> 22

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<211> 27

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: Complemento reverso del ID de SEC No: 20

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<400> 22

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\hskip-.1em\dddseqskip

tctgactttg agcctcaggg tctgagt

\hfill

27

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<210> 23

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<211> 27

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<212> RNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: Versión de RNA del ID de SEC No: 22:

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<400> 23

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\hskip-.1em\dddseqskip

ucugacuuug agccucaggg ucugagu

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27

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<210> 24

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<211> 350

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 24

5

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<210> 25

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<211> 299

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 25

6

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<210> 26

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<211> 18

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: Sonda para abl

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<400> 26

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggaatcatcg aggcatgg

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18

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<210> 27

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<211> 26

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia artificial: Sonda para bcr-b3

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<400> 27

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cactcagcca ctggatttaa gcagag

\hfill

26

Claims (13)

1. Un método para detectar un ácido nucleico de fusión en una muestra, comprendiendo los pasos de:

a) proporcionar una muestra que contenga un primer ácido nucleico de fusión de cadena simple comprendiendo la zona de empalme bcr-abl;

b) poner en contacto bajo condiciones de amplificación de ácidos nucleicos:

el primer ácido nucleico de fusión de cadena simple,

un primer cebador promotor que hibrida específicamente al primer ácido nucleico de fusión de cadena simple en un primer sitio de unión del cebador localizado 3' respecto el sitio de la zona de empalme y en la secuencia abl, y

al menos una actividad polimerasa de ácido nucleico;

c) amplificando el primer ácido nucleico de fusión de cadena simple en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos usando el primer cebador para producir varias hebras de ácidos nucleicos secundarias complementarias al menos a una porción del primer ácido nucleico de fusión de hebra simple, en donde cada segunda hebra de ácido nucleico comprende:

un sitio de zona de empalme complementario,

un primer sitio de unión a la sonda en una secuencia bcr localizada 3' y no solapando el sitio de zona de empalme complementario, y

un segundo sitio de unión a la sonda en una secuencia abl localizada hacia 5' y no solapando el sitio de zona de empalme complementario, en donde el segundo sitio de unión a la sonda solapa o se localiza 3' a la secuencia complementaria al primer sitio de unión al cebador;

d) hibridando las segundas hebras de ácido nucleico bajo condiciones de hibridación con una sonda de oligonucleótidos que hibrida específicamente al primer sitio de unión a la sonda o al segundo sitio de unión a la sonda pero no a ambos sitios, formando así un híbrido sonda:diana; y

e) detectar el híbrido sonda:diana en formato de ensayo homogéneo como una indicación de la presencia del primer ácido nucleico de fusión de cadena simple en la muestra.

2. El método de la Reivindicación 1, en donde el primer ácido nucleico de fusión de cadena simple es un mRNA, la actividad polimerasa comprende una actividad RNA polimerasa, y la sonda de oligonucleótidos es del mismo sentido que el mRNA e hibrida específicamente al primer sitio de unión a la sonda.

3. El método de la Reivindicación 1 ó 2,

en donde el primer ácido nucleico de fusión de cadena simple es un mRNA,

en donde las segundas hebras del ácido nucleico son RNA complementario, y

en donde el paso de amplificación además incluye poner en contacto las segundas hebras de ácido nucleico con un segundo cebador o un cebador promotor que hibrida específicamente a un segundo sitio de unión al cebador en una secuencia bcr 3' localizada a ambos sitios de zona de empalme complementaria y el primer sitio de unión a la sonda, y usa un actividad RNA polimerasa, una actividad DNA polimerasa DNA-dirigida y una actividad DNA polimerasa RNA-dirigida en productos de amplificación sintetizados.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la sonda de oligonucleótidos hibrida específicamente al segundo sitio de unión a la sonda y es incapaz de formar un complejo de hibridación estable con el primer ácido nucleico de fusión de cadena simple.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el paso proporcionado incluye la preparación de RNA citoplasmático a partir de células eucariotas en la muestra mediante

poner en contacto una muestra biológica conteniendo el primer ácido nucleico de fusión de cadena simple en células con una solución comprendiendo:

un tampón con un pH en un rango desde alrededor de 6,5 a alrededor de 8,5,

una sal soluble con una fuerza iónica en un rango desde alrededor de 150 mM a alrededor de 1 M,

un agente quelante a una concentración de alrededor de 5 mM, y

un detergente no iónico en un rango desde alrededor del 0,5% a alrededor de 1,5% (v/v),

liberando así el RNA citoplasmático de las células presentes en la muestra sin extracción o uso de reactivos de fenol o cloroformo, y

entonces mezclando con un soporte sólido que está unido a un oligonucleótido inmovilizado comprendiendo una secuencia base de nucleótidos que hibrida, directamente o indirectamente, para liberar el RNA citoplasmático de las células, proporcionando así bajo condiciones de hibridación un complejo de hibridación estable;

separando el complejo de hibridación unido al soporte sólido de otros componentes de la muestra;

lavando el complejo de hibridación unido al soporte sólido con una solución de lavado con suficiente fuerza iónica para mantener el complejo de hibridación unido al soporte sólido; y

recuperando el complejo de hibridación unido al soporte sólido a partir de la solución de lavado.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el paso proporcionado incluye

poner en contacto la muestra con un soporte sólido que está unido a un oligonucleótido inmovilizado que comprende una secuencia base de nucleótidos que bajo condiciones de hibridación forma, directamente o indirectamente, un complejo de hibridación estable con el primer ácido nucleico de fusión de cadena simple presente en la muestra; y

separando el complejo de hibridación estable unido al soporte sólido de los otros componentes de muestra, separando así el primer ácido nucleico de fusión de cadena simple sin extracción o uso de reactivos de fenol o cloroformo.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde

en el paso dado, el primer ácido nucleico de fusión de la primera cadena es un transcrito de mRNA de fusión a partir de la traslocación genética t(9,22) que une las dos regiones cromosomales del cromosoma 9 y el cromosoma 22 en un sitio de zona de empalme;

en el paso de unión, el primer cebador promotor hibrida específicamente al transcrito de mRNA de fusión en el primer sitio de unión del cebador que deriva de una primera región cromosomal en una secuencia abl y se localiza 3' respecto al sitio de zona de empalme;

en el paso de amplificación, el primer sitio de unión de la sonda deriva de una segunda región cromosomal en una secuencia bcr, y el segundo sitio de unión a la sonda se deriva de una tercera región cromosomal en una secuencia abl que se solapa o se localiza 3' a una secuencia complementaria al primer sitio de unión del cebador;

en el paso de hibridación, la sonda de oligonucleótidos hibrida específicamente con la segunda hebra de ácido nucleico en tanto el primer sitio de unión a la sonda o el segundo sitio de unión de la sonda, pero es incapaz de hibridarse con el transcrito de mRNA de fusión, formando así un complejo de hibridación de la sonda y la segunda hebra de ácido nucleico; y

en el paso de detección, el complejo de hibridación se detecta en un formato de ensayo homogéneo como indicación de la presencia del transcrito mRNA de fusión en la muestra.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el paso de amplificación además incluye amplificar un transcrito de control interno usando el primer cebador promotor que también se hibrida específicamente con el transcrito de control interno,

el paso de hibridación usa una segunda sonda de oligonucleótidos que se hibrida específicamente a una secuencia complementaria al transcrito de control interno, formando así un complejo de hibridación de control interno, y

el paso de detección además incluye la detección de la presencia del complejo de hibridación control interno.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el paso de amplificación incluye un segundo cebador o cebador promotor que bajo condiciones de amplificación hibrida específicamente a una secuencia de oligonucleótidos de un RNA complementario al primer ácido nucleico de fusión de cadena simple.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde el primer ácido nucleico de fusión de cadena simple es un transcrito de mRNA de fusión derivado de una traslocación t(9;22) y la sonda de oligonucleótidos se une específicamente a una secuencia derivada de abl pero no a ambas secuencias.

11. Un segundo cebador para el uso en el método de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10 con una secuencia ID de SEC. No. 5.

12. Cualquier sonda de oligonucleótidos para el uso en el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, con la secuencia de ID de SEC No: 9, ID de SEC No: 16, ID de SEC No: 26 o ID de SEC No: 27.

13. La segunda sonda de oligonucleótidos para su uso en el método de la reivindicación 8 con la secuencia de ID de SEC No: 16.