MX2011004058A - Deteccion de acido nucleico de npm1 en fluidos corporales carentes de celulas. - Google Patents

Abstract

Las invenciones presentes se relacionan con métodos para detectar ácido nucleico de NPM1 en muestras de fluidos corporales carentes de células y determinar si el ácido nucleico contiene una o más mutaciones, incluyendo inserciones y eliminaciones. Los métodos son útiles para predecir el pronóstico de pacientes con AML que tienen células con mutaciones en el gen NPM1.

Description

DETECCIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO DE NPM1 EN FLUIDOS CORPORALES CARENTES DE CÉLULAS CAMPO DE LA INVENCIÓN Las invenciones dadas a conocer se relacionan con el campo de la oncología, incluyendo el diagnóstico y la terapia del cáncer.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La siguiente discusión de los antecedentes de la invención se proporciona solamente para ayudar al lector a comprender la invención y no se admite para describir o constituir la técnica anterior para la invención.

La nucleofosmina, también conocida como B23, numatrina, y N038, es una fosfoproteina nucleolar expresada de manera ubicua que se traslada continuamente entre el núcleo y citoplasma. Las funciones de la nucleofosmina incluyen unión de ácidos nucleicos, regulación de la duplicación del centrosoma y función ribosómica, y la regulación de la ruta de ARF-p53 para supresión tumoral.

El gen que codifica la nucleofosmina es NPM1. El gen NPM1 se ubica en el cromosoma 5q35. La interrupción de NPM1 por traslocación cromosómica recíproca participa en varias malignidades hematolinfoides (Falini eí al. Hematologica. 2007; 92(4): 519-532). Estas traslocaciones tienen como resultado la formación de varias proteínas de fusión que retienen el extremo N-terminal de la nucleofosmina y se han asociado con padecimientos neoplásicos, incluyendo NPM-cinasa de linfoma anaplásico de células grandes (NPM-ALK) en el linfoma anaplásico de células grandes (Morris ef al. Science. 1994; 263:1281 -1284), NPM-receptor alfa de ácido retinoico (NPM-RARa) en la leucemia promielocítica aguda (Redner eí al. Blood. 1996; 87: 882-88), y NPM-factor 1 de mielodisplasia/leucemia mieloide (NPM-MLF1 ) en la AML/síndrome mielodisplásico (Yoneda-Kato ef al. Oncogene. 1996; 12: 265-275).

Se han identificado mutaciones heterocigóticas del gen NPM1 en alrededor de 35% de pacientes adultos, así como 6.5% de niños con leucemia mieloide aguda (AML) (Falini ef al. N. Engl. J. Med. 2005; 352: 254-266; Cazzaniga ef al. Blood. 2005; 106: 1419-1422). Muchas variantes moleculares de mutaciones en NP 1 se han descrito a la fecha en pacientes con AML, y la mayor parte cae en el exón 12 (Falini ef al. Blood. 2007; 109: 874-85). Muchas de las mutaciones en NPM1 que se han identificado en la AML se caracterizan por inserciones simples de 1 o 2 tetranucleótidos, una eliminación de 4 pares de bases (bp) o 5 bp combinada con una inserción de 9 bp, o una eliminación de 9 bp combinada con una inserción de 14 bp (Falini ef al. Blood. 2007; 109: 874-85; Chen ef al. Arch. Pathol. Lab Med. 2006; 130: 1687-1692). Las mutaciones en el exón 12 del gen NPM1 a menudo conducen a cambios del marco de lectura, lo que genera una proteína alargada que se retiene en el citoplasma.

Las mutaciones en NPM1 se asocian con altos niveles de blastocitos de médula ósea, un alto conteo de glóbulos blancos (WBC) y plaquetas, y duplicación interna en tándem de la tirosina cinasa 3 relacionada con fms (FLT3-ITD) (Thiede ef al. Blood. 2006; 107: 401 1-4020). Los pacientes que exhibieron mutaciones en NPM1 sin mutaciones en FLT3 mostraron una supervivencia global significativamente mejor y libre de enfermedades, en este estudio (Thiede ef al. Blood. 2006; 107: 4011-4020). Las mutaciones en NPM1 son comunes en la AML con un cariotipo normal (Schnittger ef al. Blood. 2005; 106: 3733-3739). Dentro del grupo de pacientes con AML que tienen un cariotipo normal, diversos estudios han mostrado que los pacientes con AML con mutaciones es NPM1 tuvieron una tasa de remisión completa similar o significativamente superior a la de los pacientes con AML con NPM1 silvestre (Boissel ef al. Blood. 2005; 106: 3618-3620; Falini ef al. N. Engl. J. Med. 2005; 352: 254-266; Suzuki ef al. Blood. 2005; 106: 2854-2861 ; Dohner ef al. Blood. 2005; 106: 3740-6).

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos para la detección de ácido nucleico de NPM1 en un fluido corporal carente de células. En ciertos aspectos, la invención incluye determinar si el ácido nucleico de NPM1 comprende una o más mutaciones. La invención también proporciona métodos para determinar un diagnóstico o pronóstico de un individuo al que se le ha diagnosticado AML, con base en determinar la presencia o ausencia de mutaciones en el gen NPM1.

En un aspecto, la invención proporciona métodos para detectar la presencia o ausencia de ácido nucleico de NPM1 en un fluido corporal carente de células de un individuo. Al individuo se le puede diagnosticar un trastorno maligno (por ejemplo, AML o MDS), o puede ser sospechoso de desarrollar uno.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para determinar un pronóstico de un individuo al que se le ha diagnosticado un trastorno hematológico (por ejemplo, AML o MDS), que comprende determinar la presencia o ausencia de una o más mutaciones en un ácido nucleico de NPM1 , en donde el ácido nucleico de NPM1 se obtiene a partir de un fluido corporal carente de células del individuo, y proporcionar un pronóstico para el individuo, en donde la presencia de una o más mutaciones en el gen NPM1 es indicio de un mejor' pronóstico para el individuo con respecto a un individuo al que se le ha diagnosticado AML y que carece de la o las mutaciones. El fluido corporal carente de células adecuado incluye, por ejemplo, suero y plasma. Los ácidos nucleicos de NPM1 adecuados que se aislan y/o valoran incluyen, por ejemplo, DNA genómico y RÑA (por ejemplo, mRNA).

En las modalidades preferidas, las mutaciones en NPM1 se determinan con respecto a la secuencia de NPM1 de la SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, una o más de las mutaciones en NPM1 valoradas se selecciona de las mutaciones en las Figuras 2A o 2B. En otras modalidades, la mutación en NPM1 es una mutación de inserción que incluye, por ejemplo,, una inserción después del nucleótido que corresponde a la posición 1018 de la SEQ ID NO: 1. En otras modalidades, la inserción es una inserción CTCT o CTCG. La presencia de una mutación en NPM1 , incluyendo una mutación de inserción, se asocia con un pronóstico mejorado (es decir, un mejor pronóstico que el de un individuo al que se le ha diagnosticado el trastorno hematológico y que carece de la mutación en NPM1). En modalidades preferidas, el pronóstico mejorado es una tasa mejorada de remisión o una tasa de supervivencia global mejorada con respecto a un individuo al que se le ha diagnosticado un trastorno hematológico pero que carece de una mutación en NPM1.

En otras modalidades, el ácido nucleico obtenido a partir del fluido corporal carente de células se valora además para la presencia o ausencia de una o más mutaciones en el gen FLT3. En algunas modalidades, la mutación en el gen FLT3 es una duplicación de una repetición en tándem interna. De acuerdo con una interpretación, un individuo que carece de una mutación en FLT3, y que además contiene una mutación en NPM1 , tiene un pronóstico mejorado con respecto a un individuo al que se le ha diagnosticado un trastorno hematológico y cualquiera o las dos mutaciones en NPM1 y en FLT3.

En otras modalidades, el método además comprende determinar la citogenética del individuo. De acuerdo con una interpretación, un individuo que tiene citogenética intermedia, y que además comprende una mutación en NPM1 , tiene un pronóstico mejorado con respecto a un individuo que carece de una mutación en NP 1 y que tiene una citogenética intermedia, normal o deficiente. En otra interpretación, un individuo que tiene citogenética normal, y que además comprende una mutación en NPM1 , tiene un pronóstico mejorado con respecto a un individuo que tiene citogenética normal y que carece de una mutación en NPM1.

En otras modalidades, la presencia o ausencia de una mutación en NPM1 se valora al determinar la secuencia de nucleótidos de por lo menos una porción del ácido nucleico de NPM1. En otra modalidad, la presencia o ausencia de una mutación en NPM1 se valora al determinar el tamaño de por lo menos una porción del ácido nucleico de NPM1. Opcionalmente, el ácido nucleico de NPM1 se amplifica. La amplificación puede realizarse al utilizar cebadores para amplificación de oligonucleótidos de la SEQ ID NO: 3 y/o SEQ ID NO: 4. Opcionalmente, se determina el estatus de cigosidad del individuo.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para diagnosticar que un individuo tiene un trastorno hematológico al determinar la presencia o ausencia de una traslocación en un ácido nucleico de NPM1 obtenido a partir de un fluido corporal carente de células, y diagnosticar que el individuo tiene un trastorno hematológico cuando se detecta una traslocación en un ácido nucleico de NPM1. En ciertas modalidades, el, trastorno hematológico es linfoma anaplásico de células grandes, leucemia promielocítica aguda, y leucemia mielógena aguda. En otras modalidades, la traslocación se presenta entre el gen NP 1 y uno de los genes de cinasa de linfoma anaplásico de células grandes, receptor alfa de ácido retinoico, o factor 1 de mielodisplasia/leucemia mieloide. Opcionalmente, el individuo puede valorarse además para una o más mutaciones en el gen NPM1 y/o el gen FLT3, tal como se describe para los aspectos precedentes.

El término "muestra" o "muestra de paciente", tal como se utiliza en este documento, incluye muestras biológicas tales como tejidos y fluidos corporales. Los "fluidos corporales" pueden incluir, pero no se limitan a, sangre, suero, plasma, saliva, liquido cefalorraquídeo, liquido pleural, lágrimas, liquido de conductos lácticos, linfa, esputo, orina, liquido amniótico y semen. Una muestra puede incluir un fluido corporal que es "carente de células". Un "fluido corporal carente de células" incluye menos de alrededor de 1 % (p/p) de material celular Integro. El plasma o suero son ejemplos de fluidos corporales carentes de células. Una muestra puede incluir un espécimen de origen natural o sintético (es decir, una muestra con células hecha para que sea carente de células).

"Plasma", tal como se utiliza en este documento, se refiere a fluido carente de células encontrado en la sangre. El "plasma" puede obtenerse de la sangre al remover el material celular integro de la sangre por métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, centrifugación, filtración, y similares). Como se utiliza en este documento, "plasma de sangre periférica" se refiere a plasma obtenido a partir de muestras de sangre periférica.

"Suero", tal como se utiliza en este documento, incluye la fracción de plasma obtenida después de que se permite que el plasma o la sangre coagulen y se elimina la fracción coagulada.

El término "ácido nucleico" tiene la intención de incluir la forma polimérica de los nucleótidos de cualquier longitud, que contiene desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, y los análogos en cualquier combinación. Los ácidos nucleicos pueden tener una estructura tridimensional, y pueden realizar cualquier función, conocida o desconocida. El término ácido nucleico incluye moléculas de doble hebra, de hebra sencilla, parcialmente de doble hebra, de horquilla y de triple hélice. A menos que se especifique o se requiera de otra manera, cualquier modalidad de la ipvención descrita en este documento, que sea un ácido nucleico, abarca tanto a la forma de doble hebra como a cada una de las dos formas complementarias conocidas o previstas para constituir la forma de doble hebra del DNA, RNA o molécula híbrida. El ácido nucleico puede amplificarse, recombinarse, o puede aislarse directamente a partir de fuentes naturales. El ácido nucleico puede incluir ácido nucleico que se ha amplificado (por ejemplo, al utilizar la reacción en cadena de la polimerasa). Ejemplos específicos de ácidos nucleicos incluyen un gen o fragmento de gen, DNA genómico, RNA incluyendo mRNA, tRNA, y rRNA, ribozimas, cDNA, ácidos nucleicos recombinantes, ácidos nucleicos ramificados, plásmidos y vectores. Los ácidos nucleicos pueden ser naturales o sintéticos.

El término "ácido nucleico genómico", tal como se utiliza en este documento, se refiere al ácido nucleico en una célula que se presenta en el o los cromosomas de las células de un organismo, el cual contiene los genes que codifican las diversas proteínas de las células de ese organismo. Un tipo preferido de ácido nucleico genómico es el que se presenta en el núcleo de una célula eucariótica. En una modalidad preferida, un ácido nucleico genómico es DNA. El ácido nucleico genómico puede ser de doble hebra o hebra sencilla, o parcialmente de doble hebra, o parcialmente de hebra sencilla o una molécula en horquilla. El ácido nucleico genómico puede estar . intacto o fragmentado (por ejemplo, digerido con endonucleasas de restricción o por sonicación, o al aplicar una tensión de corte por métodos conocidos en la técnica). En algunos casos, el ácido nucleico genómico puede incluir la secuencia de todo o de una porción de un solo gen o de múltiples genes, la secuencia de uno o más cromosomas, o la secuencia de todos los cromosomas de una célula. Como se sabe bien, el ácido nucleico genómico incluye las regiones codificantes de los genes, ¡ntrones, las regiones 5' y 3' no traducidas, DNA de flanqueo 5' y 3', y segmentos estructurales tales como DNA telomérico y centromérico, tales como orígenes de replicación, y DNA ¡ntergénico. El ácido nucleico genómico qúe representa el ácido nucleico total del genoma se refiere como "ácido nucleico genómico total".

El ácido nucleico genómico puede obtenerse por métodos de extracción/purificación a partir de fluidos corporales carentes de células como se conoce bien en la técnica. La última fuente de ácido nucleico genómico pueden ser células normales o pueden ser células, que contienen una o más mutaciones en el ácido nucleico genómico, por ejemplo, duplicación, eliminación, traslocación, y transversión. En el significado de ácido nucleico genómico se incluye ácido nucleico genómico que se ha sometido a una etapa de amplificación que incrementa la cantidad de la secuencia objetivo de interés que se busca detectar, con respecto a otras secuencias de ácidos nucleicos en el ácido nucleico genómico.

Como se utiliza en este documento, el término "cDNA" se refiere a un polinucleótido complementario o de copia producido a partir de una plantilla de RNA por la acción de la actividad de la DNA polimerasa dependiente de RNA (por ejemplo, transcriptasa inversa). El cDNA puede ser de hebra sencilla, de doble hebra o parcialmente de doble hebra. El cDNA puede, contener nucleótidos no naturales. El cDNA puede modificarse después de sintetizarse. El cDNA puede comprender una etiqueta detectable.

El término "aislado", tal como se utiliza en este documento en el contexto de un polinucleótido o polipéptido, se refiere a una molécula que se separa sustancialmente de las macromoléculas celulares con las que se asocia naturalmente. Una molécula se aisla si en la composición representa por lo menos 25%, 50%, 75%, 90%, 95%, o 99% de las macromoléculas celulares con las que se asocia naturalmente.

Un "gen" se refiere a una secuencia de DNA que comprende secuencias de control y codificación necesarias para la producción de un RNA, que puede tener una función no codificante (por ejemplo, un RNA ribosómico o de transferencia) o que puede incluir un polipéptido o un precursor de polipéptidos. El RNA o polipéptido pueden codificarse por una secuencia codificante de longitud completa o por cualquier porción de la secuencia codificante siempre y cuando la actividad o función deseada se retenga.

El término "tipo silvestre" se refiere a un gen o a un producto génico que tiene las características de ese gen o producto génico cuando se aisla a partir de una fuente que se presenta en la naturaleza. Un gen de tipo silvestre es el que se observa más frecuentemente en una población y, de esta manera, se designa arbitrariamente como la forma "normal" o "de tipo silvestre" del gen. "Tipo silvestre" también puede referirse a la secuencia en una posición o posiciones específicas de nucleótidos, o a la secuencia en una posición o posiciones particulares de codones, o a la secuencia en una posición o posiciones particulares de aminoácidos. Como se utiliza en este documento, "mutante" "modificado" o "polimórfico" se refiere a un gen o producto génico que muestra modificaciones en su secuencia y/o propiedades funcionales (es decir, características alteradas), cuando se compara con el gen o producto génico de tipo silvestre. "Mutante", "modificado" o "polimórfico" también se refiere a la secuencia en una posición o posiciones específicas de nucleótidos, o a la secuencia en una posición o posiciones particulares de codones, o a la secuencia en una posición o posiciones particulares de aminoácidos.

Una "mutación" pretende abarcar por lo menos una variación de nucleótido en una secuencia de nucleótidos con respecto a la secuencia normal. Una mutación puede incluir una sustitución, una eliminación, una inversión o una inserción. Con respecto a un polipéptido codificado, una mutación puede ser "silenciosa" y no tener como resultado un cambio en la secuencia codificada de polipéptidos, o una mutación puede tener como resultado un cambio en la secuencia codificada de polipéptidos. Por ejemplo, una mutación puede tener como resultado una sustitución en la secuencia codificada de polipéptidos. Una mutación puede tener como resultado un cambio en el marco de lectura con respecto a la secuencia codificada de polipéptidos.

El término "homología" u "homólogo" se refiere a un grado de identidad. Es posible que haya homología parcial u homología completa. Una secuencia parcialmente homóloga es una que tiene menos de 100% de identidad de secuencia, cuando se compara con otra secuencia.

"Heterocigótico" se refiere a tener diferentes alelos en uno o más loci genéticos en segmentos de cromosomas homólogos. Como se utiliza en este documento, "heterocigótico" también puede referirse a una muestra, una célula, una población celular o un organismo en el que alelos diferentes en uno o más loci genéticos pueden detectarse. Las muestras heterocigóticas también pueden determinarse a través de métodos conocidos en la técnica tal como, por ejemplo, la secuenciación de ácidos nucleicos. Por ejemplo, si un electroferograma de secuenciación muestra dos picos en un solo ¡ocus, y ambos picos son aproximadamente del mismo tamaño; la muestra puede caracterizarse como heterocigótica. O, si un pico es más pequeño que otro, pero es de por lo menos alrededor del 25% del tamaño del pico más grande, la muestra puede caracterizarse como heterocigótica. En algunas modalidades, el pico más pequeño es por lo menos alrededor del 15% del pico más grande. En otras modalidades, el pico más pequeño es por lo menos alrededor del 10% del pico más grande. En otras modalidades, el pico más pequeño es por lo menos alrededor del 5% del pico más grande. En otras modalidades, se detecta una cantidad mínima del pico más pequeño.

El "ácido nucleico" o "secuencia de ácidos nucleicos", tal como se utiliza en este documento, se refiere a un oligonucleótido, nucleótido o polinucleótido, y fragmentos o porciones de los mismos, que pueden ser de una o de doble hebra, y representan la hebra sentido o antisentido. Un ácido nucleico puede incluir DNA o RNA, y puede ser de origen natural o sintético, y puede contener desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, o análogos de nucleótidos en cualquier combinación.

Ejemplos no limitantes de polinucleótidos incluyen un gen o fragmento génico, DNA genómico, exones, intrones, mRNA, tRNA, rRNA, ribozimas, cDNA, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, DNA aislado a partir de cualquier secuencia, RNA aislado a partir de cualquier secuencia, ácido nucleico sintético, sondas de ácidos nucleicos y cebadores. Los polinucleótidos pueden ser naturales o sintéticos. Los polinucleótidos pueden comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos, uracilo, otros azúcares y grupos de enlace tales como fluororibosa y tiolato, y ramificaciones de nucleótidos. Un ácido nucleico puede modificarse, tal como por conjugación, con un componente de etiquetado. Otros tipos de modificaciones incluidas en esta definición son tapas, la sustitución de uno o de más de los nucleótidos que se presentan en la naturaleza con un análogo, y la Introducción de entidades químicas para unir el polinucleótido a otras moléculas tales como proteínas, iones metálicos, componentes de etiquetado, otros polinucleótidos o un soporte sólido. El ácido nucleico puede incluir ácido nucleico que se ha amplificado (por ejemplo, al utilizar la reacción en cadena de la polimerasa).

Un fragmento de un ácido nucleico contiene generalmente por lo menos alrededor de 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 1000 nucleótidos o más. Fragmentos más grandes son posibles y pueden incluir alrededor de.2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 5000, 7500, o 10000 bases.

El término "hibridación especifica" se refiere a una interacción de hibridación entre dos secuencias de ácidos nucleicos que comparten un grado alto de complementariedad, en donde la hibridación es para la exclusión de hibridación entre el ácido nucleico de interés y otros ácidos nucleicos relacionados. Complejos de hibridación específica se forman bajo condiciones permisivas de alineación y permanecen hibridados después de cualquier etapa subsecuente de lavado. Las condiciones permisivas para la alineación de secuencias de ácidos nucleicos pueden determinarse rutinariamente por un experto en la técnica y pueden presentarse, por ejemplo, a 65° C en presencia de alrededor de 6x SSC. La astringencia de hibridación puede expresarse, en parte, con referencia a la temperatura bajo la que se llevan a cabo las etapas de lavado. Tales temperaturas típicamente, se seleccionan para que sean de aproximadamente 5o C a 20° C más bajas que el punto térmico de fusión (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo fuerza iónica y pH definidos) en la que 50% de la secuencia objetivo híbrida con una sonda perfectamente coincidente. Las ecuaciones para calcular la Tm y las condiciones para la hibridación de ácidos nucleicos se conocen en la técnica.

El término "condiciones astringentes de hibridación", tal como se utiliza en este documento, se refiere a condiciones de hibridación por lo menos tan astringentes como las siguientes: hibridación en 50% de formamida, 5x SSC, NaH2P04 50 mM, pH 6.8, 0.5% de SDS, 0.1 mg/ml de DNA de esperma de salmón sonicado, y solución de Denhart 5x a 42° C. durante la noche; lavado con 2x SSC, 0.1% de SDS a 45° C; y lavado con 0.2x SSC, 0.1% de SDS a 45° C. En otro ejemplo, las condiciones astringentes de . hibridación no deben permitir una hibridación de dos ácidos nucleicos que difieren a lo largo de una distancia de 20 nucleótidos contiguos en más de dos bases.

Los oligonucleótidos utilizados como cebadores o sondas para amplificar específicamente (es decir, amplificar una secuencia particular de ácidos nucleicos objetivo) o detectar específicamente (es decir, detectar una secuencia particular de ácidos nucleicos objetivo) un ácido nucleico objetivo, g.eneralmente son capaces de hibridar específicamente con el ácido nucleico objetivo.

Como se utiliza en este documento, un "cebador" para la amplificación es un oligonucleótido que es complementario a una secuencia de nucleótidos objetivo que es capaz de actuar como punto de inicio de la síntesis cuando se coloca bajo condiciones en las que se inicia la extensión del cebador (por ejemplo, la extensión del cebador asociada con una aplicación tal como PCR) y conduce a la adición de nucleótidos al extremo 3' del cebador en presencia de una polimerasa de DNA o RNA. En modalidades preferidas, el nucleótido 3' del cebador es complementario a la secuencia objetivo en una posición correspondiente de nucleótido para la expresión y la amplificación óptimas. Un "cebador" puede presentarse en la naturaleza, tal como en una digestión de restricción purificada o puede producirse de manera sintética. El término "cebador", tal como se utiliza en este documento, incluye todas las formas de cebadores que pueden sintetizarse incluyendo cebadores de ácidos nucleicos peptídicos, cebadores de ácidos nucleicos bloqueados, cebadores modificados con fosforotioato, cebadores marcados, y similares. Los cebadores típicamente son de por lo menos alrededor de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o más nucleótidos de largo. Una longitud óptima para una aplicación particular de cebadores puede determinarse fácilmente en la manera descrita en H. Erlich, PCR Technology, Principies and Application for DNA Amplification (1989).

Una "sonda" se refiere a un ácido nucleico que interactúa con un ácido nucleico objetivo a través de hibridación. Las sondas pueden ser oligonucleótidos, cromosomas artificiales, cromosoma artificial fragmentado, ácido nucleico genómico, ácido nucleico genómico fragmentado, RNA, ácido nucleico recombinante, ácido nucleico recombinante fragmentado, ácido nucleico peptídico (PNA), ácido nucleico bloqueado, oligómero de heterociclos cíclicos, o conjugados de ácido nucleico. Las sondas pueden comprender nucleobases modificadas y porciones de azúcares modificadas. Una sonda puede ser completamente complementaria a una secuencia de ácidos nucleicos objetivo o parcialmente complementaria. Una sonda puede utilizarse para detectar la presencia o ausencia de un ácido nucleico objetivo. Una sonda o sondas pueden utilizarse, para detectar, por ejemplo, la presencia o ausencia de una mutación en una secuencia de ácidos nucleicos en virtud de las características de secuencia del objetivo. Las sondas pueden etiquetarse o no etiquetarse, o modificarse en cualquiera de varias maneras bien conocidas en la técnica. Una sonda puede hibridar específicamente con un ácido nucleico objetivo. Las sondas típicamente son de por lo menos alrededor de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 nucleótidos o más de largo. En modalidades preferidas, una sonda para NPM1 híbrida específicamente con un ácido nucleico que comprende por lo menos 20 nucleótidos que son sustancialmente idénticos a una región de la SEQ ID NO: 1 que abarca las posiciones de nucleótidos 1018 y 1019. Preferiblemente, la sonda híbrida específicamente ya sea con la secuencia de NPM1 tipo silvestre o una secuencia de NPM1 que comprende una mutación por inserción.

El término "etiqueta detectable", tal como se utiliza en este documento, se refiere a una molécula o un compuesto o un grupo de moléculas (por ejemplo, un sistema de detección) utilizado para identificar una molécula objetivo de . interés. Típicamente, las etiquetas detectables representan un componente de un sistema de detección y se unen a otra molécula que se asocia específicamente a la molécula objetivo. En algunos casos, la etiqueta detectable puede detectarse directamente. En otros casos, la etiqueta detectable puede ser una parte de un par de unión, que luego puede detectarse subsecuentemente. Las señales de la etiqueta detectable pueden detectarse por varios medios y dependerán de la naturaleza de la etiqueta detectable. Ejemplos de medios para detectar la etiqueta detectable incluyen, pero no se limitan a, medios espectroscópicos, fotoqulmlcos, bioquímicos, inmunoquímicos, electromagnéticos, radioquímicos, o químicos, tales como fluorescencia, quimiofluorescencia, quimioluminiscencia, o cualquier otro medio apropiado.

El término "ácido nucleico objetivo" y "secuencia objetivo" se utiliza de manera intercambiable en este documento, y se refiere a la secuencia de ácidos nucleicos que se pretende identificar. La secuencia objetivo puede ser DNA o RNA. La "secuencia objetivo" puede ser ácido nucleico genómico. Las secuencias objetivo pueden incluir secuencias de tipo silvestre, secuencias de ácidos nucleicos que contienen mutaciones puntuales, eliminaciones o duplicaciones, secuencias de todo o de una porción de un solo gen o de múltiples genes, las secuencias de uno o más cromosomas, o cualquier otra secuencia de interés. Las secuencias objetivo pueden representar secuencias o alelos alternativos de un gen particular. La secuencia objetivo puede ser de doble hebra o de hebra sencilla, o parcialmente de doble hebra, o parcialmente de hebra sencilla o una molécula en horquilla. La secuencia objetivo puede ser de alrededor de 1-5 bases, alrededor de 10 bases, alrededor de 20 bases, alrededor de 50 bases, alrededor de 100 bases, o alrededor de 500 bases, o más.

El término "amplificación" o "amplificar", tal como se utiliza en este documento, incluye los métodos para copiar un ácido nucleico objetivo, con lo cual se incrementa el número de copias de una secuencia seleccionada de ácidos nucleicos. La amplificación puede ser exponencial o lineal.

Un ácido nucleico objetivo puede ser DNA o RNA. Las secuencias amplificadas en esta manera forman un "amplicón" o "producto de amplificación". Aunque los métodos ejemplares descritos a continuación se relacionan con la amplificación al utilizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), otros métodos numerosos se conocen en la técnica para la amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, los métodos isotérmicos, los métodos de círculo rodante, etc.). El experto comprenderá que estos otros métodos pueden utilizarse ya sea en lugar de, o en conjunto con, los métodos de PCR. Véase, por ejemplo, Saiki, "Amplification of Genomic DNA" en PCR Protocols (1990), Innis er a/., Eds., Academic Press, San Diego, CA, pp 13-20; Wharam, et al., Nucleic Acids Res. (2001 ), Jun 1 ; 29(11 ):E54-E54; Hafner, er a/., Biotechniques (2001 ), 4:852-6, 858, 860.

Como se utiliza en este documento, el término "alrededor de" significa, en términos cuantitativos, más o menos 10%.

Como se utiliza en este documento, el término "cariotipo'normal" significa células que no tienen aberraciones cromosómicas que incluyen pero no se limitan a traslocaciones, inversiones, y a la presencia de elementos extra cromosómicos tal como DNA microsatelital.

El término "estatus de cigosidad", tal como se utiliza en este documento, se refiere a una muestra, una población celular, o un organismo que aparece heterocigótico, homocigótico, o hemicigótico cuando se determina al probar los métodos conocidos en la técnica y descritos en este documento. El término "estatus de cigosidad de un ácido nucleico" significa determinar si la fuente de ácido nucleico parece heterocigótica, homocigótica, o hemicigótica. El "estatus de cigosidad" puede referirse a diferencias en un solo nucleótido en una secuencia. En algunos métodos, el estatus de cigosidad de una muestra con respecto a una sola mutación puede clasificarse como tipo silvestre homocigótico, heterocigótico (es decir, un alelo de tipo silvestre y un alelo muíante), mutante homocigótico, o hemicigótico (es decir, una sola copia del alelo de tipo silvestre o mutante). Dado que la secuenciación directa de muestras de plasma o células, tal como se realiza rutinariamente en los laboratorios clínicos, no distingue de manera confiable entre hemicigosidad y homocigosidad, en algunas modalidades, estas clases se agrupan. Por ejemplo, las muestras en las que ninguna o una cantidad mínima de ácido nucleico de tipo silvestre se detecta se denominan "mutante hemicigótica/homocigótica".

La frase "determinar un pronóstico", tal como se utiliza en este documento, se refiere al proceso en el que se predice el curso o resultado de un padecimiento en un paciente. El término "pronóstico" no se refiere a la capacidad de predecir el curso o resultado de un padecimiento con 100% de certeza. En lugar de ello, el término se refiere a identificar una probabilidad incrementada o disminuida de que cierto curso o resultado ocurrirán en un paciente que exhibe un padecimiento/marcador dado, cuando se compara con aquellos individuos que no exhiben el padecimiento. La naturaleza del pronóstico es dependiente de la enfermedad específica y el padecimiento/marcador que se valora. Por ejemplo, un pronóstico puede expresarse como la cantidad de tiempo que puede esperarse para que sobreviva un paciente, la probabilidad de que la enfermedad entre en remisión, o a la cantidad de tiempo que puede esperarse para que la enfermedad permanezca en remisión.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es una representación esquemática del gen de la nucleofosmina (NPM1) y de la protelna nucleofosmina, el producto del gen NPM1. Los términos "NES", "NLS", y "NoLS" indican señal de exportación nuclear, señal de localización nuclear, y señal dé localización nucleolar en la protelna nucleofosmina, respectivamente. "**" indica el sitio de las mutaciones en el gen NP 1 y la protelna nucleofosmina.

La Figura 2A muestra las secuencias de nucleótidos de varias mutaciones en NPM-1 en el exón 12 que se han identificado en pacientes con AML. Las secuencias mutantes de NPM1 se muestran con respecto a la secuencia de NPM1 de tipo silvestre ("WT"). La Figura 2B muestra la porción de la señal de localización nucleolar (que comienza con el aminoácido 286 de la SEQ ID NO: 2) de las proteínas de nucleofosmina, que resulta de las mutaciones identificadas en la Figura 2A.

Las Figuras 3A y 3B muestran los resultados de la detección de una mutación en NPM1 presente en células de médula ósea, plasma y células de sangre periférica. La Figura 3A representa un análisis de tamaños de los productos de amplificación por PCR a partir de células de sangre periférica (células PB; parte superior), células de médula ósea (células BM; centro), y plasma de sangre periférica (parte inferior) de un solo paciente con AML. El NPM1 WT (212 bp) se presenta en cada de tipo de muestra, mientras un NPM1 mutante que contiene una inserción de 4 bp (216 bp) sólo se detecta en la médula ósea y el plasma. A la izquierda, la mayor parte de los picos representa un estándar de 200 bp. La Figura 3B representa un análisis de secuencia de la mutación de NPM1 en un paciente heterocigótico en comparación con un paciente WT. El sitio de inserción se detalla en negro, lo que indica el comienzo de un cambio en el marco de lectura en el RNA resultante (cuando se lee de derecha a izquierda desde el punto de inserción).

La Figura 4 indica el resultado de las mutaciones en NPM1 por análisis de tamaños. Los análisis se realizaron en plasma de pacientes con AML. Los resultados revelan una novedosa mutante por eliminación de 4 bp. El análisis de tamaños de los productos de amplificación por PCR distingue entre NPM1 WT (212 bp; parte inferior), mutantes por inserción de 4 bp (216 bp; centro) descritas anteriormente, y una novedosa mutante por eliminación de 4 bp de NPM1 (208 bp; parte superior). A la izquierda, la mayor parte de los picos representa un estándar de 200 bp.

La Figura 5 indica la correlación de la presencia de la mutación por inserción en NPM1 y el resultado clínico mejorado de pacientes con AML. La mutación en NPM1 confiere una ventaja de supervivencia significativa en pacientes con AML que son lentos para responder a la terapia. El diagrama de Kaplan-Meier da la supervivencia de pacientes en semanas como una proporción de la población de pacientes con AML que tomaron más de 35 días en demostrar una respuesta a la terapia. El diagrama compara pacientes mutantes positivos y mutantes negativos en NPM1 , que muestran una ventaja de supervivencia significativa para pacientes que llevan la mutación en NPM1 (P = 0.027). (E, eventos totales; N, número de muertes).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa en el descubrimiento de que las mutaciones en el gen NPM1 , que subyace varias malignidades hematológicas, puede detectarse de manera confiable al utilizar ácidos nucleicos aislados a partir de un fluido corporal carente de células (por ejemplo, suero o plasma) obtenido a partir de un paciente. En particular, se ha descubierto que el plasma de sangre periférica es un tipo de muestra confiable para la detección de las mutaciones en NPM1 en pacientes con AML. Cuando las células de médula ósea y plasma se probaron en paralelo, habla concordancia completa en las muestras coincidentes. Además, el análisis de plasma demostró una sensibilidad mayor que el análisis de mutaciones en NPM1 al utilizar células de sangre periférica.

Sin desear limitarse por teoría alguna, se considera que la alta tasa de recambio de las células tumorales, cuando se compara con células normales, subyace la sensibilidad incrementada del plasma para la detección de mutaciones en NPM1 con respecto a las células de sangre periférica. A causa de este recambio, las células tumorales vierten en la circulación su DNA, RNA y protelna, los cuales pueden ser sustratos de prueba. En malignidades hematológicas tales como AML y MDS, la mayor parte de las células tumorales está en la médula ósea. Sin embargo, sólo relativamente pocas células leucémicas circulan en la sangre periférica en algunos pacientes, por lo tanto, el análisis de sangre periférica resultó poco confiable para detectar las mutaciones en NPM1 en algunos pacientes.

La prueba de plasma y/o suero es favorable dado que contiene ácido nucleico derivado de células tumorales de médula ósea. Además, la prueba del plasma/suero minimiza la contribución de las células normales residuales a las mediciones obtenidas, lo que de esta manera ayuda a evitar la subestimación en algunos casos ocasionada por la "dilución" de muestras de médula ósea maligna por las células normales persistentes. Se considera que esto se debe al hecho de que, en el plasma, los restos creados por la muerte celular programada de células normales se eliminan inmediatamente por el sistema reticuloendotelial, mientras el desecho que resulta del recambio de células leucémicas se elimina de manera mucho menos eficiente.

Como se describe en este documento, el plasma resultó ser más sensible que las células de sangre periférica, con 8% de las pruebas basadas en células produciendo resultados falsos negativos. El falso negativo tiene como resultado que células de sangre periférica quizás se atribuyan predominantemente a enfermedad de médula ósea sin células leucémicas circulantes, mientras el plasma contenía material genético de células malignas que pudieron haber muerto en la médula ósea y, de esta manera, dio resultados positivos. Adicionalmente, el plasma proporciona la misma facilidad de recolección que las células de sangre periférica, lo que evita la necesidad de una recolección dolorosa e invasiva de muestras de médula ósea.

Para confirmar además el valor clínico de probar el plasma, los resultados dé las mutaciones se correlacionaron con observaciones clínicas similares a las que se informaron cuando se realizó la prueba de médula ósea. Habla correlación significativa de mejor supervivencia en pacientes positivos a mutaciones en NPM1 que tuvieron citogenética intermedia y requirieron más de 35 días de tratamiento para lograr la remisión. Esta observación indica que aquellos pacientes con AML que sobreviven 35 días de terapia sin mostrar signos de remisión no deben considerarse como riesgo alto si llevan la mutación en NPM1.

El gen de la nucleofosmina (NPM1) La mutación heterocigótica del gen de la nucleofosmina (NPM1) se ha descrito recientemente como una de las lesiones genéticas más frecuentes en la leucemia mieloide aguda (AML). El gen NPM1 se sitúa en el cromosoma 5q35 en los humanos. Contiene 12 exones.. Una representación esquemática del gen NPM1 se muestra en la Figura 1. La secuencia ejemplar del DNA genómico que comprende el gen NPM1 puede encontrarse en el número de acceso del NCBI GenBank NW_001838954. Cuya secuencia se incorpora en este documento para referencia.

Diversas variantes de mRNA de NPM1 se conocen en la , técnica. Muchas de las secuencias conocidas son secuencias de cDNA de longitud completa y algunas son secuencias parciales de cDNA. Las secuencias ejemplares de cDNA de NPM1 incluyen pero no se limitan a: Los números de acceso del NCBI GenBank: NM_002520, NM_199185, NM_001037738, BC002398, BC050628, BC021983, BC021668, BC016824, BC016768, BC016716, BC014349, BC012566, BC008495, DQ303464, BC009623, BC003670, AY740640, AY740639, AY740638, AY740637, AY740636, AY740635, AY740634, M28699. La secuencia de todas las variantes de NPM1 indicadas anteriormente se incorporan en este documento para referencia. Una secuencia ejemplar del cDNA del gen NPM1 se proporciona en la SEQ ID NO: 1.

Las mutaciones en NPM1 más comunes que se han identificado en la AML son inserciones de 1 o 2 tetranucleótidos, una eliminación de 4 pares de bases (bp) o 5 bp combinada con una inserción de 9 bp, y una eliminación de 9 bp combinada con una inserción de 14 bp. La mayor parte de estas mutaciones se sitúan en el exón 12 y se muestran en la Figura 2A.

El NPM1 existe en dos isoformas empalmadas alternativamente. B23.1 , la isoforma predominante, se presenta en todos los tejidos y contiene 294 aminoácidos, mientras que B23.2, una proteína truncada, carece de los últimos 35 aminoácidos del extremo C-terminal de B23..1 y se expresa en niveles muy bajos. La molécula NPM1 (mostrada esquemáticamente en la Figura 1 ) contiene distintos dominios funcionales incluyendo un dominio de homo-oligomerización del extremo N-terminal requerido para la formación de dímeros y hexámeros de NPM, un dominio de heterodimerización implicado en orientarse a otras proteínas, tal como nucleolina y el inhibidor p1 de cinasas dependientes de ciclina/marco de lectura alternativo (p14ARF, referido de ahora en adelante como ARF), y un dominio C-terminal de unión a ácidos nucleicos esencial para la asociación con RNA Implicado en el procesamiento de RNA ribosómico. La secuencia de aminoácidos de la isoforma de NPM1 B23.1 se proporciona en la SEQ ID NO: 2.

Aunque la mayor parte de NPM1 reside en el nucléolo, se traslada del núcleo al citoplasma. La Señal de Localización Nuclear (NLS) conduce a NPM1 del citoplasma al nucleoplasma, donde se transloca al nucléolo por su señal de localización nucleolar (NoLS). Los residuos particularmente importantes en la NoLS son los residuos triptófano 288 y triptófano 290 de la SEQ ID NO: 2. NPM1 permanece en los nucléolos, aún cuando contiene motivos de Señal de Exportación Nuclear (NES), ricos en leucinas, hidrófobos y altamente conservados, dentro de los residuos 94-102 y 42-49 de la SEQ ID NO: 2, los cuales lo expulsan del núcleo.

Uno de los rasgos más distintivos de los mutantes en NPM1 es su localización aberrante en el citoplasma de las células leucémicas. Esto se relaciona causalmente con dos alteraciones en el extremo C-terminal muíante leucémico: (i) generación de un motivo NES adicional rico en leucinas; y (ii) pérdida de los residuos de triptófano en una o las dos posiciones 288 y 290 de la SEQ ID NO: 2 que son cruciales para la localización nucleolar de NP 1. La mutación de ambos triptófanos se asocia con el motivo muy común de NES, L-xxx-V-xx-V-x-L; la retención del triptófano 288 se asocia con variantes raras de NES en las que la valina en la segunda posición se reemplaza por leucina, fenilalanina, cisteína o metionina (Falini et al. Blood. 2006; 107: 4514-23). La mayor parte de los mutantes en NPM1 comparten los últimos 5 residuos de aminoácidos VSLRK.

Las mutaciones de NPM1 en la AML a menudo se asocian con citogenética normal, y con duplicaciones internas en tándem del gen FLT3 (FLT3-ITD). Diversos eetudios han mostrado que, dentro del grupo de pacientes con AML que tienen un cariotipo normal, los pacientes con mutación en NPM1 tuvieron una tasa de remisión completa similar o significativamente superior que la de pacientes con AML con NPM1 de tipo silvestre (Boissel et al. Blood. 2005; 106: 3618-3620; Falini ef al. N. Engl. J. Med. 2005; 352: 254-266; Suzuki et al. Blood. 2005;106: 2854-2861 ; Dohner ef al. Blood. 2005; 106: 3740-6).

La mayor parte de los estudios han mostrado una tendencia estadística hacia un resultado favorable en la supervivencia libre de eventos adversos y supervivencia global. Análisis adicionales en el contexto de otras aberraciones moleculares han mostrado que los pacientes con mutaciones en NPM1 , sin duplicación interna en tándem de la tirosina cinasa 3 relacionada con fms concomitante (FLT3-ITD) tienen incluso un pronóstico más favorable que los pacientes con AML con FLT3-ITD, y se ha asociado con una probabilidad de alrededor de 60% de supervivencia en 5 años en pacientes más jóvenes (Dohner ef al. Blood. 2005; 106: 3740-6).

El gen FLT3 El gen FLT3 se sitúa en el cromosoma 13 en los humanos. La secuencia ejemplar del gen FLT3 en el cromosoma humano se da a conocer en el número de acceso del NCBI GenBank NG_007066, incorporado por la presente para referencia. La secuencia ejemplar del cDNA del gen FLT3 se muestra en el listado de secuencias.

En algunas modalidades las invenciones proporcionan los métodos para la detección del gen FLT3 solo o simultáneamente con NPM1 en fluidos corporales carentes de células. En modalidades preferidas, las invenciones proporcionan los métodos para la detección de una o más mutaciones del gen FLT3 solo o simultáneamente con la detección de una o más mutaciones en el gen NPML Recolección y preparación de muestras biológicas Los métodos y composiciones de esta invención pueden utilizarse para detectar mutaciones en los ácidos nucleicos de NPM1 (por ejemplo, DNA genómico y/o RNA) al utilizar una muestra biológica obtenida a partir de un individuo. El ácido nucleico puede aislarse a partir de la muestra de acuerdo con cualquier método bien conocido por los expertos en la técnica. Si es necesario, la muestra puede recolectarse o puede concentrarse por centrifugación y similares. Las células de la muestra pueden someterse a lisis, tal como por tratamientos con enzimas, calor, surfactantes, ultrasonido, o con una combinación de los mismos con el fin de preparar un fluido carente de células. Alternativamente, las mutaciones en el gen NPM1 pueden detectarse al utilizar un fluido corporal carente de células de acuerdo con los métodos descritos en la Publicación de Patente de E.U. US 2007/0248961 , incorporada por la presente para referencia.

Métodos de preparación de plasma o suero Los métodos de preparación de plasma y suero se conocen bien en la técnica. Plasma sanguíneo o suero "frescos", o plasma o suero congelados (almacenados) y subsecuentemente descongelados pueden utilizarse. El plasma o suero congelados (almacenados) deben mantenerse de manera óptima en condiciones de almacenamiento de -20 a -70 grados centígrados hasta descongelarse y utilizarse. El plasma o suero "frescos" deben refrigerarse o deben mantenerse en hielo hasta utilizarse, y la extracción de ácidos nucleicos (por ejemplo, RNA, DNA o ácido nucleico total) debe realizarse tan pronto como sea posible. Los métodos ejemplares se describen a continuación.

La sangre puede extraerse por métodos estándar en un tubo de recolección, preferiblemente vidrio siliconado, ya sea sin anticoagulante para la preparación de suero, o con EDTA, citrato de sodio, heparina, o con anticoagulantes similares para la preparación de plasma. El método preferido si se prepara plasma o suero para su almacenamiento, aunque no es un requisito absoluto, es que el plasma o suero se fraccionen primero a partir de sangre completa antes de congelarse. Esto reduce la carga de RNA intracelular extraño liberado de la lisis de células congeladas y descongeladas que pudieran reducir la sensibilidad del ensayo de amplificación o interferir con el ensayo de amplificación por la liberación de inhibidores de la PCR tales como porfirinas y hematina. El plasma o suero "frescos" pueden fraccionarse a partir de sangre completa por centrifugación, al utilizar centrifugación preferiblemente moderada de 300-800 veces la gravedad durante cinco a diez minutos, o fraccionarse por otros métodos estándar. Las altas tasas de centrifugación, capaces de fraccionar cuerpos apoptóticos, deben evitarse. Dado que la heparina puede interferir con la RT-PCR, el uso de sangre con heparina puede requerir un pre-tratamiento con heparinasa, seguido por la remoción de calcio antes de la transcripción inversa. Imai, H., ef al., J. Virol. Methods 36:181-184, (1992). De esta manera, el EDTA es el anticoagulante preferido para especímenes de sangre en los que se planea la amplificación por PCR.

Extracción y amplificación de ácidos nucleicos Opcionalmente, el ácido nucleico del fluido carente de células puede amplificarse con el fin de facilitar el análisis de mutaciones.

Diversos métodos de extracción son adecuados para aislar el DNA o RNA. Los métodos adecuados incluyen extracción con fenol y cloroformo. Véase Maniatis eí al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d, Cold Spring Harbor Laboratory Press, página 16.54 (1989). Numerosos equipos comerciales también producen DNA y RNA adecuados incluyendo, pero sin limitarse a, QlAamp™ mini blood kit, Agencourt Genfind™, Roche Cobas® Roche MagNA Puré® o la extracción con fenolxloroformo al utilizar Eppendorf Phase Lock Gels®, y el NucliSens extraction kit (Biomerieux, Marcy l'Etoile, Francia). En otros métodos, el mRNA puede extraerse a partir de muestras de sangre/médula ósea de los pacientes al utilizar MagNA Puré LC mRNA HS kit y Mag NA Puré LC Instrument (Roche Diagnostics Corporation, Roche Applied Science, Indianapolis, IN).

El ácido nucleico extraído a partir de tejidos, células, plasma o suero puede amplificarse al utilizar técnicas de amplificación de ácidos nucleicos bien conocidas en la técnica. Muchos de estos métodos de amplificación también pueden utilizarse para detectar la presencia de mutaciones simplemente al diseñar cebadores o sondas de oligonucleótidos para interactuar o hibridar con una secuencia objetivo particular en una manera especifica. A modo de ejemplo, pero no a modo de limitación, estas técnicas pueden incluir la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la polimerasa y transcriptasa inversa (RT-PCR) PCR anidada, reacción en cadena de la ligasa. Véase Abravaya, K., ef al., Nucleic Acids Research 23:675-682, (1995), amplificación de señales de DNA ramificado, Urdea, M. S., et al., AIDS 7 (supl. 2):S11-S 14, (1993), reporteros de RNA que puede amplificarse, replicación de Q-beta, amplificación basada en transcripción, amplificación de DNA boomerang, activación por desplazamiento de hebra, tecnología de sondas cíclicas, amplificación térmica basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA). Véase Kievits, T. ef al., J Virological Methods 35:273-286, (1991 ), Invader Technology, u otros ensayos de replicación de secuencias o ensayos de amplificación de señales.

El RNA de suero y de plasma es sensible, específico, y abundante, y puede utilizarse en lugar de las pruebas basadas en DNA (genómico). El RNA puede extraerse a partir de plasma o suero al utilizar partículas de sílice, cuentas de vidrio, o diatomeas, tal como en el método o adaptaciones de Boom, R., ef al., J. Clin. Micro. 28:495-503, (1990). La aplicación del método adaptado por Cheung, R. C, ef al., J. Clin Micro. 32:2593-2597, (1994), se describe.

Por ejemplo, partículas de sílice fraccionadas por tamaños se preparan al suspender 60 gramos de dióxido de silicio (Si02, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) en 500 mililitros del agua de doble destilación, estéril y desmineralizada. La suspensión entonces se deja reposar durante 24 horas a temperatura ambiente. Cuatrocientos treinta (430) mililitros de sobrenadante se eliminan por succión y las partículas se suspenden nuevamente en agua de doble destilación estéril y desmineralizada, agregada para igualar un volumen de 500 mililitros. Después de 5 horas adicionales de reposo, 440 mililitros del sobrenadante se elirninan por succión, y 600 microlitros de HCI (32% p/vol) se agregan para ajusfar la suspensión a un pH de 2. La suspensión se distribuye en alícuotas y se almacena en la oscuridad.

El regulador de lisis se prepara al disolver 120 gramos de tiocianato de guanidina (GuSCN, Fluka Chemical, Buchs, Suiza) en 100 mililitros de clorhidrato de Tris 0.1 M (Trís-HCI) (pH 6.4), y 22 mililitros de EDTA 0.2 M, ajustado a pH 8.0 con NaOH, y con 2.6 gramos de Tritón X-100 (Packard Instrument Co., Downers Grove, III.). -La solución entonces se homogeniza. El regulador de lavado se prepara al disolver 120 gramos de tiocianato de guanidina (GuSCN) en 100 mililitros de Tris-HCI 0.1 M (pH 6.4).

Cien microlitros a doscientos cincuenta microlitros (con cantidades mayores necesarias en entornos de mínima enfermedad) de plasma o suero se mezclan con 40 microlitros de suspensión de sílice preparada como se menciona anteriormente, y con 900 microlitros de regulador de lisis, preparado como se menciona anteriormente, al utilizar una mezcladora Eppendorf 5432 durante 10 minutos a temperatura ambiente. La mezcla entonces se centrifuga a 12,000 x g durante un minuto y el sobrenadante se aspira y desecha. La pastilla del sílice-RNA entonces se lava dos veces con 450 microlitros del regulador de lavado, preparado como se menciona anteriormente. La pastilla entonces se lava dos veces con un mililitro de etanol al 70% (vol/vol). A la pastilla entonces se le da un lavado final con un mililitro de acetona y se seca en un bloque térmico a 56 grados centígrados durante diez minutos. La pastilla se suspende nuevamente en 20 a 50 microlitros de agua tratada con procarbonato de dietilo a 56 grados centígrados durante diez minutos para eluir el RNA. La muestra puede eluirse alternativamente durante diez minutos a 56 grados centígrados con un regulador de TE que consiste en Tris-HCI 10 milimolar, EDTA uno milimolar (pH 8.0) con un inhibidor de RNasas (RNAsin, 0.5 U/microlitro, Promega), ya sea con o sin Proteinasa K (100 ng/ml) como se describe por Boom, R., ef al., J. Clin. Micro. 29:1804-181 1 , (1991 ). Después de la elución, la muestra entonces se centrifuga a 12,000 x g durante tres minutos, y el- sobrenadante que contiene RNA se recupera.

Como un método alternativo, el RNA puede extraerse a partir de plasma o suero al utilizar el método de extracción con tiocianato de guanidinio ácido-fenol-cloroformo descrito por Chomczynski, P. and Sacchi, N., Analytical Biochemistry 162:156-159, (1987), o el método modificado como se describe por Chomczynski, P., Biotech 15:532-537, (1993), cada uno de los cuales se incorpora por la presente para referencia.

DNA extracelular circulante, incluyendo DNA extracelular derivado de tumores, también se presenta en el plasma y el suero. Dado que este DNA se extraerá adicionalmente en grados diversos durante los métodos de extracción de RNA descritos anteriormente, puede ser deseable o necesario (lo que depende de los objetivos clínicos) purificar además el extracto de RNA y remover el DNA traza antes de continuar al análisis posterior del RNA. Esto puede lograrse al utilizar DNasa, por ejemplo, por el método que se describe por Rashtchian, A., PCR Methods Applic. 4:S83-S91 , (1994).

Alternativamente, para el análisis posterior de RNA, pueden construirse cebadores que favorecen la amplificación de los productos de RNA, pero no del DNA contaminante, tal como al utilizar cebadores que abarcan las uniones de empalme en el RNA, o cebadores que abarcan un intrón. Los métodos alternativos para amplificar RNA pero no el DNA contaminante incluyen los métodos que se describen por Moore, R. E., ef al., Nucleic Acids Res. 18:1921 , (1991 ), y los métodos que se describen por Buchman, G. W., ef al., PCR Methods Applic. 3:28-31 , (1993), que emplea un oligonucleótido que contiene dU como un cebador adaptador.

Puede ser deseable extraer RNA, más que analizar DNA a causa de la inestabilidad relativa del RNA durante el procesamiento y los análisis de rutina. Una secuencia aislada de RNA puede reproducirse como DNA al utilizar transcripción inversa, lo que puede realizarse de acuerdo con los procedimientos anteriormente publicados. Diversas transcriptasas inversas pueden utilizarse, incluyendo, pero sin limitarse a, MMLV RT, mutantes en RNasa H de MMLV RT tales como Superscript y Superscript II (Life Technologies, GIBCO BRL, Gaithersburg, Md.), AMV RT, y transcriptasa inversa termoestable de Thermus thermophilus. Por ejemplo, un método, pero no el único método, que puede utilizarse para convertir RNA extraído de plasma o suero á cDNA, es el protocolo adaptado del sistema Superscript II Preamplification (Life Technologies, GIBCO BRL, Gaithersburg, Md.; catálogo no. 18089-01 1 ), como se describe por Rashtchian, A., PCR Methods Applic. 4:S83-S91 , (1994).

Detección de mutaciones El ácido nucleico (por ejemplo, ácido nucleico total) puede extraerse y amplificarse a partir de una muestra biológica de un paciente al utilizar cualquier método apropiado. El producto amplificado entonces puede purificarse, por ejemplo, por purificación en gel, y el producto purificado resultante puede secuenciarse. Los métodos de secuenciación de ácidos nucleicos se conocen en la técnica; un método de secuenciación ejemplar incluye el ABI Prism BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Los datos de secuencias entonces pueden analizarse para la presencia o ausencia de una o más mutaciones en el ácido nucleico objetivo (por ejemplo, el ácido nucleico de NPM1 o FLT3). Los datos de secuencias también pueden analizarse para determinar la proporción de ácido nucleico de tipo silvestre a muíante presente en la muestra.

Un método alternativo de detección de amplificación o mutación es la PCR específica de alelos (ASPCR). La ASPCR utiliza coincidencia o falta de coincidencia entre la plantilla y la base del extremo 3' de un cebador bien conocido en la técnica. Véase, por ejemplo, Patente de E.U. 5,639,611.

Otro método de detección de mutaciones es la secuenciación de ácidos nucleicos. La secuenciación puede realizarse al utilizar cualquier número de métodos, equipos o sistemas conocidos en la técnica. Un ejemplo es utilizar la química de terminador de colorante y un secuenciador ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA). La secuenciación también puede implicar métodos de determinación de bases únicas tal como extensión con cebadores de un solo nucleótido (el método de secuenciación de "SNapShot") o PCR específica de alelos o mutaciones.

En otras modalidades, las mutaciones de ácidos nucleicos objetivo pueden valorarse por hibridación de sondas de polinucleótidos que comprenden opcionalmente una etiqueta detectable. La sonda puede marcarse de manera detectable por métodos conocidos en la técnica. Las etiquetas útiles incluyen, por ejemplo, colorantes fluorescentes (por ejemplo, Cy5®, Cy3®, FITC, rodamina, fósforos de lantamida, rojo de Texas, FAM, JOE, Cal Fluor Red 610®, Quasar 670®), radioisótopos (por ejemplo, 32P, 35S, 3H, 14C, 125l, 31l), reactivos electrodensos (por ejemplo, oro), enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, beta-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), etiquetas colorimétricas (por ejemplo, oro coloidal), etiquetas magnéticas (por ejemplo, Dynabeads™), biotina, dioxigenina, o haptenos y proteínas para los cuales se encuentran disponibles antisueros o anticuerpos monoclonales. Otras etiquetas incluyen ligandos u oligonucleótidos capaces de formar un complejo con el receptor o complemento de oligonucleótido correspondiente, respectivamente. La etiqueta puede incorporarse directamente en el ácido nucleico que se detectará, o puede unirse a una sonda (por ejemplo, un oligonucleótido) o anticuerpo que híbrida o se asocia con el ácido nucleico que se detectará.

En otras modalidades, las sondas son sondas TaqMan®, balizas moleculares, y Scorpions (por ejemplo, sondas Scorpion™). Estos tipos de sondas se basan en el principio de extinción de la fluorescencia e implican un fluoróforo donador y una porción de extinción. El termino "fluoróforo", tal como se utiliza en este documento, se refiere a una molécula que absorbe luz en una longitud de onda particular (frecuencia de excitación) y emite subsecuentemente luz de una longitud de onda más larga (frecuencia de emisión). El término "fluoróforo donador", tal como se utiliza en este documento, significa un fluoróforo que, cuando está muy cerca de una porción de extinción, dona o transfiere energía de emisión al extintor. Como resultado de donar energía a la porción de extinción, el fluoróforo donador emitirá en sí menos luz en una frecuencia de emisión particular que la que tendría en ausencia de una porción de extinción colocada más cerca.

El término "porción de extinción", tal como se utiliza en este documento, significa una molécula que, muy cerca de un fluoróforo donador, toma la energía de emisión generada por el donador y disipa la energía como calor o emite luz de una longitud de onda más larga que la longitud de onda de emisión del donador. En el último caso, el extintor se considera como un fluoróforo aceptor. La porción de extinción puede actuar a través de extinción proximal (es decir, de colisión) satisfaciendo o por transferencia de Forster o de energía de resonancia por fluorescencia ("FRET"). La extinción por FRET se utiliza generalmente en sondas TaqMan® la extinción proximal se utiliza en sondas tipo baliza molecular y Scorpion™. Los extintores adecuados se seleccionan con base en el espectro de fluorescencia del fluoróforo particular. Los extintores útiles incluyen, por ejemplo, los extintores Black Hole™ BHQ-1 , BHQ-2, y BHQ-3 (Biosearch Technologies, Inc.), y la serie ATTO de extintores (ATTO 540Q, ATTO 580Q, y ATTO 612Q; Atto-Tec GmbH).

Las sondas TaqMan® (Heid, er al., Genome Res 6: 986-994, 1996) utilizan la actividad de exonucleasa 5' fluorogénica de la polimerasa Taq para medir la cantidad de secuencias objetivo en muestras de cDNA. Las sondas TaqMan® son oligonucleótidos que contienen un fluoróforo donador generalmente en o cerca de la base del extremo 5', y una porción de extinción típicamente en o cerca de la base del extremo 3'. La porción de extinción puede ser un colorante como TAMRA o puede ser una molécula no fluorescente tal como ácido 4-(4-dimetilaminofenilazo) benzoico (DABCYL). Véase Tyagi, et al., 16 Nature Biotechnology 49-53 (1998). Cuando se irradia, el donador fluorescente excitado transfiere energía a la porción de extinción cercana por FRET en lugar de fluorescer. De esta manera, la proximidad cercana del donador y extintor evita la emisión de la fluorescencia del donador mientras la sonda está intacta.

Las sondas TaqMan® se diseñan para alinearse con una región interna de un producto de PCR. Cuando la polimerasa (por ejemplo, transcriptasa inversa) replica una plantilla en la que una sonda TaqMan® se une, su actividad de exonucleasa 5' escinde la sonda. Esto termina la actividad del extintor (no FRET) y el fluoróforo donador comienza a emitir la fluorescencia, que se incrementa en cada ciclo proporcional a la tasa de escisión de la sonda. La acumulación de un producto de PCR se detecta al monitorear el incremento en la fluorescencia del colorante reportero (obsérvese que los cebadores no se marcan). Si el extintor es un fluoróforo aceptor, entonces la acumulación del producto de PCR puede detectarse al monitorear la disminución en la fluorescencia del fluoróforo aceptor.

Con los cebadores Scorpion, la preparación específica de secuencias y detección de productos de PCR se logran utilizando una sola molécula. El cebador Scorpion mantiene una configuración de tallo-lazo en el estado sin hibridar. El fluoróforo se une al extremo 5' y se extingue por una porción asociada al extremo 3' aunque, en modalidades adecuadas, esta disposición puede cambiarse. La porción 3' del tallo también contiene secuencia que es complementaria al producto de extensión del cebador. Esta secuencia se enlaza al extremo 5' de un cebador específico a través de un monómero que no puede amplificarse. Después de la extensión de la porción de cebador, la secuencia de la sonda específica es capaz de unirse a su complemento dentro del amplicón extendido, lo que de esta manera abre el lazo de horquilla. Esto evita que la fluorescencia de se extinga y una señal se observa. Un objetivo específico se amplifica por el cebador inverso y la porción de cebador del cebador Scorpion, lo que tiene como resultado un producto de extensión. Una señal fluorescente se genera debido a la separación del fluoróforo del extintor que resulta de la unión del elemento de sonda (por ejemplo, la sonda JAK2) del cebador Scorpion al producto de extensión.

El estatus de cigosidad y la proporción de ácido nucleico de tipo silvestre a mutante en una muestra puede determinarse por métodos conocidos en la técnica, incluyendo métodos de detección cuantitativa específicos de secuencias. Otros métodos pueden implicar determinar el área bajo las curvas de los picos de secuenciación de electroferogramas de secuenciación estándar, tales como aquellos creados al utilizar ABI Sequencing Systems, (Applied Biosystems, Foster City CA). Por ejemplo, la presencia de sólo un pico único, tal como una "G", en un electroferograma en una posición representativa de un nucleótido particular, es una indicación de que los ácidos nucleicos en la muestra contienen sólo un nucleótido en esa posición, la "G". La muestra entonces puede clasificarse como homocigótica dado que sólo se detecta un alelo. La presencia de dos picos, por ejemplo, un pico "G" y un pico "T" en la misma posición en el electroferograma, indica que la muestra contiene dos especies de ácidos nucleicos; una especie lleva la "G" en la posición del nucleótido en cuestión, el otro lleva la "T" en la posición del nucleótido en cuestión. La muestra entonces puede clasificarse como heterocigótica dado que se detecta más de un alelo.

Los tamaños de los dos picos pueden determinarse (por ejemplo, al determinar el área bajo cada curva), y una proporción de las dos diferentes especies de ácidos nucleicos puede calcularse. Una proporción de ácido nucleico de tipo silvestre a mutante puede utilizarse para monitorear la progresión de la enfermedad, determinar, el tratamiento, o para hacer un diagnóstico. Por ejemplo, el número de células cancerosas que llevan una mutación específica puede cambiar durante el curso de la enfermedad o la terapia. Si una proporción de referencia se establece temprano en la enfermedad, una proporción más alta determinada posteriormente del ácido nucleico mutante con respecto al ácido nucleico de tipo silvestre, puede ser una indicación de que la enfermedad está empeorando o de que un tratamiento es ineficaz; el número de células que llevan la mutación puede estar incrementándose en el paciente. Una proporción más baja del ácido nucleico mutante respecto al de tipo silvestre, puede ser una indicación de que un tratamiento funciona o de que la enfermedad no progresa; el número de células que llevan la mutación puede estar disminuyendo en el paciente.

En ciertas modalidades, el ácido nucleico de NPM1 comprende una mutación por inserción o eliminación. Estas mutaciones pueden identificarse adecuadamente al determinar el tamaño de por lo menos una porción del ácido nucleico de NPM1 aislado del paciente. Los métodos para detectar la presencia o la cantidad de polinucleótidos de tamaños diferentes se conocen bien en la técnica y cualquiera de ellos puede utilizarse en los métodos descritos en este documento. La técnica de separación/detección de tamaños utilizada debe permitir la resolución del ácido nucleico siempre que difieran entre sí en por lo menos un nucleótido. La separación puede realizarse bajo condiciones desnaturalizantes o no desnaturalizantes o nativas - es decir, la separación puede realizarse en ácidos nucleicos de una sola o de doble hebra. Se prefiere que la separación y detección permitan la detección de diferencias de longitud tan pequeño como de un nucleótido. Se prefiere además que la separación y detección puedan hacerse en un formato de alta resolución que permita la determinación en tiempo real o al mismo tiempo de la abundancia de los ácidos nucleicos en una pluralidad de alícuotas de reacción tomadas durante la reacción de ciclación. Los métodos útiles para la separación y el análisis de los productos amplificados incluyen, pero no se limitan a, electroforesis (por ejemplo, electroforesis en geles de agarosa, electroforesis capilar (CE)), cromatografía (HPLC), y espectrometría de masas.

En una modalidad, la CE es un medio preferido de separación dado que proporciona una separación excepcional de los polinucleótidos en el intervalo de por lo menos 10-1 ,000 pares de bases con una resolución de un solo par de bases. La CE puede realizarse por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, tal como se da a conocer en las Patentes de E.U. Nos. 6,217,731 ; 6,001,230; y 5,963,456, que se incorporan en este documento para referencia. Los aparatos de CE de alta resolución se encuentran disponibles comercialmente, por ejemplo, el sistema de análisis de alta resolución HTS9610 y sistema de análisis genético por electroforesis en 96 capilares, completamente automatizado, SCE 9610 de Spectrumedix Corporation (State College, Pa.); serie P/ACE 5000 y serie CEQ de Beckman Instruments Inc (Fullerton, Cali ); y analizador genético ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems, Foster City, Calif.). Cerca del extremo de la columna de CE, en estos dispositivos, los fragmentos amplificados de DNA pasan un detector fluorescente que mide las señales de las etiquetas fluorescentes. Estos aparatos proporcionan una alta resolución automatizada para la detección de productos de PCR etiquetados con fluorescencia.

El empleo de CE en los métodos descritos en este documento, permite una productividad superior en comparación con la electroforesis convencional en bloques de gel. Al utilizar un gel capilar, la velocidad de separación se incrementa en alrededor de 10 veces sobre los sistemas convencionales en bloques de gel.

Con la CE, también se pueden analizar múltiples muestras al mismo tiempo, lo que es esencial para una alta resolución. Esto se logra, por ejemplo, al emplear sistemas de capilares múltiples. En algunos casos, la detección de la fluorescencia de las bases de DNA puede complicarse por la dispersión de la luz de la matriz porosa y paredes capilares. Sin embargo, un escáner de fluorescencia confocal puede utilizarse para evitar problemas debidos a la dispersión de la luz (Quesada et al., Biotechniques (1991), 10:616-25).

En algunas modalidades, el ácido nucleico puede analizarse y detectarse por tamaños al utilizar electroforesis en geles de agarosa. Los métodos para realizar electroforesis en geles de agarosa se conocen bien en la técnica. Véase Sambrook ef al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.) (1989), Cold Spring Harbor Press, N.Y.

En una modalidad, la detección es por transferencia tipo Southern e hibridación con una sonda marcada. Las técnicas implicadas en transferencia tipo Southern se conocen bien por los expertos en la técnica y pueden encontrarse en muchos libros estándar sobre protocolos moleculares. Véase Sambrook ef al., (1989). Brevemente, los productos de amplificación se separan por electroforesis en gel. El gel entonces se pone en contacto con una membrana, tal como de n ¡troce lu losa, lo que permite la transferencia del ácido nucleico y la unión no covaíente. Subsecuentemente, la membrana se incuba con una sonda conjugada con un cromóforo que es capaz de hibridar con un producto de amplificación objetivo. La detección es por la exposición de la membrana a una película de rayos x o dispositivos para la detección de emisión de iones.

EJEMPLOS Ejemplo 1 : Detección de mutaciones en NPM1 en ácidos nucleicos derivados de plasma.

Con el fin de valorar la viabilidad del plasma como una fuente de material genético para el análisis de mutaciones, células de médula ósea, células de sangre periférica y plasma de sangre periférica de 31 pacientes recientemente diagnosticados con AML se analizaron simultáneamente-para mutaciones en NPM1 y los resultados se compararon entre los tres tipos de muestras.

DNA genómico se extrajo a partir de muestras de médula ósea o sangre completa de los pacientes al utilizar el BioRobot EZ1 Blood DNA kit (Qiagen, Valencia, CA). El ácido nucleico total se extrajo a partir de plasma al utilizar el equipo de extracción NucliSens en el sistema EasyMag (bioMerieux, Durham, NC). La amplificación por PCR del gen NPM1 para todos los tipos de muestras se realizó al utilizar un cebador delantero de NPM1 que híbrida con el intrón 11 de NPM1 y cebador inverso que híbrida con un exón 12 de NPM1. Los cebadores delantero e inverso se marcan con 6-carboxifluorescelna (6-FAM; Eurogentec, San Diego, CA). El NPM1 mutado o alelos de tipo silvestre se verificaron al determinar el tamaño de los productos de PCR al utilizar el ABI3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las secuencias de los cebadores delantero e inverso se dan a continuación.

Cebador delantero: 5'-tta act ctc tgg tgg tag aat gaa-3' (SEQ ID NO: 3) Cebador inverso: 5'-tgt tac aga aat gaa ata aga cgg-3' (SEQ ID NO: 4) Al utilizar estos cebadores de amplificación, los ácidos nucleicos de NPM1 de tipo silvestre (WT) demostraron un pico de 212 bp, mientras las mutantes por inserción en NPM1 demostraron un pico extra de 216 bp ademas del pico de NPM1 WT (véase, por ejemplo, Figura 3A). Figura 3B demuestra que la cuatro mutación por inserción/cambio en el marco de lectura de base también es capaz de identificarse en un paciente heterocigótico comparado con un tipo silvestre, y que la mutación resulta de una inserción CTCT. Estos resultados demuestran que el método precedente es robusto y capaz de distinguir entre un ácido nucleico tipo silvestre y el mutante en NPM1 por la inserción de 4 bp, aislado a partir de todas las fuentes probadas, incluyendo células de médula ósea, células de sangre periférica, y plasma.

El plasma de los 31 pacientes mostró concordancia completa con células de médula ósea, pero se observó una discrepancia con células de sangre periférica. El ácido nucleico de NPM1 mutado se detectó en 6 de las 31 muestras pareadas de plasma de sangre periférica y células de médula ósea. Sin embargo, cuando se valoraron células de sangre periférica, una de las seis muestras que contenía ácido nucleico de NPM-1 mutado (cuando se valora en células de médula ósea y plasma), se identificó de manera incorrecta como si tuviera NPM-1 de tipo silvestre al utilizar un análisis de células de sangre periférica. (Figura 3A). En esta valoración de mutaciones en un solo paciente de ácido nucleico de NPM1 en células de sangre periférica demostró ser inexacta, pero la valoración al utilizar muestras de células de médula ósea y de plasma mostró una mutación inequívoca mediante inserción. Como apoyo adicional de la precisión de las pruebas con base en plasma para mutaciones en NPM1 , ninguna muestra de sangre periférica o de células de médula ósea, positiva a mutaciones, dio un falso negativo cuando se probó el plasma. Estos datos validaron el uso de un ensayo basado en plasma para la detección de las mutaciones en NPM1 en muestras de ácidos nucleicos de plasma.

Ejemplo 2: Mutaciones en NPM 1 en pacientes con AML y MDS y la identificación de una mutación novedosa El análisis de ácido nucleico de NP 1 se realizó en pares recolectados de manera aleatoria de muestras de plasma y células de sangre periférica de pacientes con AML (98 muestras) y síndrome mielodisplásico (MDS) (28 muestras) tratados en la Universidad de Texas, Centro para el Cáncer MD Anderson. Todas las muestras se recolectaron a partir de pacientes anteriormente sin tratamiento antes de que la terapia se iniciara. Todos los pacientes con MDS estaban fuera de cualquier clase de terapia al momento de obtener las muestras para el análisis. Todas las muestras se recolectaron utilizando protocolos aprobados por Juntas Institucionales de Revisión, todos los pacientes proporcionaron consentimiento informado, y el estudio cumplió con el código de ética de la Asociación Médica Mundial (Declaración de Helsinki). Los datos clínicos se recolectaron por revisión de historias clínicas y formaron parte de la base de datos de leucemia en el Centro para el Cáncer MD Anderson. El diagnóstico se basó en un análisis morfológico, inmunofenotípico, citogenético y molecular completo, y la clasificación estuvo de acuerdo con la clasificación Francesa Estadounidense Británica (FAB). Todos los pacientes con MDS requirieron evidencia de displasia en por lo menos dos linajes. El estatus citogenético se clasificó como favorable (t(15;17), t(8,21), o inv16)), desfavorable (-5, -7 o anormalidades complejas (=3)), o intermedio (todos los otros). El estatus de desempeño (P), determinado con el sistema de calificación de Zubrod, se clasificó como bueno (0 o 1) o malo (2-4). Los que responden a la terapia son pacientes que lograron una respuesta completa (CR), de acuerdo con los criterios de grupo de International Working para CR.

Las características de los pacientes con AML y MDS incluidos en este estudio se listan en la Tabla 1. La edad media fue 62 (intervalo, 18 a 82) para los pacientes con AML y 68 (intervalo, 43 a 81) para los pacientes con MDS. La mayor parte de los pacientes con AML tuvieron un estatus citogenético intermedio (34%) o pobre (59%). La mitad de los pacientes con MDS se clasificó con anemia resistente al tratamiento con blastocitos incrementados en transformación (RAEB-T) y 46% tuvieron de anemia resistente al tratamiento con blastocitos incrementados (RAEB) de acuerdo con la clasificación Francesa Estadounidense Británica (FAB). Sólo 3% de los pacientes tuvo leucemia progranulocítica aguda (APL), mientras 24% tuvo leucemia con diferenciación monocitoide (Tabla 1). La clasificación de los pacientes con AML y MDS se basó en la clasificación FAB en lugar de la clasificación de la Organización Mundial de la Salud (WHO).

Tabla 1 Características de pacientes con AML y MDS Las mutaciones en el ácido nucleico de NPM1 se detectaron en 24 (24%) de las 98 muestras de plasma de AML, mientras sólo 22 (22%) de las muestras de células revelaron la mutación (Tabla 2). Por lo tanto, 8% de las muestras positivas dio un resultado falso negativo cuando se analizaron células de sangre periférica. Los dos casos de AML para los que la mutación en NPM1 se detectó en el DNA de plasma, pero no en el DNA de células de sangre periférica, se caracterizaron sin blastocitos circulantes. Sin embargo, la falla para detectar mutaciones en NPM1 en la sangre periférica de AML que carece de blastocitos no fue universal. Las mutaciones en NPM1 se detectaron en el DNA de células de sangre periférica en otros casos para los que no se reportaron blastocitos circulantes.

Tabla 2 Frecuencia de mutaciones en NPM1 en pacientes con AML y MDS La tasa más alta de mutación en NPM1 se detectó en pacientes con AML clasificados como M2 por la clasificación FAB (38% de M2). Aunque el número de casos es pequeño, el grupo M4/M5 también tuvo una alta tasa de mutación en NPM1 (Tabla 2). Además de los pacientes con AML, se probó el plasma de 28 pacientes con MDS anteriormente sin tratamiento para mutaciones en NPM1. De estos pacientes, se encontró que sólo 1 paciente (4%) llevaba una mutación en NPM1. Este paciente con MDS con mutación en NPM1 tenía RAEB (Tabla 2), pero con citopenia relativamente limitada (conteo de glóbulos blancos de 4.5 x 109/ml), lo que sugiere la posibilidad de leucemia temprana en lugar de la enfermedad mielodisplásica. Todos los pacientes se clasificaron de acuerdo con la clasificación FAB. Si se utilizaba la clasificación de la Organización Mundial de la Salud (WHO), todos los RAEB-T se habrían clasificado como AML y la prevalencia de la mutación en NPM1 habría sido de 21 % en lugar de 24%. La carencia de las mutaciones en NPM1 en pacientes con RAEB-T soporta el concepto de que estos casos poseen características más consistentes con la MDS que con la leucemia aguda.

En la mayor parte de los pacientes, la mutación en NPM1 comprendió la inserción de 4 bp de CTCT como se muestra en las Figuras 3A y 3B. En un solo paciente, una nueva eliminación de 4 bases se detectó en el exón 12 de NPM1 (Figura 4). Este paciente tuvo leucemia progranulocítica aguda (APL) y expresó la forma corta del transcrito de fusión RARa-PML, y respondió a la terapia.

Ejemplo 3: Características clínicas y patológicas de pacientes con AML en presencia o ausencia de mutaciones en NPM1.

Las 98 muestras de pacientes con AML, caracterizadas en el Ejemplo 2, se caracterizaron además con base en su constitución hematológica. Los pacientes con mutaciones en NPM1 se encontraron con un conteo significativamente superior de glóbulos blancos (WBC), en comparación con pacientes que carecen de la mutación (Tabla 3). Estos pacientes también tuvieron un porcentaje superior de blastocitos en sangre periférica y médula ósea. Además, los blastocitos en pacientes con NPM1 mutado expresaron niveles significativamente inferiores de HLADR, CD13 y CD34, y niveles significativamente superiores de CD33 (Tabla 3).

Tabla 3 Comparación de características clínicas y patológicas de pacientes con AML en presencia o ausencia de mutaciones en NPM1 Hubo también una diferencia entre pacientes con AML con NPM1 mutado y NPM1 WT con respecto a sus anormalidades citogenéticas y la presencia de una mutación en el gen FLT3 (Tabla 4). Generalmente, los pacientes que tienen la mutación en NPM1 se asociaron con un mejor perfil citogenético; 12% que tienen citogenética pobre contra 41 % en el grupo de NPM1 tipo silvestre.

Tabla 4 Estatus de citogenética y mutación en FLT3 en pacientes con AML en presencia o ausencia de la mutación en NPM1 Se observó además que la respuesta a la terapia fue ligeramente superior en pacientes con AML con la mutación en NPM1 que en pacientes con AML sin la mutación, aunque la diferencia no fuera bastante significativa (P = 0.06). Estos datos son consistentes con estudios anteriores más grandes que demuestran que la mutación en NPM1 es característica de la AML e indicativa de la capacidad de respuesta de un paciente a la quimioterapia de inducción. Véase, por ejemplo, Falini et al., N. Engl. Meó (2005) 352:254-266. Cuando todos los pacientes se consideraron, no había diferencia significativa en la supervivencia entre pacientes con mutación en NPM1 y aquellos sin la mutación. Sin embargo, cuando se consideran sólo pacientes que tienen citogenética intermedia, aquellos con la mutación en NPM1 demostraron una supervivencia libre de eventos adversos relativamente más prolongada que la de los pacientes sin la mutación, (P = 0.056). El bajo valor de P posiblemente se debe al pequeño número de pacientes estudiados. La diferencia más notable en la supervivencia se encontró en pacientes positivos a mutaciones con citogenética intermedia, quienes requirieron más de 35 días para responder a la terapia. En estos pacientes, la supervivencia fue significativamente más prolongada que en pacientes que carecían de la mutación en NPM1 (Figura 5).

Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas en este documento, se incorporan expresamente para referencia en su totalidad, en la misma magnitud como si cada una se incorporara para referencia individualmente. En caso de conflicto, la presente especificación, incluyendo las definiciones, dominará.

Aunque las presentes invenciones se hayan descrito con referencia a modalidades ejemplares y alternativas, los expertos en la técnica reconocerán que pueden hacerse cambios en la forma y el detalle sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Por ejemplo, aunque pueden haberse descrito diferentes modalidades ejemplares y alternativas que incluyen una o más características que proporcionan uno o más beneficios, se contempla que las características descritas pueden intercambiarse una con otra o combinarse alternativamente una con otra en las modalidades ejemplares descritas o en otras modalidades alternativas. Dado que la tecnología de la presente invención es relativamente compleja, no todos los cambios en la tecnología son previsibles. La presente invención, descrita con referencia a las modalidades ejemplares y alternativas, y establecida en las reivindicaciones siguientes, pretende manifiestamente ser tan amplia como sea posible. Por ejemplo, a menos que se indique específicamente de otro modo, las reivindicaciones que declaran un solo elemento particular, también abarcan uria pluralidad de tales elementos particulares.

Claims (35)

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar un pronóstico de un individuo diagnosticado con leucemia mielógena aguda (AML), el método comprende determinar la presencia o ausencia de una o más mutaciones en un ácido nucleico de NP 1 , en donde el ácido nucleico de NPM1 se obtiene a partir de un fluido corporal carente de células del individuo, y proporcionar un pronóstico para el individuo, en donde la presencia de una o más mutaciones en el gen NPM1 es indicio de un mejor pronóstico para el individuo con respecto a un individuo diagnosticado con AML y que carece de la o las mutaciones.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el fluido corporal carente de células es suero o plasma.

3. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde la presencia o ausencia de una o más mutaciones se determina con respecto a la SEQ ID NO: 1.

4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el ácido nucleico de NPM1 es DNA genómico.

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el ácido nucleico de NPM1 es mRNA.

6. El método dé conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde una de las mutaciones en el ácido nucleico de NPM1 comprende una inserción CTCT.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, en donde la inserción es después del nucleótido que corresponde a la posición 1018 de la SEQ ID NO: 1.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde por lo menos una de las mutaciones en el ácido nucleico de NPM1 se selecciona de la Figura 2A o Figura 2B.

9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que además comprende detectar la presencia o ausencia de una o más mutaciones en el gen FLT3.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, en donde la o las mutaciones en el gen FLT3 son una duplicación de una repetición en tándem interna.

11. El método de conformidad con la reivindicación 9, en donde la presencia de una o más mutaciones en el gen NPM1 y la ausencia de una o más mutaciones en el gen FLT3 es un indicio de un mejor pronóstico del individuo diagnosticado con AML.

12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que además comprende determinar la citogenética del individuo.

13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el método comprende amplificar ácido nucleico de NPM1 obtenido a partir del fluido corporal carente de células del paciente con AML e hibridar el ácido nucleico de NPM1 amplificado con una sonda de oligonucleótidos que es capaz de detectar específicamente la presencia de por lo menos una mutación del ácido nucleico de NPM1 bajo condiciones de hibridación.

14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde el método comprende determinar el tamaño de por lo menos una porción del ácido nucleico de NPM1, en donde un tamaño incrementado es indicio de la presencia de una mutación por inserción.

15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde el pronóstico se relaciona con la tasa de la remisión.

16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde el pronóstico en el paciente con AML se relaciona con la supervivencia global.

17. Un método para determinar un pronóstico de un individuo diagnosticado con una AML, el método comprende determinar la presencia o ausencia de una mutación por inserción en un ácido nucleico de NPM1 , en donde el ácido nucleico de NPM1 se obtiene a partir de un fluido corporal carente de células del individuo, y proporcionar un pronóstico para el individuo, en donde la presencia de la mutación por inserción es un indicio de un mejor pronóstico para el individuo con respecto a un individuo diagnosticado con AML y que carece de la mutación por inserción.

18. El método de conformidad con la reivindicación 17, en donde la mutación por inserción comprende una inserción CTCT después del nucleótido que corresponde a la posición 1018 de la SEQ ID NO: 1.

19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 18, que además comprende detectar la presencia o ausencia de una o más mutaciones en el gen FLT3.

20. El método de conformidad con la reivindicación 19, en donde la o las mutaciones en el gen FLT3 son una duplicación de repetición en tándem interna.

21. El método de conformidad con la reivindicación 19, en donde la presencia de la mutación por inserción y la ausencia una mutación en el gen FLT3 son un indicio de un mejor pronóstico del individuo diagnosticado con AML.

22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21 , en donde el pronóstico se relaciona con la tasa de la remisión o la supervivencia global.

23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22, en donde el método comprende determinar el tamaño de por lo menos una porción del ácido nucleico de NPM1 , en donde un tamaño incrementado es indicio de la presencia de una mutación por inserción.

24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 23, en donde el método comprende amplificar el ácido nucleico de NPM1 al utilizar un cebador de amplificación que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.

25. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 24, en donde el método comprende amplificar el ácido nucleico de NPM1 al utilizar un par de cebadores de amplificación que comprenden la secuencia de las SEQ ID NOs: 3 y 4.

26. Un método para diagnosticar a un individuo con un trastorno hematológico, el método comprende determinar la presencia o ausencia de una traslocacióri en un ácido nucleico de NPM1 , en donde el ácido nucleico de NPM1 se obtiene a partir de un fluido corporal carente de células del individuo, y diagnosticar al individuo con un trastorno hematológico cuando se detecta una traslocación en un ácido nucleico de NPM1.

27. El método de conformidad con la reivindicación 26, en donde el trastorno hematológico se selecciona del grupo que consiste en linfoma anaplásico de células grandes, leucemia promielocítica aguda, y leucemia mielógena aguda.

28. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26 a 27, en donde la traslocación está entre el gen NPM1 y un segundo gen seleccionado del grupo que consiste en cinasa de linfoma anaplásico de células grandes, receptor alfa de ácido retinoico, y factor 1 de mielodisplasia/leucemia mieloide.

29. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28, que además comprende determinar la presencia o ausencia de una o más mutaciones en un ácido nucleico de NPM1.

30. El método de conformidad con la reivindicación 29, en donde la presencia o ausencia de una o más mutaciones se determina con respecto a la SEQ ID NO: 1.

31. El método de conformidad con la reivindicación 30, en donde una de las mutaciones én el ácido nucleico de NPM1 comprende una inserción CTCT.

32. El método de conformidad con la reivindicación 31 , en donde la inserción es después del nucleótido que corresponde a la posición 1018 de la SEQ ID NO: 1.

33. El método de conformidad con la reivindicación 30, en donde por lo menos una de las mutaciones en el ácido nucleico de NPM1 se selecciona de la Figura 2A o Figura 2B.

34. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26 a 33, en donde el ácido nucleico de NPM1 es DNA genómico.

35. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26 a 34, en donde el ácido nucleico de NPM1 es mRNA.