CN108918624B - 一种检测多巴胺的酶生物传感器及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于电化学生物传感器技术领域，公开了一种检测多巴胺的酶生物传感器及其制备与应用。所述检测多巴胺的酶生物传感器由参比电极、对电极及修饰后的工作电极组成，所述修饰后的工作电极由工作电极及固化在工作电极表面的物质识别膜组成，其中，所述物质识别膜主要由掺杂石墨烯复合材料、酪氨酸酶以及壳聚糖制备而成；掺杂石墨烯复合材料主要是由氧化石墨烯与苯胺混合，然后通过聚合以及煅烧获得。本发明的酶生物传感器具有良好的选择性、重现性和稳定性，可对多巴胺进行准确检测，抗干扰能力强，还具有较宽的检测范围，较低的检测限。本发明的方法简单且成本低，具有良好的应用前景。

Description

一种检测多巴胺的酶生物传感器及其制备与应用

技术领域

本发明属于电化学生物传感器技术领域，具体涉及一种基于掺杂石墨烯的检测多巴胺的酶生物传感器及其制备方法与应用。

背景技术

作为生物体内最重要的儿茶酚胺之一的多巴胺(dopamine，以下简称DA)，是一种在神经元之间传递信息的介体，即神经递质，其浓度范围约为10^-7～10^-3mol/L。DA在中枢神经系统、心血管系统、肾脏系统和荷尔蒙分泌系统的功能中起着不可或缺的作用，并且DA浓度的异常会影响甚至引发帕金森病、HIV感染、精神分裂症、高尿酸血症和类风湿关节炎等许多疾病。目前，已报道的血多巴胺检测方法较多，常见的有气液色谱-质谱联用法、温度测定法、分子发光法、比色法、电化学方法等，但是这些检测方法中的选择性大多依赖于对多巴胺特异性识别的酶或抗体，并具有损坏性和成本相当昂贵。因此，针对血清或者药物样品，设计出简单、高选择性、低成本、快速和高灵敏的多巴胺检测方法仍然极具临床意义。

因此，本发明保护了一种具有良好的选择性、灵敏度和稳定性的基于掺杂石墨烯复合材料的酶生物传感器，有效应用于多巴胺的检测。

发明内容

为了解决以上现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种具有良好的选择性、灵敏度和稳定性的检测多巴胺的酶生物传感器。

本发明的另一目的在于提供上述检测多巴胺的酶生物传感器的制备方法；

本发明的再一目的在于提供上述检测多巴胺的酶生物传感器在多巴胺检测中的应用。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种检测多巴胺的酶生物传感器，由参比电极、对电极及修饰后的工作电极组成，所述修饰后的工作电极由工作电极及固化在工作电极表面的物质识别膜组成，其中，所述物质识别膜主要由掺杂石墨烯复合材料、酪氨酸酶以及壳聚糖制备而成。

所述物质识别膜具体是指掺杂石墨烯复合材料配成分散液，酪氨酸酶以及壳聚糖分别配成溶液；然后将掺杂石墨烯复合材料(N-GN)与酪氨酸酶(Tyr)负载在工作电极表面，再负载壳聚糖溶液(CS)成膜。

所述掺杂石墨烯复合材料主要是由氧化石墨烯与苯胺混合，然后通过聚合以及煅烧获得。

所述掺杂石墨烯复合材料具体通过以下方法制备得到：

(a)将氧化石墨烯与苯胺分散均匀；在氧化剂的作用下和酸性介质中，苯胺发生聚合反应，得到聚苯胺-氧化石墨烯复合物；

(b)将聚苯胺-氧化石墨烯复合物进行煅烧，获得掺杂石墨烯复合材料。

所述氧化石墨烯与苯胺的质量体积比为(50～200)mg：0.5mL；

所述氧化剂为过硫酸铵，所述酸性介质为盐酸，所述氧化剂与酸性介质的摩尔比为(2～2.5)：1，苯胺与酸性介质的体积比为1:(10～20)；酸性介质以水溶液的形式加入，酸性介质的浓度为0.5mol/L；所述聚合反应的温度为4～10℃，聚合反应的时间为6～12h；

所述煅烧的氛围为保护性氛围，所述保护性氛围为氮气或惰性气氛，所述煅烧是指先在400～500℃下煅烧，后在700～800℃继续煅烧；所述煅烧的时间为1.5～2.5小时，所述继续煅烧的时间为0.5～1.5小时。

步骤(a)的具体步骤为将氧化石墨烯在水中超声剥离，加入苯胺超声分散均匀；然后低温下，加入氧化剂与酸性介质的混合物，反应，获得聚苯胺-氧化石墨烯复合物。所述氧化石墨烯与水的质量体积比为50～200mg：50mL，超声剥离的时间为1～4h，反应的时间为6～12小时。

反应完成后，去除水分，真空干燥，研磨，得到聚苯胺-氧化石墨烯复合物。

上述检测多巴胺的酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)对基底电极进行表面预处理；

(2)将掺杂石墨烯复合材料分散于水中，获得掺杂石墨烯复合材料分散液；将酪氨酸酶配成酪氨酸酶溶液；将掺杂石墨烯复合材料分散液与酪氨酸酶溶液混合均匀，得到复合溶液；

(3)将复合溶液滴加到基底电极的表面，室温晾干；

(4)将壳聚糖配成溶液，获得壳聚糖溶液；将壳聚糖溶液滴加在步骤(3)的电极表面，室温晾干，得到基于掺杂石墨烯的酶修饰工作电极；

(5)将基于掺杂石墨烯的酶修饰工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系，得到检测多巴胺的酶生物传感器。

步骤(1)中所述表面预处理具体是指：将基底电极的表面依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al₂O₃粉末抛光成镜面，再用水冲洗；然后依次在无水乙醇和水中超声清洗，取出用水洗净，晾干，然后置于铁氰化钾溶液中(5mmol/LK₃Fe(CN)₆+0.1mol/LKCl)进行电极活化处理。

步骤(2)中所述掺杂石墨烯复合材料分散液的浓度为2.5～12.5mg/mL。

步骤(2)中所述酪氨酸酶溶液的浓度为32～56kU/mL；酪氨酸酶溶液是采用PBS溶液配制而成，优选为pH 6.5，0.1M的PBS溶液。

步骤(4)中所述壳聚糖溶液的pH 6～7；壳聚糖溶液是采用乙酸溶液配制成1.5～3mg/mL的溶液，然后采用碱调节而成；所述乙酸的质量浓度为1％，所述碱为0.1mol/L NaOH溶液调节。

步骤(2)中所述掺杂石墨烯分散液与酪氨酸酶溶液体积比为1：(0.5～2)，优选为1:1。

步骤(3)中复合溶液滴加量与步骤(4)中所述壳聚糖溶液滴加量的体积比为5：(2～4)，优选为5:3。

上述酶生物传感器在多巴胺定量检测中的应用。

本发明的原理：

本发明选用的掺杂石墨烯复合材料，借助不同组分的协同作用克服了石墨烯本身卷曲、层间堆叠和溶剂中分散性差的不足，然后，利用壳聚糖的成膜性，并利用掺杂石墨烯的载体特性，有利于增加酶催化剂在电极表面的固定量和稳定性，利于对底物的催化。本发明将掺杂石墨烯复合材料应用于酶生物传感器，制备得到的检测多巴胺的传感器检测性能良好，检测范围8.33×10^-5～7.86×10^-4mol/L mol/L的区间内呈良好的线性关系，线性回归方程为I(μA)＝-11.819C(mmol/L)-5.062，相关系数为R²＝0.9958，最低检测限为-1.77×10^-5mol/L(S/N＝3)，灵敏度为168.84mA·mol^-1·cm^-2。

本发明的制备方法及所得到的产物具有如下优点及有益效果：

(1)本发明的检测多巴胺的生物传感器具有良好的电子传递性，能将反应产生的电子进行良好的转移，能实现生物分子的选择性检测，提高所述生物传感器的反应速度。

(2)本发明所述的检测多巴胺的生物传感器具有良好的选择性、重现性和稳定性，可对多巴胺进行准确检测，抗干扰能力强。

(3)本发明所述的检测多巴胺的生物传感器可用于血清总多巴胺或食品中多巴胺的检测，制备简单，具有较宽的检测范围，较低的检测限，反应在室温中性环境下进行，性能稳定，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为实施例3中酶修饰工作电极在不同条件下的循环伏安图；曲线a为酶修电极在空白滴液(空白PBS)中的循环伏安图，曲线b为酶修饰电极在氧气及多巴胺存在的条件下的循环伏安图(通O₂)，曲线c为酶修饰电极在氮气和多巴胺存在条件下的循环伏安图(通N₂)；

图2为实施例3制备的酶生物传感器在含有不同浓度多巴胺的磷酸缓冲溶液中的差示脉冲图；

图3为实施例3制备的酶生物传感器对不同浓度多巴胺的响应电流的标准曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

一种基于掺杂石墨烯的检测多巴胺的酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)将直径为3mm的玻碳电极依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al₂O₃粉末抛光成镜面，用蒸馏水冲洗，然后依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗1min，再将玻碳电极置于10mL铁氰化钾溶液中(5mmol/L K₃Fe(CN)₆+0.1mol/LKCl)在0～0.8V下采用循环伏安法扫描6圈进行电极活化，取出用蒸馏水冲洗，室温晾干得到预处理的玻碳电极；

(2)将100mg氧化石墨烯在50mL去离子水后超声剥离4h(超声功率为100W)，加入0.5mL苯胺后继续超声30min，低温搅拌下(8℃)加入5mL含1.25g过硫酸铵(APS)的0.5M HCl(5mL的0.5M HCl+1.25g过硫酸铵)，继续低温搅拌6小时后，加热蒸干水分，于80℃真空干燥10h，研磨，研磨得粉末置于石英舟，在管式炉中氮气氛围煅烧，先在400℃下煅烧2小时，后继续升温至700℃煅烧1小时，取出研磨即得掺杂石墨烯复合材料；

(3)将掺杂石墨烯复合材料分散于水中，获得浓度为5mg/mL的掺杂石墨烯复合材料溶液；采用PBS溶液(0.1mol/L、pH 6.5)配制浓度为32kU/mL的酪氨酸酶溶液(Sigma)；将两种溶液以1:1体积比混合得到混合溶液，取5μL混合物滴于步骤(1)的电极表面，在室温下晾干；

(4)采用1wt％乙酸溶液配制1.5mg/ml壳聚糖溶液，并用0.1mol/L NaOH溶液调节壳聚糖溶液至pH 6.5，取3μL滴于步骤(3)的电极表面，在室温下晾干，得到基于掺杂石墨烯的酶修饰工作电极；

(5)将酶修饰工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系(铂电极为对电极，银/饱和甘汞为参比电极)，得到检测多巴胺的酶生物传感器。

在室温下进行电化学试验，均在10mL磷酸缓冲溶液(0.1mol/L、pH 6.5)中进行，测试之前通O₂，测试过程中采用差示脉冲法。其中空白对照未滴加多巴胺溶液，测试稳定后依次滴加多巴胺溶液。

本实施例随着DA的浓度的增大，对应的还原峰峰电流明显增大，修饰电极在检测范围1.1×10^-4～10^-3mol/L的区间内呈良好的线性关系，线性回归方程为I(μA)＝-5.61C(mmol/L)-5.14，相关系数R²＝0.9731。

实施例2

一种基于掺杂石墨烯的检测多巴胺的酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)将直径为3mm的玻碳电极依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al₂O₃粉末抛光成镜面，用蒸馏水冲洗，然后依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗1min，再将玻碳电极置于10mL铁氰化钾溶液中(5mmol/L K₃Fe(CN)₆+0.1mol/L KCl)在0～0.8V下采用循环伏安法扫描6圈进行电极活化，取出用蒸馏水冲洗，室温晾干得到预处理的玻碳电极；

(2)将100mg氧化石墨烯在50mL去离子水后超声剥离4h(超声功率为100W)，加入0.5mL苯胺后继续超声30min，低温搅拌下(8℃)加入5mL含1.25g过硫酸铵(APS)的0.5MHCl，继续低温搅拌6小时后，加热蒸干水分，于80℃真空干燥10h，研磨，研磨得粉末置于石英舟，在管式炉中氮气氛围煅烧，先在400℃下煅烧2小时，后继续升温至700℃煅烧1小时，取出研磨即得掺杂石墨烯复合材料；

(3)将掺杂石墨烯复合材料分散于水中，获得浓度为5mg/mL的掺杂石墨烯复合材料溶液；采用PBS溶液(0.1mol/L、pH 6.5)配制浓度为40kU/mL的酪氨酸酶(Sigma)溶液；将两种溶液以1:1体积比混合得到混合溶液，取5μL混合物滴于步骤(1)的电极表面，在室温下晾干；

(4)采用1wt％乙酸溶液配制1.5mg/ml壳聚糖溶液，并用0.1mol/L NaOH溶液调节壳聚糖溶液至pH 6.5，取3μL滴于步骤(3)的电极表面，在室温下晾干，得到基于掺杂石墨烯的酶修饰工作电极；

(5)将酶修饰工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系(铂电极为对电极，银/饱和甘汞为参比电极)，得到检测多巴胺的酶生物传感器。

在室温下进行电化学试验，均在10mL磷酸缓冲溶液(0.1mol/L、pH 6.5)中进行，测试之前通O₂，测试过程中采用差示脉冲法。其中空白对照未滴加多巴胺溶液，测试稳定后依次滴加多巴胺溶液。

本实施例随着DA的浓度的增大，对应的还原峰峰电流明显增大，修饰电极在检测范围9.9×10^-5～4.15×10^-4mol/L的区间内呈良好的线性关系，线性回归方程为I(μA)＝-15.16C(mmol/L)-6.79，相关系数R²＝0.9842。

实施例3

一种基于掺杂石墨烯的检测多巴胺的酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)将直径为3mm的玻碳电极依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al₂O₃粉末抛光成镜面，用蒸馏水冲洗，然后依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗1min，再将玻碳电极置于10mL铁氰化钾溶液中(5mmol/L K₃Fe(CN)₆+0.1mol/L KCl)在0～0.8V下采用循环伏安法扫描6圈进行电极活化，取出用蒸馏水冲洗，室温晾干得到预处理的玻碳电极；

(2)将100mg氧化石墨烯在50mL去离子水后超声剥离4h(超声功率为100W)，加入0.5mL苯胺后继续超声30min，低温搅拌下(8℃)加入5mL含1.25g过硫酸铵(APS)的0.5MHCl，继续低温搅拌6小时后，加热蒸干水分转入80℃真空干燥10h后研磨，研磨得粉末置于石英舟，在管式炉中氮气氛围煅烧，先在400℃下煅烧2小时，后继续升温至700℃煅烧1小时，取出研磨即得掺杂石墨烯复合材料；

(3)将掺杂石墨烯复合材料分散于水中，获得浓度为5mg/mL的掺杂石墨烯复合材料溶液；采用PBS溶液(0.1mol/L、pH 6.5)配制浓度为48kU/mL的酪氨酸酶溶液；将两种溶液以1:1体积比混合得到混合溶液，取5μL混合物滴于步骤(1)的电极表面，在室温下晾干；

(4)采用1wt％乙酸溶液配制1.5mg/ml壳聚糖溶液，并用0.1mol/L NaOH溶液调节壳聚糖溶液至pH 6.5，取3μL滴于步骤(3)的电极表面，在室温下晾干，得到基于掺杂石墨烯的酶修饰工作电极；

(5)将酶修饰工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系(铂电极为对电极，银/饱和甘汞为参比电极)，得到检测多巴胺的酶生物传感器。

在室温下进行电化学试验，均在10mL磷酸缓冲溶液(0.1mol/L、pH 6.5)中进行，测试之前通O₂，测试过程中采用差示脉冲法。其中空白对照未滴加多巴胺溶液，测试稳定后依次滴加多巴胺溶液。

本实施例随着DA(多巴胺)的浓度的增大，对应的还原峰峰电流明显增大，修饰电极在检测范围8.33×10^-5～7.86×10^-4mol/L的区间内呈良好的线性关系，线性回归方程为I(μA)＝-11.819C(mmol/L)-5.062，相关系数R²＝0.9958。

本实施例中酶修饰工作电极在不同条件下的循环伏安图如图1所示，其中曲线a为酶修电极在空白滴液(磷酸缓冲溶液，空白PBS)中的循环伏安图，曲线b为酶修饰电极在氧气及多巴胺存在的条件下的循环伏安图(通O₂)，曲线c为酶修饰电极在氮气和多巴胺存在的条件下的循环伏安图(通N₂)。从图1可知，当溶液加入多巴胺后出现了一对氧化还原峰，但在氧气条件下，还原峰明显增加，说明在氧气条件下，酪氨酸酶才开始参与反应。

本实施例制备的检测多巴胺的酶生物传感器在含有不同浓度多巴胺的磷酸缓冲溶液中的差示脉冲伏安图如图2所示。图2中，多巴胺浓度为0.08333mmo1/L、0.16393mmo1/L、0.24194mmo1/L、0.31746mmo1/L、0.39063mmo1/L、0.46154mmo1/L、0.5303mmo1/L、0.59701mmo1/L、0.66176mmo1/L、0.72464mmo1/L、0.78571mmo1/L、0.84507mmo1/L、0.90278mmo1/L。利用了掺杂石墨烯的载体特性，有利于增加酶催化剂在电极表面的固定量和稳定性，利于对底物的催化。

本实施例制备的检测多巴胺的酶生物传感器对不同浓度多巴胺的响应电流的标准曲线图如图3所示。

本实施例制备的酶修饰电极对底物检测范围为8.33×10^-5～7.86×10^-4mol/Lmol/L，线性回归方程为I(μA)＝-11.819C(mmol/L)-5.062，相关系数为R²＝0.9958，最低检测限为-1.77×10^-5mol/L(S/N＝3)，灵敏度为168.84mA·mol^-1·cm^-2。

实施例4

一种基于掺杂石墨烯的检测多巴胺的酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)将直径为3mm的玻碳电极依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al₂O₃粉末抛光成镜面，用蒸馏水冲洗，然后依次在无水乙醇和蒸馏水中超声清洗1min，再将玻碳电极置于10mL铁氰化钾溶液中(5mmol/L K₃Fe(CN)₆+0.1mol/L KCl)在0～0.8V下采用循环伏安法扫描6圈进行电极活化，取出用蒸馏水冲洗，室温晾干得到预处理的玻碳电极；

(2)将100mg氧化石墨烯在50mL去离子水后超声剥离4h(超声功率为100W)，加入0.5mL苯胺后继续超声30min，低温搅拌下(8℃左右)加入5mL含1.25g过硫酸铵(APS)的0.5MHCl，继续低温搅拌6小时后，加热蒸干水分转入80℃真空干燥10h后研磨，研磨得粉末置于石英舟，在管式炉中氮气氛围煅烧，先在400℃下煅烧2小时，后继续升温至700℃煅烧1小时，取出研磨即得掺杂石墨烯复合材料；

(3)将掺杂石墨烯复合材料分散于水中，获得浓度为5mg/mL的掺杂石墨烯复合材料溶液；采用PBS溶液(0.1mol/L、pH 6.5)配制浓度为56kU/mL的酪氨酸酶溶液，将两种溶液以1:1体积比混合得到混合溶液，取5μL混合物滴于步骤(1)的电极表面，在室温下晾干；

(4)采用1wt％乙酸溶液配制1.5mg/ml壳聚糖溶液，并用0.1mol/L NaOH溶液调节壳聚糖溶液至pH 6.5，取3μL滴于步骤(3)的电极表面，在室温下晾干，得到基于掺杂石墨烯的酶修饰工作电极；

(5)将酶修饰工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系(铂电极为对电极，银/饱和甘汞为参比电极)，得到检测多巴胺的酶生物传感器。

在室温下进行电化学试验，均在10mL磷酸缓冲溶液(0.1mol/L、pH 6.5)中进行，测试之前通O₂，测试过程中采用差示脉冲法。其中空白对照未滴加多巴胺溶液，测试稳定后依次滴加多巴胺溶液。

本实施例差分脉冲伏安扫描曲线上还原峰基本不出现，非常微弱，原因可能是电极上Tyr溶液(酪氨酸酶溶液)浓度过高导致整个修饰电极的导电性降低，峰形变差，响应电流减弱。

本发明中氧化石墨烯通过以下方法得到：

(a)清洗石墨粉：称取2.5～10g石墨粉于容器中，加入100mL蒸馏水，加入100mL浓盐酸，在60～80℃水浴中加热并搅拌2h，真空抽滤后，依次用蒸馏水、丙酮、乙醇清洗，清洗完毕后，放入真空干燥箱中100℃烘干，研磨成粉状备用；

(b)取清洗后的石墨粉，采用修正的Hummers方法制备氧化石墨烯：

(b1)低温反应(0～4℃)：在冰水浴中，将110mL浓H₂SO₄放入容器中，同时搅拌使其温度降至低温反应区间，然后依次加入已清洗好的2.5～10g石墨粉，2.5g NaNO₃，15gKMnO₄，加完后计时，搅拌反应90min，溶液呈紫绿色；

(b2)中温反应(30～40℃)：将温度升高，在搅拌下使其温度保持在35℃左右，计时反应90min，溶液依然呈紫绿色；

(b3)高温反应(70～100℃)：中温反应后，向烧杯中缓慢加入220mL去离子水，然后加热将温度控制在85℃，随后缓慢加入一定量双氧水(5％约13mL)至溶液逐渐变成金黄色即可；

(b4)待该制备反应完毕后，趁反应液温热之时，将反应后的溶液用去离子水洗涤并过滤，并用转速为4000rpm的离心机反复离心再清洗过滤，直到滤液中检测不到SO₄ ^2-为止(用BaCl₂检验)；此时将所得到的黑色产物用去离子水超声清洗40min后，在40℃下干燥24h，即可得到黑棕色的氧化石墨烯。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种检测多巴胺的酶生物传感器在检测多巴胺中的应用，其特征在于：所述检测多巴胺的酶生物传感器是由参比电极、对电极及修饰后的工作电极组成，所述修饰后的工作电极由工作电极及固化在工作电极表面的物质识别膜组成，其中，所述物质识别膜由掺杂石墨烯复合材料、酪氨酸酶以及壳聚糖制备而成；

所述掺杂石墨烯复合材料具体通过以下方法制备得到：

（a）将氧化石墨烯与苯胺分散均匀；在氧化剂的作用下和酸性介质中，苯胺发生聚合反应，得到聚苯胺-氧化石墨烯复合物；

（b）将聚苯胺-氧化石墨烯复合物进行煅烧，获得掺杂石墨烯复合材料；

所述氧化石墨烯与苯胺的质量体积比为（50~200）mg：0.5mL；所述煅烧是指先在400~500 ℃下煅烧，后在700~800 ℃继续煅烧。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述物质识别膜具体是指掺杂石墨烯复合材料配成分散液，酪氨酸酶以及壳聚糖分别配成溶液；然后将掺杂石墨烯复合材料与酪氨酸酶负载在工作电极表面，再负载壳聚糖溶液成膜。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：掺杂石墨烯复合材料分散液的浓度为2.5~12.5mg/mL；酪氨酸酶溶液的浓度为32~56kU/mL；掺杂石墨烯分散液与酪氨酸酶溶液体积比为1：（0.5~2）。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：掺杂石墨烯复合材料的制备中，所述氧化剂为过硫酸铵，所述酸性介质为盐酸，所述氧化剂与酸性介质的摩尔比为（2~2.5）：1，苯胺与酸性介质的体积比为1:（10~20）；酸性介质以水溶液的形式加入，酸性介质的浓度为0.5mol/L；所述聚合反应的温度为4~10℃，聚合反应的时间为6~12h；

所述煅烧的氛围为保护性氛围，所述煅烧的时间为1.5~2.5小时，所述继续煅烧的时间为0.5~1.5小时。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（a）的具体步骤为将氧化石墨烯在水中超声剥离，加入苯胺超声分散均匀；然后低温下，加入氧化剂与酸性介质的混合物，反应，获得聚苯胺-氧化石墨烯复合物。

6.根据权利要求1~5任一项所述的应用，其特征在于：所述检测多巴胺的酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）对基底电极进行表面预处理；

（2）将掺杂石墨烯复合材料分散于水中，获得掺杂石墨烯复合材料分散液；将酪氨酸酶配成酪氨酸酶溶液；将掺杂石墨烯复合材料分散液与酪氨酸酶溶液混合均匀，得到复合溶液；

（3）将复合溶液滴加到基底电极的表面，室温晾干；

（4）将壳聚糖配成溶液，获得壳聚糖溶液；将壳聚糖溶液滴加在步骤（3）的电极表面，室温晾干，得到基于掺杂石墨烯的酶修饰工作电极；

（5）将基于掺杂石墨烯的酶修饰工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系，得到检测多巴胺的酶生物传感器。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：

步骤（2）中所述掺杂石墨烯复合材料分散液的浓度为2.5~12.5mg/mL；

步骤（2）中所述酪氨酸酶溶液的浓度为32~56kU/mL；酪氨酸酶溶液是采用PBS溶液配制而成；

步骤（4）中所述壳聚糖溶液的pH 6~7；壳聚糖溶液是采用乙酸溶液配制成1.5~3mg/mL的溶液，然后采用碱调节而成。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：步骤（2）中所述掺杂石墨烯分散液与酪氨酸酶溶液体积比为1：（0.5~2）；

步骤（3）中复合溶液滴加量与步骤（4）中所述壳聚糖溶液滴加量的体积比为5：（2~4）。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述酶生物传感器在多巴胺定量检测中的应用。

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