CN110018211A - 一种检测汞离子的电化学发光生物传感器的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物传感器技术领域，公开了一种检测汞离子的电化学发光生物传感器的制备方法。氮化碳量子点作为一种新型的共反应物可以增强发光体(Ru(dcbpy)3 2+)的电化学发光信号。为了实现对汞离子的特异性检测，我们引入了富含T碱基的DNA1和DNA2，并将其分别连在发光体和共反应物上，DNA1和DNA2可以通过汞离子进行配对结合，发光体与共反应物之间的距离变近，电化学发光信号进一步增强。构筑的电化学发光生物传感器对汞离子的检测限为3.3×10‑ 15mol·L‑1。本发明提供的电化学发光生物传感器成本低、灵敏度高、选择性好，适用于地表水中汞离子含量的实际应用检测。

Description

一种检测汞离子的电化学发光生物传感器的制备方法
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，特别涉及一种检测汞离子的电化学发光生物传感器的制备方法。
背景技术
工业生产产生的含汞离子(Hg2+)废弃物排放到环境中，会对土壤、水以及农作物产生危害。例如，引起农作物生理功能的紊乱、营养不均衡，最终使农作物枯萎甚至死亡，导致农作物产量减少和质量降低等。Hg2+通过食物链进入人体后，会在体内富集，引起神经系统紊乱，甚至中毒死亡。因此对水中Hg2+含量进行检测很有必要，它可以为水质量评估和后续处理提供理论依据
对于Hg2+的检测一直是人们十分关注的问题，目前常用的Hg2+分析测定方法有原子吸收光谱法、电感耦合等离子体质谱法和原子荧光光谱法等。虽然这些方法比较灵敏、精确，但是它们操作要求高、需要大型设备。电化学法、电化学发光法(ECL)、比色法等，这些方法操作简单，成本低。其中电化学发光法因其低的背景干扰，高的灵敏度和宽的检测范围等优异特点引起人们广泛的关注。随着科技的进步，生物识别原件(如适配体、DNA和抗体)等逐渐进入人们的视线，并在检测领域占有一席之地。DNA中的碱基可以与特定的目标物进行结合，因此基于DNA构建的生物传感器具有更好地选择性。
发明内容
针对目前检测Hg2+的方法存在的一些问题，本发明提供了一种成本低、灵敏度高、选择性好的ECL生物传感器检测Hg2+。
一种基于ECL检测Hg2+的电化学发光生物传感器制备方法，包括以下步骤：
(1)Ru(dcbpy)3 2+-DNA1复合材料的制备：
将三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌溶于磷酸盐缓冲溶液中，将1-(3-二甲基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸EDC和N,N-二甲基甲酰胺NHS混合溶液加入到上述溶液中搅拌，之后加入DNA1继续搅拌，再加入乙酸钠溶液和乙醇进行沉淀反应，离心、洗涤、干燥，得到Ru(dcbpy)3 2+-DNA1复合材料；
(2)g-C3N4QDs-DNA2复合材料的制备：
含有EDC和NHS的混合液加入到g-C3N4QDs溶液中，搅拌后加入DNA2溶液继续进行搅拌，得到g-C3N4QDs-DNA2复合材料；
(3)将玻碳电极依次用不同粒径的三氧化二铝粉末打磨进行抛光处理，直到呈镜面，用乙醇和二次水超声清洗；
(4)配制含有Hg2+标准液、Ru(dcbpy)3 2+-DNA1、g-C3N4QDs-DNA2和磷酸盐缓冲溶液的混合液；
(5)取步骤(4)所得的混合液修饰到经步骤(3)处理的电极上，室温下进行干燥；
(6)在步骤(5)处理的电极上修饰Nafion进行材料固定，得到检测Hg2+的电化学发光生物传感器。
步骤(1)中，三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌，EDC和NHS的混合溶液，DNA1，乙酸钠溶液和乙醇的用量比例为4mg：2mL：1.6mL：800μL：16mL；其中，EDC和NHS的质量比为4:1，DNA1的浓度为0.5-3μM，乙酸钠溶液的浓度为0.5-5M。
步骤(1)中，第一次搅拌为室温下搅拌2h；第二次搅拌为25℃下搅拌6-12h，搅拌速度为100rpm；沉淀反应5-12h，温度-30-1℃。
步骤(2)中，EDC和NHS的混合液、g-C3N4QDs的溶液、DNA2溶液的用量比例为400μL：1.6mL：1.6mL；其中，EDC和NHS的混合液中，EDC和NHS的浓度比为4mM:1mM；g-C3N4QDs的溶液的浓度为1-5mg·mL-1，DNA2溶液的浓度为0.5-3μM。
步骤(2)中，第一次搅拌为室温下搅拌15min；第二次搅拌为室温下搅拌1h。
步骤(3)中，玻碳电极的直径d＝3mm；所用的三氧化二铝粉末的粒径依次为0.3μm和0.05μm。
步骤(4)混合液中，制备混合液时，三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌，DNA1，g-C3N4QDs的溶液、DNA2溶液的用量比例为4mg：1.6mL：1.6mL：1.6mL，磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.1M，pH为7，Hg2+的浓度为1×10-14～1×10-9mol/L；其中，DNA1的浓度为0.5-3μM，g-C3N4QDs的溶液的浓度为1-5mg·mL-1，DNA2溶液的浓度为0.5-3μM。
步骤(5)中，修饰时，混合液的用量为4μL。
步骤(6)中，Nafion的质量百分浓度为0.5％，用量为3μL。
将本发明制备的电化学发光生物传感器用于检测待测液中Hg2+浓度的步骤：
(1)将本发明制备的电极放置15min后，分别测定电极ECL信号强度，作Hg2+浓度对ECL信号强度的标准曲线，计算回归方程。
(2)按上述比例将Ru(dcbpy)3 2+-DNA1和g-C3N4QDs-DNA2混合液于离心管中，再加入Hg2+待测液和磷酸盐缓冲液(0.1M，pH＝7)，震荡均匀后，放入25℃的恒温箱中反应70min后，分别取4μL修饰到已处理好的3mm玻碳电极上，室温干燥后修饰3μL 0.5％Nafion。(3)根据待测液的ECL信号强度计算待测液中Hg2+浓度。
所述Ru(dcbpy)3 2+-DNA1原液浓度为28.8μM
所述的DNA1和DNA2富含T碱基，只可通过Hg2+配对结合。
本ECL生物传感器的工作原理：
Ru(dcbpy)3 2+-DNA1中含有发光体Ru(dcbpy)3 2+，可以产生ECL信号，但是较弱。g-C3N4QDs-DNA2中的共反应物g-C3N4QDs可以增强其ECL信号强度。当目标物Hg2+出现后，Ru(dcbpy)3 2+与g-C3N4QDs通过两条DNA链的互补配对，距离更近，ECL信号强度进一步增强。
本发明具有以下优点：
本发明所涉及的ECL生物传感器制备方法简单，简化了实验操作的复杂程度，实现了目标物简单、快速、灵敏的分析检测。该ECL生物传感器可实现水体中Hg2+的特异性检测，检测限低至3.3×10-15M。
附图说明
图1为该ECL生物传感器的检测示意图；
图2为该ECL生物传感器检测Hg2+的标准曲线。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明做进一步说明。
配置磷酸盐缓冲溶液(浓度为0.1mM)，磷酸盐缓冲溶液是由磷酸氢二钠与磷酸二氢钠组成，分别称取3.5814g的磷酸氢二钠与1.5601g的磷酸二氢钠，各配成100mL溶液，然后取一部分磷酸氢二钠与一部分磷酸二氢钠混合，将其混合溶液的pH值调至所需值。
实施例1
本发明的具体制备方法如下：
(1)Ru(dcbpy)3 2+-DNA1复合材料的制备：
将4mg三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌溶于8mL缓冲溶液(pH＝7)中，2mL含有160mgEDC和40mg NHS混合溶液加入到上述溶液中室温搅拌2h，之后加入1.6mL 0.5-3μM DNA1继续搅拌6-12h，此次搅拌环境25℃，100rpm，再加入800μL 0.5-5M乙酸钠溶液和16mL乙醇在-30-1℃进行沉淀反应5-12h，12000rpm条件下离心30min，得到的沉淀用70％乙醇洗涤两次，最后，在室温下晾干后溶于1mL缓冲溶液(pH＝7)放于4℃冰箱备用。
(2)g-C3N4QDs-DNA2复合材料的制备：
400μL混合液含有40mM EDC和10mM NHS加入到1.6mL 1-5mg mL-1g-C3N4QDs溶液中，室温下搅拌15min后加入1.6mL 0.5-3μM DNA2溶液，继续在室温下搅拌1h，得到g-C3N4QDs-DNA2复合材料放于4℃冰箱备用。
(3)将玻碳电极GCE(d＝3mm)依次用0.3μm和0.05μm的三氧化二铝粉末打磨进行抛光处理，直到呈镜面，用乙醇和二次水超声清洗。
(4)配制含有Hg2+标准液、Ru(dcbpy)3 2+-DNA1、g-C3N4QDs-DNA2和磷酸盐缓冲溶液的混合液；
(5)取步骤(4)所得的混合液修饰到经步骤(3)处理的电极上，室温下进行干燥；
(6)在步骤(5)处理的电极上修饰Nafion进行材料固定，得到检测Hg2+的电化学发光生物传感器。
步骤(4)混合液中，制备混合液时，三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌，DNA1，g-C3N4QDs的溶液、DNA2溶液的用量比例为4mg：1.6mL：1.6mL：1.6mL，磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.1M，pH为7，Hg2+的浓度分别为1×10-14、5×10-14、1×10-13、2×10-13、1×10-12、1×10-11、5×10-11、2×10-10、1×10-9mol/L；其中，DNA1的浓度为0.5-3μM，g-C3N4QDs的溶液的浓度为1-5mg·mL-1，DNA2溶液的浓度为0.5-3μM。
步骤(5)中，修饰时，混合液的用量为4μL。
步骤(6)中，Nafion的质量百分浓度为0.5％，用量为3μL。
所述生物传感器的构建如附图1。
实施例2
利用本发明对待测液进行检测，步骤如下：
(1)Ru(dcbpy)3 2+-DNA1复合材料的制备：
将4mg三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌溶于8mL缓冲溶液(pH＝7)中，2mL含有160mgEDC和40mg NHS混合溶液加入到上述溶液中室温搅拌2h，之后加入1.6mL 0.5-3μM DNA1继续搅拌6-12h，此次搅拌环境25℃，100rpm，再加入800μL 0.5-5M乙酸钠溶液和16mL乙醇在-30-1℃进行沉淀反应5-12h，12000rpm条件下离心30min，得到的沉淀用70％乙醇洗涤两次，最后，在室温下晾干后溶于1mL缓冲溶液(pH＝7)放于4℃冰箱备用。
(2)g-C3N4QDs-DNA2复合材料的制备：
400μL混合液含有40mM EDC和10mM NHS加入到1.6mL 1-5mg mL-1g-C3N4QDs溶液中，室温下搅拌15min后加入1.6mL 0.5-3μM DNA2溶液，继续在室温下搅拌1h，得到g-C3N4QDs-DNA2复合材料放于4℃冰箱备用。
(3)将玻碳电极GCE(d＝3mm)依次用0.3μm和0.05μm的三氧化二铝粉末打磨进行抛光处理，直到呈镜面，用乙醇和二次水超声清洗。
(4)配制含有Hg2+标准液、Ru(dcbpy)3 2+-DNA1、g-C3N4QDs-DNA2和磷酸盐缓冲溶液的混合液；
(5)取步骤(4)所得的混合液修饰到经步骤(3)处理的电极上，室温下进行干燥；
(6)在步骤(5)处理的电极上修饰Nafion进行材料固定，得到检测Hg2+的电化学发光生物传感器。
(7)将步骤(6)所得的电极放置15min后，分别测定电极ECL信号强度，作Hg2+浓度对ECL信号强度的标准曲线，计算回归方程如附图2所示。
步骤(4)混合液中，制备混合液时，三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌，DNA1，g-C3N4QDs的溶液、DNA2溶液的用量比例为4mg：1.6mL：1.6mL：1.6mL，磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.1M，pH为7，Hg2+的浓度分别为1×10-14、5×10-14、1×10-13、2×10-13、1×10-12、1×10-11、5×10-11、2×10-10、1×10-9mol/L；其中，DNA1的浓度为0.5-3μM，g-C3N4QDs的溶液的浓度为1-5mg·mL-1，DNA2溶液的浓度为0.5-3μM。
步骤(5)中，修饰时，混合液的用量为4μL。
步骤(6)中，Nafion的质量百分浓度为0.5％，用量为3μL。
按上述比例将Ru(dcbpy)3 2+-DNA1和g-C3N4QDs-DNA2混合液于离心管中，再加入Hg2 +待测液和磷酸盐缓冲液(0.1M，pH＝7)，震荡均匀后，放入25℃的恒温箱中反应70min后，分别取4μL修饰到已处理好的3mm玻碳电极上，室温干燥后修饰3μL 0.5％Nafion。
将制备的电极放置15min后，测定电极ECL信号强度。根据待测液的ECL信号强度计算待测液中Hg2+浓度。

Claims (9)

1.一种检测汞离子的电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)Ru(dcbpy)3 2+-DNA1复合材料的制备：
将三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌溶于磷酸盐缓冲溶液中，将1-(3-二甲基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸EDC和N,N-二甲基甲酰胺NHS混合溶液加入到上述溶液中搅拌，之后加入DNA1继续搅拌，再加入乙酸钠溶液和乙醇进行沉淀反应，离心、洗涤、干燥，得到Ru(dcbpy)3 2+-DNA1复合材料；
(2)g-C3N4QDs-DNA2复合材料的制备：
含有EDC和NHS的混合液加入到g-C3N4QDs溶液中，搅拌后加入DNA2溶液继续进行搅拌，得到g-C3N4QDs-DNA2复合材料；
(3)将玻碳电极依次用不同粒径的三氧化二铝粉末打磨进行抛光处理，直到呈镜面，用乙醇和二次水超声清洗；
(4)配制含有汞离子标准液、Ru(dcbpy)3 2+-DNA1、g-C3N4QDs-DNA2和磷酸盐缓冲溶液的混合液；
(5)取步骤(4)所得的混合液修饰到经步骤(3)处理的电极上，室温下进行干燥；
(6)在步骤(5)处理的电极上修饰Nafion进行材料固定。
2.根据权利要求1所述的一种检测汞离子的电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌，EDC和NHS的混合溶液，DNA1，乙酸钠溶液和乙醇的用量比例为4mg：2mL：1.6mL：800μL：16mL；其中，EDC和NHS的质量比为4:1，DNA1的浓度为0.5-3μM，乙酸钠溶液的浓度为0.5-5M。
3.根据权利要求1所述的一种检测汞离子的电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，第一次搅拌为室温下搅拌2h；第二次搅拌为25℃下搅拌6-12h，搅拌速度为100rpm；沉淀反应5-12h，温度-30-1℃。
4.根据权利要求1所述的一种检测汞离子的电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，EDC和NHS的混合液、g-C3N4QDs的溶液、DNA2溶液的用量比例为400μL：1.6mL：1.6mL；其中，EDC和NHS的混合液中，EDC和NHS的浓度比为4mM:1mM；g-C3N4QDs的溶液的浓度为1-5mg·mL-1，DNA2溶液的浓度为0.5-3μM。
5.根据权利要求1所述的一种检测汞离子的电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，第一次搅拌为室温下搅拌15min；第二次搅拌为室温下搅拌1h。
6.根据权利要求1所述的一种检测汞离子的电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，玻碳电极的直径d＝3mm；所用的三氧化二铝粉末的粒径依次为0.3μm和0.05μm。
7.根据权利要求1所述的一种检测汞离子的电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(4)混合液中，制备混合液时，三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌，DNA1，g-C3N4QDs的溶液、DNA2溶液的用量比例为4mg：1.6mL：1.6mL：1.6mL，磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.1M，pH为7，Hg2+的浓度为1×10-14～1×10-9mol/L；其中，DNA1的浓度为0.5-3μM，g-C3N4QDs的溶液的浓度为1-5mg·mL-1，DNA2溶液的浓度为0.5-3μM。
8.根据权利要求1所述的一种检测汞离子的电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，修饰时，混合液的用量为4μL。
9.根据权利要求1所述的一种检测汞离子的电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，Nafion的质量百分浓度为0.5％，用量为3μL。
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