CN114539230A - 一类电化学发光体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种构建电化学发光体的合成方法及应用，该两种电化学发光体LU‑CO和LU‑NA，其结构如式(1)和(2)所示。本发明利用“分子嫁接策略”的方法构建电化学发光体，以能量共振转移为桥梁，普适性拓展电化学发光体，本发明可以在水相中点亮电化学非活性染料的电化学信号，同时实现硝基还原的活性分析；本发明合成了一系列电化学发光体(LU‑CO，LU‑NA和LU‑NA‑X)，其能量共振转移效率接近100％。受益于染料分子种类和传感机制的多样性，本发明将为快速开发电化学发光(ECL)发光体和推进其在未来应用中的多形态和高性能应用提供帮助。
Description
技术领域
本发明属于有机小分子电化学发光体领域，具体涉及一类电化学发光体及其制备方法和应用。
背景技术
由于近零光学背景和光漂白，电化学发光(ECL)自1960年代中期的开创性工作以来，已被广泛用于追求临床诊断、食品分析、环境监测和生物成像等不同领域的分析极限。作为核心组件之一，ECL发光体直接决定了应用中的策略和性能。因此，开发具有多种形式和卓越性能的新发光体一直是基于ECL研究的前沿之一，但仍然是一个艰巨的挑战。原则上，对于共反应剂机制的ECL发光体，产生高效的发光信号有三个必要的前提条件。首先，ECL发光体能很好的与工作电极交换高能电子。其次，处于高能状态的ECL发光体可以与共反应剂自由基反应并产生激发态，在此期间，水溶液中的高能发光体不会发生自我湮灭或被环境中的分子淬灭。最后，辐射跃迁应该主导激子的最终归宿。对于大多数的分子而言，即使是具有优良光物理性质的荧光染料，均很难满足上述所有的条件，这极大限制了ECL活性分子的类型。
目前的ECL发光体依据结构特点可以分为三类，金属配合物，半导体纳米颗粒/纳米团簇，和共轭有机分子。为了提高ECL效率并适应不同的应用方案，研究者通过电位控制聚集诱导、自增强、结晶、以及其他策略，在调节电极界面、发光体和/或共反应剂之间的电子传输方面做出了巨大努力。尽管在机理研究和一些应用方面取得了空前的进展，但开发具有高ECL效率、良好的水溶性/分散性和易于修饰的ECL发光体仍处于起步阶段。例如，当前在水溶液体系中只有三(2,2'-联吡啶)钌(II)([Ru(bpy)3]2+)被用于商业化的ECL系统，ECL发光体的匮乏和开发难度，大大阻碍了它们在未来肿瘤诊断中应用。因此，ECL发光体的普适性开发策略以及实现其多样化应用的研究是科学研究的重点和热点。
此外，尽管有很多具有优良光物理特性的荧光分子，但是它们中的大多数是没有ECL信号的。其次，传统的ECL传感通常需借助于免疫传感机制，以抗原-抗体或适配体作为媒介来实现传感分析，很难实现没有相应媒介的催化酶类的检测，因此也极大的限制了ECL传感在催化酶类的检测中的应用。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一类全新的电化学发光体，本发明提出了一种普适性的“分子嫁接”策略，成功的设计出两种ECL发光体，利用能量共振转移的方式，将染料分子嫁接于高性能的ECL引发剂上，点亮了ECL非活性染料，且实现了ECL发光体和应用的拓展。按照类似的嫁接原理，将数量庞大且传感机制多样的荧光染料，以RET作为桥梁，嫁接于现有的高性能ECL引发剂上，以实现ECL发光体和应用的拓展。作为概念证明，两种经典不具备ECL活性的染料，即7-(二乙基氨基)香豆素-3-羧酸和3-(4-氨基-1,8-萘二甲酰亚胺基)丙酸，与作为ECL引发剂的鲁米诺分子通过共价连接，以近乎100％的RET效率点亮了染料分子的ECL信号。此外，通过对分子中染料部分上的取代基进行修饰，可以进一步对ECL发射信号微调，同时实现催化酶的活性分析。
本发明提出了所述电化学发光体的制备方法和应用。
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述构建的两种ECL发光体，简称分别为LU-CO和LU-NA，结构分别如式(1)和(2)所示：
本发明所述的电化学发光体的制备方法，包括如下步骤：
(1)将鲁米诺(LU)、4-Boc-1-哌嗪乙酸(化合物1)和1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐混合，在惰性气体保护下加入二甲基甲酰胺和N，N-二异丙基乙胺搅拌反应，反应完成后淬灭，有机相洗涤干燥后，通过减压蒸馏得到了化合物2，将化合物2溶于二氯甲烷和三氟乙酸的混合液中并搅拌反应，反应完成后溶液经减压蒸馏干燥，粗品纯化，获得的LU-NH；
(2)将LU-NH、7-(二乙胺基)香豆素-3-羧酸和N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于DMF，搅拌后向溶液中加入DIEA继续搅拌反应，反应结束后萃取，洗涤，干燥，减压蒸馏，粗品提纯为LU-CO，即为式(1)化合物；
(3)将LU-NH、3-(4-氨基-1,8-萘二甲酰亚胺基)丙酸和N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于DMF，搅拌后向溶液中加入DIEA继续搅拌反应，反应结束后萃取，洗涤，干燥，减压蒸馏，粗品提纯为LU-NA，即为式(2)化合物；
其反应路线如下所示：
其中，步骤(1)中原料为鲁米诺，4-Boc-1-哌嗪乙酸，1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐(PyBOP)，碱为N，N-二异丙基乙胺(DIEA)，在室温下搅拌，溶剂为DMF。
其中，步骤(1)中通过薄层色谱法监测反应完成后，加入H2O淬灭反应，有机相分别用饱和氯化铵、碳酸氢钠和氯化钠洗涤，有机相经无水硫酸镁干燥后，通过减压蒸馏得到了化合物2。
其中，步骤(1)中鲁米诺和化合物1的摩尔比为0.1:1-1:100。
作为优选，所述鲁米诺和化合物1的摩尔比为1:1。
其中，步骤(1)中溶于二氯甲烷和三氟乙酸的混合液中并搅拌5小时，所述二氯甲烷和三氟乙酸的体积比为1:1，薄层色谱(TLC)监测反应完成后，溶液经减压蒸馏，干燥，粗品经硅胶柱色谱纯化，获得的LU-NH为浅黄色粉末。
其中，步骤(2)所述LU-NH和7-(二乙胺基)香豆素-3-羧酸(CO，CAS：50995-74-9)的摩尔比为1:1-50:1，优选摩尔比为23:19。所述LU-NH，7-(二乙基氨基)香豆素-3-羧酸(CO),N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和DIEA，溶剂为DMF，室温下搅拌12小时。反应结束后，向混合液中加入5mL水，用二氯甲烷萃取，依次用饱和氯化铵、碳酸氢钠和氯化钠溶液洗涤。最后，有机相用无水Na2SO4干燥，减压蒸馏，粗品通过硅胶柱色谱法提纯为黄色粉末即为LU-CO。
其中，步骤(3)所述LU-NH和3-(4-氨基-1,8-萘二甲酰亚胺基)丙酸(NA，CAS：1022899-85-9)的摩尔比为0.1:1-50:1，优选摩尔比为1:1。所述的LU-NH，3-(4-氨基-1,8-萘甲酰亚胺)丙酸(NA)，EDCI，DIEA，溶剂为DMF，室温下搅拌12小时。反应结束后，向混合物中加入水，二氯甲烷萃取，依次用饱和氯化铵、碳酸氢钠和氯化钠溶液洗涤。最后，有机相用无水Na2SO4干燥，减压蒸馏，粗品经硅胶柱色谱法提纯为黄色粉末即为LU-NA。
本发明所述的电化学发光体在硝基还原酶检测中的应用。
本发明所述的基于LU-NA电化学发光体极大的拓展了ECL传感在催化酶类的检测中的应用。具有优良光物理特性的荧光分子数量巨大且它们中的大多数是没有ECL信号的，然而，荧光染料具有多种多样成熟的传感机制。其次，传统的ECL传感通常需借助于免疫传感机制，以抗原-抗体或适配体作为媒介来实现传感分析，很难实现没有相应媒介的催化酶类的检测，因此也极大的限制了ECL传感在催化酶类的检测中的应用。本发明通过分子嫁接理念设计的LU-CO和LU-NA，一方面很好的继承了电化学特性，另一方面，引入的荧光染料部分可以很好的继承的荧光的传感设计策略。为此，本发明以硝基还原酶为例，通过分子内电荷能量转移机制(ICT)，构建了基于LU-NA分子的硝基还原酶传感体系。
本发明中的探针设计原理如下：
本发明针对现有ECL领域缺乏发光体的普适性开发策略以及其多样化应用，首次提出一种普适性的“分子嫁接”理念，以RET为桥梁，实现了ECL发光体的拓展和应用。为了实现高效的RET，供体、受体和连接基团的选择是至关重要的。作为一个范例，本发明选用具有高ECL活性的鲁米诺(LU)作为供体，经鲁米诺供体的ECL发射波长和染料受体的吸收波长比对，CO和NA被选做两个模型接受体。如图中1a,b所示，经实验表明，鲁米诺的发射峰与CO和NA的吸收峰之间有很大面积的重叠。同时，通过密度函数理论计算了LU、CO和NA的HOMO和LUMO的轨道能级分布。如图1中c所示，结果表明，CO或NA的HOMO-LUMO能级处于LU的HONO-LUMO能级之间，满足LU和CO或NA之间的能量转移。因此，实验光谱和理论计算初步表明，CO和NA是基于鲁米诺供体的两个理想的能量接受体。另外，LU和CO或NA之间适当的距离和角度同样是有效的RET的另外两个关键要素。为此，本发明选择了具有自我构象调节能力的哌嗪衍生物作为连接基团来连接LU和CO/NA。按照这一思路设计了目标分子结构，LU-CO和LU-NA。首先，通过DFT计算对目标分子LU-CO和LU-NA的结构进行了优化。如图2中a-d所示，通过DFT和时间依赖的DFT(TD-DFT)得到LU-CO和LU-NA的电子等密度图和前沿轨道能量。LU-CO和LU-NA的HOMO-LUMO能极差比LU单体小得多，且接近于相应的染料单体。此外，电子主要分布在染料单元中，表明染料单体与LU有效供体-受体相互作用，且染料是最终光子发射的主要贡献区域。另外，还计算出LU-CO或LU-NA中LU与染料之间的中心核与核之间的距离(R)分别为
和
这符合实现RET的供体与受体之间的距离规则。随后通过公式转化可以算得LU-CO和LU-NA的取向因子(κ2)分别为0.59和2.89，这也是在合理范围内(0≤κ2≤4)。因此，LU-CO和LU-NA的临界福斯特半径(R0)依据公式可分别算得为
和
考虑实际的R值较小，因此，理论上，提出的LU-CO和LU-NA符合RET的要求。
本发明中ECL发光体与硝基还原酶的作用机制如下：
首先，制备了带有硝基取代基的LU-NA-NO2。该分子中-NO2末端基团具有较强的吸电子能力，使得受体单元中的分子内电荷转移(ICT)被阻断，进一步导致RET的中断。因此，在该条件下，ECL发射信号主要表现为LU供体部分的发射。在硝基还原酶(NTR)和NADH存在条件下，LU-NA-NO2分子中的硝基基团可以被定量地还原为具有供电子能力的氨基基团。经还原后，体系中分子内电荷能量转移的能力得到改善，随之，RET可以正常进行，最终表现为受体单元(染料部分)的ECL发射增强。由此带来的信号变化就可以实现硝基还原酶的传感分析。本发明通过合成LU-NA-NO2在硝基还原酶和NADH的存在下，LU-NA-NO2的-NO2基团可以被定量的还原成具有供电子能力的-NH2基团，因此，体系中分子内电荷能量转移的能力改善，从而有传感的信号变化。
检测机制如下：
本发明中构建了硝基还原酶传感体系，其中包括：硝基还原酶传感的电化学发光体(LU-NA-X)，其端基带-NO2将-NO2还原成-NH2有了分子内电荷转移，实现了波长的变化，实现了波长的微调。本发明中制备了带有硝基取代基的LU-NA-NO2。该分子中-NO2末端基团具有较强的吸电子能力，使得受体单元中的分子内电荷转移(ICT)被阻断(图3a)，进一步导致RET的中断。因此，在该条件下，ECL发射信号主要表现为LU供体部分的发射。有趣的是，在硝基还原酶(NTR)和NADH存在条件下，LU-NA-NO2分子中的硝基基团可以被定量地还原为具有供电子能力的氨基基团。经还原后，体系中分子内电荷能量转移的能力得到改善，随之，RET可以正常进行，最终表现为受体单元(染料部分)的ECL发射增强(图3b)。
本发明中提出的LU-NA-X实现了波长的一个微调，图3c所示。这里X并不是代表结构，而是表示发光位置的变化。该结构可以不固定的，本发明中因为在底物的作用下-NO2在被还原成-NH2。
本发明建立了一种普适性开发ECL发光体的方法；利用荧光染料具有多种多样成熟的传感机制，建立了ECL新的传感应用场景开拓了ECL传感在催化酶类的检测中的应用。最后，还结合待测物与LU-NA-X的响应情况，构建了可同时显示了校准曲线和选择性的三维坐标生物传感系统。
本发明提出了一种开发ECL发光体的“分子嫁接策略”，以RET为桥梁，普适性拓展ECL发光体，可以有效丰富ECL发光体结构。本发明可以在水相中点亮ECL非活性染料的ECL信号，同时实现硝基还原的活性分析。本发明通过根据光学特性和理论预测筛选了供体、受体、连接体和取代基，合成了一系列ECL发光体(LU-CO、LU-NA和LU-NA-X)，其RET效率接近于100％。与以往从头设计全新分子来实现有机小分子ECL信号不同，新构建的ECL分子平台中的每个单元都最大限度地发挥了其优势，即该分子平台一方面通过高活性ECL引发剂(LU)继承了电化学发光的快速响应，背景信号低等优势，另一方面，通过染料部分将多样化的荧光传感机制整合到ECL平台中，并利用该分子平台成功实现了催化酶的活性分析。最后，还结合待测物与LU-NA-X的响应情况，构建了可同时显示了校准曲线和选择性的三维坐标生物传感系统。受益于染料分子种类和传感机制的多样性，本发明将为快速开发ECL发光体和推进其在未来应用中的多形态和高性能应用提供帮助。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明通过能量共振转移的方式构建了两种全新结构的不同发光波长的ECL(LU-CO和LU-NA)，通过对LU-CO和LU-NA中的RET的效率进行测定，LU-CO和LU-NA的RET效率都接近于100％。
2、本发明与以往从头设计全新分子来实现有机小分子ECL信号不同，新构建的ECL分子中的每个单元都最大限度地发挥了其优势，即该分子一方面通过高活性ECL引发剂(LU)继承了电化学发光的快速响应，背景信号低等优势，另一方面，通过染料部分将多样化的荧光传感机制整合到ECL分子中，并利用该分子成功实现了催化酶的活性分析。
3、本发明构建了硝基还原酶传感体系LU-NA-NO2，经硝基还原酶作用获得的LU-NA-X的发射波长可以通过改变NTR的浓度进行精细的调制。随着NTR浓度从25到200μg/mL的增加，ECL的最大发射波长从425nm逐渐转移到540nm处。通过色度图将该光谱信号进行转化，最终形成一系列的色度坐标(x，y)，即对应不同的发射(波长)信号。另外，将该色度坐标用MATLAB进行转化可显示出信号与NTR浓度的线性关系，同理将其他干扰物种进行处理发现这些干扰物不在给定范围内。本发明是第一个可以使用三维坐标进行的分析的ECL生物传感，其可以同时显示校准曲线和选择性的分析报告。值得注意的是，基于小分子的易修饰性的优势，以及荧光传感机制的多样化，除了上述硝基取代基修饰外，还可以进行不同需求的多种多样的修饰方案以实现不同待测物的分析。由此，通过“分子嫁接”构建的ECL分子平台可以很好的将多样化的荧光传感的响应机制整合到ECL体系中，极大丰富ECL的传感机制和应用场景。
附图说明
图1为PBS(pH＝8.0，0.01M)中CO、NA的吸收光谱(a)和鲁米诺的标准化ECL发射光谱(b)；以及基于DFT/b3lyp/6-311+g(d)的LU、CO、NA、LU-CO和LU-NA的HOMO和LUMO的电子等密度图和前沿轨道能量(c)；
图2为LU-CO(a)和LU-NA(b)的基态构象结构以及鲁米诺核心和染料核心之间的相应距离和偶极方向；偶极角与LU-CO(c)和LU-NA(d)的中心到中心矢量的关系图；
图3为基于ECL分子平台实现硝基还原酶的响应机制(a)；在含有5mg/mL NADH的PBS(pH＝8.0，0.01M)溶液中，LU-NA-NO2与不同浓度NTR响应前(蓝线)和后(红线)的ECL发射光谱(b)；与不同浓度的NTR(25-200μg/mL)反应后的一系列的LU-NA-X以及LU、LU-CO、LU-NA的ECL光谱的CIE坐标图(c)；
图4为LU-CO的核磁氢谱图；
图5为LU-NA的核磁氢谱图；
图6中(a)LU-CO、LU-NA和对照组的紫外可见光吸收；(b)CO、NA、LU-CO和LU-NA的归一化后的荧光光谱图；(c)PBS(pH＝8.0，0.01M)溶液中不同激发波长的CO、LU-CO、NA和LU-NA的标准化荧光强度；(d)LU、LU-CO和LU-NA在PBS(0.01M，pH＝8.0)中350nm激发下的时间分辨衰减曲线；
图7中(a)LU、LU-CO和LU-NA的CV曲线(上)和相应的ECL强度(下)；(b)在PBS(0.01M，pH＝8.0)溶液中，以H2O2为共反应剂，以GCE为工作电极，CO和NA的CV曲线(上)和相应的ECL强度(下)；(c)LU、LU-CO和LU-NA的ECL发射光谱图；(d)在PBS(pH＝8.0，0.01M)溶液中，LU和CO或NA以1:1的比例的物理混合物的ECL发射光谱；
图8为三维坐标生物传感系统。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
化合物LU-NH的合成
将鲁米诺LU(363mg，2.05mM)、化合物1(4-Boc-1-哌嗪乙酸)(500mg，2.05mM)和1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐(PyBOP，1.6g，3.07mM)加入10mL的圆底烧瓶中。用N2脱气后，烧瓶中加入5mL二甲基甲酰胺(DMF)和N，N-二异丙基乙胺(DIEA，1.1mL，6.15mM)并在室温下搅拌。薄层色谱法(TLC)监测反应完成后，加入20mL H2O淬灭反应。有机相分别用饱和氯化铵(15mL×3)、碳酸氢钠(15mL×3)和氯化钠(15mL×3)洗涤。有机相经无水硫酸镁干燥后，通过减压蒸馏得到了化合物2。随后，将化合物2(200mg)溶于二氯甲烷(10mL)和三氟乙酸(10mL)的混合液中并搅拌5小时。薄层色谱(TLC)监测反应完成后，溶液经减压蒸馏，干燥，粗品经硅胶柱色谱纯化，获得的LU-NH为浅黄色粉末(120mg，产率80％)。
1HNMR(600MHz，DMSO)δ13.31(s，1H)，11.81(s，1H)，9.01(d，J＝8.3Hz，1H)，8.62(s，2H)，7.87(t，J＝8.1Hz，1H)，7.65(d，J＝8.6Hz，1H)，3.42(s，2H)，3.24(s，4H)，2.78(s，4H)。13C NMR(151MHz，DMSO)δ13.31，11.81，9.01，9.00，8.62，7.89，7.87，7.86，7.66，7.64，3.42，3.24，2.78。HRMS(ESI+):m/z304.14042[M+H]+实际测得为304.13600。
实施例2
化合物LU-CO的合成
将LU-NH(140mg，0.46mM)、CO(100mg，0.38mM)和N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI，110mg，0.58mM)的化合物溶于DMF(2mL)。搅拌10分钟后，将DIEA(0.19mL，1.15mM)加入溶液中，并在室温下再搅拌12小时。反应结束后，向混合液中加入5mL水，用二氯甲烷(10mL)萃取，依次用饱和氯化铵(8mL×3)、碳酸氢钠(8mL×3)和氯化钠(8mL×3)溶液洗涤。然后，有机相用无水Na2SO4干燥减压蒸馏，粗品通过硅胶柱色谱法提纯为黄色粉末即为LU-CO(100mg，收率48％)。其1HNMR如图4所示：
1H NMR(600MHz，DMSO)δ13.43(s，1H)，11.94(s，1H)，11.50(s，1H)，9.01-8.94(m，1H)，7.92(s，1H)，7.79(t，J＝8.1Hz，1H)，7.56(d，J＝7.4Hz，1H)，7.43(t，J＝8.6Hz，1H)，6。68(dd，J＝9.0，2.4Hz，1H)，6.48(t，J＝5.7Hz，1H)，3.70(s，1H)，3.38(dd，J＝14.0，6.9Hz，4H)，3.18(s，1H)，2.50(d，J＝29.8Hz，4H)，1.16(d，J＝3.5Hz，4H)，1.06(t，J＝7.0Hz，6H)。13C NMR(151MHz，DMSO)δ170.59，164.51，158.92，157.06，151.68，144.11，134.85，130.55，121.06，116.66，115.53，109.85，107.65，96.80，62.18，55.38，53.57，53.04，44.64，40.53，29.45，22.56，12.77。HRMS(ESI+):m/z 547.22996[M+H]+实际测得为547.23111。
实施例3
LU-NA的合成:
将LU-NH(100mg，0.23mM)、NA(65mg，0.23mM)和N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI，66mg，0.35mM)溶于DMF(2mL)。搅拌10分钟后，向溶液中加入DIEA(0.12mL,0.68mM)并在室温下搅拌12小时。向混合物中加入5mL水，二氯甲烷(10mL)萃取，依次用饱和氯化铵(8mL×3)、碳酸氢钠(8mL×3)和氯化(8mL×3)溶液洗涤。然后，有机相用无水Na2SO4干燥，减压蒸馏，粗品经硅胶柱色谱法提纯为黄色粉末即为LU-NA(59mg，产率45％)。1HNMR如图5所示：
1H NMR(600MHz，DMSO)δ13.43(s，1H)，11.98(s，2H)，9.03(d，J＝8.3Hz，1H)，8.62(d，J＝8.4Hz，1H)，8.44(d，J＝7.2Hz，1H)，8.20(d，J＝8.4Hz，1H)，7.86(t，J＝8.1Hz，1H)，7.68-7.61(M，2H)，7.46(S，2H)，6.85(D，J＝8.4Hz，1H)，4.23-4.19(M，2H)，3.63(S，2H)，3.22(S，2H)，2.70-2.64(M，2H)，1.23(S，4H)，0.85(T，J＝6.9Hz，2H)。13C NMR(151MHz，DMSO)δ172.53，170.57，169.18，164.25，163.32，153.30，147.34，134.49，131.53，130.21，130.13，129.89，129.60，124.48，122.22，119.83，108.67，107.94，100.00，53.45，34.14，31.76，30.29，29.47，24.96，22.57。HRMS(ESI+):m/z 570.20956[M+H]+实际测得为570.21753。
实施例4
光致发光信号测试
室温条件下，在磷酸盐缓冲液(PBS，0.01M,pH＝8.0)中测试LU,LU-CO和LU-NA的光物理性质。化合物LU、LU-CO和LU-NA的紫外-可见光吸收光谱测试条件：将LU、LU-CO和LU-NA溶于0.01M，pH＝8.0的PBS缓冲溶液中，最终浓度为30uM，波长范围为300-500nm。化合物LU(30μM)、LU-CO(30μM)和LU-NA(30μM)的荧光光谱和荧光寿命测试条件：激发波长为350nm，测试溶液为PBS(0.01M，pH＝8.0)，衰减时间是通过二阶拟合衰减光谱获得。
如紫外-可见光吸收光谱(图6a)所示，由于LU的氨基(给电子基)变成了酰胺基(吸电子基)，LU-CO和LU-NA中LU部分的吸收带呈蓝移，而染料单元的吸收带由于羧基转化为酰胺基而略呈红移。图6b中的荧光光谱进一步显示，LU-NA的最大发射波长几乎与NA相同，而LU-CO的发射波长与CO相比略有红移，这归因于羧基和酰胺基的不同吸电子能力。此外，当在350nm(LU的最大激发波长)激发时，LU-CO和LU-NA的荧光强度远高于CO和NA(图6c)，表明LU在分子间RET的光子吸收方面的关键作用。更重要的是，与CO和NA受体共轭后，LU的FL寿命(τ)明显下降(图6d)，相应的RET效率(ERET)分别为81％和73％。这些实验结果证实，在光照条件下，分子LU-CO和LU-NA中，从LU供体单元到染料受体单元的RET可以有效发生。
实施例5
电化学发光测试
测定LU-CO和LU-NA分子中的染料能否在电化学激发条件下，通过RET机制产生ECL信号。通过循环伏安法对LU、CO、NA、LU-CO和LU-NA在PBS中以H2O2为共反应剂的条件下的电化学性质进行了测试。取10mg LU，LU-CO和LU-NA溶于0.5mL水中，再加入0.5mL质量分数为0.05％的Nafion充分超声混合均匀，取50uL上述溶液滴在玻碳电极上，室温保存使其自然晾干。在测试过程中使用传统的三电极体系，负载有上述LU，LU-CO和LU-NA的玻碳电极为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，在含有10mM过氧化氢的磷酸盐缓冲液中进行测试。通过电化学工作站里循环伏安曲线得到电化学发光图。进一步的，通过电化学工作站里的恒电位曲线结合荧光光谱采集LU，LU-CO和LU-NA的光谱图。
如图7a，图7b所示，LU、LU-CO和LU-NA三者均能在峰电位约为0.50V左右被氧化，而在相同的条件下，单一染料(CO和NA)没有观察到这种情况的氧化峰。因此，LU、LU-CO和LU-NA的氧化峰可以归因于分子中LU供体的失电子过程所形成。与此同时，这些分子的ECL信号也被记录，从图7a中可以看出LU-CO和LU-NA从电化学氧化开始就表现出明显ECL信号，并在约0.5V时达到最大强度值，而单纯的染料单体在相同条件下没有显示ECL信号(图7b)。进一步的，通过电化学光谱采集装置，记录了LU-CO和LU-NA的ECL发射光谱。如图7c所示，LU-CO和LU-NA分子的ECL光谱峰显示，除了在425nm处的较弱的发射峰(鲁米诺)外，LU-CO和LU-NA分别在481nm和540nm处显示了一个新的ECL发射峰，其最大发射峰的位置与相应的荧光光谱峰几乎相同。另外，在相同条件下，通过将染料(CO或NA)和LU进行简单的物理混合后进行相同的ECL测试时(图7d)，并没有在481nm或540nm处出现ECL光谱峰值，这也进一步验证了该体系只有通过共价连接形式时才会发生RET现象。最后，通过FRET效率的评估方法，对LU-CO和LU-NA中的RET的效率进行了评估，由此可计算得出，LU-CO和LU-NA的RET效率都接近于100％。由此可以得出结论，嫁接分子体系中的染料通过高效的RET途径展现了高的ECL信号。
实施例6
LU-NA-NO2的合成：
LU-NH(100mg，0.23mM)、3-(6-nitro-1,3-dioxo-1H-benzo[de]isoquinolin-2(3H)-yl)propanoic acid(NA-NO2)(CAS:307299-14-5)(72mg，0.23mM)和N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI，66mg，0.35mM)的化合物溶于DMF(2mM)。搅拌10分钟后，向溶液中加入DIEA(0.12mL,0.68mM)并在室温下搅拌12小时。向混合液中加入5mL水，二氯甲烷(10mL)萃取，依次用饱和氯化铵(8mL×3)、碳酸氢钠(8mL×3)和氯化钠(8mL×3)溶液洗涤。然后，有机相用无水Na2SO4干燥，减压蒸馏，粗品经硅胶柱色谱法提纯为黄色粉末即为LU-NA-NO2(77mg，产率56％)。LU-NA-NO2其结构如下如所示：
1H NMR(600MHz，DMSO)δ13.41(s，1H)，11.86(s，1H)，9.24(s，1H)，9.01(d，J＝8.3Hz，1H)，8.71(d，J＝8.7Hz，1H)，8.62(dd，J＝13.7，7.6Hz，2H)，8.56(d，J＝8.0Hz，1H)，8.10(t，J＝8.0Hz，1H)，7.84(T，J＝8.1Hz，1H)，7.61(D，J＝7.7Hz，1H)，4.30-4.23(M，2H)，3.64-3.61(M，2H)，3.61-3.57(M，2H)，3.11(D，J＝7.1Hz，2H)，2.78-2.71(M，2H)，2.56(D，J＝30.1Hz，4H)。13C NMR(151MHz，DMSO)δ172.44，171.32，170.67，170.51，168.99，163.40，162.60，154.06，149.66，134.85，132.19，130.61，130.12，129.33，128.80，127.09，124.76，123.24，121.99，121.13，62.25，53.77，45.21，42.04，37.13，31.18，21.53。HRMS(ESI+):m/z600.18374[M+H]+实际测得为600.18590。
实施例7
硝基还原酶的检测：
取10mg LU-NA-NO2溶于0.5mL水中，再加入0.5mL质量分数为0.05％的Nafion充分超声混合均匀，取50uL上述溶液滴在玻碳电极上，室温保存使其自然晾干。在测试过程中使用传统的三电极体系，负载有上述LU-NA-NO2的玻碳电极为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，在含有10mM过氧化氢的磷酸盐缓冲液中进行测试。负载有上述LU-NA-NO2的玻碳电极和不同浓度的硝基还原酶(25-200μg/mL)在PBS(0.01M，pH＝7.0)溶液中摇晃约24h。用NaOH水溶液(0.01M)将混合溶液的pH值调整到8.5后，以H2O2(10mM)为共反应剂，恒电位(0.6V)条件下进行ECL光谱测试。
在硝基还原酶(NTR)和NADH存在条件下，LU-NA-NO2分子中的硝基基团可以被定量地还原为具有供电子能力的氨基基团(图3a)。经还原后，体系中分子内电荷能量转移的能力得到改善，随之，RET可以正常进行，最终表现为受体单元(染料部分)的ECL发射增强(图3b)。由此带来的信号变化就可以实现硝基还原酶的传感分析。其次，经硝基还原酶作用获得的LU-NA-X的发射波长可以通过改变NTR的浓度进行精细的调制。如图3c所示，随着NTR浓度从25到200μg/mL的增加，ECL的最大发射波长从425nm逐渐转移到540nm处。通过色度图将该光谱信号进行转化，最终形成一系列的色度坐标(x，y)，即对应不同的发射(波长)信号。依据CIE 1976色度图，将测得的ECL光谱进行转化，绘制对应的色度坐标，可显示出信号与NTR浓度的线性关系，因此，经硝基还原酶作用获得的LU-NA-X的发射波长可以通过改变NTR的浓度进行精细的调制，证明本发明的LU-NA-NO2可以应用在催化酶类(如硝基还原酶)的检测中。
实施例8
三维坐标生物传感系统的建立：
取10mg LU-NA-NO2溶于0.5mL水中，再加入0.5mL质量分数为0.05％的Nafion充分超声混合均匀，取50uL上述溶液滴在玻碳电极上，室温保存使其自然晾干。在测试过程中使用传统的三电极体系，负载有上述LU-NA-NO2的玻碳电极为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，在含有10mM过氧化氢的磷酸盐缓冲液中进行测试。负载有上述LU-NA-NO2的玻碳电极和各种不同的待测物(1mg/mL)在PBS(0.01M，pH＝7.0)溶液中摇晃约24h。用NaOH水溶液(0.01M)将混合溶液的pH值调整到8.5后，以H2O2(10mM)为共反应剂，恒电位(0.6V)条件下进行ECL光谱测试。配置如下浓度各待测物：包括NQO1(1mg/mL)、GSH(1mg/mL)、Cys(1mg/mL)、Gly(1mg/mL)、Fe3+(1mg/mL)和Cu2+(1mg/mL)，采用超纯水溶解。将实施例9个得到的色度坐标用MATLAB进行转化可显示出信号与NTR浓度的线性关系，同理将其他干扰物种进行处理发现这些干扰物不在给定范围内。结合待测物与LU-NA-X的响应情况，构建了可同时显示了校准曲线和选择性的三维坐标生物传感系统。
如图8所示，本发明实现了可以使用三维坐标进行的分析的ECL生物传感，经硝基还原酶作用获得的LU-NA-X的发射波长可以通过改变NTR的浓度进行精细的调制，达到一张图办实现两个目的，可同时显示了校准曲线和选择性的三维坐标生物传感系统。
Claims (10)
1.一类电化学发光体，其特征在于，所述电化学发光体其结构如式(1)或者(2)所示：
2.一种权利要求1所述的电化学发光体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将鲁米诺、4-Boc-1-哌嗪乙酸和1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐混合，在惰性气体保护下加入N,N-二甲基甲酰胺和N，N-二异丙基乙胺搅拌反应，反应完成后淬灭，有机相洗涤干燥后，通过减压蒸馏得到了化合物2，将化合物2溶于二氯甲烷和三氟乙酸的混合液中并搅拌反应，反应完成后溶液经减压蒸馏干燥，粗品纯化，获得的LU-NH；
(2)将LU-NH、7-(二乙胺基)香豆素-3-羧酸和N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于N,N-二甲基甲酰胺，搅拌后向溶液中加入N,N-二异丙基乙胺继续搅拌反应，反应结束后萃取，洗涤，干燥，减压蒸馏，粗品提纯为LU-CO，即为式(1)化合物；
(3)将LU-NH、3-(4-氨基-1,8-萘二甲酰亚胺基)丙酸和N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于N,N-二甲基甲酰胺，搅拌后向溶液中加入N,N-二异丙基乙胺继续搅拌反应，反应结束后萃取，洗涤，干燥，减压蒸馏，粗品提纯为LU-NA，即为式(2)化合物。
3.根据权利要求2所述的电化学发光体的制备方法，其特征在于，其反应路线如下所示：
4.根据权利要求2所述的电化学发光体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中通过薄层色谱法监测反应完成后，加入H2O淬灭反应，有机相分别用饱和氯化铵、碳酸氢钠和氯化钠洗涤，有机相经无水硫酸镁干燥后，通过减压蒸馏得到了化合物2。
5.根据权利要求1所述的电化学发光体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中鲁米诺和化合物1的摩尔比为0.1:1-1:100。
6.根据权利要求2所述的电化学发光体的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述LU-NH和7-(二乙胺基)香豆素-3-羧酸(CO)的摩尔比为1:1-50:1。
7.根据权利要求2所述的电化学发光体的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述LU-NH和3-(4-氨基-1,8-萘二甲酰亚胺基)丙酸的摩尔比为0.1:1-50:1。
8.一种权利要求1所述的电化学发光体在硝基还原酶检测中的应用。
9.一种硝基还原酶传感的电化学发光体所构建的硝基还原酶传感体系，其特征在于，所述硝基还原酶传感的电化学发光体优选为硝基取代基的LU-NA-NO2，所述LU-NA-NO2由LU-NH制备而成。
10.根据权利要求9所述的硝基还原酶传感体系，其特征在于，所述硝基取代基的LU-NA-NO2由LU-NH、3-(6-nitro-1,3-dioxo-1H-benzo[de]isoquinolin-2(3H)-yl)propanoicacid(NA-NO2)和N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于N,N-二甲基甲酰胺，搅拌后向溶液中加入N,N-二异丙基乙胺继续搅拌反应，反应结束后萃取，洗涤，干燥，减压蒸馏，粗品提纯为LU-NA-NO2。
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