CN105806921A - 一种无外设光源的黄曲霉毒素光电化学传感器的制备方法及应用 - Google Patents

一种无外设光源的黄曲霉毒素光电化学传感器的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于功能纳米材料构建的具备电致化学发光和光电化学双重信号发达策略的生物免疫传感器的制备方法，所制备的传感器操作简单、携带方便、检测快、成本低，可用于日常生产、生活等领域的对黄曲霉毒素的快速、灵敏检测。

Description

一种无外设光源的黄曲霉毒素光电化学传感器的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种用于检测黄曲霉毒素的传感器的制备方法，该传感器集成了电致化学发光和光电化学双重功能。属于新型纳米功能材料与电化学生物传感分析技术领域。
背景技术
黄曲霉毒素是一类化学结构类似的化合物，均为二氢呋喃香豆素的衍生物。黄曲霉毒素存在于土壤、动植物、各种坚果中，特别是容易污染花生、玉米、稻米、大豆、小麦等粮油产品，是霉菌毒素中毒性最大、对人类健康危害极为突出的一类霉菌毒素。黄曲霉毒素主要有黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2等几种。黄曲霉毒素被世界卫生组织划定为1类致癌物，毒性比砒霜大68倍，仅次于肉毒霉素，是目前已知霉菌中毒性最强的。黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡，家庭自制发酵食品也能检出黄曲霉毒素，尤其是高温高湿地区的粮油及制品种检出率更高。
目前，检测黄曲霉毒素的方法主要有色谱法、质谱法等。此类方法仪器贵重、操作复杂，化验人员需要专业培训后才能进行检测。因此，研发成本低、检测快、灵敏度高、特异性强的黄曲霉毒素传感器具有重要意义。
电化学生物传感分析技术由于操作简便、检测速度快等优势，日益得到人们的重视。目前，用于检测黄曲霉毒素的电化学生物传感分析技术按照检测手段来分主要有电化学传感器、电致化学发光传感器和光电化学传感器三种。其中，电致化学发光传感器和光电化学传感器相对于电化学传感器，具有背景信号噪音少、灵敏度高、检测成本低等特点，近几年被越来越多的研究者所关注。
电致化学发光也称为电化学发光，是指通过电化学方法在电极表面产生一些特殊的物质，这些物质之间或与体系中其他组分之间通过电子传递形成激发态，由激发态返回到基态产生发光现象。电致化学发光传感器即通过改变电极表面的修饰材料，与分析物产生电化学发光，在最优条件下，根据分析物浓度与电化学发光强度的相关变化实现对分析物的定性定量分析。
光电化学传感器是基于外加光源激发光电敏感材料导致电子-空穴对进行分离，在合适的偏电位条件下，实现电子在电极、半导体及修饰物和分析物上的快速传递，并形成光电流。在最优条件下，分析物浓度的变化会直接影响光电流的大小，可以根据光电流的变化实现对分析物的定性定量分析。
但是，由于电致化学发光传感器需要外置光信号捕捉设备如光电二极管等，而光电化学传感器需要外设光源来激发光电敏感材料，这在一定程度上影响了二者操作的便捷性，限制了他们在实际生产、生活中更为广泛的应用。因此，设计、制备更为简便、快捷的检测黄曲霉毒素的电化学生物传感分析技术具有十分重要的实用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单、携带方便、检测快、成本低的黄曲霉毒素传感器的制备方法，所制备的传感器，可用于日常生产、生活等领域的对黄曲霉毒素的快速、灵敏检测。基于此目的，本发明在同一电解池中，采用四电极系统，即两个工作电极、一个对电极和一个参比电极，其中工作电极1采用金硫化银纳米棒溶胶AuAg2SNRs和电聚合鲁米诺共同进行修饰，作为电致化学发光工作电极W1，工作电极2采用二氧化钛纳米片溶胶TiO2NSs和黄曲霉毒素抗体溶液共同进行修饰，作为光电化学工作电极W2。进行检测时，在电解池中加入固定浓度过氧化氢后，在W1上施加阶跃电压，由于AuAg2SNRs的催化作用，鲁米诺与过氧化氢反应，产生电致化学发光，这便相当于“开灯”，当阶跃电压为0时，电致化学发光消失，这便相当于“关灯”，与此同时在W2上一直施加恒定电压，由于TiO2NSs会因为电致化学发光产生的发光激发导致电子-空穴对进行分离，标记在黄曲霉毒素二抗上的辣根过氧化物酶HRP催化过氧化氢产生氧气，使过氧化氢成为空穴“给体”，从而在W2上得到光电流，当电致化学发光消失，即“关灯”时，光电流随即消失。由于在固定过氧化氢浓度的前提下，光电流大小与HRP浓度正相关，当被测物中黄曲霉毒素浓度越大，当与一抗免疫结合到W2上时，再免疫结合标记有HRP的黄曲霉毒素二抗的浓度就会越大，产生的光电流也就越大，因此通过记录光电流的大小即可实现对黄曲霉毒素的检测。
基于以上发明原理，本发明采用的具体技术方案如下：
1.一种无外设光源的黄曲霉毒素光电化学传感器的制备方法，其特点在于，制备步骤为：
（1）电致化学发光工作电极W1的制备方法，所述的W1是由金硫化银纳米棒溶胶AuAg2SNRs和电聚合鲁米诺共同修饰的ITO导电玻璃，其特点是，具体的制备步骤为：
1）以ITO导电玻璃为工作电极，在电极表面滴涂AuAg2SNRs，覆盖面积为1cm×1cm，室温下晾干；
2）将1）得到的工作电极，浸入电解液中，浸入面积为AuAg2SNRs所覆盖的面积，利用三电极系统对工作电极进行电化学沉积，沉积后取出工作电极，使用超纯水清洗，4℃下避光干燥，制得电致化学发光工作电极W1；
所述的金硫化银纳米棒溶胶AuAg2SNRs为核壳结构的棒状纳米材料的水溶液，所述核壳结构的棒状纳米材料为以金纳米棒为核，硫化银纳米粒子为壳层的棒状纳米材料，所述金纳米棒是棒状金纳米粒子，长度为20~40nm；
所述的电解液为含有鲁米诺的硫酸溶液，所述的电解液中鲁米诺的浓度为1~10mmol/L，硫酸浓度为0.1~1.0mol/L；
所述的三电极系统，包括工作电极、参比电极和对电极，所述的参比电极为饱和甘汞电极，所述的对电极为铂丝电极；
所述的电化学沉积过程，采用的电化学方法为循环伏安法，起始电压为-0.2V，终止电压为1.5V，扫速为100mv/s，循环20~30圈；
（2）光电化学工作电极W2的制备方法，所述的W2是由TiO2NSs和黄曲霉毒素抗体共同修饰的ITO导电玻璃，其特点是，具体的制备步骤为：
1）以ITO导电玻璃为工作电极，在电极表面滴涂8~12μLTiO2NSs，室温下晾干；
2）将1）中得到的工作电极放入马弗炉中，在450℃下进行退火处理，处理后冷却至室温；
3）将2）中得到的工作电极表面滴涂8~12μL黄曲霉毒素抗体溶液，4℃下干燥，干燥后用超纯水清洗，4℃下干燥，制得光电化学工作电极W2；
所述的TiO2NSs为1mg/mL的二氧化钛纳米片的水溶液，所述二氧化钛纳米片为方形片状的二氧化钛纳米粒子，边长为60~80nm；
所述的黄曲霉毒素抗体溶液的浓度为300μg/mL；
（3）无外设光源的黄曲霉毒素光电化学传感器的制备方法：
1）将W1和W2导电的一面相对插入电解池中，W1与W2间距为0.5cm~1.5cm；
2）以Ag/AgCl为参比电极RE、铂丝电极为对电极CE，插入电解池中，与W1和W2共同组成四电极系统；
3）在电解池中加入10mLpH值为11~13的NaOH溶液和0.2mL浓度为1mmol/L的过氧化氢溶液；
4）将1）~3）所制得四电极系统以及电解池置于暗盒中，即制得无外设光源的黄曲霉毒素光电化学传感器。
2.本发明所述的黄曲霉毒素光电化学传感器的应用于黄曲霉毒素的检测，其特点是具体的检测方法为：
（1）在W2上滴加10μL不同浓度的黄曲霉毒素标准溶液，孵化30min后，黄曲霉毒素与W2上的黄曲霉毒素抗体进行免疫结合，冲洗后，再滴加10μL辣根过氧化物酶HRP标记的黄曲霉毒素二抗，孵化30min后，HRP标记的黄曲霉毒素二抗与黄曲霉毒素进行免疫结合，冲洗后，制得待测W2；
（2）利用电化学工作站，在W1上采用阶跃电压的方法对W1施加阶跃电压，初始电压为0v，阶跃电压为0.7~0.9v，阶跃时间为10~30s；同时，在待测W2上采用时间-电流方法对待测W2施加恒定电压，电压为0~0.6v；待测W2上的电流会随着黄曲霉毒素浓度的增大而相应增大，根据所得电流增大值与黄曲霉毒素浓度之间的关系，绘制工作曲线；；
（3）将待测黄曲霉毒素溶液代替黄曲霉毒素的标准溶液，按照（1）和（2）所述的黄曲霉毒素检测方法进行检测，根据所得到的电流增大值与所绘制的工作曲线得出待测黄曲霉毒素溶液的浓度；
所述的HRP标记的黄曲霉毒素二抗的浓度为300μg/mL。
本发明的有益成果
（1）本发明所述的黄曲霉毒素光电化学传感器制备简单，操作方便，无需外部辅助设备，利用检测设备的微型化、便携化，并实现了对黄曲霉毒素的快速、灵敏、高选择性检测，具有广阔的市场发展前景；
（2）本发明首次在同一电解池中采用四电极系统检测黄曲霉毒素，并实现了电致化学发光与光电化学双功能信号放大策略。在电解池中随着黄曲霉毒素浓度的增加，修饰在W2上的HRP标记的黄曲霉毒素二抗就会增加，也就意味着HRP对过氧化氢催化的提高。如此以来，一方面，使得电致化学发光强度线性增加，所激发的光电流线形增大；另一方面，过氧化氢作为电子给体，使得光电化学反应中光电流线形增大；第三方面，由于AuAg2SNRs的大的比表面积以及与鲁米诺氨基的结合，可以使电聚合鲁米诺更好地负载到电极表面，增大发光强度。因此，可以实现电致化学发光和光电化学两种方法在同一电解池中、同一电化学工作站下共同反应、相互作用，实现了对黄曲霉毒素检测电信号的双重放大，极大地提高了检测灵敏度和检出限，具有重要的科学意义。由于该光电传感器无需外设光源，更有利于微型化、便携化，所以具有广阔的市场应用价值。
具体实施方式
实施例1一种无外设光源的黄曲霉毒素光电化学传感器，具体的制备步骤为：
（1）电致化学发光工作电极W1的制备：
1）以ITO导电玻璃为工作电极，在电极表面滴涂AuAg2SNRs，覆盖面积为1cm×1cm，室温下晾干；
2）将1）得到的工作电极，浸入电解液中，浸入面积为AuAg2SNRs所覆盖的面积，利用三电极系统对工作电极进行电化学沉积，沉积后取出工作电极，使用超纯水清洗，4℃下避光干燥，制得电致化学发光工作电极W1；
所述的AuAg2SNRs为核壳结构的棒状纳米材料的水溶液，所述核壳结构的棒状纳米材料为以金纳米棒为核，硫化银纳米粒子为壳层的棒状纳米材料，所述金纳米棒是棒状金纳米粒子，长度为20nm；
所述的电解液为含有鲁米诺的硫酸溶液，所述的电解液中鲁米诺的浓度为1mmol/L，硫酸浓度为0.1mol/L；
所述的三电极系统，包括工作电极、参比电极和对电极，所述的参比电极为饱和甘汞电极，所述的对电极为铂丝电极；
所述的电化学沉积过程，采用的电化学方法为循环伏安法，起始电压为-0.2V，终止电压为1.5V，扫速为100mv/s，循环20圈。
（2）光电化学工作电极W2的制备：
1）以ITO导电玻璃为工作电极，在电极表面滴涂8μLTiO2NSs，室温下晾干；
2）将1）中得到的工作电极放入马弗炉中，在450℃下进行退火处理，处理后冷却至室温；
3）将2）中得到的工作电极表面滴涂8μL黄曲霉毒素抗体溶液，4℃下干燥，干燥后用超纯水清洗，4℃下干燥，制得光电化学工作电极W2；
所述的TiO2NSs为1mg/mL的二氧化钛纳米片的水溶液，所述二氧化钛纳米片为方形片状的二氧化钛纳米粒子，边长为60~80nm；
所述的黄曲霉毒素抗体溶液的浓度为300μg/mL；
（3）无外设光源的黄曲霉毒素光电化学传感器的制备方法：
1）将（1）中制备的W1和（2）中制备的W2面面相对插入电解池中，W1与W2间距为0.5cm；
2）以Ag/AgCl为参比电极RE、铂丝电极为对电极CE，插入电解池中，与W1和W2共同组成四电极系统；
3）在电解池中加入10mLpH值为11的NaOH溶液和0.2mL浓度为1mmol/L的过氧化氢溶液；
4）将1）~3）所制得四电极系统以及电解池置于暗盒中，即制得无外设光源的黄曲霉毒素光电化学传感器。
实施例2一种无外设光源的黄曲霉毒素光电化学传感器，具体的制备步骤为：
（1）电致化学发光工作电极W1的制备：
制备步骤同实施例1中W1的制备步骤，不同之处为金纳米棒的长度为30nm，电解液中鲁米诺的浓度为5mmol/L，硫酸浓度为0.5mol/L，循环伏安法进行电化学沉积时，循环25圈。
（2）光电化学工作电极W2的制备：
1）以ITO导电玻璃为工作电极，在电极表面滴涂10μLTiO2NSs，室温下晾干；
2）将1）中得到的工作电极放入马弗炉中，在450℃下进行退火处理，处理后冷却至室温；
3）将2）中得到的工作电极表面滴涂10μL黄曲霉毒素抗体溶液，4℃下干燥，干燥后用超纯水清洗，4℃下干燥，制得光电化学工作电极W2；
其余同实施例1中W2的制备步骤。
（3）无外设光源的黄曲霉毒素光电化学传感器的制备方法：
制备步骤同实施例1，不同之处为W1与W2间距为1.0cm，在电解池中加入的NaOH溶液的pH值为12。
实施例3一种无外设光源的黄曲霉毒素光电化学传感器，具体的制备步骤为：
（1）电致化学发光工作电极W1的制备：
制备步骤同实施例1中W1的制备步骤，不同之处为金纳米棒的长度为40nm，电解液中鲁米诺的浓度为10mmol/L，硫酸浓度为1.0mol/L，循环伏安法进行电化学沉积时，循环30圈。
（2）光电化学工作电极W2的制备：
1）以ITO导电玻璃为工作电极，在电极表面滴涂12μLTiO2NSs，室温下晾干；
2）将1）中得到的工作电极放入马弗炉中，在450℃下进行退火处理，处理后冷却至室温；
3）将2）中得到的工作电极表面滴涂12μL黄曲霉毒素抗体溶液，4℃下干燥，干燥后用超纯水清洗，4℃下干燥，制得光电化学工作电极W2；
其余同实施例1中W2的制备步骤。
（3）无外设光源的黄曲霉毒素光电化学传感器的制备方法：
制备步骤同实施例1，不同之处为W1与W2间距为1.5cm，在电解池中加入的NaOH溶液的pH值为13。
实施例4一种无外设光源的黄曲霉毒素光电化学传感器的应用
实施例1制备的一种无外设光源的黄曲霉毒素光电化学传感器应用于黄曲霉毒素的检测，其检测步骤为：
（1）在W2上滴加10μL不同浓度的黄曲霉毒素标准溶液，孵化30min后，黄曲霉毒素与W2上的黄曲霉毒素抗体进行免疫结合，冲洗后，再滴加10μL辣根过氧化物酶HRP标记的黄曲霉毒素二抗，孵化30min后，HRP标记的黄曲霉毒素二抗与黄曲霉毒素进行免疫结合，冲洗后，制得待测W2；
（2）利用电化学工作站，在W1上采用阶跃电压的方法对W1施加阶跃电压，初始电压为0v，阶跃电压为0.7v，阶跃时间为10s；同时，在待测W2上采用时间-电流方法对待测W2施加恒定电压，电压为0v；待测W2上的电流会随着黄曲霉毒素浓度的增大而相应增大，根据所得电流增大值与黄曲霉毒素浓度之间的关系，绘制工作曲线；
（3）将待测黄曲霉毒素溶液代替黄曲霉毒素的标准溶液，按照（1）和（2）所述的黄曲霉毒素检测方法进行检测，根据所得到的电流增大值与所绘制的工作曲线得出待测黄曲霉毒素溶液的浓度；
所述的HRP标记的黄曲霉毒素二抗的浓度为300μg/mL。
实施例5一种无外设光源的黄曲霉毒素光电化学传感器的应用
实施例2制备的一种无外设光源的黄曲霉毒素光电化学传感器应用于过氧化氢的检测，其检测步骤除以下步骤外，其余步骤同实施例4：
步骤（2）利用电化学工作站，在W1上采用阶跃电压的方法对W1施加阶跃电压，初始电压为0v，阶跃电压为0.8v，阶跃时间为20s；同时，在待测W2上采用时间-电流方法对待测W2施加恒定电压，电压为0.3v；待测W2上的电流会随着黄曲霉毒素浓度的增大而相应增大，根据所得电流增大值与黄曲霉毒素浓度之间的关系，绘制工作曲线。
实施例6一种无外设光源的黄曲霉毒素光电化学传感器的应用
实施例3制备的一种无外设光源的黄曲霉毒素光电化学传感器应用于过氧化氢的检测，其检测步骤除以下步骤外，其余步骤同实施例4：
步骤（2）利用电化学工作站，在W1上采用阶跃电压的方法对W1施加阶跃电压，初始电压为0v，阶跃电压为0.9v，阶跃时间为30s；同时，在待测W2上采用时间-电流方法对待测W2施加恒定电压，电压为0.6v；待测W2上的电流会随着黄曲霉毒素浓度的增大而相应增大，根据所得电流增大值与黄曲霉毒素浓度之间的关系，绘制工作曲线。
实施例7实施例1-3所制备的黄曲霉毒素光电化学传感器，按照实施例4-6的检测步骤应用于黄曲霉毒素的检测，具有优良的检测效果，检测限为13pmol/L。

Claims (5)

1.一种无外设光源的黄曲霉毒素光电化学传感器的制备方法，其特征在于，采用金硫化银纳米棒溶胶AuAg2SNRs和电聚合鲁米诺共同修饰的ITO导电玻璃作为电致化学发光工作电极W1，二氧化钛纳米片溶胶TiO2NSs和黄曲霉毒素抗体溶液共同修饰的ITO导电玻璃作为光电化学工作电极W2，Ag/AgCl电极作为参比电极RE、铂丝电极作为对电极CE，将四个电极共同插入同一电解池中组成四电极系统，将制得的四电极系统置于暗盒中，即制得无外设光源的黄曲霉毒素光电化学传感器。
2.根据权利要求1所述的无外设光源的黄曲霉毒素光电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述的金硫化银纳米棒溶胶AuAg2SNRs为核壳结构的棒状纳米材料的水溶液，所述核壳结构的棒状纳米材料为以金纳米棒为核，硫化银纳米粒子为壳层的棒状纳米材料，所述金纳米棒是棒状金纳米粒子，长度为20~40nm。
3.根据权利要求1所述的无外设光源的黄曲霉毒素光电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述的二氧化钛纳米片溶胶TiO2NSs为二氧化钛纳米片的水溶液，所述二氧化钛纳米片为方形片状的二氧化钛纳米粒子，边长为60~80nm。
4.根据权利要求1所述的无外设光源的黄曲霉毒素光电化学传感器的制备方法，其特征在于，将W1和W2导电的一面相对插入电解池中，W1与W2间距为0.5cm~1.5cm。
5.根据权利要求1所述的制备方法制备的黄曲霉毒素光电化学传感器，其特征在于，所述的黄曲霉毒素光电化学传感器应用于黄曲霉毒素的检测，检测步骤为：
（1）在W2上滴加待测黄曲霉毒素溶液，在待测黄曲霉毒素溶液中的黄曲霉毒素与W2上的黄曲霉毒素抗体免疫结合后，冲洗掉其余物质，再滴加辣根过氧化物酶HRP标记的黄曲霉毒素二抗进行免疫结合，结合后冲洗掉多余的HRP标记的黄曲霉毒素二抗，制得待测W2；
（2）利用电化学工作站，在含有固定浓度过氧化氢的电解液中，在W1上采用阶跃电压的方法对W1施加阶跃电压，初始电压为0v，阶跃电压为0.7~0.9v，阶跃时间为10~30s；同时，在待测W2上采用时间-电流方法对待测W2施加恒定电压，电压为0~0.6v；待测W2上的电流会随着待测黄曲霉毒素溶液中黄曲霉毒素的浓度增大而相应增大，根据所得电流增大值得出待测黄曲霉毒素溶液中黄曲霉毒素的浓度。
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