CN109136347A

CN109136347A - 一种监测核酸文库复杂程度的方法

Info

Publication number: CN109136347A
Application number: CN201710491638.3A
Authority: CN
Inventors: 罗昭锋; 方晓娜; 王进军; 何磊; 杨伟丽
Original assignee: University of Science and Technology of China USTC
Current assignee: University of Science and Technology of China USTC
Priority date: 2017-06-16
Filing date: 2017-06-23
Publication date: 2019-01-04

Abstract

本文提供一种监测核酸文库复杂程度的方法。本文提供一种确定或监测核酸文库复杂程度的方法，所述方法包括以下步骤：1)以文库中的核酸为模板进行PCR扩增，获得扩增曲线，2)当曲线达到平台期后，将扩增曲线对扩增循环数求导，导数值越小，指示库容越大。本文还提供包括所述确定或监测核酸文库复杂程度方法的改进的SELEX方法，以及通过所述改进的SELEX方法获得核酸适配体的方法。本发明的方法可以是自动化方法。本发明的方法简单易于判定，可以通过仪器直接获得明确的结果。

Description

一种监测核酸文库复杂程度的方法

技术领域

本发明涉及生物学领域和化学领域，特别涉及分子生物学领域。具体的，涉及一种复杂核酸文库如SELEX筛选中的核酸文库的复杂程度监测方法。

背景技术

核酸文库复杂程度的监测目前还缺乏很好的手段，已经报导的一些方法主要是针对SELEX(Systematic Evolution of Ligand by Exponential Enrichment，即配体指数级富集系统进化)筛选过程中文库的复杂程度的分析判断。SELEX技术是20世纪90年代初发展起来的一种新的组合化学技术，是一个在人工体外合成的大容量随机寡核苷酸序列文库中，通过 PCR扩增技术，指数级富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过若干轮筛选，从而获得高亲和力和特异性的核酸适配体(aptamer)。目前核酸适配体筛选的难点之一在于缺乏有效的筛选进程监测手段，因筛选通常要很多轮，每一轮常涉及很多步骤，整个实验周期长。如果仅仅依靠多轮筛选后获得的文库检测亲和力来判断筛选成败，这存在很多缺陷。一是不知道失败发生在哪一轮，更无从知晓失败的真正原因；二是当筛选多轮之后，如果没有明显的亲和力，也无法判断是因为还没有筛选到足够的轮数，还是已经失败，无法给出是该停止筛选还是需要继续筛选的明确指导。三是检测亲和力常常需要用特定的方法，若每一轮都检测会浪费大量的时间、精力和科研资源。

已经报导的SELEX过程的文库复杂程度监测手段除了测序外，还可以根据序列多态性(RFLP)、荧光定量PCR实验中的Tm值，dHPLC等方法。其中利用文库序列多态性的方法，涉及酶解以及电泳等系列过程，操作繁琐且不够灵敏，通过Tm值来监测筛选进程，受PCR体系影响较大，结果不稳定，即便条件控制严格，差值也很小，甚至与误差相近。为提升可靠性，2013年出现了改良的方法(reMELTing)，效果依然不理想。

参考文献

T.Schutze et al.，A calibrated diversity assay for nucleic acidlibraries using DiStRO--a Diversity Standard of RandomOligonucleotides.Nucleic Acids Res 38，e23(Mar 1，2010).

R.Beier，E.Boschke，D.Labudde，New strategies for evaluation andanalysis of SELEX experiments.BioMed research international 2014，849743(2014).

J.Vanbrabant，K.Leirs，K.Vanschoenbeek，J.Lammertyn，L.Michiels，reMelting curve analysis as a tool for enrichment monitoring in the SELEXprocess.Analyst 139，589(Feb 7，2014).

D.Aird et al.，Analyzing and minimizing PCR amplification bias inIllumina

sequencing libraries.Genome biology 12，(2011).

N.Mencin et al.，Monitoring the progress of selection during SELEX.Current Opinion in Biotechnology 24，S110(Jul，2013).

J.Vanbrabant，K.Leirs，K.Vanschoenbeek，J.Lammertyn，L.Michiels，reMelting curve analysis as a tool for enrichment monitoring in the SELEXprocess.Analyst 139，589(Dec 23，2013).

发明内容

本发明建立了根据荧光定量PCR扩增曲线来判断文库复杂程度的方法，可以很好的克服现有方法的缺点。根据本发明可以检测SELEX实验中任意一轮筛选有效性，不仅可以看到每一轮文库的复杂程度，也可以比较几个文库之间的复杂程度差异，方便的应用到筛选的进程监测中。

本发明的原理：SELEX筛选时扩增的模板为复杂模板而并非单一模板，当PCR扩增曲线达到平台期之后，变性完退火时可能会出现两条链并不能完全互补配对的情况，即只有引物区配对，中间随机区域无法配对，此时PCR产物能结合的染料数量相比完全配对时有所减少，故会出现荧光值下降的趋势。随着筛选的进行，文库的复杂程度降低，富集程度增加， PCR产物的两条链分开之后再次完全配对的概率增加，因此扩增曲线平台期的荧光值会表现出由最开始几轮的降低而变为平缓或者上升。即扩增曲线在达到平台期之后的曲线，横坐标任一循环数对应的点求导计算斜率比上一轮的数值大，说明文库的复杂程度降低，有富集，该轮筛选有效。如果扩增曲线在平台期已经变得很平缓或者上升，即斜率的数值大于或者等于0，提示该轮的文库的库容已经很小了，可以选择停止筛选并将该轮文库检测亲和力，若仍旧没有亲和力，则预示着筛选失败，可尽早寻找其它的解决方法，避免投入更多的时间和精力以及耗材。本发明的方法简单易读，仪器直接给出结果，不会模棱两可。经过后期的亲和力检测，以及高通量测序验证，证实该方法简单可靠。

在一些实施方案中，本发明提供一种确定或监测核酸文库复杂程度的方法，所述方法包括以下步骤：

1)以文库中的核酸为模板进行PCR扩增，获得扩增曲线，

2)当曲线达到平台期后，将扩增曲线对扩增循环数求导，导数值越小，指示库容越大。

在一些实施方案中，本发明的方法可以确定或监测RNA文库的复杂程度。例如，当对RNA文库进行分析时，所述方法还可以包括将RNA文库反转录成cDNA文库，以反转录成的cDNA文库为模板进行PCR扩增，获得扩增曲线。

在一些实施方案中，本发明方法中的核酸模板是复杂模板，优选的所述核酸文库的复杂程度是变化的。例如，随着筛选的进行，文库的复杂程度降低。在一些实施方案中，随着文库的复杂程度降低，富集程度增加，扩增曲线则会表现出由最开始几轮的在达到平台期之后会降低而变为达到平台期之后变平缓或者上升。在一些实施方案中，扩增曲线纵坐标达到平台期之后的曲线，对于横坐标任一循环数对应的点求导计算斜率比上一轮的数值大，指示文库的复杂程度降低，有富集，由此指示该轮筛选有效。在一些实施方案中，如果扩增曲线在达到平台期后已经变得很平缓或者上升，即对于扩增曲线达到平台期之后的曲线，斜率的数值大于或者等于0，指示该轮的文库的库容已经很小了，由此指示可以选择停止筛选。在一些实施方案中，对于扩增曲线纵坐标达到平台期之后的曲线，斜率的数值大于或者等于0，指示该轮的文库的库容小，由此可以将该轮文库检测亲和力；在一些实施方案中，此时若仍旧没有亲和力，则指示筛选失败。如本领域技术人员所知，在PCR扩增曲线中，横坐标和纵坐标可以分别表示循环数和荧光强度或者分别表示扩增时间和荧光强度。

在一些实施方案中，本发明的方法包括将不同样品放在相同PCR条件下进行扩增。所述相同条件可以是例如相同的PCR扩增体系，相同的 DNA聚合酶，相同的PCR扩增条件和/或相同仪器。在一些实施方案中，本发明方法中的文库的扩增产物长度相同。

在一些实施方案中，本发明方法中的PCR可以通过荧光定量PCR进行。在一些实施方案中，进行荧光定量PCR的荧光染料不受特别限制，例如可以包括双链结合染料，例如EvaGreen染料、LC Green染料、SYBR Green染料或SYT09染料。

在一些实施方案中，本发明提供一种改进的SELEX方法，所述方法包括本文描述的方法确定或监测核酸文库复杂程度。SELEX方法包括以下两个过程的多轮重复：1)使用亲和技术将高亲和性的核酸适配体从低亲和性核酸适配体中分离或筛选出来，以及2)使用PCR扩增所筛选出的核酸适配体。

在一些实施方案中，本发明的方法包括根据确定或监测的核酸文库的复杂程度对于每轮SELEX筛选的有效性进行判定，对于文库富集程度进行判定，和/或对筛选终点进行判定。例如，如上文所述，随着文库的复杂程度降低，富集程度增加，扩增曲线则会表现出由最开始几轮的在达到平台期之后会降低而变为后面几轮在达到平台期之后变平缓或者上升。因此，在一些实施方案中，扩增曲线纵坐标达到平台期之后的曲线，对于横坐标任一循环数对应的点求导计算斜率比上一轮的数值大，指示文库的复杂程度降低，有富集，由此指示该轮筛选有效。在一些实施方案中，如果扩增曲线在达到平台期后已经变得很平缓或者上升，即斜率的数值大于或者等于0，指示该轮的文库的库容已经很小了，由此指示可以选择停止筛选。在一些实施方案中，对于扩增曲线达到平台期之后的曲线，斜率的数值大于或者等于0，指示该轮的文库的库容小，由此可以将该轮文库检测亲和力；在一些实施方案中，此时若仍旧没有亲和力，则指示筛选失败。

在一些实施方案中，本发明的方法包括以扩增后的双链制备成单链作为次级文库，重复进行筛选的步骤，例如重复1-20轮，包括重复进行1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20轮。在一些实施方案中，如果需要，本发明的方法可以重复进行更多轮，例如大于20轮。在一些实施方案中，在文库的库容简单(例如，对于扩增曲线达到平台期之后的曲线，斜率的数值大于或者等于0)时停止筛选。

在一些实施方案中，本发明提供一种获得核酸适配体的方法，所述本文描述的改进的SELEX方法进行。在一些实施方案中，在文库的库容简单(例如，对于扩增曲线达到平台期之后的曲线，斜率的数值大于或者等于0)时停止筛选。在一些实施方案中，本文描述的方法还包括检测亲和力的步骤。在一些实施方案中，本文描述的包括对获得的核酸适配体测序的步骤。核酸适配体是指对靶分子具有特异性结合的核酸分子。核酸适配体可包含任何合适数目的核苷酸，可包含标签。如果适配体包含标签，适配体的所有拷贝可以具有相同标签或不同标签。适配体可以是ssDNA、 dsDNA、RNA或DNA和RNA组合。在一些实施方案中，本发明提供了包含所述核酸适配体文库或本发明实施方案的微阵列芯片。

在一些实施方案中，本发明提供了利用本发明的方法识别与靶标结合的核酸适配体的方法。在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：a) 提供包含多个适配体候选物的文库，b)在允许适配体文库成员与靶标结合的缓冲条件下使适配体文库接触靶标；c)以文库中与靶标结合的核酸为模板进行PCR扩增，获得扩增曲线，将扩增曲线对扩增循环数求导数，获得文库的复杂性值，根据复杂性值判断是否重复进行筛选。在一些实施方案中，本发明的方法包括分离至少一个被靶标结合的适配体文库分子，和/或测定被结合的适配体候选物的可变序列。在一些实施方案中，所述方法包括在步骤b)之后的扩增步骤。在一些实施方案中，上述识别与靶标结合的适配体的方法包含在接触步骤之后的漂洗步骤，其中不与靶标结合的适配体候选物通过缓冲液被漂洗掉。在一些实施方案中，本发明提供的获得核酸适配体的方法包括以下步骤：(a)在有利于结合的条件下使适配体文库成员与靶标接触；(b)从特异性结合于靶分子的核酸区分未结合的核酸；(c)解离核酸-靶复合物；(d)扩增从核酸-靶复合物解离的核酸，以产生富含适配体的混合物；和(e)重复结合、区分、解离和扩增的步骤，重复产生靶分子的高度特异性、高亲和力核酸适配体所需的循环数。在选择RNA适配体的情况下，所述方法进一步包括以下步骤：(i)在步骤(d)的扩增前逆转录从核酸-靶复合物解离的核酸；和(ii)在重新开始该过程前，转录来自步骤(d)的扩增的核酸。在一些实施方案中，本发明的方法包括以文库中的核酸为模板进行PCR扩增，获得扩增曲线，将扩增曲线对扩增循环数求导数，获得文库的复杂性值，根据复杂性值判断是否重复进行上述筛选步骤。

本发明的SELEX方法可用于筛选对各种靶标表现出期望亲和力的核酸适配体。例如，靶标包括蛋白质如凝血酶、DNA聚合酶、氨基酸如色氨酸等。在一些实施方案中，适合作为靶标的物质包括但不限于蛋白质或多肽、糖类、脂类、药剂、非药剂或者高分子复合物。在一些实施方案中，靶标包括病毒、细胞表面的肽等。靶标可被固定在固相支持物上。在一些实施方案中，靶标可能包含标记物。在一些实施方案中，适配体与靶标具有亲和力，例如适配体以Kd小于100nM的结合解离常数与靶标结合，以 Kd在0.1μM至100μM之间的结合解离常数与靶标结合，以Kd在0.1mM 至1000mM之间的结合解离常数与靶标结合。在一些实施方案中，适配体可以从包括15至120个核苷酸长度的完全随机化的适配体候选物开始连续数轮富集候选适配体。

在一些实施方案中，本发明提供所述方法在自动化筛选中文库复杂程度判断的应用。在一些实施方案中，本发明提供所述方法在监测文库复杂程度其它方面的应用。在一些实施方案中，本发明提供所述方法可以用于比较不同文库复杂程度方面的差异。

在一些实施方案中，本文描述的方法可以是自动化方法，例如可以用于自动化方法中。在一些实施方案中，可以利用计算机程序进行本文所述任何方法的一个或多个步骤。在一些实施方案中，本发明包括计算机程序执行的步骤。在一些实施方案中，本发明包括一种计算机可读存储介质，其上存储有可执行指令，所述指令在由一个或多个处理器执行时，可以使所述一个或多个处理器执行本发明方法的一步或多步操作。例如，在一些实施方案中，当所述指令在由一个或多个处理器执行时，可以使所述一个或多个处理器执行以下操作：1)以文库中的核酸为模板进行PCR扩增，获得扩增曲线，2)将扩增曲线达到平台期后对扩增循环数求导数。在一些实施方案中，当所述指令在由一个或多个处理器执行时，可以使所述一个或多个处理器执行以下操作：根据获得的导数，输出库容指示，例如，当曲线达到平台期后，将扩增曲线对扩增循环数求导，导数值越小，指示库容越大；或者例如当曲线达到平台期之后，将扩增曲线对扩增循环数求导数，在导数达到最高值之后，导数值下降越多，指示库容越大；下降越少或处于0或以上，指示库容越小。在一些实施方案中，当所述指令在由一个或多个处理器执行时，可以使所述一个或多个处理器执行以下操作：根据确定或监测的核酸文库的复杂程度，输出对于每轮筛选的有效性进行判定，对于文库富集程度进行判定，和/或对筛选终点进行判定的结果。在一些实施方案中，当所述指令在由一个或多个处理器执行时，可以使所述一个或多个处理器执行以下操作：根据确定或监测的核酸文库的复杂程度，指示以筛选获得文库为起始文库，重复进行筛选的步骤，例如重复1-20轮。在一些实施方案中，当所述指令在由一个或多个处理器执行时，可以使所述一个或多个处理器执行以下操作：当在文库的库容简单时，指示停止筛选，和/或指示检测亲和力、对获得的核酸适配体测序等。

因此，在一些实施方案中，本发明提供一种电子设备，包括：存储器，用于存储可执行指令；以及处理器，用于执行存储器中存储的可执行指令，以执行上述一步或多步操作。

图9是示出了示例硬件布置500的框图。硬件布置500包括处理器 506。处理器506可以是用于执行本文描述的流程的不同动作的单一处理单元或者是多个处理单元。布置500还可以包括用于从其他实体接收信号的输入单元502、以及用于向其他实体提供信号的输出单元504。输入单元502和输出单元504可以被布置为单一实体或者是分离的实体。此外，布置500可以包括具有非易失性或易失性存储器形式的至少一个可读存储介质508，例如EEPROM、闪存、和/或硬盘驱动器。可读存储介质508 包括计算机程序510，该计算机程序510包括代码/计算机可读指令，其在由布置500中的处理器506执行时使得硬件布置500可以执行例如上面所描述的流程及其任何变形。计算机程序510可被配置为具有例如计算机程序模块510A，模块510B，模块510C架构的计算机程序代码，用于执行上文描述的步骤。在备选实施例中，该代码中的至少一项可以至少被部分地实现为硬件电路。处理器可以是单个CPU，但也可以包括两个或更多个处理单元。计算机程序可以由连接到处理器的计算机程序产品来承载。计算机程序产品可以包括其上存储有计算机程序的计算机可读介质。例如，计算机程序产品可以是闪存、随机存取存储器(RAM)、只读存储器 (ROM)、EEPROM，且上述计算机程序模块在备选实施例中可以用UE 内的存储器的形式被分布到不同计算机程序产品中。这些计算机程序指令可以提供给通用计算机、专用计算机或其他可编程数据处理装置的处理器，从而这些指令在由该处理器执行时可以创建用于实现这些功能/操作的装置。另外，本公开的技术可以采取存储有指令的计算机可读介质上的计算机程序产品的形式，该计算机程序产品可供指令执行系统使用或者结合指令执行系统使用。

附图说明

图1，筛选链霉亲和素五轮的扩增曲线比较：从第四轮开始扩增曲线出现明显的变化，在达到平台期之后荧光值不再降低，反而升高，说明第四轮的文库复杂程度明显降低。

图2，筛选Taq酶六轮的扩增曲线比较：从第四轮开始扩增曲线在达到平台期之后降低变缓，第六轮开始升高，说明第四轮的文库复杂程度降低，到第六轮已经明显富集。

图3，筛选COPEPTIN小肽六轮的扩增曲线比较：从第四轮开始扩增曲线出现明显的变化，在达到平台期之后不再降低，说明第四轮的文库复杂程度明显降低。

图4，筛选Cocaine小分子八轮的扩增曲线比较：从第八轮开始扩增曲线出现明显的变化，在达到平台期之后不降反升，说明第八轮的文库复杂程度明显降低。

图5，筛选COPEPTIN小肽时得到的六轮的文库，用不同的酶扩增，比较不同的酶扩增的扩增曲线，发现趋势基本保持一致。说明本专利的方法具有普适性。

图6，筛选COPEPTIN小肽时得到的六轮的文库，荧光定量PCR扩增时候使用不同的体积，比较不同的体积是否会让扩增曲线发生变化，结果是不同体积得到的扩增曲线保持高度一致。说明本专利的方法不受扩增体积的影响。

图7，筛选COPEPTIN小肽时得到的六轮的文库，荧光定量PCR扩增时候使用不同PCR程序，比较不同的程序是否会让扩增曲线发生变化。结果显示不同扩增程序得到的扩增曲线保持高度一致。

图8，将筛选COPEPTIN小肽时得到的六轮文库进行高通量测序，分析测序数据，得到最富集的10条序列，100条序列，以及1000条序列在总序列数中的占比，发现随着筛选进行文库序列的复杂程度不断降低，这说明本发明的方法，与高通量测序结果有很好的对应关系。

图9，可用于实施本发明的方法的示例硬件布置500的框图。

具体实施方式

为了弥补现有文库复杂程度监测手段的缺乏，本发明建立了根据荧光定量PCR扩增曲线来判断文库复杂程度的方法，并且将其应用到SELEX 筛选进程监测中，成功筛选到新的核酸适配体。我们建立的方法可以在每一轮筛选的PCR扩增步骤即可完成，PCR扩增时加入双链DNA结合的染料，当体系中的模板被扩增时，随着PCR的进行，双链DNA产物越来越多，结合的染料越来越多，被仪器检测到的荧光信号越来越强。SELEX 筛选时扩增的模板为复杂模板而并非单一模板，当荧光定量PCR扩增曲线达到平台期之后，变性后退火时可能会出现只有引物区配对，中间随即区域无法配对的情况，即两条链并不能完全互补配对，故会出现曲线下降的趋势。随着筛选的进行，文库的复杂程度降低，富集程度增加，扩增曲线则会表现出由最开始几轮的在达到平台期之后的降低而变为后面几轮在达到平台期之后变平缓或者上升，具体就是扩增曲线的纵坐标达到平台期之后的曲线，对横坐标任一循环数对应的点求导计算斜率的数值会慢慢变大，由负值变为零或正值，该方法操作简单，实时可靠，仪器自动判读，结果不会模棱两可。可以检测任意一轮筛选有效性，方便地应用到筛选的进程监测中，可应用到自动化筛选中。

本发明建立了一种根据荧光定量PCR扩增曲线来判断文库复杂程度的方法，包括：以DNA文库为模板进行荧光定量PCR扩增检测并记录扩增曲线，通过分析曲线来判断文库的复杂程度。具体方法为将扩增曲线纵坐标达到平台期之后的曲线，将扩增曲线对扩增循环数求导，导数会随库容复杂程度的变化而变化，如果导数值越小，说明库容越大；如果导数值处于0或以上，说明库容越简单。若初始模板为RNA，则先将RNA反转录成cDNA，再进行荧光定量PCR扩增。

在具体实施方案中，所述的荧光定量PCR体系可以包含例如：

所述的荧光染料可以为Eva Green染料、LC Green染料、SYBR Green 染料或SYT09染料等。

所述的荧光定量PCR扩增体系的反应条件可以为：第一阶段： 95～98℃预变性0.5-10min；第二阶段：95℃-98℃变性10s-30s，42-72℃退火10s-30s，72℃延伸10s-30s，共15-45个循环；

所述的用扩增曲线监测库容变化的方法为：SELEX筛选时扩增的模板为复杂模板而并非单一模板，当荧光定量PCR扩增曲线达到平台期之后，变性完退火时可能会出现两条链并不能完全互补配对，故会出现曲线下降的趋势。随着筛选的进行，文库的复杂程度降低，富集程度增加，扩增曲线则会表现出由最开始几轮的在达到平台期之后的降低而变为后面几轮在达到平台期之后变平缓或者上升。表现出来的就是将扩增曲线对扩增循环数求导，导数会依次由负值逐步升高，导数值下降越小，说明库容越大；如果导数值越大，如处于0或以上，库容越简单。

提供以下实施例以便更好地理解本发明而非限制本发明。以下实施例中的实验方法如无特殊说明均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买所得。

实施例1链霉亲和素核酸适配体筛选过程中库容监测结果

1.随机文库的设计与合成：设计合成两端包含有20个核苷酸(引物)，中间包括40个核苷酸随机序列的核酸序列文库如下：

5’AGCAGCACAGAGGTCAGATG(40N)

CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’

2.准备链霉亲和素磁珠(以下简称SA磁珠)：吸取50ul链霉亲和素磁珠(Invitrogen，DYNABEADS MYONE STREPTAVIDIN C1，货号： 65001)用水清洗2次，每次用200ul，清洗完备用。

3.孵育和清洗：用130ul结合缓冲液结合缓冲液(150mM NaCL，20 mM HEPES，1mMKCl，1mM GaCl2，1mM MgCl2，PH 7.4)稀释溶解 1OD上述的随机核酸文库(上海生工合成)至10uM，沸水煮10min使折叠的链解开，放在冰水中复性5min让DNA链重新折叠成不同的二级结构。将步骤2得到的SA磁珠50uL与经缓慢变复性处理的随机DNA核酸文库放置于垂直混合仪上孵育2小时，置于磁力架上，保留磁珠去掉上清，用结合缓冲液清洗磁珠3次，每次使用200ul。

4.分离：将上一步得到的磁珠加入100ul水；再放入95℃ PCR仪加热 10min，使链解离，14000rpm瞬离，置于磁力架上收集上清去除磁珠；

5.荧光定量PCR检测：取PCR mix，50ul体系，加入5％的EvaGreen 染料，加入模板扩增。MIX体系如下，扩增条件为95℃预变性3min， 95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，共30个循环， 72℃1min。正向引物：5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3′；反向引物：5’-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3′。

6.PCR扩增文库：以第四步获得的上清文库为模板扩增，将模板加入PCR mix中(配方同上)，共扩增2ml。引物由金斯瑞合成。正向引物： 5’6-FAM-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3′；反向引物：5’ AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-spacer18-TTCACGGTAGCACGCATAG G-3′。将上述混合好的体系分成100ul/管，扩增条件如下：95℃预变性3 min，95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，共20个循环，72℃1min，4℃保存。

7.扩增产物用乙醇沉淀：收集扩增产物，分装在5个2ml的EP管中，每管400uL，分别加入40uL乙酸钠(1/10体积)充分混匀；再加入800uL 预冷的无水乙醇(2倍体积)，充分混匀，放入-80℃冰箱冷冻1小时，12000g 离心10min，弃上清液；加750uL 70％乙醇清洗一次，12000g离心2min，弃上清液，重复清洗一次，烘干管内液体后加200uL结合缓冲液溶解沉淀并测浓度。

8.制备DNA单链文库

8.1.制胶：按照如下配方配制7M尿素变性聚丙烯酰胺凝胶：

加样前用移液枪上下吹打TBE缓冲液数次以彻底洗涤样品孔；

8.2加样：加样前使用TBE/Urea样品缓冲液：样品＝2：1，然后于95℃水浴加入10min，取出立即放入事先准备的冰水中冰浴2min，立即上样电泳；400V电压下电泳至溴酚蓝到达胶底部；

8.3电泳，切胶：将凝胶取出放在塑料膜上，激发波长495nm，发射波长517nm，检测我们需要的带有FAM标记的ssDNA；用干净的刀片将目的条带直接切下，切胶时注意带有polyA的ssDNA在目的条带上方，避免切到带有polyA的ssDNA。

8.4纯化：碎胶，加入1ml ddH₂O水浴将胶中的ssDNA转移至溶液中，使用试剂盒(上海生工SK1144)纯化回收ssDNA。

9.多轮筛选：将步骤8.4得到的DNA单链文库替代步骤3中的随机核酸文库，重复上述步骤2-8的过程，每次操作均以前一次操作中得到的次级文库为起始核酸文库，筛选过程中通过步骤5的荧光定量PCR的曲线判断筛选进程，见图1。当库容已经很单一时，可停止筛选，检测该轮文库与靶标的亲和力。经过亲和力测试验证，富集的文库具有明显的亲和力，表示筛选成功。文库的富集程度与亲和力成正相关。然后，将筛选得到的五轮文库进行高通量测序，并分析测序结果发现，本发明的方法得到的文库库容复杂性变化，与高通量测序结果有很好的对应关系。

所述筛选方法中，可逐轮增加筛选压力，以增进筛选核酸适配体的富集程度，缩短筛选进程。所述增加筛选压力包括减少投入的单链DNA文库的量、SA磁珠的用量和两者的孵育时间。

实施例2 Taq酶的SELEX筛选过程以及库容监测结果

1.随机文库的设计与合成

设计合成两端包含有20个核苷酸(引物)，中间包括40个核苷酸随机序列的有FAM标记的核酸序列文库如下： 5’-FAM-AGCAGCACAGAGGTCAGATG(40N) -CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’

2.SPR-SELEX筛选

2.1将Taq酶偶联到CM5芯片表面：先用50mM NaOH(含万分之五的SDS)清洗芯片两遍，每遍进样40ul、流速20ul/min。再用50mM NaOH 清洗芯片，进样20ul，流速10ul/min。然后用将等体积的EDC(0.4M水溶液；1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide)和NHS(0.1M水溶液； N-hydroxysuccinimide)混合后进样50ul活化芯片，流速5ul/min。将Taq 酶用pH 4.0的10mM醋酸钠稀释至终浓度为50μg/mL后进样，进样体积 80μL，流速5uL/min。进样完成后，进乙醇胺封闭芯片，流速5uL/min，进样50uL。进样30ul1mg/ml鲑鱼精DNA结合非特异性位点，流速 5ul/min。

2.2孵育：用结合缓冲液1X Taq buffer稀释溶解1OD上述的随机核酸文库至10uM，沸水煮10min使折叠的链解开，放在沸水中至水自然冷却到室温，缓慢复性让DNA链重新折叠成不同的二级结构。然后进样120 μL，流速2μL/min，使随机DNA核酸文库流经偶联有Taq酶的芯片表面。随后用缓冲液10μL/min，洗涤30min，将未结合的随机核酸文库洗掉。结合缓冲液配方为20mM HEPES，150mM NaCL，1mM KCl，1mM GaCl2， 1mM MgCl2；PH 7.4。

2.3分离：取出上述步骤2.2的芯片，用少量(少于5u1)5mM NaOH 洗脱结合在芯片表面的适配体，即为筛选所得的核酸适配体富集文库。

2.4荧光定量PCR检测：取不带荧光修饰的PCR mix，50ul体系，加入5％的EvaGreen染料，加入模板扩增。MIX体系如下，扩增条件为95℃预变性3min，95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，共30个循环，72℃1min。正向引物：5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG 3′；反向引物：5’-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3′。

2.5PCR扩增文库：5’端引物： 5’-FAM-AGCAGCACAGAGGTCAGATG，3’端引物： 5’-(20A)-link-TTCACGGTAGCACGCATAGG。两步扩增，将上述步骤2.3 的NaOH洗脱液作为模板，进行乳浊液PCR扩增，100μL PCR mix与1ml 矿物油混合后震荡产生乳浊液，将乳浊液分成50ul/管扩增25个循环，扩增产物用正丁醇纯化后作为模板再进行扩增2mL PCR mix，扩增循环数不超过18个循环，扩增条件为：95℃3min，95℃30sec，60℃30sec， 72℃30sec，扩增完成后用乙醇沉淀的方法回收扩增产物，烘干后得到的核酸用200μL 1X Taq buffer溶解。矿物油配方如下

2％(vol/vol)ABIL EM90 1ml

0.05％Triton X-100(#T-9284，Sigma) 25ul

mineral oil(#M-3516，Sigma) 至50ml

2.5.1正丁醇纯化步骤如下：收集扩增产物，每管用50uL正丁醇洗一次，并收集正丁醇于PCR产物里，最后用100uL正丁醇将PCR管逐一在洗一次，充分混匀后14000rpm离心10min，后小心去除上清；沉淀中再加入约1.5ml正丁醇充分混匀后，14000rpm离心10min，后小心去除上清；沉淀中加入1.5ml的无水乙醇，漩涡震荡，后14000rpm离心5min，后小心去除上清，65℃烘干。加入100uL 1X Taq buffer溶解沉淀，后以此为模板再进行扩增。

2.5.2乙醇沉淀步骤如下：乙醇沉淀PCR产物，将PCR产物分装在5 个2ml的EP管中，每管400uL，分别加入40uL乙酸钠(1/10体积)充分混匀；再加入800uL预冷的无水乙醇(2倍体积)，充分混匀，放入-80℃ 1h，12000g离心10min，弃上清液；加750uL 70％乙醇(1/2离心管容量)， 12000g离心2min，弃上清液，烘干管内液体后加200uL 1X Taq buffer溶解沉淀。

2.6单链制备：上述步骤2.5的双链产物按体积比1∶1加入TBE/尿素变性缓冲液，沸水浴15min，随后冰浴3min，将所有的样品进行变性PAGE 胶电泳，凝胶配方如下表所示，400V电压下电泳分离约20min，使加长的一条链与有FAM标记的链分开，切胶回收有FAM标记的链，将回收的胶捣碎，加入1ml ddH₂O水浴将胶中的ssDNA转移至溶液中，使用试剂盒(上海生工SK1144)纯化回收ssDNA，即为筛选得到的次级DNA单链富集文库；

3.磁珠法筛选

3.1将Taq酶偶联到磁珠上：取20ul磁珠用水清洗干净，使用EDC(0.4M 水溶液；1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide)和NHS(0.1M水溶液；N-hydroxysuccinimide)等体积混合后100ul与磁珠孵育15min，活化磁珠表面的羧基

Taq酶用pH5.0的10mM醋酸钠稀释至终浓度为50μg/mL后与活化后的磁珠混合，置于垂直混合仪上孵育30min，通过表面的氨基偶联到磁珠表面。

偶联结束，将管置于磁力架上，去掉上清并立即向磁珠中加入100ul pH8.5的1M乙醇胺.HCl，反应10min，封闭磁珠表面未反应的活化位点。置于磁力架上，移去封闭液，磁珠用1x Taq buffer清洗3次。

3.2孵育和清洗：用130ul结合缓冲液1X Taq buffer稀释溶解1 OD 上述的随机核酸文库至10uM，沸水煮10min使折叠的链解开，放在沸水中至水自然冷却到室温，缓慢复性让DNA链重新折叠成不同的二级结构。

将3.1得到的连有蛋白的磁珠2uL与经缓慢变复性处理的随机DNA 核酸文库放置于垂直混合仪上孵育1小时，置于磁力架上，保留磁珠去掉上清，用1X Taq buffer清洗磁珠6次，每次使用50ul。

3.3分离：将3.2得到的磁珠用沸水煮沸10min后收集上清，上清中得到的核酸分子即为筛选所得的核酸适配体一级富集文库；

3.4荧光定量PCR检测：取不带荧光修饰的PCR mix，50ul体系，加入5％的EvaGreen染料，加入模板扩增。MIX体系如下，扩增条件为 95℃预变性3min，95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸 30sec，共30个循环，72℃1min。正向引物： 5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3′；反向引物： 5’-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3′。

3.5PCR扩增文库：以3.3获得的次级文库为模板，第一步用乳浊液 PCR，矿物油配方如下

2％(vol/vol)ABIL EM90 1ml

0.05％Triton X-100(#T-9284，Sigma) 25ul

mineral oil(#M-3516，Sigma) 至50ml

将模板加入以下PCR mix中(配方同上)，正向引物： 5’-FAM-AGCAGCACAGAGGTCAGATG；反向引物： 5’-(20A)-link-TTCACGGTAGCACGCATAGG。将上述混合好的100μLmix 与1mL矿物油混合后用涡旋混合仪震荡产生乳浊液，将乳浊液分成50ul/管，扩增条件如下：95℃预变性3min，95℃变性30sec，60℃退火30 sec，72℃延伸30sec，共25个循环，72℃1min，4℃保存。扩增产物用正丁醇纯化(方法同2.5.1)，将纯化产物作为模板，加入2ml的PCR mix中，模板量加5％，95℃预变性3min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，扩增18个循环；72℃延伸1min，4℃保存。扩增产物有用乙醇沉淀纯化(方法同2.5.2)。

3.6单链制备：上述步骤2.5的双链产物按体积比1∶1加入TBE/尿素变性缓冲液，沸水浴15min，随后冰浴3min，将所有的样品进行变性PAGE 胶电泳，凝胶配方如下表所示，400V电压下电泳分离约20min，使加长的一条链与有FAM标记的链分开，切胶回收有FAM标记的链，将回收的胶捣碎，加入1ml ddH₂O水浴将胶中的ssDNA转移至溶液中，使用试剂盒(上海生工SK1144)纯化回收ssDNA，即为筛选得到的次级DNA单链富集文库；

4.多轮筛选：将步骤2.6和步骤3.6中得到的DNA单链文库替代步骤 2.2和3.2中的随机文库，SPR-SELEX筛选和磁珠法筛选交替进行，重复筛选，每次操作均以前一次操作中得到的次级文库为起始核酸文库，筛选过程中通过步骤2.4或者3.4的荧光定量PCR的扩增曲线判断筛选进程，结果见图2。当库容已经很单一时，可停止筛选，检测该轮文库与靶标的亲和力。经过亲和力测试验证，富集的文库具有明显的亲和力，表示筛选成功。文库的富集程度与亲和力成正相关。然后，将筛选得到的六轮文库进行高通量测序，并分析测序结果发现，本发明的方法得到的文库库容复杂性变化，与高通量测序结果有很好的对应关系。

所述筛选方法中，可逐轮增加筛选压力，以增进筛选核酸适配体的富集程度，缩短筛选进程。所述增加筛选压力包括减少投入的单链DNA文库的量、靶标蛋白的用量和两者的孵育时间。

实施例3 COPEPTIN小肽SELEX筛选过程中库容监测结果

1.随机文库的设计与合成：设计合成两端包含有20个核苷酸(引物)，中间包括40个核苷酸随机序列的有FAM标记的核酸序列文库如下： 5’FAM-AGCAGCACAGAGGTCAGATG(40N) CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’

2.靶标与文库孵育：加结合缓冲液(150mM NaCL，20mM HEPES， 1mM KCl，1mMGaCl₂，1mM MgCl₂，PH 7.4)稀释溶解1OD上述的随机核酸文库(上海生工合成)至2uM，沸水煮10min使折叠的链解开，放在冰水中复性5min让DNA链重新折叠成不同的二级结构。将COPEPTIN小肽(是有生物素修饰的)加入到文库中，小肽终浓度为2uM。室温孵育2小时。

3.超滤：使用超滤管(Millipore Ultra 0.5ml 10K)浓缩，将步骤2中的文库和小肽的混合物分三次加到超滤管中，每次14000g离心5分钟，弃滤过液。超滤管截留大约100ul液体。

4.清洗：加入400ul PBS到超滤管中，14000g离心5分钟，弃滤过液，超滤管截留大约100ul液体。重复操作三次。

5.准备链霉亲和素磁珠(以下简称SA磁珠)：吸取25ul链霉亲和素磁珠(Invitrogen，DYNABEADS MYONE STREPTAVIDIN C1，货号： 65001)用PBS清洗2次，每次用200ul，清洗完加入100ul PBS重悬后备用。

6.将步骤5得到的SA磁珠与步骤4超滤管中的截留液混合，旋转混合20min后置于磁力架上回收SA磁珠，弃上清。用PBS清洗磁珠4次，每次200ul。将获得的磁珠加入100ul水，95℃加热15min后收集上清，作为扩增的模板。

7.Q-PCR检测：取不带荧光修饰的PCR mix，50ul体系，加入5％的 EvaGreen染料，模板按照如下条件扩增，95℃预变性3min，95℃变性 30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，共30个循环，72℃1min。

8.PCR扩增文库：以上一步获得的上清文库为模板扩增，将模板加入以下PCR mix中，共扩增2ml。引物由金斯瑞合成。正向引物： 5’6-FAM-AGCAGCACAGAGGTCAGATG 3′；反向引物：5’ AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-spacer18-TTCACGGTAGCACGCATAG G-3′。扩增条件如下：95℃预变性3min，95℃变性30sec，60℃退火 30sec，72℃延伸30sec，共25个循环，72℃1min，4℃保存。

9.扩增产物用乙醇沉淀：收集扩增产物，分装在5个2ml的EP管中，每管400uL，分别加入40uL乙酸钠(1/10体积)充分混匀；再加入800uL 预冷的无水乙醇(2倍体积)，充分混匀，放入-80℃冰箱冷冻1小时，12000g 离心10min，弃上清液；加750uL 70％乙醇清洗一次，12000g离心2min，弃上清液，重复清洗一次，烘干管内液体后加200uL结合缓冲液溶解沉淀并测浓度。

10.制备DNA单链文库

10.1制胶：按照如下配方配制7M尿素变性聚丙烯酰胺凝胶：

10.2加样：加样前使用TBE/Urea sample buffer：样品＝1∶1，然后于 95℃水浴加入10min，取出立即放入事先准备的冰水中2min，立即上样电泳；400V电压下电泳至溴酚蓝到达胶底部；

10.3电泳，切胶：将凝胶取出放在塑料膜上，激发波长495nm；发射波长517nm，检测我们需要的带有FAM标记的ssDNA；用干净的刀片将目的条带直接切下(切胶时注意带有polyA的ssDNA在目的条带上方，避免切到带有polyA的ssDNA)

10.4纯化：碎胶，加入1ml ddH₂O水浴将胶中的ssDNA转移至溶液中，使用试剂盒(上海生工SK1144)纯化回收ssDNA。

11.多轮筛选：将步骤10.4得到的DNA单链文库替代步骤2中的随机核酸文库，重复上述步骤2-10的过程，每次操作均以前一次操作中得到的次级文库为起始核酸文库，筛选过程中通过步骤7的Q-PCR的曲线判断筛选进程，见图3。经过亲和力测试验证，富集的文库具有明显的亲和力，表示筛选成功。文库的富集程度与亲和力成正相关。然后，将筛选得到的六轮文库进行高通量测序，并分析测序结果发现，本发明的方法得到的文库库容复杂性变化，与高通量测序结果有很好的对应关系。

实施例4 Cocaine适配体筛选过程中库容监测结果

1.随机文库的设计与合成：设计合成两端包含有20个核苷酸(引物)，中间包括40个核苷酸随机序列的有FAM标记的核酸序列文库，文库以及引物信息如下：

2.文库固定到链霉亲和素磁珠上：取100ul文库(浓度为1uM，DPBS 溶解)到PCR管中，加引物S1CS(100uM，DPBS溶)2uL，离心混匀。放入 PCR仪进行缓慢变复性。程序为：95℃10min，0.1℃/sec降温到60℃1min，再次0.1℃/sec降温到25℃。取100ul链霉亲和素磁珠(货号同实例3)，用200ul DPBS清洗磁珠，重复5遍。用磁铁垂钓磁珠，除上清。将文库加入到SA beads中，室温摇床孵育0.5h。用磁铁垂钓磁珠，除上清。用 DPBS清洗6遍，每遍200ul。用磁铁垂钓磁珠，除上清。

3.小分子靶标Cocaine与连有文库的磁珠孵育：加入100ul Cocaine溶液(2uLCocaine加到98ulDPBS中，Cocaine终浓度为100uM)到连有文库的SA beads中。混匀，室温摇床孵育1h。

4.磁铁垂钓磁珠，回收上清，上清即为扩增的模板。

5.Q-PCR检测：同实例3

6.PCR扩增文库：以步骤4获得的上清文库为模板扩增，将模板加入以下PCR mix中，共扩增2ml。扩增条件如下：95℃预变性3min，95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，共25个循环，72℃ 1min，4℃保存。

7.正丁醇浓缩PCR产物：收集扩增产物，加入5倍体积的正丁醇充分震荡混匀；9000rpm离心10min，弃上清液；

8.制胶及电泳：按照如下配方配制7M尿素变性聚丙烯酰胺凝胶，加样前使用TBE/Urea sample buffer：样品＝1∶1的比例，将步骤7得到的双链与上样缓冲液混匀，然后于95℃水浴加入10min，取出立即放入事先准备的冰水中2min，立即上样电泳；400V电压下电泳至溴酚蓝到达胶底部；

名称	体积/质量
		Urea	3.78g
40％聚丙烯酰胺	1.8ml
		5*TBE	1.8ml
ddH<sub>2</sub>O	2.25ml
		10％APS	60ul
TEMED	15ul

9.切胶及纯化单链：将凝胶取出放在塑料膜上，激发波长495nm：495；发射波长517nm检测我们需要的带有FAM标记的ssDNA；用干净的刀片将目的条带直接切下(切胶时注意带有polyA的ssDNA在目的条带上方，避免切到带有polyA的ssDNA)，碎胶，加入1ml ddH₂O水浴将胶中的 ssDNA转移至溶液中，使用3KD的超滤管离心，9000rpm离心10min，纯化回收ssDNA即为次级文库。

10.多轮筛选：将步骤9得到的DNA单链文库替代步骤2中的随机核酸文库，重复上述步骤2-9的过程，每次操作均以前一次操作中得到的次级文库为起始核酸文库，筛选过程中通过步骤5的Q-PCR的曲线判断筛选进程，见图4。经过亲和力测试验证，富集的文库具有明显的亲和力，表示筛选成功。文库的富集程度与亲和力成正相关。然后，将筛选得到的八轮文库进行高通量测序，并分析测序结果发现，本发明的方法得到的文库库容复杂性变化，与高通量测序结果有很好的对应关系。

实施例5使用不同的酶，检测实例3中COPEPTIN小肽SELEX筛选过程的每一轮文库的库容变化。

1.将实施例3中得到的COPEPTIN每一轮筛选文库测定浓度后，稀释到一样的浓度，并作为模板使用不同的酶扩增，比较文库的复杂程度。

2.使用的酶包括Bio rad公司的DNA聚合酶，上海生工的Pfu聚合酶， Tiangen的DNA聚合酶，Roche的DNA聚合酶， High-Fidelity DNA Polymerase，具体扩增的程序以及PCR mix的配制见下表

3.扩增30个循环后得到的曲线如图6。不同的酶扩增得到的曲线趋势保持一致。

实施例6使用不同的体系，检测实例3中COPEPTIN小肽SELEX 筛选过程的每一轮文库的库容变化。

1.将实施例3中得到的COPEPTIN每一轮筛选文库测定浓度后，稀释到一样的浓度，并作为模板使用不同的体积扩增，比较文库的复杂程度。

2.分别使用Roche的DNA聚合酶以及Pfu DNA聚合酶配制PCR mix，按照下表配制

3.将配制好的mix分别按照20ul/管和50ul/管的体积，按照95度180s 预变性；95℃30s，60℃30s，72℃30s扩增30个循环后得到的曲线如图5。不同的体积对扩增曲线的影响不大，曲线的形状保持一致。

实施例7使用不同的扩增程序，检测实例3中COPEPTIN小肽SELEX 筛选过程的每一轮文库的库容变化。

1.将实施例3中得到的COPEPTIN每一轮筛选文库测定浓度后，稀释到一样的浓度，并作为模板使用不同的程序扩增，比较文库的复杂程度。

将配制好的mix分别按照50ul/管的体积，扩增时分别按照按照95度 180s预变性；95℃30s，60℃30s，72℃30s扩增30个循环以及95℃10s， 60℃10s，72℃10s扩增30个循环后得到的曲线如图7。不同的PCR程序对扩增曲线的影响不大，曲线的形状基本保持一致。

实施例8.通过高通量测序检测实例3中COPEPTIN小肽SELEX筛选过程的每一轮文库的库容

1.将实施例3中得到的COPEPTIN每一轮筛选文库测定浓度后，稀释到同样的浓度，并分别作为模板扩增，扩增时使用的正向引物带有不同的标签，标签引物及对应的模板见下表。扩增条件同实施例3步骤8。

2.将扩增得到PCR产物混合到一起，用试剂盒纯化(上海生工： SK1144)，然后进行高通量测序。得到的六轮文库的高通量测序数据，分析最富集的前10条序列，前100条序列，以及前1000条序列在总序列中的占比，结果见图8，分析结果显示文库的复杂程度与本方法中荧光定量 PCR曲线给出的判断一致。

Claims

1.一种确定或监测核酸文库复杂程度的方法，所述方法包括以下步骤：

1)以文库中的核酸为模板进行PCR扩增，获得扩增曲线，

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述文库为RNA文库，所述方法还包括将RNA文库反转录成cDNA文库，以反转录成的cDNA文库为模板PCR扩增，获得扩增曲线。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中核酸模板是复杂模板，优选的所述核酸文库的复杂程度是变化的，例如是随着筛选而降低的。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述方法包括将不同样品放在相同PCR条件下进行扩增，优选的所述文库的扩增产物长度相同。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述PCR为荧光定量PCR，优选的所述荧光定量PCR的荧光染料包括双链结合染料，例如Eva Green染料、LC Green染料、SYBR Green染料或SYT09染料。

6.一种改进的SELEX方法，所述方法包括通过权利要求1-5中任一项的方法确定或监测核酸文库复杂程度的步骤。

7.根据权利要求6所述的方法，所述方法还包括根据确定或监测的核酸文库的复杂程度对于每轮筛选的有效性进行判定，对于文库富集程度进行判定，和/或对筛选终点进行判定。

8.权利要求6或7所述的方法，其中所述方法包括以筛选获得文库为起始文库，重复进行筛选的步骤，例如重复1-20轮，优选的在文库的库容简单时停止筛选。

9.一种获得核酸适配体的方法，所述方法通过权利要求6-8任一项的改进的SELEX方法进行。

10.权利要求1-9任一项的方法，其中所述方法用于自动化方法中。