CN106124500B - 一种用菁染料可视化识别转铁蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用菁染料可视化识别转铁蛋白的方法，菁染料与不同构象的转铁蛋白在溶液中相互作用，导致菁染料形成不同的超分子聚集体，能够在吸收光谱中表现出不同的特征信号，从而通过吸收光谱中特征峰对应的波长范围以及菁染料与不同种类的转铁蛋白相互作用的溶液的颜色变化，直观的判断转铁蛋白的种类及构象。该方法通过以不同转铁蛋白自身结构为条件诱导调控一种菁染料超分子聚集体达到可视化识别不同构象的转铁蛋白，建立了菁染料聚集体识别转铁蛋白构象的谱学特征指标。
Description
技术领域
本发明涉及一种用菁染料可视化识别转铁蛋白的方法。
背景技术
转铁蛋白(Transferrin，Tf)是一种单链糖基化β-球蛋白，是细胞生长和增殖所必需的血清糖蛋白，由670-700个氨基酸组成，分子量约80kDa。转铁蛋白的C端及N端分别含有一个铁结合位点，Fe3+的吸收和释放的过程等同于蛋白构象开放与闭合的过程。按含铁数目，转铁蛋白包括：单铁转铁蛋白、脱铁转铁蛋白和双铁转铁蛋白。转铁蛋白的构象是发挥其生理功能的结构基础，其特定构象的识别研究对于探究转铁蛋白的功能具有非常重要的研究价值。转铁蛋白及转铁蛋白受体在药物运输和临床上已得到越来越多的应用，并引起广泛的关注，由于富集于肿瘤细胞表面的转铁蛋白受体只能识别闭合构象的含铁转铁蛋白，转铁蛋白的特异性识别问题则成为其在药物靶向治疗方面的重要因素。目前文献报道的研究转铁蛋白构象问题的方法主要以研究转铁蛋白本身的核磁共振、荧光光谱、圆二色谱和吸收光谱的变化为主。然而这些方法并不能简便直观地分辨某种构象的转铁蛋白，所以开发一种操作简单、可视化的检测特定转铁蛋白的新方法十分具有意义。
发明内容
本发明解决的技术问题是如何利用菁染料的颜色变化及吸收光谱的变化，实现对不同构象转铁蛋白的识别。
根据本发明所述的用菁染料可视化识别转铁蛋白的方法，其中所述的菁染料为式I的化合物：
菁染料在无金属离子存在下其聚集形式受温度和pH的影响，但在一定温度和pH范围内特定生物大分子对菁染料聚集体的诱导调控方式不会出现太大改变，能够通过菁染料的聚集状态反映生物大分子的结构特征。单铁转铁蛋白的特殊构象(只有一端结构域处于开放状态)对菁染料超分子具有诱导调控作用，当菁染料中加入一定浓度的单铁转铁蛋白，菁染料J-聚集体(蓝色)随着蛋白浓度增加逐渐转化为H-聚集体(粉色)，J-聚集体的解聚及H-聚集体的形成可作为菁染料可视化识别具有特殊构象的单铁转铁蛋白的特征信号；具有完全开放构象的脱铁转铁蛋白仅诱导菁染料形成J-聚集体(蓝色)且不易解聚，这一点可作为菁染料识别脱铁转铁蛋白的特征信号；具有完全闭合构象的双铁转铁蛋白可以诱导菁染料H-聚集体(粉色)与J聚集体同时存在(粉蓝色)，并且在样品表观颜色上用裸眼不易区分，因此通过溶液样品比色可直接判断识别转铁蛋白的种类及构象。
通过吸收光谱表征了菁染料在不同转铁蛋白存在下的响应信号，吸收光谱转化信号与样品溶液的聚集状态颜色变化相一致，见附图1，2和3，并且转铁蛋白在菁染料出现吸收峰的波段没有吸收信号不会对聚集体的吸收峰造成干扰，说明通过比色方法可以直接实现可视化识别不同构象的转铁蛋白。
具体技术方案如下：
一种用菁染料可视化识别转铁蛋白的方法，其特征在于菁染料与不同构象的转铁蛋白在溶液中相互作用，导致菁染料形成不同的超分子聚集体，能够在吸收光谱中表现出不同的特征信号，从而通过吸收光谱中特征峰对应的波长范围以及菁染料与不同种类的转铁蛋白相互作用的溶液的颜色变化，直观地判断转铁蛋白的种类及构象。
转铁蛋白自身的构象不同，对菁染料的聚集状态的影响不同，构象开放的脱铁型转铁蛋白引起一种菁染料超分子聚集体，而构象为闭合状态的含铁转铁蛋白会引发另一种菁染料超分子聚集体。
所述构象完全开放的脱铁型转铁蛋白引起的菁染料超分子聚集体为J-聚集体，且不易解聚。
所述J-聚集体呈蓝色。
所述含铁转铁蛋白包括构象呈部分闭合的单铁转铁蛋白和构象呈完全闭合的双铁转铁蛋白。
随着所述构象呈部分闭合的单铁转铁蛋白的浓度增加，引起的菁染料超分子聚集体的状态由J-聚集体逐渐转化为H-聚集体。
所述H-聚集体呈粉红色。
随着所述构象呈部分闭合的单铁转铁蛋白的浓度增加，溶液颜色由蓝色逐渐转化为粉红色，标志着J-聚集体的解聚及H-聚集体的形成，这种颜色的变化可作为菁染料可视化识别单铁转铁蛋白的标志。
所述构象呈完全闭合的双铁转铁蛋白可以诱导菁染料的两种超分子聚集体，即：H-聚集体与J聚集体同时存在，但H-聚集体占主要比例，随着双铁转铁蛋白的浓度增加，样品的颜色没有明显变化，这可作为菁染料可视化识别双铁转铁蛋白的标志。
所述用菁染料可视化识别转铁蛋白的方法包括如下具体的步骤：
(1)用缓冲溶液溶解待测转铁蛋白，配制成转铁蛋白母液，置于4℃冰箱中备用；采用有机溶剂将菁染料配制成菁染料溶液。
(2)将转铁蛋白母液按不同摩尔比加入到相同体积的菁染料中，所述在溶液样本中待测转铁蛋白与菁染料的摩尔比为0.0005-6∶1，漩涡混匀，避光反应0.1小时，最后用缓冲溶液定容至所需体积在20-40℃下避光反应0.5-5小时，得到一系列待测溶液；
(3)待测样品比色直观监测；
(4)测量待测样品的吸收光谱，利用比色法分析菁染料对所测转铁蛋白的特征信号，从而判断转铁蛋白的种类及构象。
所述缓冲溶液选自不含金属离子的缓冲溶液。
所述有机溶剂选自甲醇或二甲基亚砜中的一种。
所述缓冲溶液为Tris-HCl缓冲溶液，浓度范围为5-100mmol/L，优选浓度为10mmol/L，所述pH值为6.5-7.4，优选pH值为6.85，所述菁染料溶液的浓度范围为2-10μmol/L，优选5μmol/L。
所述在溶液样本中待测转铁蛋白与菁染料的摩尔比为0.0005-6∶1，优选0.01-5∶1；所述反应温度为20-40℃，优选25-37℃；所述反应时间为0.5-5小时，优选2-3小时。
本申请的有益效果：
(1)通过转铁蛋白自身构象为模板对菁染料进行调控，在吸收光谱上菁染料对转铁蛋白的不同构象产生不同响应信号直接反映与转铁蛋白的反应特征。
(2)本申请利用菁染料聚集体作为探针，对转铁蛋白的结构十分敏感，并伴有聚集状态的变化，从而可实现对转铁蛋白构象的可视化检测，同时在紫外吸收光谱上表现出明显的聚集体变化信号。
(3)本申请所使用试剂组成成分简单，只需按比例配制即可检测，操作简捷且成本低廉，该体系为环境友好型的液体环境，体系无需引发剂、催化剂，反应简单易行。
附图说明
图1为菁染料在单铁转铁蛋白存在下的吸收光谱变化图
图2为菁染料在脱铁转铁蛋白存在下的吸收光谱变化图
图3为菁染料在双铁转铁蛋白存在下的吸收光谱变化图
具体实施方式
下面结合具体实施例对本申请做进一步说明，但本申请并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均可从商业途径而得。
实施例1：
将不同构象的转铁蛋白分别溶解在Tris-HCl缓冲溶液(10mmol/L，pH值为6.85)中得到蛋白母液，菁染料用甲醇溶解，形成染料溶液。菁染料中分别按比例加入不同构象的转铁蛋白，在溶液样本中待测转铁蛋白与菁染料的摩尔比为0.0005-5∶1，其中菁染料溶液浓度为5μmol/L，漩涡混匀，避光反应0.1小时后用缓冲溶液定容，在35℃下避光反应2小时，监测溶液样品的颜色变化并进行吸收光谱测试。
(1)在菁染料中逐渐加入单铁转铁蛋白，样品溶液颜色由粉红色→蓝色→粉色，吸收结果表明菁染料在535nm和660nm处表现出特征峰，当加入单铁转铁蛋白时，菁染料二聚体(535nm)逐渐消失，J-聚集体(660nm)吸收逐渐增加，当J-聚集体达到最大吸收时，继续增加蛋白浓度J-聚集体逐渐解聚并在480nm处逐渐形成H-聚集体。
(2)在菁染料中逐渐加入脱铁转铁蛋白，样品溶液颜色由粉红色→蓝色，吸收结果表明当加入脱铁转铁蛋白时，菁染料二聚体消失，J-聚集体形成且不易转化成其他聚集状态。
(3)在菁染料中逐渐加入双铁转铁蛋白，样品溶液颜色由粉红色→粉蓝色，吸收结果表明当加入双铁转铁蛋白时菁染料二聚体吸收基本保持不变且占主要比例，J-聚集体随着蛋白浓度的增加吸收强度有所增加。
实施例2：
将不同构象的转铁蛋白分别溶解在Tris-HCl缓冲溶液(5mmol/L，pH值为6.5)中得到蛋白母液，菁染料用甲醇溶解，形成染料溶液。菁染料中分别按不同比例加入不同构象的转铁蛋白，在溶液样本中待测转铁蛋白与菁染料的摩尔比为0.01-6∶1，其中菁染料溶液浓度为2μmol/L，漩涡混匀，避光反应0.1小时后用缓冲溶液定容，在20℃下避光反应5小时，监测溶液样品的颜色变化并进行吸收光谱测试。
测试部分的结论与实施例1中的结论相同。
实施例3：
将不同构象的转铁蛋白分别溶解在Tris-HCl缓冲溶液100mmol/L，pH值为7.4)中得到蛋白母液，菁染料用甲醇溶解，形成菁染料溶液。菁染料中分别按不同比例加入不同构象的转铁蛋白，在溶液样本中待测转铁蛋白与菁染料的摩尔比为0.5-3∶1，其中菁染料浓度为10μmol/L，漩涡混匀，避光反应0.1h后用缓冲溶液定容，在40℃下避光反应0.5小时，监测溶液样品的颜色变化并进行吸收光谱测试。
测试部分的结论与实施例1中的结论也相同。
实施例4：
将脱铁转铁蛋白和双铁转铁蛋白分别溶解到Tris-HCl缓冲溶液(10mmol/L，pH7.0)中得到蛋白母液，菁染料用甲醇溶解，然后将两种蛋白分别按不同摩尔比混合(保证总蛋白浓度为1μmol/L)加入到4μmol/L菁染料溶液中，在溶液样本中待测转铁蛋白与菁染料的摩尔比为0.25∶1，漩涡混匀后避光反应0.1小时，然后用缓冲溶液定容，在37℃避光反应2小时，监测溶液样品的颜色变化并进行吸收光谱测试。吸收结果发现随着脱铁转铁蛋白的比例逐渐增加，双铁转铁蛋白比例逐渐减少，菁染料逐渐从二聚体转化成J-聚集体，相应溶液颜色变化与吸收结果表现一致，说明在混合转铁蛋白中菁染料能够可视化监控呈开放构象的脱铁转铁蛋白的含量。
以上描述是对本发明申请的解释，不是对发明申请的限定，本发明所限定的范围参见权利要求，在本发明的保护范围之内，可以作任何形式的修改。
Claims (7)
1.一种用菁染料可视化识别转铁蛋白的方法，其特征在于菁染料与不同构象的转铁蛋白在溶液中相互作用，导致菁染料形成不同的超分子聚集体，能够在吸收光谱中表现出不同的特征信号，从而通过吸收光谱中特征峰对应的波长范围以及菁染料与不同种类的转铁蛋白相互作用的溶液的颜色变化，能够直观地判断转铁蛋白的种类及构象；
转铁蛋白包括构象完全开放的脱铁型转铁蛋白，构象呈部分闭合的单铁转铁蛋白和构象呈完全闭合的双铁转铁蛋白；转铁蛋白自身的构象不同，对菁染料的聚集状态的影响不同；
构象完全开放的脱铁型转铁蛋白引起的菁染料超分子聚集体为J-聚集体；
构象呈部分闭合的单铁转铁蛋白引起的菁染料超分子聚集体为H-聚集体；
构象呈完全闭合的双铁转铁蛋白诱导菁染料的两种超分子聚集体，即：H-聚集体与J聚集体同时存在。
2.根据权利要求1所述的用菁染料可视化识别转铁蛋白的方法，其特征在于所述构象完全开放的脱铁型转铁蛋白的浓度增加，引起的菁染料超分子聚集体为表观颜色呈蓝色的J-聚集体，且不易解聚。
3.根据权利要求1所述的用菁染料可视化识别转铁蛋白的方法，其特征在于随着所述构象呈部分闭合的单铁转铁蛋白的浓度增加，溶液颜色由蓝色逐渐转化为粉色，标志着J-聚集体的解聚及H-聚集体的形成，这种颜色的变化作为菁染料可视化识别单铁转铁蛋白的标志。
4.根据权利要求1所述的用菁染料可视化识别转铁蛋白的方法，其特征在于所述构象呈完全闭合的双铁转铁蛋白可以诱导菁染料的两种超分子聚集体，即：H-聚集体与J聚集体同时存在，并且随着双铁转铁蛋白的浓度增加，样品的颜色没有明显变化，这作为菁染料可视化识别双铁转铁蛋白的标志。
5.根据权利要求1-4任一项所述的用菁染料可视化识别转铁蛋白的方法，其特征在于所述方法包括如下具体的步骤：
(1)用缓冲溶液溶解待测转铁蛋白，配制成转铁蛋白母液，置于4℃冰箱中备用；采用有机溶剂将菁染料配制成菁染料溶液；
(2)将转铁蛋白母液按不同摩尔比加入到相同体积的菁染料溶液中，在溶液样本中待测转铁蛋白与菁染料的摩尔比为0.0005-6∶1，漩涡混匀，避光反应0.1小时，最后用缓冲溶液定容至所需体积在20-40℃下避光反应0.5-5小时，得到一系列待测溶液；
(3)待测样品比色直观监测；
(4)测量待测样品的吸收光谱，利用比色法分析菁染料对所测转铁蛋白的特征信号，从而判断转铁蛋白的种类及构象。
6.根据权利要求5所述的用菁染料可视化识别转铁蛋白的方法，其特征在于所述缓冲溶液选自不含金属离子的缓冲溶液，所述有机溶剂选自甲醇或二甲基亚砜中的一种。
7.根据权利要求6所述的用菁染料可视化识别转铁蛋白的方法，其特征在于所述有机溶剂为甲醇，所述缓冲溶液为Tris-HCl缓冲溶液，浓度范围为5-100mmol/L，pH值为6.5-7.4，所述菁染料溶液的浓度范围为2-5μmol/L。
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| CN201610737617.0A CN106124500B (zh) | 2016-08-29 | 2016-08-29 | 一种用菁染料可视化识别转铁蛋白的方法 |
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| 转铁蛋白对菁染料超分子的组装及调控研究;陈蕾;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》;20160315(第3期);第1.7-1.8，2.2.1-2.2.2 ,2.3.5，3.1.4节 |
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