CN111999274B - 一种基于mtc染料的血液未结合铁转铁蛋白的可视化检测方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于MTC染料的血液未结合铁转铁蛋白的检测方法,属于临床检测方法技术领域。将MTC染料与待测血液混合,血液中的未结合铁转铁蛋白增加时,可以诱导MTC聚集形式向J‑聚集体转变,从而使待测血液颜色变蓝,且在660nm处有最大吸光度峰值,通过待测血液颜色的变化判断血液中未结合铁转铁蛋白浓度的变化,通过待测血液吸光度的值计算血液中未结合铁转铁蛋白浓度,从而实现血液中未结合铁转铁蛋白的检测。本发明的检测方法只需使用MTC一种检测物质,步骤简便、干扰因素较少,从而使检测结果稳定。同时,本发明的检测方法伴随着可见的颜色变化,实现了基于MTC染料的血液未结合铁转铁蛋白的可视化检测。
Description
技术领域
本发明属于临床检测方法技术领域,涉及一种基于MTC染料的血液未结合铁转铁蛋白的可视化检测方法及应用。
背景技术
3,3'-二硫丙基-4,5,4',5'-二苯并-9-甲基硫碳菁三乙基铵盐(MTC)是一大类具有特殊结构的功能性荧光类化合物,它对环境变化非常敏感、聚集状态多样且不同聚集体因光学特性差异较大可以实现可视化,可以以生物大分子为模板进行自组装且该过程受生物大分子结构调控,因此在溶液和一些基质中可以自聚集成纳米级的超分子聚集体。通过利用MTC聚集体之间的相互转化来反映生物大分子的某些结构特性或作为特异性识别生物分子的探针。因此可以利用MTC的结构状态反映生物大分子的轻微构象变化,包括寡核苷酸、寡肽和蛋白质。MTC除了单体形式,还可以形成两种不同排列取向的二聚体,即H-聚集体和J-聚集体,通过改变某些因素,如溶液PH,温度等,聚集体之间可以实现H-聚集体单体J-聚集体之间的转化。并且MTC溶液的吸收带会随着聚集形式的变化进行蓝移(J-聚集体)和红移(H-聚集体),溶液中J-聚集体增加,溶液颜色变成蓝色,在660m处出现吸光度峰值,当溶液中H-聚集体增加,溶液颜色变成红色,在530m处出现吸光度峰值。
人体内绝大部分的铁都是由血清转铁蛋白(TRF)传递的。转铁蛋白是在肝脏中合成的,每1mol TRF可结合2mol Fe3+,在生理情况下,TRF分子仅有三分之一被铁饱和。血清转铁蛋白释放与结合铁的同时,伴随着转铁蛋白构象的变化,其吸收和释放铁离子的过程就是构象从完全闭合转变到完全开放的过程。没有结合铁的转铁蛋白是完全开放构象称为apo-tf,结合双铁的是完全闭合构象称为holo-tf,因此血清中转铁蛋白有三种存在状态,分别是单铁、双铁和无铁转铁蛋白。铁能否快速有效的运输到人体所需的部位,转铁蛋白起着至关重要的作用。检测转铁蛋白还具有以下临床意义:转铁蛋白主要可用于诊断贫血和监测治疗效果。其次转铁蛋白在急性时相反应中往往降低,因此可以作为炎症、恶性病变,肾病综合征辅助诊断指标,并且在肝脏疾病中,转铁蛋白的变化最明显。
市场上目前已有检测未结合铁转铁蛋白(apo-tf)浓度的试剂盒,其检测项目名称是不饱和铁结合能力(UIBC),检测apo-tf的基本原理是:在碱性pH条件下,血清中加入过量的已知浓度Fe3+,Fe3+与转铁蛋白结合位点特异结合,使apo-tf充分饱和。然后加入还原剂,将剩余的Fe3+还原成Fe2+,显色剂亚铁嗪与剩余的Fe2+反应生成络合物,检测560nm处吸光度即可得知剩余Fe2+的浓度。已知过量的铁离子浓度减去剩余未结合铁离子浓度就等于apo-tf的量,即不饱和铁结合能力(UIBC)。但此方法操作复杂、干扰因素较多,且结果不稳定。
但目前尚无基于MTC染料的血液未结合铁转铁蛋白检测方法相关报道。因此,建立一种基于MTC染料的血液中未结合铁转铁蛋白的检测方法具有重要的临床意义。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种基于MTC染料的血液未结合铁转铁蛋白检测方法、检测试剂盒及探针,以解决现有的检测方法操作复杂、干扰因素较多导致检测结果不稳定的问题。
为了达到上述目的,本发明采用以下技术方案予以实现:
一种基于MTC染料的血液未结合铁转铁蛋白的可视化检测方法,将MTC染料与待测血液混合后,观察混合体系颜色变化,若观察到混合体系颜色由红色变为蓝色,则判断血液未结合铁转铁蛋白浓度增加;若观察到混合体系颜色由红色变为紫红色,则判断血液未结合铁转铁蛋白浓度未发生变化。
进一步地,还包括计算待测血液未结合铁转铁蛋白的浓度的操作:测定混合体系在350nm~700nm下的吸光度值,根据吸光度值计算待测血液未结合铁转铁蛋白的浓度。
进一步地,根据660nm处的吸光度值计算血液未结合铁转铁蛋白浓度。
进一步地,MTC染料的浓度为2mmol/L。
进一步地,一种基于MTC染料的血液未结合铁转铁蛋白的可视化检测方法,包括以下步骤:
1)配制MTC染料溶液;
2)将待测血液离心分离,将分离出的血浆稀释;
3)将MTC染料溶液与步骤2)中稀释后的血浆混合、孵育,制得混合液;
4)观察混合液的颜色变化,若观察到混合液颜色由红色变为蓝色,则判断血液未结合铁转铁蛋白浓度增加;若观察到混合液颜色由红色变为紫红色,则判断血液未结合铁转铁蛋白浓度未发生变化。
进一步地,步骤3)中,MTC染料与稀释后的血浆的体积比为1:5。
进一步地,待测血液为EDTA抗凝全血。
MTC染料在制备识别未结合铁转铁蛋白的探针中的应用。
MTC染料在制备识别未结合铁转铁蛋白的试剂盒中的应用。
进一步地,所述试剂盒为检测抗凝全血中未结合铁转铁蛋白的试剂盒。
进一步地,所述试剂盒为快速检测或快速诊断肝脏疾病的试剂盒。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明公开了一种基于MTC染料的血液未结合铁转铁蛋白的可视化检测方法,将MTC染料与待测血液混合,当待测血液中的未结合铁转铁蛋白增加时,可诱导MTC染料的结构向J-聚集体转变,待测血液中J-聚集体增加使待测血液颜色变为蓝色,形成肉眼可见的颜色变化。本发明通过待测血液颜色的变化判断血液未结合铁转铁蛋白浓度的变化,实现了血液未结合铁转铁蛋白的可视化检测。与现有的未结合铁转铁蛋白检测方法相比,本发明的检测方法只需使用MTC一种检测物质就可判断血液中未结合铁转铁蛋白的浓度变化,该检测方法步骤简便、干扰因素较少。
进一步地,当待测血液中的未结合铁转铁蛋白增加时,可诱导MTC染料的结构向J-聚集体转变,MTC染料的J-聚集体在660nm处有最大的吸光度峰值,通过测试待测血液的吸光度值,计算血液未结合铁转铁蛋白的浓度。本发明的检测方法只需使用MTC一种检测物质就可完成血液中未结合铁转铁蛋白的检测,该检测方法干扰因素较少、检测结果稳定。
进一步地,本申请中将MTC染料的浓度限制为2mmol/L,该浓度下可以保持血液中未结合铁转铁蛋白和MTC染料反应的线性关系,保证显色结果的可视化以及使实验结果颜色变化形成单一光谱。
进一步地,本申请中将MTC染料与稀释后的血浆的体积比限制为1:5,该配比下血液中未结合铁转铁蛋白和MTC染料反应的线性关系,保证显色结果的可视化以及使实验结果颜色变化形成单一光谱。
进一步地,本发明中MTC检测使用的是EDTA抗凝全血,EDTA与血液中的钙离子形成稳定的螯合物而阻止血液凝固,避免了血液中其他金属离子的干扰,结果更加准确和稳定。
附图说明
图1为本发明基于MTC染料的血液apo-tf检测步骤和现有的UIBC检测步骤对比图;
图中(a)为基于MTC染料的血液apo-tf检测步骤;图(b)为UIBC的检测步骤;
图2为本发明中在660nm处吸光度值随着apo-tf浓度增加变化图;
图3为本发明中正常组和肝病患者组MTC检测apo-tf在660nm出的吸光度值及颜色对比图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案,下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是,本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象,而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换,以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外,术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形,意图在于覆盖不排他的包含,例如,包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元,而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述:
本发明中MTC(3,3'-二硫丙基-4,5,4',5'-二苯并-9-甲基硫碳菁三乙基铵盐)是按照Hamer(HAMER F M,The Chemistry of Heterocyclic Compounds.[M].New York:Interscience,1964,Vol.18:148-200)和Ficken(FICKEN G E,The Chemistry ofSynthetic Dyes.[M].New York:Academic Press,1971,Vol.4:228-240)建议的方法合成,使用前经甲醇重结晶,质量通过核磁共振、质谱、红外光谱和元素分析鉴定。
样本采集:采集体检部正常人的血浆样本为正常对照组,采集住院部诊断为肝硬化,原发性肝癌,病毒性肝炎等肝脏疾病患者的血浆样本为肝病患者组,利用MTC检测血浆中apo-tf的浓度。
一种基于MTC染料的血液apo-tf的检测方法,包括以下步骤:
1)将0.0076g MTC加入5mL双蒸水(DD)中制备新鲜MTC染料溶液(2mmol/L);2)EDTA抗凝全血3500rpm离心10分钟,分离出血浆,将血浆稀释50倍;
3)将100μl染料溶液与500μl血浆稀释液混合,孵育5分钟;
4)利用CYTATION 5imaging reader(BioTek,USA),在350nm到700nm的波长范围内检测混合物的吸光度,记录660nm处的吸光度。
5)结果显示正常组溶液颜色是紫红色,肝病患者组溶液颜色是蓝色,根据溶液颜色变蓝可判断肝病患者组血液中apo-tf浓度增加,在660nm的吸光度值随血液apo-tf浓度的增加而增加(参见图3)。因为患者的个体差异,血液中apo-tf浓度不同,因此660nm的吸光度值不同。
6)记录660nm峰值的吸光度,根据标准曲线计算血液中apo-tf的浓度。
参见图1(a)、(b),本发明中MTC检测apo-tf只需在血浆中加入MTC一种试剂,孵育后上机检测即可得到apo-tf的浓度;而现有的UIBC的检测步骤,首先需要调节溶液酸碱度,加入还原剂,最后再次加入显色剂,并且最后的结果是通过加减间接得到apo-tf的浓度。与现有的UIBC的检测步骤相比,本发明的步骤简便、干扰因素较少,检测结果稳定。
参见图2,在MTC溶液中加入不同浓度的apo-tf工作液,记录660nm处吸光度值,结果显示,随着apo-tf浓度的增加,660nm吸光度峰值逐渐增大,进一步说明,apo-tf能够诱导MTC向J-聚集体转化。
对不同浓度apo-tf下的吸光度进行拟合,拟合后的曲线为y=y0+A*exp(R0*x),实验数据图中的曲线拟合式是通过套用常见指数函数公式进行拟合,结合实验数据得知,公式里的y代表吸收比,x代表apo-tf的浓度,A和R0分别是曲线拟合式的截距和斜率,y0代表实验常数。本发明中MTC(3,3'-二硫丙基-4,5,4',5'-二苯并-9-甲基硫碳菁三乙基铵盐)是一种具有很强自聚集能力的超分子配合物,除了单体形式,MTC还可以形成两种不同排列取向的二聚体,即H-二聚体和J-二聚体,聚集体之间还可以实现H-聚集体单体/>J-聚集体之间的转化。并且它的吸收带会随着聚集形式的变化进行蓝移和红移,即J-聚集体增加时吸收带蓝移,在660nm处出现吸光度峰值,H-聚集体增加时吸收带红移,在530nm处出现吸光度峰值。血液中的转铁蛋白有三种存在状态,分别是结合一个铁离子的的单铁转铁蛋白,结合了两个铁离子的双铁转铁蛋白(holo-tf)以及未结合铁的无铁转铁蛋白(apo-tf)。
利用MTC的特性,研究发现血液中的apo-tf增加,可诱导MTC结构向J-聚集体转变,溶液中J-聚集体增加使溶液颜色由紫红色变为蓝色,在660nm处出现吸光度峰值,形成肉眼可见的蓝色变化。因此,MTC染料可以用于制备识别未结合铁转铁蛋白的探针中以及制备识别未结合铁转铁蛋白的试剂盒。
此外,MTC可以作为肝脏疾病中apo-tf病理改变时的可视化快速鉴别诊断方法,进而可以辅助检测肝脏疾病apo-tf的改变。
以上内容仅为说明本发明的技术思想,不能以此限定本发明的保护范围,凡是按照本发明提出的技术思想,在技术方案基础上所做的任何改动,均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
Claims (3)
1.MTC染料在制备通过识别抗凝全血中未结合铁转铁蛋白快速诊断肝脏疾病的试剂盒中的应用。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,识别抗凝全血中未结合铁转铁蛋白,包括以下步骤:
1)配制浓度为2 mmol/ L的 MTC染料;
2)将EDTA抗凝全血离心分离,将分离出的血浆稀释;
3)将步骤1)配制的MTC染料与步骤2)稀释后的血浆按照1:5的体积比混合、孵育,制得混合液;
观察混合液颜色变化,若观察到混合液颜色由红色变为蓝色,则判断EDTA抗凝全血未结合铁转铁蛋白浓度增加;若观察到混合液颜色由红色变为紫红色,则判断EDTA抗凝全血未结合铁转铁蛋白浓度未发生变化。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于,计算抗凝全血未结合铁转铁蛋白的浓度的操作包括:测定混合液在350 nm~700 nm下的吸光度值,根据吸光度值计算抗凝全血未结合铁转铁蛋白的浓度。
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