CN1735805A - 用于检测肿瘤特异性融合蛋白的方法和探针 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及融合蛋白的检测。本发明提供一套至少第一种和第二种分子探针的探针套，每一探针具有染料，其中所述染料共同地使能量转移发生；至少一种探针具有使所述第一种探针和第二种探针并置的反应基团，其中所述反应基团能够调节所述探针的并置，使得在所述染料之间发生能力转移的可能性提高。本发明提供了一种方法，可以在单细胞水平上检测细胞中融合蛋白的存在。

Description

用于检测肿瘤特异性融合蛋白的方法和探针
本发明涉及肿瘤特异性融合蛋白等的检测。更加特别地，本发明涉及通过在单细胞水平上检测融合蛋白的存在来指示存在染色体易位的技术。在各种类型癌症的诊断中，例如白血病、淋巴瘤和实体瘤，染色体异常通常被用于对预后相关性亚组进行分类。多种染色体异常产生融合基因，即通过一个基因的上游部分与其他基因的下游部分偶联的异常偶联的基因，反之亦然。融合基因可以被转录成融合基因转录产物，并且被翻译成融合蛋白。通常，融合蛋白在肿瘤形成过程中起重要作用。迄今，在各种类型癌症中已经记述了上百种不同的融合基因和融合蛋白。2-5
术语“癌症”包括一组不同种类的肿瘤，其中在考虑恶性程度以及对治疗的反应时，各个种类的肿瘤具有其自身的特点。毫无疑问，对各种癌症种类的精确诊断和分类十分有利于选择最有效的治疗方法。此外，可以在治疗过程中在大量正常细胞的背景下检测少量的恶性细胞对于评价治疗的有效性和预测即将发生的复发是十分重要的。
可以通过大量技术来检测染色体易位，这些技术的大部分需要现代的分子生物学技术。细胞生成技术，包括传统的染色体条带技术(chromosomal banding technique)(核型分析)以及使用荧光标记探针的荧光原位杂交技术(FISH)。也可以用位于断裂点的两侧的引物，通过基于聚合酶链反应(PCR)的策略来检测存在于染色体易位、倒置和缺失中的染色体断裂点的融合。DNA扩增仅可以被用于染色体异常，其中断裂点在小区域内丛生。在大多数情况下，断裂点分散在较大的内含子区域(intronicregion)中，但是数个易位、倒置和缺失产生融合基因和融合转录产物，后者可于反转录步骤(RT-PCR)后通过PCR进行扩增。
针对检测特异的染色体异常的最常用的技术包括在染色体或核酸(DNA或RNA)水平上进行分析。这种遗传学融合标记物的一个优点在于它们直接参与肿瘤形成。因此，它们在疾病的整个发展过程中一直存在。但是，融合标记物的主要缺陷是无法排除在患病且特别是在治疗过程中的基因转录和/或基因翻译水平的变化。因此，融合基因转录产物或融合蛋白的表达的变化使得难以将标记的检测水平与恶性细胞的数量相关联。这意味着融合基因产物的检测优选在单个细胞的蛋白质水平下进行。
融合蛋白包括至少两种蛋白质的部分，这两个部分对应于原先分离的基因，并且由最初分离的基因转录和翻译得到。融合蛋白唯一地由融合点表征，这两个蛋白在融合点上连接。融合点通常是抗原性暴露的，包括有时可以被免疫检测的独特表位。
最初，试图通过制备抗对应于融合蛋白的连接区的肽的抗体来产生融合蛋白特异性抗体。这种方法极少获得成功，主要是由于事实上难以找到专一地与融合蛋白反应而不与在细胞中正常生成的非融合蛋白反应的免疫试剂。如果获得融合体特异性抗体，它们通常不能应用于荧光显微镜或者流式细胞计数。6-8例如，抗BCR-ABL融合蛋白的ERP-FP1抗体在Western印迹方法中十分有效，但是不能成功用于人BCR-ABL阳性的白血病的显微镜研究。6-7此外，鉴于在染色体易位的各个重排中的巨大变化以及根据生成不同融合蛋白的非异常基因中(甚至当在相同的两个基因中发生易位时)的断裂点的位置，一般认为在融合蛋白的各种分离情况下均可能产生新的融合点。因此，通过对融合蛋白的融合点表位的特异性免疫检测来检测融合蛋白从未被广泛地应用。
用于特异地检测融合蛋白的一种可替代方法包括应用识别融合蛋白的一部分的所谓捕获抗体(catching antibody)和识别融合蛋白的另一个部分的标记检测抗体。在该体系中，捕获抗体结合到固体支持层上，例如ELISA平板或者试纸(dipstick)上。捕获抗体还可被固定到珠上，通过流式细胞仪来分析该珠。9在将捕获抗体与怀疑含有融合蛋白的细胞溶解产物一起孵育后，通过标记检测抗体来检测被结合的融合蛋白。虽然实施很便捷，但是在不破坏细胞完整性时，该捕获/检测抗体体系实际上是不能被用于检测细胞内的融合蛋白。大部分肿瘤特异性融合蛋白定位在细胞内，例如细胞核转录因子或者位于细胞质内或者在细胞质和细胞核之间穿梭的信号化分子。因此，捕获/检测抗体体系不能在单细胞水平上检测细胞内的融合蛋白。
理论上，抗融合蛋白的两个不同部分的两种不同标记抗体的共定位，证实了在单个细胞中存在融合蛋白。但是，完整的共定位证据需要通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)进行分析。尽管这样，通常不是直接评价两个抗体的共定位，因为识别来源于未受影响的染色体上的正常基因的正常蛋白质会产生背景染色，该染色会干扰融合蛋白的检测。此外，CLSM具有很大的缺陷，其需要专门的设备精良的实验室以及受过训练的技术高超的人员。对于常规诊断操作，例如在临床条件下，这种费时而且高度专业化的技术是不合适的。
上面的所有都表明，特别需要一种改进方法来检测融合蛋白，该方法优选被用于临床实验室。尤其具有挑战性的是在单细胞水平上检测细胞内融合蛋白。
本发明阐明荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance EnergyTransfer，FRET)技术可以被用于检测融合蛋白的存在。本发明提供一种用于检测细胞中的融合蛋白的存在的方法，使用一套至少第一种和第二种分子探针的探针套，每一探针能够识别位于所述融合蛋白的融合区域两侧的一结合位点，各个探针基因一种染料，其中所述染料一起使得能够发生能量转移，该方法包括提供一探针套，提供包含细胞的样品，在允许所述探针并置到所述融合蛋白上的条件下，将所述样品与所述探针接触，去除任何未结合的以及任何非特异结合的探针，通过FRET检测所述探针的并置(iuxtaposition)，以确定所述融合蛋白的存在。还提供一套至少第一种和第二种分子探针的探针套，每一探针具有一种染料，其中所述染料一起使得能够发生能量转移；至少一种探针具有能够并置所述至少第一种和第二种探针的反应基团，其中所述反应基团能够调节并置所述探针，使得在所述染料之间发生能量转移的可能性升高。按照本发明，分子探针能够通过所谓结合结构域特异性地结合到感兴趣的生物分子上。在通过结合结构域将至少第一种和第二种探针结合到感兴趣的分子上后，可以用一个反应基团来调节并置。反应基团不会或者极少可能与结合结构域竞争来结合感兴趣的分子。因此，一套本发明的探针区别于已知的抗体探针套，这些已知的抗体探针套仅通过结合到一个抗原性分子或复合物上而成簇或并置。反应基团优选在所述探针结合到感兴趣的分子上后仍可以用于调节并置的探针在空间上的排列。在一个实施方案中，所述的感兴趣的分子是一种蛋白质，优选融合蛋白，更加优选为致癌融合蛋白。特别优选的是一套第一种和第二种分子探针的探针套，其中每一探针能够识别和结合到位于所述融合蛋白的融合区域两侧的一结合位点(表位)上。当然，当采用一套探针，其中每一探针结合到感兴趣的分子的不同表位(例如，位于融合蛋白的融合区的C-和N-末端的表位)，所述不同表位不会以分子间或分子内的方式相互作用，因为这显然会干扰探针结合。因此，一套探针中的不同探针能够结合到不同的、基本上不相互作用的表位。这与在WO 01/75453中描述的情形不同，该专利涉及用于借助两种探针(报道分子)检测一个单元(entity)的方法，其中两种探针可能基本上同时地或顺序地结合到该单元的相同靶点上，或者结合到不同靶点上。WO 01/75453的报道分子/探针可以被用于检测嵌合的融合蛋白。其提及一个报道分子优选结合到SH2结构域上，而其他报道分子结合到SH2-结合位点上，即WO 01/75453的探针优选结合到相互作用的表位上。这种探针和检测方法明显区别于本发明，因为当采用一套其中不同探针针对相同的或相互作用的表位的探针时，如本文提供的基于FRET的方法将完全不起作用。此外，WO01/75453的探针都不具有并置探针的反应基团。
本发明提供一种包含本发明的一套探针的诊断试剂盒和一种方法，所述方法在对疾病进行诊断和/或分类中以及在治疗疾病之前、期间和之后，用一套探针检测一种融合蛋白的存在，以评价所述治疗的有效性。
还提供一种用于制备按照本发明的一套探针的方法，包括将各种探针与染料接触以形成所述探针与所述染料的缀合物，并纯化所述缀合物，还包括将至少一种探针与反应基团或其衍生物接触，以形成所述探针与所述反应基团之间的缀合物，并纯化所述缀合物。
荧光共振能量转移(FRET)是两个电子激发态的两种染料分子之间的距离依赖的相互作用，其中“供体”分子被一种光源激发，将其能量转移给“受体”分子。通常，供体和受体染料是不同的，在这种情况下，可以通过受体的激活荧光表观或者通过淬灭供体荧光来检测FRET。当供体和受体荧光相同，可以通过生成的荧光去偏振(depolarization)来检测FRET。当受体放射光谱显著地交叠，发生能量转移。为了实现共振能量转移，供体必需吸收光线并通过激发电子的共振将其转移给受体。10-13FRET通常是基于供体染料和受体染料之间的相互作用，这两种染料都是荧光的。但是，也可以使用非荧光受体染料。非荧光受体染料具有优点，这是因为它们消除背景荧光，背景荧光由直接(即非激活的)受体激发产生。在本发明中，可能采用荧光供体染料和非荧光受体染料监控融合蛋白上的并置探针。一套探针特异性地结合到天然蛋白质上，例如蛋白质A和B，将产生基线荧光信号。对于一套探针并置在A-B融合蛋白上，探针之间的FRET将会泯灭供体荧光。使用非荧光受体涉及测定供体荧光的减少，而不是测定受体荧光的增加。总的来说，与信号增强的检测相比，信号降低的检测较不灵敏。因此，按照本发明的方法，优选采用荧光供体染料和荧光受体染料进行。
对于能量转移的发生，供体的荧光放射波长必需比受体激发波长更短；也就是说，该过程必需是能量地“下降的”。两种染料足够接近地并置，通常比100更近，但是优选比50更近，这对于供体/受体对之间的能量转移来说是关键的。1是一个米制单位，等于0.1纳米或者10-10米。FRET能量转移效率与供体和受体之间的距离的6次幂成反比。提供一种观点，由于对距离的高度灵敏性，FRET特别适合于检测两种不同染料缀合的探针在融合蛋白上的并置。
在本发明的优选实施方案中，一个探针套包括一套至少两种染料缀合的抗体，所述抗体能够识别位于融合蛋白的融合区域两侧的一结合位点。合适的抗体包括常规(多克隆的或单克隆的)或者合成的抗体或者其功能性等价的结合片段，例如Fab′、Fab、单链Fv片段，双抗体(单链Fv二聚物)等。例如，可以用一套染料缀合的探针，例如抗A抗体和抗B抗体，通过FRET检测嵌合融合蛋白A-B。在优选实施方案中，将一种样品与两种抗体接触，一种抗体抗融合蛋白的结构域A而另一个抗融合蛋白的结构域B，以在细胞样品中检测A-B融合蛋白的存在。一种抗体用FRET供体染料标记，而另一种用FRET受体染料标记。仅当结构域A紧密地接近结构域B，例如当这两个结构域是相同蛋白质分子的部分，这两个抗体才会足够接近(“并置”)，使得供体/受体对诱导可检测的FRET荧光信号。
一种以上的不同抗体与相同蛋白质分子同时反应需要识别不同的结合位点或表位，这些位点或表位足够分开以防止对抗体的空间阻碍。例如，同时应用一种针对位于T淋巴细胞的细胞表面上的T细胞受体(TCR)分子可变区(V)的抗体和一种针对该分子的恒定区(C)的抗体将产生不可靠的和不可重复的结果。但是，同时应用V结构域抗体和与TCR分子密切相关的抗CD3分子的抗体，在流式细胞仪器和显微镜下都获得良好的染色结果。14这些数据表明，同一个蛋白质上的两个表位之间的距离优选应当超过约80，以同时被识别。
有时，对于必需的FRET能量转移来说，两种抗同一融合蛋白的不同部分的染料缀合的抗体的共定位是不够的。完整的抗体是一个大Y字形的蛋白质分子，大小约150kDa，由两条重链和两条轻链构成。由于抗体分子的长度(300-400)以及铰链区的弹性，并置的抗体分子能够跨越较大的距离。15紧密并置的FRET探针对于获得FRET信号通常是足够的，稳定和/或增强并置的两个探针来提高FRET效率是有利的。例如，探针或染料的大小可能通过负面的空间作用干扰FRET分析。此外，抗体的弹性可能降低一对FRET染料之间发生FRET的可能性，这对染料被缀合到抗体探针上。在制备染料缀合物时，与荧光探针相似，通常不能控制缀合的位置。例如，在抗体缀合的情况下，染料分子可能结合到抗体分子的不同部分上。根据染料缀合的位置，染料在探针上的空间方向对于FRET能量转移效率来说可能有利或不利，即结合到探针上的染料不必在相互之间的能量转移距离之内。
令人惊奇地本发明提供一种观点，通过提供至少一种基因反应基团的探针，可以调节对一套探针的并置，以提高一对染料之间的FRET能量转移的可能性。本发明提供一套至少第一种和第二种分子探针的探针套，每一探针具有一种染料，其中所述染料一起使得能够发生能量转移；至少一种探针包含反应基团，使得抗体并置所述的至少第一种探针和第二种探针，其中所述反应基团能够调节并置所述探针，使得在所述染料之间发生能量转移的可能性升高。使用这样一种探针套以检测并置探针的灵敏度相对于使用不含任何反应基团的探针提高了。
在本发明内容中，术语“反应基团”是指能够调节FRET染料的空间排列的成分，使得发生能量转移的可能性升高和/或能量转移效率提高。空间排列是指染料之间的距离以及它们的相对方向。调节空间排列包括调整和稳定染料的空间排列。发生能量转移的主要条件之一是供体和受体分子必需紧密接近，通常为10-100。在优选实施方案中，反应基团可以将所述染料并置，彼此的间距在100内，更加优选彼此的间距在50内，最优选彼此的间距在20内。因此，优选反应基团较小，如小于10千道尔顿(kDa)，小于5kDa，甚至小于2kDa或者小于1kDa。例如，反应基团是生物素。
如所述，反应基团可以调节并置的探针，使得通过直接与其他探针相互作用的能量转移的可能性提高。例如，第一种探针的反应基团结合到并置的第二种探针的一部分上，在空间方向上在所述探针之间形成稳定的复合物，该复合物对于FRET发生是有利的。对于上面提及的关于染料缀合的位点，通常不可能在确定位点上用反应基团来选择性地修饰一种探针。进行修饰位点主要是通过特定残基的存在和可达性来确定，反应基团通过该残基缀合到探针上，例如通过伯胺或者通过巯基。因此，抗体探针可能在免疫球蛋白的恒定区和/或可变区含有反应基团。可以想象，不是每一个位点都同样地适合于与第二种探针相互作用，例如，由于空间阻碍。因此，优选探针具有多个反应基因，以在统计学上提高其与其他探针相互作用的能力。例如，探针具有两个或三个或甚至五个反应基团。
在此提供一种方法，用于在细胞中检测融合蛋白的存在，采用一套至少第一种和第二种分子探针的探针套，每一探针能够识别位于所述融合蛋白的融合区域两侧的一结合位点(通过其结合结构域)，每一探针还具有一种染料，其中所述染料一起使得能够发生能量转移，至少一种探针具有反应基团，以调节并置所述的至少第一种和所述的第二种探针，使得在所述染料之间发生能量转移的可能性升高，该方法包括提供一探针套，提供一种包含细胞的样品，在允许将所述探针并置到所述融合蛋白上的条件下将所述样品与所述探针接触，去除任何未结合和任何非特异性地结合的探针，通过FRET来检测所述探针的并置，以确定所述融合蛋白的存在。
在第一种探针能够直接与至少第二种探针相互作用的情况下，优选在连续步骤中将所述样品与各种探针接触，该连续步骤具有大量中间洗涤步骤以避免探针之间的自身相互结合。例如，样品与包括反应基团的探针A接触，以识别并结合到融合蛋白的一部分上。接着，通过重复洗涤步骤来去除任何未被结合的和任何非特异性结合的探针A。随后，在允许将探针A和B并置到同一融合蛋白上的条件下，将样品与能够与融合蛋白的另一部分反应的探针B接触。在此，任何未被结合的以及任何非特异性结合的探针B优选通过重复洗涤步骤来去除。在本发明的一个实施方案中，探针A的反应基团与至少一个并置的探针B相互作用，以增强和/或稳定存在于所述探针上的染料的空间方向，使得它们之间发生能量转移的可能性升高。虽然这种方法可以被用于检测融合蛋白的存在，但是显然这种方法包括多个分开的接触和洗涤步骤，相当浪费人力和时间。而且，如果探针能够直接相互作用，预计会产生显著的背景染色，该染色由探针结合到来源于正常基因的正常蛋白质的结构域上而不是融合蛋白上而产生。在上例中，结合到天然蛋白质A上的探针A的反应基团可能会恢复并与探针B反应。此外，如果不是有效地去除所有未被结合的探针A，可能在将所述样品与探针B接触时，会在探针A和B之间发生不期望的相互作用。这两种事件都会产生可检测的能量转移信号，尽管实际上探针B未与探针A被并置到融合蛋白上。
因此，在本发明的优选实施方案中，第一种探针的反应基团不会直接或立即与第二种探针反应，以避免所述探针的自身结合。这对于通过各种探针对融合蛋白进行空间排列以及对于将所述探针并置在所述融合蛋白上都是有利的。而且，其避免了在直接连接探针或多聚化探针之间发生过早的能量转移，并降低特异的背景信号。这对于确保能量转移信号真实地反映并置探针来说是重要的。
本发明提供一种观点，如果第一种探针的反应基团不与至少第二种探针反应以避免所述探针的自身结合，一种所谓“桥连”物质被用于调节所述探针之间的相互作用，以对探针的并置进行调节，使得所述探针上的染料之间的能量转移的可能性升高。该物质可以是能够结合或者修饰探针、反应基团和/或染料以调节并置探针上的染料的空间排列的任何种类的化合物，使得该空间排列对于FRET是有利的。优选地，该物质可以将所述染料并置，彼此的间距在2-100内。在染料缀合探针结合到靶点融合蛋白上之后，所述物质优选以足以调节并置探针上的所述染料的空间排列的含量被添加到一种样品中。有利地，所述物质以高特异性和高亲和性结合到反应基团上。此外，优选这种物质相对较小，使得桥连物质仅最小地影响一对染料之间的距离和一对染料的相对定位。
在优选实施方案中，提供一种方法来在细胞中检测融合蛋白的存在，采用一套至少第一种和第二种分子探针的探针套，每一探针能够识别位于所述融合蛋白的融合区域两侧的一结合位点，每一探针还具有一种染料，其中所述染料一起使得能够发生能量转移，至少一种探针具有反应基团，以调节并置所述的至少第一种和所述的第二种探针，使得在所述染料之间发生能量转移的可能性升高，其中所述第一种探针的反应基团不会直接与所述第二种探针反应，该方法包括提供一探针套，提供一种包含细胞的样品，在允许将所述探针并置到所述融合蛋白上的条件下将所述样品与所述探针接触，去除任何未结合和任何非特异性地结合的探针，将所述探针与能够连接到所述第一种探针的至少一个反应基团上的物质接触，通过FRET来检测所述探针的并置，以确定所述融合蛋白的存在。
一种采用探针套的方法，至少一种探针包含反应基团，其中探针不会直接相互作用并且需要一种桥连物质，这种方法具有多个优点。首先，与采用能够直接相互作用的探针的方法相比，能够实现提高特异性并降低背景染色。毕竟，对于反应基团通过桥连物质产生作用，在加入所述物质之前，探针需要相互紧密地并置，即由一种探针邻近另一种探针在同一个融合蛋白上结合产生。其次，由于对于各种探针不需要分开的接触/洗涤步骤，这种方法十分迅速而且容易操作。因此，可以在单一反应中将样品与所有探针的混合物接触。此外，可以同时去除任何未被结合的和任何非特异性地结合的探针。
正如在此详细描述的，特别优选的是一套至少第一种和第二种分子探针的探针套，每一探针具有一种染料，其中所述染料一起使得能够发生能量转移；每一探针具有一种反应基团。一种物质优选地能够结合，或“桥连”至少两种反应基团。在一个优选的实施方案中，一套探针中的每一探针具有相同的反应基团。此外，一套探针中的每一探针可以具有不同的、但具有相同反应活性的反应基团。这可以使用一种类型的桥连物质，该物质具有至少两个针对一个反应基团的相同结合位点。
在优选实施方案中，探针具有一个以上的反应基团，使得所述探针能够与一分子以上的桥连物质相互反应。倘若一种探针具有一个以上的反应基团，理论上将会增加所述探针与所述桥连物质之间的相互作用的可能性。此外，由于本发明容易实施，合适的反应基团或其衍生物可以购买得到，并且容易并且有效地结合到探针上。
按照本发明，特别感兴趣的反应基团是生物素，而抗生物素蛋白或链霉抗生物素是特别合适的桥连物质。抗生物素蛋白是蛋白来源的糖蛋白，具有约68000道尔顿的分子量，直径为8-10。其由四条相同的亚基链组成。一个抗生物素蛋白或链霉抗生物素能够结合四分子生物素。抗生物素蛋白对生物素具有格外高的亲和性(亲和常数＞1015M-1)。这种高亲和性使得可以在抗生物素蛋白和生物素标记的探针之间迅速形成稳定的复合物。蛋白质链霉抗生物素由细菌阿维丁链霉菌(Streptomyces avidinii)生成，具有非常类似于抗生物素蛋白的结构，也能够紧密地结合生物素。其通常表现为较低的非特异性结合，因此通常被用于替代抗生物素蛋白。一旦生物素-抗生物素蛋白复合物形成，该键基本上是不能去除的。生物素-抗生物素蛋白系统被广泛地使用，并且已经被证明在抗原、糖基缀合物以及核酸的检测和定位中是非常有用的，采用生物素化的抗体、凝集素或核酸探针。如所述，具有这种小尺寸的反应基团对于在染料对之间产生近的间距是有利的。生物素是具有仅244道尔顿的分子量的维生素。此外，许多生物素分子可以被偶联到一个蛋白质上，确保生物素化蛋白结合一分子以上的抗生物素蛋白。抗生物素蛋白、链霉抗生物素和生物素可以从许多商业来源获得。各种用于制备生物素缀合物的标准方法对于本领域技术人员来说是已知的，它们中的大部分可以在一天之内完成。而且，商业性生物素化试剂盒也是可以获得的，其含有蛋白质生物素化的所有必需成分。
如果一套探针被使用，其中每一探针具有不同反应基团，合适的物质包括能够结合至少各种反应基团之一的分子。或者，这种结合物质包括至少两个分子的复合物，这两个分子可以共价地或者非共价地结合在一起，其中各种分子能够结合到反应基团上。
本发明提供一种在单细胞水平上检测融合蛋白的方法，使用一套按照本发明的探针，每一探针能够通过该探针的结合结构域结合到位于所述融合蛋白的融合区域两侧的一结合位点上，即，一种探针针对包含融合蛋白的N末端的蛋白质片段，而其他一种探针针对包含相同融合蛋白的C末端片段的蛋白质片段。融合蛋白包括任何种类的蛋白质类物质，该物质在融合基因转录和翻译后形成。融合基因包括与另一种基因或其衍生部分的一种或多种基因的一部分。融合蛋白可以由染色体易位、倒置或缺失产生。在优选实施方案中，所提供的方法被用于检测肿瘤特异性融合蛋白。融合蛋白可以是内源性表达的蛋白或者其可以由遗传工程产生。采用按照本发明的方法容易检测的恶性肿瘤中的融合蛋白包括，但是不限于表1中所列举的那些。
非常中肯地指出，本发明的方法不需要破坏细胞完整性来检测细胞内的融合蛋白的存在，例如制备细胞溶解产物。保持细胞形态的完整性使得可以在单细胞水平上进行分析，例如通过流式细胞仪或者荧光显微镜。通过流式细胞仪检测FRET信号使得能够在不同群体中对特定的个别细胞进行快速、多参数的分析。流式细胞仪的主要优点在于，其直接给出定量数据，并且非常迅速(可以在数小时内获得结果)。
本发明中所提供的方法使得可以在单细胞水平上检测融合蛋白。在优选实施方案中，所提供的方法被用于在单细胞水平上检测细胞内的蛋白质。当检测细胞内融合蛋白时，处理包含细胞的样品，使得可以通透物质并且保持形态。优选处理是固定和保留细胞基质以及细胞内蛋白质的形态学完整性，以及使探针(例如抗体)最有效率穿透。
不同于作为示例的“捕获/检测”抗体方法，该方法实际上仅能被用于在细胞表面上或者在细胞溶解产物中检测融合蛋白的存在，而本发明的方法可以通过免疫表型特征，对细胞混合物中的细胞亚群进行门控分析。因此，本文提供的方法使得可以在正常细胞的大背景下检测极少的恶性肿瘤细胞群体中的融合蛋白。这对于检测融合阳性细胞的低频率是特别有利的，例如在用以评价处理效果的处理期间或之后检测微小残留病变(minimal residual disease)(MRD)的情况下。在优选实施方案中，所提供的方法包括多参数流式细胞仪以鉴定和/或分离单细胞以在单细胞水平上检测融合蛋白的存在。用于实施所提供的方法所必需的全部为流式细胞仪设备。重要的是，可以在常规实验室由具有普通技术的人员实施该方法。
在各种类型的癌症中，已经描述了一百多种不同融合基因和融合蛋白。如所述，所提供的方法使得可以在单细胞水平上区别正常蛋白质和异常融合蛋白的存在。理论上，识别融合蛋白的两个不同结构域的两种抗体，通过结合到来源于正常基因而不是融合基因的正常蛋白质的结构域上以产生背景染色。但是，在靶细胞群体中，通常仅两个正常蛋白之一达到可检测的表达水平，这通过细胞表面和/或细胞内标记来确定。而且，正常蛋白质和融合蛋白通常在其细胞内表达模式方面是不同的，常常产生不同的亚细胞定位。16.17这意味着，两种不同的正常蛋白的相同定位在靶向细胞群体的单细胞水平上不可能发生。特别地，如果在正常细胞中存在足以产生FRET信号的相同并置的探针，那也是极少数情况。
本文所提供的是用于生产一套至少第一种和第二种分子探针的方法的探针套，每一探针具有一种染料，其中所述染料一起使得能够发生能量转移；至少一种探针具有可以并置所述第一种探针和第二种探针的反应基团，该方法包括将每一探针与染料接触以在所述探针和所述染料之间形成缀合物，并纯化所述缀合物，还包括将至少一种探针与反应基团或其衍生物接触以在所述探针和所述反应基团之间形成缀合物，并纯化所述缀合物。Frester半径(R0)是对应于50％能量转移效率的距离，其表征各个供体/受体对。其数值通常在30-60之间。在本发明中，术语染料是指与另一种染料一起可以被用于能量转移分析例如FRET分析的取代分子(substituent)。如上所提及，FRET通常是基于均具有荧光的供体染料和受体染料之间的相互作用。在一个实施方案中，本发明采用一套探针，其中所述染料中的至少一种是一种荧光染料。但是，还可以使用非荧光受体，并且通过供体荧光淬灭来检测FRET。如所述，通过监控供体荧光的下降作为并置探针的结果来检测FRET的灵敏度通常不如检测受体荧光增加的灵敏度。因此，在优选实施方案中，至少两种荧光标记的探针被用于检测融合蛋白，这将在详细描述的说明书中被示例。优选的荧光染料的例子是那些适合用于通过常规流式细胞仪进行的分析，包括荧光素标记，例如5-(和6)-羧基荧光素、5-或6-羧基荧光素、6-(荧光素)-5-(和6)-羧基胺己酸以及荧光素异硫氰酸酯、Alexa Fluor染料例如Alexa Fluor488或者Alexa Fluor 594、花菁染料例如Cy2、Cy3、Cy5、Cy7，可选择取代的香豆素、R-藻红蛋白、德克萨斯红和Princeston Red以及R-藻红蛋白与例如Cy5或德克萨斯红的缀合物，和藻胆蛋白的成员。其他感兴趣的染料为量子点(quantum dot)染料，其几乎达到对颜色的极限调色。对于适合于通过流式细胞仪检测能量转移的供体/受体对的各种信息可以在Szollosi等中找到。18荧光染料的优选组合包括那些被用于常规串联缀合物中的那些染料，也被称作为duochromes19。
所提供的方法包括提供包含细胞的样品，其中当要检测细胞内的融合蛋白，则可选择地固定和透化处理所述样品。样品可以包含来自生物样品的原代细胞。生物样品可以是体液，包括血液、血清、尿液、骨髓、脑脊髓(CSF)、唾液。也可以是组织样品、组织匀浆。样品包括被培养的细胞，可以是培养的原代细胞，例如来自淋巴结活检的肿瘤细胞。此外，样品包含来自实验室建立的细胞系的培养细胞，细胞系例如K562、KASUMI-1、REH或CEM细胞系，来自大量来源，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC；从 www.atcc.Org可以获得在线产品目录)。所提供的方法适合于检测细胞内的内源性融合蛋白的存在以及重组融合蛋白。
对于分析包含细胞悬浮液的样品，优选处理样品以能够保持材料的形态，透化处理以确保感兴趣的分子足以与探针接触。处理类型将取决于多种因素，例如取决于所用的固定剂，固定范围和类型以及感兴趣的分子的性质。可以用固定剂进行固定，例如甲醛。
对于原代细胞中的融合蛋白的检测，采用其他标记来确定感兴趣的靶向细胞群体是特别有利的。在传染性疾病、MRD检测和监控以及基因治疗中的大量重要生物学应用通常要求在较大的背景中分析和分离较少的细胞(例如，造血干细胞/祖细胞)。在本发明的一个实施方案中，该方法包括对至少一种细胞标记进行染色，例如细胞表面标记或细胞内标记，以确定细胞混合物中的靶向细胞群体，包括将所述样品与能够选择性地结合到所述标记上的化合物接触。在优选实施方案中，这种化合物用荧光染料直接标记。合适的化合物包括荧光标记抗体或者其功能性相当的结合片段。此外，可使用能够选择性地结合到细胞标记上的化合物，可以用染料缀合的第二试剂(例如，荧光标记的第二抗体)检测该化合物。细胞标记包括任何种类的细胞内或膜结合标记，其可以被用于在细胞混合物中区别细胞亚群。细胞混合物包括活细胞。细胞混合物还包括被透化处理和/或固定的细胞。细胞标记可以是分化簇(CD)抗原。CD标记可以是造血细胞中的细胞表面分子，其区别于单克隆抗体。造血细胞包括胸腺细胞、树突细胞、Langerhans细胞、嗜中性细胞、嗜曙红细胞、生发中心B细胞、囊泡树突细胞、血浆细胞和骨髓细胞。例如，合适的细胞标记包括CD1、CD3、CD4、CD8、CD10、CD19、CD20、CD33、CD34和CD117。针对大量人CD标记的单克隆抗体可以从不同的供应商获得，例如BD Biosciences或Ancell Immunology Research Products，Bayport，USA。通常，可以获得与所选择的荧光染料直接缀合的抗体，例如CD10-PE或CD19-FITC，这显然是实施按照本发明的方法的优选。
在优选实施方案中，提供一种方法，用多参数流式细胞仪/细胞分选技术来鉴定和/或分离稀少的单一细胞，以及通过感兴趣所融合细胞的存在或缺乏来进一步表征这些细胞。这种方法特别适合于应用来解决免疫系统发育、传染性疾病、癌症和基因治疗中存在的重要问题。典型地，在用探针套染色细胞样品之前，采用标准方法，用至少一种相关的染料缀合的抗体标记细胞，以确定靶细胞群体。除了用于融合蛋白检测的FRET染料外，染料的选择优选应当但是不是专一地确定在使用两种或三种用于免疫分型的染料。例如，一个按照本发明的FRET探针套可以与另一种染料结合来通过免疫分型特征来调节白细胞亚群门控(leukocytesubset gating)，例如通过CD10、CD19和CD20来精确地确定骨髓中的B细胞前体亚群，或者用CD1、CD4和CD8确定胸腺细胞亚群，或者用CD34和/或CD117确定干/前体细胞群体。如详细的说明书中所示，本发明提供可以在非常小的细胞亚群中检测细胞内融合蛋白的方法，即检测MRD，这对于评价癌症治疗的有效性是关键的。
本发明提供用于在细胞中检测融合蛋白的存在的诊断试剂盒，包括按照本发明的一套探针。例如这种试剂盒可以被用于通过检测肿瘤特异性融合细胞阳性细胞来监控和量化恶性细胞，例如白血病细胞。在此提供的诊断检测试剂盒可以用于在诊断时期以及在治疗期间和之后来评价所应用的癌症治疗方法的有效性。
表1.可以通过抗体介导的FRET技术检测的恶性肿瘤中的融合蛋白的例子
  恶性肿瘤   染色体异常   融合蛋白
  前-B-ALL急性髓性白血病淋巴瘤尤文氏肉瘤   t(1；19)(q23；p13)t(4；11)(q21；q23)t(9；22)(q34；q11)t(12；21)(p13；q22)t(8；21)(q22；q22)t(15；17)(q22；q21)inv(16)(p13；q22)t(2；5)(p23；q35)t(11；22)(q24；q12)   E2A-PBX1MLL-AF4BCR-ABLTEL-AML1AML1-EtopML-RARACBFB-MYH11NPM-ALKEWS-FLI1
附图说明
图1.由基因A的上游(5′)部分和基因B的下游(3′)部分组成的融合基因的示意图。该A-B融合基因被转录为A-B mRNA，并被翻译成A-B融合蛋白。
图2.以荧光染料X作为供体染料和Y作为受体染料的荧光共振能量转移(FRET)的原理的示意图。A.如果受体X和Y之间的距离太大，Y不会被供体X的放射光线激发。B.如果供体和受体染料之间的距离足够小(＜80但是优选＜50)，供体染料的放射光线将会激发受体染料Y。
图3.被一套抗A和抗B抗体探针识别的A-B融合蛋白的示意图。
A.探针A用供体染料X缀合，而探针B用受体染料Y缀合(参见附图2)。此外，两种探针用生物素作为反应基团缀合。B.在用抗体探针A和B孵育后，如果两种抗体确实识别并结合到同一A-B融合蛋白上，则用抗生物素蛋白孵育将探针结合到一起。通过FRET原理(参见附图2)，可以检测两种抗体的并置(通过生物素-抗生物素蛋白系统稳定)。
图4.在ALL细胞中，FRET介导检测TEL-AML1融合蛋白的例子。
A.诊断时的前B-ALL细胞。通过光散射特征确定的ALL原始细胞的流式细胞仪门控(左边)，接着对CD19+原始细胞进行门控(之间)，和对CD10+/CD19+ALL细胞中的TEL-AML1融合蛋白的存在进行评价(右边)。
B.随诊过程中的前B-ALL细胞。流式细胞仪检测流动过程中的TEL-AML1阳性细胞(微小残留疾病)的低频率来评价治疗有效性。仅3％的CD10+原始细胞为TEL-AML1融合蛋白阳性，即所有白细胞的0.2％。
详细描述
如上所提及，本发明涉及用探针套检测细胞中的融合蛋白的存在的方法。该方法可以被用于诊断各种类型的癌症，这些癌症涉及产生融合蛋白的染色体易位、颠换或缺失。例如约35％的患有急性淋巴细胞白血病(ALL)和慢性骨髓白血病(CML)的成人与特定染色体缺陷、产生费城(Ph)染色体的9号和22号染色体之间的易位相关。这种易位发生在称作ABL的酪氨酸激酶蛋白的基因组的位点上，产生异常的BCR-ABL融合蛋白，该融合蛋白是ABL基因与另一种称作BCR的基因的可读框内融合的基因产物。通常，融合蛋白在癌症发生过程中起重要作用。例如，ABK在BCR-ABL融合蛋白中的激酶活性被激活和去调控，在ALL和CML中引起不受调控的细胞生长。当在患者中诊断到急性淋巴细胞白血病，通常包括传统细胞遗传学，例如对Ph染色体的核型分析，白血病细胞的总数约1011-1013。在约5周的化学治疗后，大部分患者实现完全去除这种细胞。完全去除这种细胞并不意味着完全从机体中根除白血病细胞，而是它们的含量超出了常规细胞形态学方法的灵敏度的范围(例如1-5％)。此时，多达1010恶性细胞仍然存留在患者体内。它们代表了微小残留病变(MRD)。检测残余的恶性肿瘤细胞的低频率使得可以在化学治疗过程中对携带的肿瘤进行较长时间的追踪，从而可以更好地评价白血病细胞对治疗的灵敏度。目前已经确定MRD的水平代表一种最有效的最终结果的预后因子。此外，对MRD水平升高的检测使得能够预期即将发生的疾病复发。在本发明中提供的方法使得能够在单细胞水平中区分正常蛋白质和异常融合蛋白的存在。
作为该方法的例子，本发明人将描述用于检测TEL-AML1融合蛋白的探针套的制备。还描述在诊断时和在追踪过程中来检测MRD水平，用这种探针套来检测ALL中的TEL-AML1融合蛋白的存在的方法。
实施例
一套探针的制备
优选地，按照本发明的荧光探针套包括一套两个荧光染料缀合的抗体，各个抗体还具有反应基团。制备抗体的方法是本领域技术人员已知的。例如，为了获得单克隆抗体，试验动物用免疫原进行免疫，例如重组蛋白质或者合成肽。通过检测采血和确定反应性的滴度，以监控动物的免疫反应。当获得适当的高滴度时，从动物中收集血液，制备抗血清。如果需要，进一步分馏抗血清，富集对蛋白质基因反应活性的抗体。参见，例如Harlow等Antibodies.A laboratory Manual，Cold Spring HarborPublications，纽约(1988)。可以通过本领域已知的各种技术来获得单克隆抗体，例如，通过加入聚乙二醇(PEG)融合被免疫小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤细胞系来获得单克隆抗体。被融合的细胞在选择培养基中培养，例如含有次黄嘌呤、氨喋呤和胸腺嘧啶的混合物的培养基。在这种选择培养基中存活的融合细胞被检测，以生产期望的抗体(通常通过固相免疫分析例如ELISA)和，如果为阳性，克隆培养物，使得在各个培养孔中仅有一个细胞。这生产了来自单一祖先的细胞克隆，单一祖先是无限生殖的并且生产单克隆抗体。获得的抗体可以用常规的免疫诊断技术进行表征，例如通过使用表达重组融合蛋白的细胞的溶解产物进行Western印迹或者通过ELISA。
抗体的生物素化
生物素通常通过伯胺(即赖氨酸)被缀合到蛋白质上。通常，3-6个生物素分子被缀合到各个抗体上。在柱中用100mM碳酸盐，pH 8.4对抗体进行透析或交换。在缓冲液平衡后，测定抗体浓度。(对于IgG，1mg/ml具有1.4的A280)。如果抗体浓度低于1mg/ml，缀合物可能是次优的。如果需要，透析抗体到4mg/ml的浓度。在使用前，立即将10mg生物素(N-羟基琥珀酰生物素，Pierce)溶解在1ml无水DMSO(无水二甲基亚砜，Aldrich)中。具有反应活性的生物素分子是不稳定的。一旦生物素被溶解，应当立即使用。加入生物素，以生成80μl/mg抗体的比例；立即混合，用箔包裹试管；在室温下培养和旋转2小时。去除未被反应的生物素，将抗体换到10mM Tris pH 8.2、150mM NaCl，pHix(5mg/ml溶于95％酒精的五氯苯酚(以10,000x或每升3-4滴使用)Sigma)。
抗体的FITC缀合物
FITC是一种小的有机分子，通常通过免疫球蛋白的伯胺(即赖氨酸)被缀合到蛋白质上。通常3-6个FITC分子被缀合到各个抗体上；较高程度的缀合产生溶解问题以及内部淬灭(亮度下降)。因此，在多个平行反应中，抗体通常缀合到不同含量的FITC上，比较生成的试剂的亮度(以及背景粘性)来选择最佳的缀合比例。可以在半天内完成全部缀合。反应活性的荧光素分子、荧光素异硫氰酸酯是不稳定的。一旦打开一个瓶子并溶解FITC，应当立即使用。由于一瓶FITC含有用于约100mg抗体的足够物质，在同一天进行多个FITC缀合是经济的。
1. 抗体制备
在柱中在500mM碳酸盐，pH 9.5中透析或交换抗体。在缓冲液平衡后，测定抗体浓度(对于IgG，1mg/ml具有1.4的A280)。如果抗体浓度低于1mg/ml，缀合可能是次优的。如果需要，透析抗体到4mg/ml的浓度。
2. 共价缀合
在使用前，立即将10mg(1瓶的全部内容物，无需称重)FITC(Molecular Probes)溶解在无水DMSO中。加入FITC以产生40-80μg/mg抗体的比例；立即混合。用箔包裹试管；在室温下培养和旋转1小时。去除未被反应的FITC，通过过滤或透析，将抗体与500mM碳酸盐交换。
3. 缀合的表征
通过测定280nm和495nm时的吸光率，来确定F/P和蛋白浓度。IgG：1mg/ml具有为1.4的A(280)；mw＝150,000。IgM：1mg/ml具有为1.2的A(280)；mw＝900,000。荧光素：1mM具有为68的A(495)，11.8的A(280)。F/P值为3-10对于任何特定IgG可能是最佳的蛋白质浓度：
IgG(mg/ml)＝[A(280)-0.31*A(495)]/1.4
IgM(mg/ml)＝[A(280)-0.31*A(495)]/1.2
F/P比例：
IgG：3.1*A(495)/[A(280)-0.31*A(495)]
IgM：15.9*A(495)/[A(280)-0.31*A(495)]
通过FRET分析进行检测
从ALL患者中获得骨髓样品，按照标准方法分离白细胞。用两种细胞表面标记来标记白细胞，以通过免疫表型探针来确定白细胞亚群。使用FITC缀合的单克隆抗人CD19(FITC-CD19)以及PE缀合的单克隆抗人CD10(PE-CD10。然后按照标准的方法固定细胞，例如，在1％多聚甲醛中，以保存细胞的完整性及其内容物。用去垢剂如皂角苷透化处理细胞膜，使探针套可以进入细胞内部。在4℃下黑暗中用含有按照本发明的探针套(0.1-0.3μg/ml各种探针)标记细胞1小时，包括Cy3标记的生物素缀合的抗TEL的螺旋-环-螺旋基序的抗体以及Cy5标记的生物素缀合的抗AML1的Runt结构域的抗体。在洗涤细胞以去除未被结合的探针后，用未标记的抗生物素蛋白培养细胞，以产生两种不同抗体的足够紧密和稳定的并置。然后在流式细胞仪中分析细胞。结果示于附图4。组A表示对在诊断时从患者中获得的前B ALL细胞中的TEL-AML1融合蛋白的评价。ALL原始细胞首先根据其光散射特征被门控(前向散射比侧向散射)。然后，对CD19+的原始细胞进行门控(FL1比侧向散射)。在CD19+/CD10+ALL细胞亚群中很容易检测到TEL-AML1融合蛋白的存在。在组B中，显示在5周治疗方案后，对同一患者进行类似分析，以评价治疗的有效性。仅3％的CD10+原始细胞为TEL-AML1融合蛋白阳性，即仅全部白细胞的0.2％。先前未报道过对如此低频率的TEL-AML1阳性细胞(微小残留病变)的检测。
本发明人已经采用FacsCalibur来进行FRET测定，使用Cy3和Cy5作为供体/受体对。488nm下激发对于Cy3(543nm更好)不是最佳的，632nm对于Cy5是最佳的，通过这种设计，可以获得合理的良好的FRET分布曲线(其实际上比用FITC/TRITC对获得的结果更好，因为自身荧光是较小的问题)。此外，本发明人使用488-＞520条带用于细胞基础的自身荧光修正。用Cell Quest Pro软件来获取数据和进行分析。
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Claims (21)

1.一套至少第一种和第二种分子探针的探针套，每一探针具有一种染料，其中所述染料一起使得能量发生转移；至少一种探针具有反应基团，所述反应基团使得所述至少第一种和第二种探针并置。
2.权利要求1的探针套，其中所述反应基团使得所述染料并置，彼此的间距在100内，优选彼此的间距在50内，更加优选彼此的间距在20内。
3.权利要求1或2的探针套，其中所述第一种探针的反应基团不与所述第二种探针直接反应。
4.权利要求1-3中任一项的探针套，其中至少一种探针具有多个反应基团。
5.权利要求1-4中任一项的探针套，其中所述探针是一种抗体或者与其功能相当的结合片段。
6.权利要求1-5中任一项的探针套，其中所述染料中的至少一种是荧光染料。
7.权利要求6的探针套，其中所述荧光染料选自荧光素异硫氰酸酯(FITC)、四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)、德克萨斯红(TR)、R-藻红蛋白(R-PE)、别藻篮蛋白(APC)、藻胆蛋白类(Phycobiliproteins)成员、Cy3、Cy5、Cy5、Cy5.5、Cy7、花菁染料、Alexa Fluor染料、上述荧光染料的串联缀合物、以及量子点(quantum dot)染料。
8.权利要求1-7中任一项的探针套，其中所述反应基团是生物素。
9.用于检测细胞中的融合蛋白的存在的方法，采用一套至少第一种和第二种分子探针的探针套，每一探针能够识别位于所述融合蛋白的融合区域两侧的一结合位点，每一探针还具有染料，其中所述染料一起使得能量发生转移，所述方法包括：
-提供一探针套，
-提供包含细胞的样品，
-将所述样品与所述探针套接触，
-在允许所述探针在所述融合蛋白上并置的条件下，
-通过FRET检测所述探针的并置，以确定所述融合蛋白的存在。
10.用于检测细胞中的融合蛋白的存在的方法，采用一套至少第一种和第二种分子探针的探针套，每一探针能够识别位于所述融合蛋白的融合区域两侧的一结合位点，每一探针还具有一种染料，其中所述染料一起使得能量发生转移，至少一种探针具有反应基团以调节并置所述至少第一种和第二种探针，由此提高所述染料之间的能量转移的可能性，所述方法包括：
-提供一探针套，
-提供包含细胞的样品，
-将所述样品与所述探针套接触，
-在允许所述探针在所述融合蛋白上并置的条件下，
-通过FRET检测所述探针的并置，以确定所述融合蛋白的存在。
11.用于检测细胞中的融合蛋白存在的方法，采用一套至少第一种和第二种分子探针的探针套，每一探针能够识别位于所述融合蛋白的融合区域两侧的一结合位点，每一探针还具有一种染料，其中所述染料一起使得能量发生转移，至少一种探针具有反应基团以调节并置所述至少第一种和第二种探针，由此提高所述染料之间的能量转移的可能性，其中所述第一种探针的反应基团不与所述第二种探针直接反应，所述方法包括：
-提供一探针套，
-提供包含细胞的样品，
-将所述样品与所述探针套接触，
-在允许所述探针在所述融合蛋白上并置的条件下，
-将所述探针与能够将至少所述第一种探针的反应基团连接到所述第二种探针上的物质接触，
-通过FRET检测所述探针的并置，以确定所述融合蛋白的存在。
12.权利要求11的方法，其中所述物质使得所述染料并置，彼此的间距在2-100范围内。
13.权利要求11或12的方法，其中所述反应基团包括生物素，而其中所述物质包括抗生物素蛋白或者链霉抗生物素。
14.权利要求9-13中任一项的方法，包括对所述样品的至少一种细胞标记进行染色以确定靶细胞群体，所述方法包括将所述样品与能够选择性地结合到所述细胞标记上的化合物接触，其中所述细胞标记优选是一种分化簇(CD)抗原。
15.权利要求9-14中任一项的方法，其中所述融合蛋白是肿瘤特异性的融合蛋白。
16.权利要求9-15中任一项的方法，其允许在单细胞水平上进行检测，优选采用流式细胞仪。
17.用于提供至少第一种和第二种染料缀合探针并提供至少一种具有能够并置所述第一种和第二种探针的反应基团的探针的方法，其中所述染料一起使得能量发生转移，所述方法包括：
-将每一探针与合适的染料接触，以在所述探针与所述染料之间形成缀合物，
-还包括将至少一种探针与一种反应基团或其衍生物接触以在所述探针与所述反应基团之间形成缀合物。
18.权利要求17的方法，其中所述反应基团包括生物素。
19.包含权利要求1-8中任一项的探针套的诊断试剂盒。
20.权利要求1-8中任一项的探针套或者权利要求9-16中任一项的方法在疾病治疗之前、期间和之后用于评价所述治疗的有效性或者用于诊断和/或分类疾病中的用途。
21.能量转移技术在检测细胞内融合蛋白的存在中的用途，包括使用至少第一种和第二种分子探针，每一探针能够识别位于所述融合蛋白的融合区域两侧的一结合位点，每一探针具有一种染料，其中所述染料一起使得能量发生转移，优选至少一种探针具有使得所述探针并置的反应基团。
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