CN106337082A

CN106337082A - 基于酶法生成随机g四链体的细胞凋亡免标记检测方法

Info

Publication number: CN106337082A
Application number: CN201610272231.7A
Authority: CN
Inventors: 聂舟; 刘卓靓; 黄燕; 骆星宇
Original assignee: Hunan University
Current assignee: Hunan University
Priority date: 2016-04-28
Filing date: 2016-04-28
Publication date: 2017-01-18

Abstract

本发明公开了基于酶法生成随机G四链体的细胞凋亡免标记检测方法，包括如下步骤：(1)将细胞样本固定化；(2)将固定化的细胞样本与底物dNTP加入TdT反应体系孵育，孵育条件为：20—40℃，1—3h；孵育时，以待测细胞样本中凋亡细胞的片段化DNA作为引物，TdT将dNTP底物聚合到DNA缺口端生成G四链体的长链DNA；(3)将经步骤(2)反应后的细胞样本加入硫磺素T中，用荧光显微镜检测，根据荧光信号的强弱实现对凋亡细胞的检测。该方法是一种简便、免单体标记、原位检测凋亡细胞的新方法。

Description

基于酶法生成随机G四链体的细胞凋亡免标记检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及基于酶法生成随机G四链体的细胞凋亡免标记检测方法。

背景技术

细胞凋亡即细胞程序性死亡，是正常组织细胞保持体内平衡的一种生理性自杀。凋亡在许多生理过程中都有着重要作用，比如免疫系统的成熟和效应机制，组织器官胚胎发育，神经系统的发育，以及急速依赖的组织重塑等等。不适当的凋亡会引起缺血、心脏疾病、中风、自身免疫病和中枢神经系统退变性疾病等。近年来的研究发现细胞凋亡是各种抗癌药物引发细胞死亡的主要方式，从而使得细胞凋亡与癌症之间的关系及细胞凋亡在癌症治疗中的作用成为抗肿瘤研究的新焦点。凋亡细胞的检测方法也成为一个研究热点。

细胞凋亡过程中可观察到系列形态学特征和生化特征，据此发展出几种方法以检测凋亡细胞胞内的多种效应。目前广泛使用的细胞凋亡商品化试剂盒是一种检测凋亡过程中DNA片段化的TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end-labeling)法(TdT，末端脱氧核苷酸转移酶)。细胞进入凋亡进程，自身的水解酶对核DNA进行降解，产生大量带有的3’-OH的DNA。传统的TUNEL方法利用荧光染料标记的dUTP作为TdT的延伸单体，在凋亡细胞中延伸带有缺口的DNA片段，然后洗去未反应的标记染料的dUTP单体，在荧光显微镜下成像观察或者制成细胞悬液通过流式细胞仪检测。凋亡细胞的比例与荧光强度正相关。TUNEL最近的发展主要是对底物单体dNTP所连接的信号输出分子进行改进，包括用酶或单克隆抗体标记，利用酶催化反应或抗原抗体识别原理，提高反应的灵敏度和选择性。

目前广泛使用的基于TUNEL法检测细胞凋亡的商品化试剂盒所使用的单体均需要标记，这些标记单体的合成复杂、成本高、保存条件较为严格，造成这类试剂盒价格昂贵、一般需要低温避光保存。检测过程中，固定化细胞经外源TdT酶与带有抗体、酶、荧光基团或者其他功能基团的dNTP孵育后，必须经过严格的清洗过程除去高背景信号(未反应的标记单体)，再通过加入后续反应物或者直接检测荧光信号来实现凋亡细胞的检测。最常用的TUNEL法细胞凋亡检测试剂盒使用荧光基团标记dNTP，整个检测过程需避光，条件控制苛刻，并且试剂盒保存期较短(-20℃，一年)。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种基于酶法生成随机G四链体的细胞凋亡免标记检测方法。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

基于酶法生成随机G四链体的细胞凋亡免标记检测方法，包括如下步骤：

(1)将细胞样本固定化；该步骤为常规方法，具体为：将细胞样本自然风干，用质量百分比浓度为4％的多聚甲醛溶液室温固定10min，磷酸缓冲盐溶液洗两次，每次5min；加入含有1％体积百分比浓度的Triton X-100的磷酸缓冲盐溶液室温促渗5min；磷酸缓冲盐溶液洗两次，每次5min；

(2)将固定化的细胞样本与底物dNTP加入TdT反应体系孵育，孵育条件为：20—40℃，1—3h；孵育时，以待测细胞样本中凋亡细胞的片段化DNA作为引物，TdT将dNTP底物聚合到DNA缺口端生成G四链体的长链DNA；

(3)将经步骤(2)反应后的细胞样本加入硫磺素T(细胞样本数目为10⁵个,硫磺素T的加入量为63.77ng)中，用荧光显微镜检测，根据荧光信号的强弱实现对凋亡细胞的检测。

优选地，每10⁵个细胞样本与底物dNTP加入到50μL TdT反应体系中，底物dNTP在反应体系中的终浓度为1mM。

优选地，步骤(2)所述TdT反应体系中含有30～70个单位的TdT。

优选地，步骤(2)所述底物dNTP含有如下质量百分比含量的组分：dGTP 45％～55％，dATP 35％～45％，dTTP 5％～15％。

更优选地，步骤(2)所述底物dNTP含有如下质量百分比含量的组分：dGTP 50％，dATP 40％，dTTP 10％。

优选地，步骤(3)中每10⁵个细胞样本加入60—65ng，优选为63.77ng硫磺素T。

优选地，步骤(3)中选取荧光显微镜的激发波长为紫光365nm—450nm。

下面对本发明作进一步说明：

针对TUNEL法中标记单体的合成复杂、成本高和检测需严格清洗过程等技术问题，本发明首次提出了在复杂的凋亡细胞体系中利用TdT酶原位合成G四链体实现凋亡细胞的免标记、免清洗、无污染、原位高灵敏检测的技术原理(图1)。该方法使用非标记、含有特定组成的dNTP作为TdT延伸单体，凋亡细胞中片段化DNA作为引物由TdT聚合生成长链DNA，此长链DNA可以形成连续多个的G四链体结构，G四链体结构结合荧光染料硫磺素T(ThT)并能极大增强其荧光。非凋亡细胞中没有片段化DNA，TdT加入不会产生长链DNA，加入ThT后无荧光信号。由于使用了无标记单体dNTP，只有经TdT延伸后加入ThT的凋亡细胞才能产生明显的荧光信号，背景极低，因此待测细胞样品无需清洗就可以用荧光显微镜直接检测。本发明首次利用无标记单体，TdT原位聚合生成的G四链体作为信号分子，实现了凋亡细胞的灵敏检测，具有免标记、免清洗、无污染、高灵敏度和原位检测等特点；同时，检测成本低、样品处理简单、应用前景好。

本发明中采取的技术方案具体为：将细胞(数目:10⁵个)按常规方法固定后与特定组成的底物dNTP(浓度为1mM)以及TdT孵育，以待测细胞样本中凋亡细胞的片段化DNA(不是一定序列的DNA)作为引物，TdT将dNTP底物聚合到DNA缺口端生成G四链体的长链DNA，再加入硫磺素T(浓度为2μM)，用荧光显微镜检测，根据荧光信号的强弱实现对凋亡细胞的检测；每50μL的TdT反应体系中含有30～70个单位的TdT；底物dNTP的质量含量组成为45％～55％dGTP，35％～45％dATP，5％～15％dTTP(优选地，底物dNTP的质量含量组成为50％dGTP，40％dATP，10％dTTP)；反应时间为60-180min，温度为20-40℃；选取荧光显微镜的激发波长为紫光365nm-450nm。

通过对凋亡细胞的片段化DNA检测来反应细胞的凋亡程度，其灵敏度主要取决于对DNA片段的检测。我们首先证明以优化的特定组成的dNTP为单体，TdT可以将单链DNA有效延伸，获得的长链DNA为G四链体构象，可以跟ThT结合产生荧光(图略)。进一步考察了以TdT聚合产生的G四链体长链的DNA作为信号分子对单链DNA的检测，检测限为0.5nM(图略)，证明该方法可以实现单链DNA的检测。在此基础上，我们通过加入DNase I(一种非特异性水解DNA底物的核酸酶)切割基因组DNA产生大量DNA片段，模拟凋亡环境下大量核酸水解酶释放，用本发明方法实现了基因组DNA的检测(图2)，本实验分别考察了基因组DNA在不加入DNase I与TdT，单独加入其中一种酶，和两者分别加入后TdT延伸产物与ThT结合后的荧光强度。由图可知，只有在两种酶分别处理后，才能生成G四链体，并且随着细胞数目的增多，即基因组DNA增多，荧光信号逐步增强。同时，对照实验发现复杂生物体系中的常见分子，如牛血清蛋白、人血清蛋白、凝血酶以及多种氨基酸、细胞色素C、谷胱甘肽、抗坏血酸都不会引起ThT自身的荧光增强，或者淬灭ThT结合G四链体DNA后的荧光。基于以上实验基础，本方法可以实现DNA片段的灵敏、特异性检测。

正常细胞中基因组DNA很少有缺口，不能作为TdT的延伸引物，细胞只有处于凋亡状态下产生的DNA片段才能被TdT延伸，保证方法的特异性。本方法可以有效区分凋亡细胞(药物处理)与非凋亡细胞(未经药物处理)(图3)。由于本方法基于免标记dNTP的TdT延伸检测，没有背景荧光信号，不需要TdT聚合反应后的清洗步骤，使操作更为简便。这里将本方法与商用试剂盒(FITC标记单体)进行比较(图4)，阳性样品经过DNase I处理后产生许多含有很多片段化DNA；通过对商用试剂盒方法(FITC标记单体)与本发明方法在清洗步骤前后的比较，体现出本方法免清洗、低背景的优势；商用试剂盒中对应的暗场为FITC荧光通道，本发明对应的暗场为ThT荧光检测通道。商用试剂盒从加入标记单体后的所有过程需避光，孵育后如果没有清洗步骤，检测时将会产生大量的背景信号。但是基于免标记单体的本方法，溶液中的游离单体不会产生任何背景信号，省略了TdT酶反应后的清洗步骤，并且整个过程无须避光，简化实验操作，更利于方法的推广。

我们构建的这种无标记的聚合体系，首次提出了非标记dNTP在TdT作用下形成G四链体作为输出信号的新原理，较好地实现了对凋亡细胞的原位、特异性检测。与传统方法相比，该方法具有免标记、零污染、低成本、免清洗、较高灵敏度等优点，同时该方法操作处理简单、检测时间短，为凋亡细胞研究提供了有力手段。

综上所述，说明本发明方法是一种简便、免单体标记、原位检测凋亡细胞的新方法。

附图说明

图1为本发明的原理示意图；

图2为基于TdT延伸产生G四链体DNA检测基因组DNA(DNase I处理)结果图；

图3为基于本发明检测凋亡细胞的荧光共聚焦显微镜图；图中A、B、E为十字孢碱(STS)诱导的凋亡细胞，C、D为非诱导细胞；(A)凋亡细胞经TdT延伸；(B)凋亡细胞不加TdT；(C)非凋亡细胞经TdT延伸；(D)非凋亡细胞不加TdT；(E)凋亡细胞经TdT延伸后，加入DNase I(10U)孵育1.5小时，以降解生成的G四聚体长链DNA；最后加入ThT与PI溶液(碘化丙啶，细胞核染料)，采集荧光(暗场)成像图；

图4为商用试剂盒与本发明对DNase I处理的小鼠肾脏模型(阳性样本)的比较图。

具体实施方式

所述基于酶法生成随机G四链体的细胞凋亡免标记检测方法包括如下步骤：

1.细胞样本固定化：

(1)将细胞样本(数目:10⁵个)自然风干，用质量百分比浓度为4％的多聚甲醛溶液室温固定10min，磷酸缓冲盐溶液洗两次，每次5min。

(2)加入含有1％体积百分比浓度的Triton X-100的磷酸缓冲盐溶液室温促渗5min；磷酸缓冲盐溶液洗两次，每次5min。

2.酶法生成随机G四链体：

将按步骤1处理的细胞样品加入50μL的TdT反应液，其中含有60个单位的TdT；1mM的底物dNTP(底物dNTP的质量含量组成为50％dGTP，40％dATP，10％dTTP)在37℃中反应2h(保持湿润环境)。

3.细胞样本检测过程：

将按步骤2处理的细胞样品加入100μL含有2μM的ThT的Tris-HCl(50mMTris-HCl，50mM KCl，pH 7.2)。选取405nm激光光源，共聚焦显微镜采集图像。

效果说明：如图3所示，加入TdT的凋亡细胞样品(图3A)中ThT通道有明显的荧光信号，而凋亡细胞中没有加入TdT(图3B)没有荧光信号，说明在凋亡细胞中，TdT可以延伸片段化的DNA，生成随机排列的G四链体结构，四链体结构结合ThT后特异性地增强其荧光，从而实现凋亡细胞的检测。并且，在不加入TdT的凋亡细胞内无ThT荧光，说明细胞中其他物质不会引起ThT荧光增强而引起假阳性信号。而正常细胞加入TdT(图3C)，和不加入TdT(图3D)在ThT通道内都没有信号。说明基于本发明可以区分正常细胞和凋亡细胞，保证在大量细胞中对凋亡细胞的灵敏检测。

Claims

1.基于酶法生成随机G四链体的细胞凋亡免标记检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)将细胞样本固定化；

(3)将经步骤(2)反应后的细胞样本加入硫磺素T中，用荧光显微镜检测，根据荧光信号的强弱实现对凋亡细胞的检测。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，每10⁵个细胞样本与底物dNTP加入到50μL TdT反应体系中，底物dNTP在反应体系中的终浓度为1mM。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述TdT反应体系中含有30～70个单位的TdT。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述底物dNTP含有如下质量百分比含量的组分：dGTP 45％～55％，dATP 35％～45％，dTTP 5％～15％。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述底物dNTP含有如下质量百分比含量的组分：dGTP 50％，dATP 40％，dTTP 10％。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中每10⁵个细胞样本加入60—65ng硫磺素T。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中每10⁵个细胞样本加入63.77ng硫磺素T。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中选取荧光显微镜的激发波长为紫光365nm—450nm。