CN101760522A - 一种使用gapdh基因分析arhgdib基因表达量的rt-pcr技术 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表达量的RT-PCR技术。本发明分别根据人的ARHGDIB基因mRNA和GAPDH基因mRNA设计并筛选到最佳PCR检测方案，能同时对标本中的两个基因的mRNA进行检测，根据两个基因的mRNA检测Ct值与正常对照两个基因的mRNA检测Ct值的ΔΔCt值，可分析ARHGDIB基因与看家基因-GAPDH基因之间的相对表达量。同时本发明提供相应的一步RT-PCR检测试剂盒。本发明还提供人工合成的两种RNA，减少假阴性的发生率；本发明检测速度快，能排除基因组DNA的干扰，特异性强，且灵敏度高，可用于ARHGDIB基因表达方面的研究和临床。
Description
技术领域
本发明涉及一种使用GAPDH基因mRNA为内参，对ARHGDIB基因进行相对定量的实时荧光RT-PCR扩增检测技术，并形成相应试剂盒，属于分子生物技术领域。
背景技术
随着人类基因组图谱的完成，人们开始进入后基因组时代，重点也转向了研究各基因在生命中的作用，包括基因在生长发育、遗传、疾病、外型体征等方面的作用。其中，对于RhoGDP dissociation inhibitor(GDI)beta基因(ARHGDIB基因)表达的研究也越来越多。
基因表达的检测有几种方法。经典的方法是根据在细胞或生物体中所观察到的生物化学或表型的变化来决定某一特定基因是否表达。随着大分子分离技术的进步使得特异的基因产物或蛋白分子的识别和分离成为可能。随着重组DNA技术的运用，现在有可能检测、分析任何基因的转录产物。目前有好几种方法广泛应用于研究特定RNA分子。这些方法包括RT-PCR、原位杂交、NORTHERN凝胶分析、打点或印迹打点、S-1核酸酶分析、RNA酶保护研究以及基因芯片等。
荧光探针PCR技术是今年兴起并得到快速发展的技术，是将同时带有关联的荧光发光基团(能量供体)和淬灭基团(能量受体)的荧光探针结合PCR技术而产生的一种新的检测技术，具有灵敏度高、特异性强，且不易发生产物污染等特点，包括Taqman探针技术、分子信标(Beacan探针)等，由于该技术操作简便，检测速度快，且各方面性能都有优势，目前在临床、研究等核酸检测领域得到广泛的应用。
GAPDH(Human glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)基因为常用的看家基因，在人体细胞内表达情况较为稳定，已被广泛用于基因表达的研究，利用ΔΔCt值的方法能对其他基因的表达情况进行相对定量分析。公式为：F＝2-ΔΔCt。
本发明将RT-PCR与荧光探针技术结合，通过广泛筛选和优化检测引物和探针，同时对细胞内的GAPDH基因和ARHGDIB基因mRNA进行相对定量分析。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、简便的使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表达量的RT-PCR技术。
为解决上述问题，本发明提供了一种一步法RT-PCR同时检测GAPDH基因mRNA和ARHGDIB基因mRNA的技术。
根据GeneBank序列号为NC_000012的基因序列为模板，设计了一对引物及特异性探针，检测长度为139bp的目标mRNA，其引物探针序列分别为：
引物1：5`-ACCACAGAAGTCCCTGAAAGAGCT-3` (Seq No.1)
引物2：5`-GGTGAGCCGGGTGACAACGAC-3` (Seq No.2)
探针1：5`-TCGGATCTGTCACCACAGGACCA-3` (Seq No.3)
或探针2：5`-TGGTCCTGTGGTGACAGATCCGA-3`(Seq No.4)
设计的探针跨越了NC_000012基因序列中第111098-111743位核苷酸的内含子，分别与其两端的外显子特异性匹配，这样可非常有效的避免基因组DNA对实验结果的影响，同时也省去了使用DNA酶对样本进行消化用以去除DNA干扰的步骤。
根据GeneBank序列号为NW_925295的基因序列为模板，设计了一对引物及特异性探针，检测长度为131bp的内参(GAPDH基因)mRNA，其引物探针序列分别为：
引物3：5`-TCAAGATCATCAGCAATGCCT-3` (Seq No.5)
引物4：5`-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3` (Seq No.6)
探针3：5`-ACTGTGGTCATGAGTCCTTCCACGA-3`(Seq No.7)
或者上述引物序列的互补序列，或者上述序列同源性大于75％的序列。
计的探针跨越了NW_925295基因序列中第2104-2193位核苷酸的内含子，分别与其两端的外显子特异性匹配，这样可非常有效的避免基因组DNA对实验结果的影响，同时也省去了使用DNA酶对样本进行消化用以去除DNA干扰的步骤。
上述试剂盒的探针(探针1、探针2和探针3)，其5`端的荧光发光基团可为FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Fluorescein、Rhodamine、Rhodamine Red、Rhodamine Green、Rhodamine6G、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine orange或ROX中任意一种；3`端荧光淬灭基团可为DABCYL、DABSYL、Eclipse、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或MGB基团中的任意一种。
本发明提供的使用GAPDH基因mRNA分析ARHGDIB基因相对表达量的RT-PCR试剂盒是使用一步法RT-PCR的技术，使操作更为简便、快速。使用表达量相对稳定的GAPDH基因与目标基因同时检测，能对标本中的ARHGDIB基因mRNA进行相对表达量进行定量分析。
本发明提供的使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表达量的RT-PCR技术形成的试剂盒，使用2个人工合成的RNA序列作为RNA阳性对照品，序列为：
模板1：ACCACAGAAGUCCCUGAAAGAGCUGCAGGAAAUGGACAAAGAUGAUGAGAGUCUAAUUAAGUACAAGAAAACGCUGCUGGGAGAUGGUCCUGUGGUGACAGAUCCGAAAGCCCCCAAUGUCGUUGUCACCCGGCUCACC(139bp)(Seq No.8)
模板2：UCAAGAUCAUCAGCAAUGCCUCCUGCACCACCAACUGCUUAGCACCCCUGGCCAAGGUCAUCCAUGACAACUUUGGUAUCGUGGAAGGACUCAUGACCACAGUCCAUGCCAUCACUGCCACCCAGAAGACU(131bp)(Seq No.9)
其中，ARHGDIB基因mRNA检测体系使用模板1作为阳性对照品，GAPDH基因mRNA检测体系使用模板2作为阳性对照品。
本发明提供的使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表达量的RT-PCR技术形成的试剂盒组成为：
组成成分(20人份/盒) 体积
反应缓冲液A 380μl
反应缓冲液B 380μl
混合酶 60μl
RNA阳性对照品A 30μl
RNA阳性对照品B 30μl
DEPC水 1ml
其中，反应缓冲液的组分(终浓度)包括：50mM Tris-HCl(PH 8.3)、50mM KCl、300uMdNTP、3mM MgCl2，而且ARHGDIB基因mRNA检测体系(反应缓冲液A)含200nM引物1、200nM引物2和200nM探针1，GAPDH基因mRNA检测体系(反应缓冲液B)含200nM引物3、200nM引物4和200nM探针3，其中，两条探针的5`端标记的发光基团均为FAM，在3`端标记的淬灭基团均为Eclipse。混合酶的组成成份(终浓度)包括：0.5U AMV酶、0.5U RNase Inhibitor、0.1mg/ml BSA、5mM DTT、1.5U Taq酶、0.05U UNG酶。
本发明提供的试剂盒操作步骤如下：
PCR反应液的配制：
A管：按每人份反应缓冲液A 19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反应液，并按22ul/管分装到0.2ml PCR管中，然后加入适量待检的总RNA并补充DEPC水，使反应总体积为30ul；
B管：按每人份反应缓冲液B 19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反应液，并按22ul/管分装到0.2ml PCR管中，然后加入适量待检的总RNA并补充DEPC水，使反应总体积为30ul；
RNA阳性对照品直接取8ul，A管使用RNA阳性对照品A，B管使用RNA阳性对照品B，按如下程序进行一步法RT-PCR检测：反应管先在50℃反应5分钟，然后95℃保温5分钟，再按94℃20秒→60℃35秒循环40次(60℃退火条件下采集荧光)。
采用比较Ct值的相对定量法，即通过标本的两管检测Ct值与正常对照品的两管检测Ct值的ΔΔCt值，根据F＝2-ΔΔCt公式计算ARHGDIB基因相对GAPDH基因的表达量。
传统的RT-PCR使用两步法扩增，时间长，操作相对复杂，且因多了一个步骤而易发生污染，所以本发明提供的试剂盒采用一步法RT-PCR技术，将RT步骤与PCR步骤一步完成，无须开管进行二次加样，将少了污染的机会。由于反应体系中RT步骤是使用特异性引物进行延伸，与传统的随机引物法相比，逆转录需要的时间更短，通常可在1.5小时内完成全部RT-PCR反应，并且由于试剂盒使用热稳定性较强的AMV逆转录酶，可在50℃进行RT反应，产品的特异性非常高。
具体实施方式
根据GeneBank中的人类基因组12号染色体ARHGDIB基因相关序列进行比对和分析，设计和制备引物与探针(设计模板GeneBank序列号为NC_000012)：
引物1：5`-ACCACAGAAGTCCCTGAAAGAGCT-3` (Seq No.1)
引物2：5`-GGTGAGCCGGGTGACAACGAC-3` (Seq No.2)
探针1：5`-FAM-TCGGATCTGTCACCACAGGACCA-Eclipse-3`(Seq No.3)
设计并制备人工合成RNA序列：
ACCACAGAAGUCCCUGAAAGAGCUGCAGGAAAUGGACAAAGAUGAUGAGAGUCUAAUUAAGUACAAGAAAACGCUGCUGGGAGAUGGUCCUGUGGUGACAGAUCCGAAAGCCCCCAAUGUCGUUGUCACCCGGCUCACC(139bp)(Seq No.8)
根据GeneBank中的人类基因组12号染色体GAPDH基因相关序列进行比对和分析，设计和制备引物与探针(设计模板GeneBank序列号为NW_925295)：
引物3：5`-TCAAGATCATCAGCAATGCCT-3` (Seq No.5)
引物4：5`-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3` (Seq No.6)
探针3：5`-FAMACTGTGGTCATGAGTCCTTCCACGAEclipse-3`(Seq No.7)
设计并制备人工合成RNA序列：
UCAAGAUCAUCAGCAAUGCCUCCUGCACCACCAACUGCUUAGCACCCCUGGCCAAGGUCAUCCAUGACAACUUUGGUAUCGUGGAAGGACUCAUGACCACAGUCCAUGCCAUCACUGCCACCCAGAAGACU(131bp)(Seq No.9)
将人工合成的两条RNA序列用DEPC处理过的水溶解并稀释至适当浓度，分别作为ARHGDIB和GAPDH基因mRNA的阳性对照品。
按如下配方配制反应缓冲液A(终浓度)：50mM Tris-HCl(PH 8.3)、50mM KCl、300uMdNTP、3mM MgCl2、200nM引物1、200nM引物2和200nM探针1。
按如下配方配制反应缓冲液B(终浓度)：50mM Tris-HCl(PH 8.3)、50mM KCl、300uMdNTP、3mM MgCl2、200nM引物3、200nM引物4和200nM探针3。
按如下配方配制混合酶(终浓度)：0.5U AMV酶、0.5U RNase Inhibitor、0.1mg/ml BSA、5mM DTT、1.5U Taq酶、0.05U UNG酶。
试剂盒组成为：
组成成分(20人份/盒) 体积
反应缓冲液A 380μl
反应缓冲液B 380μl
混合酶 60μl
RNA阳性对照品A 30μl
RNA阳性对照品B 30μl
DEPC水 1ml
本发明提供的试剂盒未提供mRNA提取试剂，用户可根据自身要求使用传统的酚-氯仿提取方法或购买商业化的RNA提取试剂盒。
检测步骤：
PCR反应液的配制：
A管：按每人份反应缓冲液A 19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反应液，并按22ul/管分装到0.2ml PCR管中，然后加入适量待检的总RNA并补充DEPC水，使反应总体积为30ul；
B管：按每人份反应缓冲液B 19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反应液，并按22ul/管分装到0.2ml PCR管中，然后加入适量待检的总RNA并补充DEPC水，使反应总体积为30ul；
RNA阳性对照品直接取8ul，A管使用RNA阳性对照品A，B管使用RNA阳性对照品B，按如下程序进行一步法RT-PCR检测：反应管先在50℃反应5分钟，然后95℃保温5分钟，再按94℃20秒→60℃35秒循环40次(60℃退火条件下采集荧光)。
结果分析与监控：
根据仪器分析的结果，在如下情况视实验有效：对照品A和对照品B的Ct值均＜32且大于26。
根据公式F＝2-ΔΔCt计算相对表达量。
也有部分全自动荧光PCR扩增仪可直接读取ΔΔCt值。
SEQUENCE LISTING
<110>上海复星医药(集团)股份有限公司
上海复星医学科技发展有限公司
剑军，何
懿，夏
<120>一种使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表达量的RT-PCR技术
<160>9
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
accacagaag tccctgaaag agct 24
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
ggtgagccgg gtgacaacga c 21
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
tcggatctgtcaccacagga cca 23
<210>4
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
tggtcctgtg gtgacagatc cga 23
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
tcaagatcat cagcaatgcc t 21
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
agtcttctgg gtggcagtga t 21
<210>7
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
actgtggtca tgagtccttc cacga 25
<210>8
<211>139
<212>RNA
<213>人工序列
<400>8
accacagaag ucccugaaag agcugcagga aauggacaaa gaugaugaga gucuaauuaa 60
guacaagaaa acgcugcugg gagauggucc uguggugaca gauccgaaag cccccaaugu 120
cguugucacc cggcucacc 139
<210>9
<211>131
<212>RNA
<213>人工序列
<400>9
ucaagaucau cagcaaugcc uccugcacca ccaacugcuu agcaccccug gccaagguca 60
uccaugacaa cuuugguauc guggaaggac ucaugaccac aguccaugcc aucacugcca 120
cccagaagac u 131
Claims (7)
1.一种使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表达量的RT-PCR技术，其特征在于包含用于检测ARHGDIB基因mRNA的一对特异性引物和一条特异性探针以及用于检测GAPDH基因mRNA的一对特异性引物和一条特异性探针，扩增目标片段长度分别为139bp和131bp，引物和探针序列分别为：
检测ARHGDIB基因mRNA的引物和探针：
引物1：5`-ACCACAGAAGTCCCTGAAAGAGCT-3`(Seq No.1)
引物2：5`-GGTGAGCCGGGTGACAACGAC-3`(Seq No.2)
探针1：5`-TCGGATCTGTCACCACAGGACCA-3`(Seq No.3)
或探针2：5`-TGGTCCTGTGGTGACAGATCCGA-3`(Seq No.4)
检测GAPDH基因mRNA的引物和探针：
引物3：5`-TCAAGATCATCAGCAATGCCT-3`(Seq No.5)
引物4：5`-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3`(Seq No.6)
探针3：5`-ACTGTGGTCATGAGTCCTTCCACGA-3`(Seq No.7)
或者上述引物序列的互补序列，或者上述序列同源性大于75％的序列。
2.根据权利要求1所述的一种使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表达量的RT-PCR技术，其特征在于标记探针5`端的荧光发光基团可为FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Fluorescein、Rhodamine、Rhodamine Red、Rhodamine Green、Rhodamine 6G、Oregon Green488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine orange或ROX中任意一种；3`端荧光淬灭基团可为DABCYL、DABSYL、Eclipse、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或MGB基团中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的一种使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表达量的RT-PCR技术，其特征在于使用一步法RT-PCR荧光检测技术，对待测标本和正常对照品中的ARHGDIB基因mRNA和GAPDH基因mRNA同时进行检测，对ARHGDIB基因的表达量进行相对定量分析。
4.根据权利要求1所述的一种使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表达量的RT-PCR技术，其特征在于，可形成试剂盒，使用2个人工合成的RNA序列作为RNA阳性对照品，序列为：
模板1：ACCACAGAAGUCCCUGAAAGAGCUGCAGGAAAUGGACAAAGAUGAUGAGAGUCUAAUUAAGUACAAGAAAACGCUGCUGGGAGAUGGUCCUGUGGUGACAGAUCCGAAAGCCCCCAAUGUCGUUGUCACCCGGCUCACC(139bp)(Seq No.8)
模板2：UCAAGAUCAUCAGCAAUGCCUCCUGCACCACCAACUGCUUAGCACCCCUGGCCAAGGUCAUCCAUGACAACUUUGGUAUCGUGGAAGGACUCAUGACCACAGUCCAUGCCAUCACUGCCACCCAGAAGACU(131bp)(Seq No.9)。
5.根据权利要求4所述的使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表达量的RT-PCR技术形成的试剂盒，其特征在于，ARHGDIB基因mRNA检测体系使用模板1作为阳性对照品，GAPDH基因mRNA检测体系使用模板2作为阳性对照品。
6.根据权利要求4所述的一种使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表达量的RT-PCR技术形成的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒组成为：
组成成分(20人份/盒) 体积
反应缓冲液A 380μl
反应缓冲液B 380μl
混合酶 60μl
RNA阳性对照品A 30μl
RNA阳性对照品B 30μl
DEPC水 1ml
其中，反应缓冲液的组分(终浓度)包括：50mM Tris-HCl(Ph 8.3)、50mM KCl、300uMdNTP、3mM MgCl2，而且ARHGDIB基因mRNA检测体系(反应缓冲液A)含200nM引物1、200nM引物2和200nM探针1，GAPDH基因mRNA检测体系(反应缓冲液B)含200nM引物3、200nM引物4和200nM探针3，其中，两条探针的5`端标记的发光基团均为FAM，在3`端标记的淬灭基团均为Eclipse。混合酶的组成成份(终浓度)包括：0.5U AMV酶、0.5U RNaseInhibitor、0.1mg/ml BSA、5mM DTT、1.5U Taq酶、0.05U UNG酶。RNA阳性对照品A和RNA阳性对照品B分别为适当浓度的模板1和模板2。
7.根据权利要求6所述的一种使用GAPDH基因分析ARHGDIB基因表达量的RT-PCR技术形成的试剂盒，其特征在于，操作步骤如下：
PCR反应液的配制：
A管：按每人份反应缓冲液A 19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反应液，并按22ul/管分装到0.2ml PCR管中，然后加入适量待检的总RNA并补充DEPC水，使反应总体积为30ul；
B管：按每人份反应缓冲液B 19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反应液，并按22ul/管分装到0.2ml PCR管中，然后加入适量待检的总RNA并补充DEPC水，使反应总体积为30ul；
RNA阳性对照品直接取8ul，A管使用RNA阳性对照品A，B管使用RNA阳性对照品B，按如下程序进行一步法RT-PCR检测：反应管先在50℃反应5分钟，然后95℃保温5分钟，再按94℃20秒→60℃35秒循环40次(60℃退火条件下采集FAM通道荧光)。
结果分析，根据标本的两管检测Ct值与正常对照品的两管检测Ct值的ΔΔCt值，对ARHGDIB进行相对定量分析。
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| CN102443636A (zh) * | 2011-11-28 | 2012-05-09 | 山东博奥克生物科技有限公司 | 通用gapdh基因荧光定量聚合酶链式反应试剂盒 |
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-
2008
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20100630 |