CN111406217A - 包含铁螯合剂的凝血酶原时间试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明属于凝血诊断领域，涉及基于重组或天然组织因子蛋白和磷脂的凝血酶原时间试剂，其能够通过添加选自由铁载体和3,5‑二苯基‑1,2,4‑三唑构成的组中的铁螯合剂来稳定。

Description

包含铁螯合剂的凝血酶原时间试剂
技术领域
本发明属于凝血诊断领域，并且涉及基于重组或天然组织因子蛋白和磷脂的凝血酶原时间试剂，该凝血酶原时间试剂能够通过添加选自由铁载体和3,5-二苯基-1,2,4-三唑构成的组中的铁螯合剂来稳定。
背景技术
组织因子蛋白(简称组织因子或凝血活酶，英文为tissue factor)是一种对血液凝固至关重要的跨膜蛋白。它由通常不与流动的血液接触的细胞表达，例如由内皮下(平滑肌)中的细胞和血管周围的细胞(例如成纤维细胞)表达。然而，在血管受损的情况下，表达组织因子蛋白的细胞与因子VII发生接触，因子VII是在血液中循环的促凝血因子。在钙的存在下，组织因子蛋白和因子VII形成复合物，并且因子VII的活性增加约一千倍(F VII>FVIIa)。在磷脂和钙存在的情况下，由组织因子蛋白和因子VIIa构成的复合物催化非活化凝血因子X转化为活化因子Xa，从而加速凝血过程。组织因子与因子VII一起形成所谓的外源性凝血途径，通过该途径会通过尽可能快的血液凝结以防止血管的损伤。
在凝血诊断中，已经开发出不同的体外测试方法，借助于这些方法能够确定患者的血液或血浆是否能够毫无问题地凝结，或者是否存在凝结障碍。在凝血障碍的情况下，通常需要获得有关存在障碍的原因的更精确认知，以便能够选择最佳的治疗措施。为了研究血液凝结的不同的分功能，特别是为了研究血液凝结的外源性系统，使用组织因子蛋白作为活化剂。组织因子蛋白作为凝血激活剂的最广为人知的应用是用于确定凝血酶原时间(PT)(同义词：凝血活酶时间)的所谓快速测试。在快速测试及其变体方案中，通常将血浆样品与组织因子蛋白、磷脂和钙离子的混合物混合，并以秒为单位测量从混合的时间点直到能够检测到的纤维蛋白形成为止的持续时间。可替代地，在使用发色底物的凝血测试中，一种测试方法测量从混合的时间点直到达到特定吸光度变化为止的持续时间。组织因子蛋白还用于其他测试方法中，这些测试方法不用于确定凝血时间，而是用于确定凝血系统的各个成分，例如凝血酶生成潜力(ETP)(EP-A2-420332)。原则上，组织因子蛋白可用于涉及外源性凝血的各成分的所有测试。
凝血酶原时间试剂(组织因子试剂、PT试剂)对于相应测试具有中心意义。通常，凝血酶原时间试剂包括组织因子以及凝血活性磷脂。组织因子蛋白或者作为组织提取物从不同物种(例如兔子、人、牛)的不同器官(例如大脑、胎盘、肺)中获得，或者重组产生。在现有技术中已知用于获得组织因子蛋白和制备凝血酶原时间试剂的多种方法，并且许多凝血酶原时间试剂是可商购的。
目前，大多数可购买的凝血酶原时间试剂以冻干形式出售，因此在使用之前必须溶解在重构介质中，例如溶解在蒸馏水或缓冲溶液中。对此的原因是液态试剂的稳定性差。以冻干形式提供的试剂的缺点不仅在于制造商和用户必须执行附加的时间和成本密集的方法步骤(冻干和重构)，而且这些附加的步骤包含会导致损害试剂质量的错误的风险。因此，期望的是液态、即用的试剂配方。但是，提供液态的凝血酶原时间试剂的问题是它们的稳定性差。凝血酶原时间试剂的稳定性例如能够理解为在储存期间维持对于规定血浆(例如正常血浆)的凝血酶原时间。理想情况下，凝血酶原时间试剂应在其储存或使用期间维持其技术规格，或者说在最好情况下，应保持其生产时间点具有的属性和特征。
在现有技术中描述了用于稳定液态凝血酶原时间试剂的不同策略。在EP-A2-942284中描述了一种基于重组组织因子的液态凝血酶原时间试剂，其通过组合添加抗坏血酸和血清白蛋白而被稳定。在US 3,522,148中描述了一种包含从组织中提取的(天然)组织因子蛋白的液态凝血酶原时间试剂，其通过添加特定的钠盐或钙盐而被稳定。在EP-A1-585987中描述了另一种基于天然组织因子蛋白的液态凝血酶原时间试剂，其通过添加不同的稳定剂(例如白蛋白或聚乙二醇)以及不同的抗菌活性物质(例如叠氮化钠或抗生素)而被稳定。在EP-A2-524803中描述了一种用于制备凝血酶原时间试剂的方法，在该方法中，金属离子螯合剂，特别是EDTA或EGTA，被用于组织因子的提取并且能够包含在制备好的试剂中。与金属离子螯合剂结合的钙离子量能够通过添加额外的钙盐来代替。
在US 2017/0234895 A1描述了一种用于制备即用的液态凝血酶原时间试剂的两件式试剂盒，该试剂盒在第一容器中包含具有组织因子蛋白和磷脂的第一溶液，在第二容器中包含氯化钙溶液。为了稳定目的，在第一溶液中包含钙螯合剂。两种溶液首先在即将使用前由用户彼此混合。在此，尽管在制造商方面能够省去冻干，并且在用户方面能够省去冻干试剂的重构，然而用户还总是必须将两种液体彼此混合以获得即用的凝血酶原时间试剂。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种在液态下长期稳定的即用的凝血酶原时间试剂，该凝血酶原时间试剂能够至少包含至少一种组织因子蛋白和磷脂，并且能够可选地还包含钙离子。
已经发现，添加铁螯合剂，特别是来自包含铁载体(Siderophore)的组中的铁螯合剂(对此特别是添加去铁胺、荧光铁载体(荧光嗜铁素，Pyoverdin)或铁色素(高铁色素，Ferrichrom))，或者添加来自3,5-二苯基-1,2,4-三唑类的组中的铁螯合剂(对此特别是添加地拉莫司)，提高了包含组织因子和磷脂以及可选的钙离子的含水溶液的稳定性。根据本发明的、稳定的并以液态储存的凝血酶原时间试剂在+37℃的情况下在储存10周后仍提供与该期限开始时的PT测量结果偏差小于20％的凝血酶原时间(PT)测量结果。在+37℃的情况下强制储存10周以用于快速评估：在+2℃至+8℃的情况下，是否能够期待12个月或更长时间的储存稳定性。如果稳定的凝血酶原时间试剂在+37℃的情况下储存10周后提供的凝血酶原时间(PT)测量结果与该期限开始时的PT测量结果偏差小于20％，则能够期待该试剂在+2℃至+8℃的储存温度下在12个月或更长时间是稳定的。
因此，本发明的主题是一种包含组织因子蛋白和磷脂的凝血酶原时间试剂，该凝血酶原时间试剂还包含至少一种铁螯合剂，其中，至少一种铁螯合剂选自由铁载体和3,5-二苯基-1,2,4-三唑构成的组中。
铁载体是一类铁结合螯合剂，其由微生物(例如细菌和真菌)和由植物形成，并且对铁(III)离子(Fe3+离子)具有高亲和力。优选的铁载体是来自六齿羟肟酸盐/酯(异羟肟酸酯/盐，Hydroxamate)的组中的铁载体，例如去铁胺、荧光铁载体和铁菌素(Ferricrocin)。
优选地，来自铁载体的组中的铁螯合剂选自由去铁胺、荧光铁载体和铁色素构成的组中。
在一个实施方式中，根据本发明的凝血酶原时间试剂包含铁螯合剂：去铁胺，其来自六齿羟肟酸酯/盐(同义词：除铁能(Desferrioxamin)；商品名：得斯芬(Desferal))的组中，并且其例如由多毛链霉菌(Streptomyces pilosus)形成。
在另一实施方式中，根据本发明的凝血酶原时间试剂包括铁螯合剂：荧光铁载体、非核糖体多肽，它们例如由荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)形成，并且被分类到六齿混合羟肟酸酯/盐型铁载体和儿茶酚盐/酯型铁载体的组中。来自六齿混合羟肟酸酯/盐型铁载体和儿茶酚酯/盐型铁载体的组中的其他合适的铁螯合剂，例如是杂菌素(Heterobactin)和耶尔森菌素(Yersinibactin)。
在另一实施方式中，根据本发明的凝血酶原时间试剂包括铁螯合剂：铁色素，其是由三个甘氨酸和羟基化和乙酰化的鸟氨酸基团构成的环状六肽(同义词：去铁铁色素)，其例如由稗粒黑粉菌(Ustilago sphaerogena)形成并且同样被归类到六齿羟肟酸酯/盐的组中。
3,5-二苯基-1,2,4-三唑类是一类铁结合螯合剂，这种螯合剂还被开发用于治疗目的(EP-B1-0914118)。优选地，3,5-二苯基-1,2,4-三唑类是地拉罗司、[3,5-二(2-羟苯基)-[1,2,4]三唑-1-基]乙酸乙基酯和3,5-二(2-羟苯基)-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-[1,2,4]三唑。
在相应的实施方式中，根据本发明的凝血酶原时间试剂包含来自3,5-二苯基-1,2,4-三唑类的组中的铁螯合剂，对此特别是地拉罗司(IUPAC名称：4-[(3Z,5E)-3,5-二(6-氧代环己-2,4-二烯-1-基)-1,2,4-三唑烷-1-基]苯甲酸)、[3,5-二(2-羟苯基)-[1,2,4]三唑-1-基]乙酸乙基酯或3,5-二(2-羟苯基)-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-[1,2,4]三唑。
根据本发明的凝血酶原时间试剂包含浓度优选为0.007至2.5mmol/L，特别优选为0.01至0.5mmol/L的上述合适的铁螯合剂之一。
根据本发明的凝血酶原时间试剂能够包含上述合适的铁螯合剂之一，或由两种、三种、四种或更多种上述合适的铁螯合剂构成的组合。
在特别优选的实施方式中，根据本发明的凝血酶原时间试剂还包含钙离子。为此目的，凝血酶原时间试剂能够包含浓度优选为5至500mmol/L的氯化钙。
凝血酶原时间试剂中包含的组织因子蛋白优先选自由人或动物(例如兔、牛等)的重组组织因子蛋白和来自组织提取物(例如来自大脑、胎盘、肺等)的天然的人或动物组织因子蛋白构成的组中。
磷脂能够来自天然和/或合成来源。
尽管本发明的特别优点在于，根据本发明的凝血酶原时间试剂能够作为即用的液态试剂储存，然而当然也能够将试剂以可在水或缓冲液中重构的冻干剂的形式提供。
本发明的另一主题是一种用于制备液态凝血酶原时间试剂的方法，其中，提供液体，该液体包含组织因子蛋白、磷脂和至少一种铁螯合剂，铁螯合剂选自由铁载体和3,5-二苯基-1,2,4-三唑构成的组中，铁载体优选是去铁胺、荧光铁载体或铁色素，3,5-二苯基-1,2,4-三唑优选是地拉罗司、[3,5-二(2-羟苯基)-[1,2,4]三唑-1-基]乙酸乙基酯、或者3,5-二(2-羟苯基)-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-[1,2,4]三唑；并将该液体填充到试剂瓶中，而无需将该液体冻干。
本发明的另一主题是一种用于稳定包含组织因子蛋白和磷脂以及可选的Ca2+离子的凝血酶原时间试剂的方法，通过将至少一种铁螯合剂添加到试剂中来实现，铁螯合剂选自由铁载体和3,5-二苯基-1,2,4-三唑构成的组中，其中，铁载体优选是去铁胺、荧光铁载体或铁色素，而3,5-二苯基-1,2,4-三唑优选是地拉罗司、[3,5-二(2-羟苯基)-[1,2,4]三唑-1-基]乙酸乙基酯或3,5-二(2-羟苯基)-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-[1,2,4]三唑。
优选地，在根据本发明的稳定方法中，加入一定量的铁螯合剂，使得试剂包含的铁螯合剂的最终浓度为0.007至2.5mmol/L，特别优选为0.01至0.5mmol/L。
本发明的另一个主题是根据本发明的凝血酶原时间试剂在体外方法中用于确定患者样品中的凝血参数的应用，特别是用于确定由凝血酶原时间(PT，也称为快速测试)及其变体方案、由凝血酶原时间导出的纤维蛋白原和凝血酶生成潜力(ETP)构成的组中的凝血参数。根据本发明的试剂适合用作为凝血级联的激活剂，例如应用在基于探测纤维蛋白凝块的测试方法中，以及在发色或荧光的测试方法中。
本发明还涉及用于确定血浆样品中凝血参数的方法，其中，将血浆样品与根据本发明的凝血酶原时间试剂混合成反应混合物，并确定反应混合物中的凝血参数。凝血参数能够例如是样品(例如人全血或血浆样品)的凝血酶原时间或凝血酶生成潜力。
为了确定凝血酶原时间，优选以光度法测量反应混合物的吸光度变化，并且确定从根据本发明的凝血酶原时间试剂与血浆样品混合的时间点直至达到阈值为止的持续时间。
为了由凝血酶原时间测定导出的纤维蛋白原浓度(“导出的纤维蛋白原”)，以光度法测量反应混合物的吸光度增加；该吸光度增加与纤维蛋白原浓度相关。
本发明还涉及铁螯合剂在制备包含组织因子蛋白和磷脂的凝血酶原时间试剂中的应用，其中，铁螯合剂选自由铁载体和3,5-二苯基-1,2,4-三唑构成的组中。来自铁载体的组优选使用的铁螯合剂选自由去铁胺、荧光铁载体和铁色素构成的组中。来自3,5-二苯基-1,2,4-三唑的组优选使用的铁螯合剂选自由地拉罗司、[3,5-二(2-羟苯基)-[1,2,4]三唑-1-基]乙酸乙基酯和3,5-二(2-羟苯基)-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-[1,2,4]三唑构成的组中。
附图说明
图1示出了经过几周时间(t)具有利用去铁胺稳定的PT试剂(9＝9mg/L＝0.0137mM去铁胺；12＝12mg/L＝0.0183mM去铁胺；15＝15mg/L＝0.0228mM去铁胺)的正常质控血浆Ci-Trol 1以秒为单位(PT[s])的凝血酶原时间变化，其与未稳定的无去铁胺(0＝0mg/L＝0mM去铁胺)的PT试剂、以及与冻干储存并在相应时间点新鲜溶解的参比试剂(R)比较。这些试剂在37℃的温度下储存。
图2示出了经过几周时间(t)具有利用去铁胺稳定的PT试剂(9＝9mg/L＝0.0137mM去铁胺；12＝12mg/L＝0.0183mM去铁胺；15＝15mg/L＝0.0228mM去铁胺)的异常质控血浆Ci-Trol 2以秒为单位(PT[s])的凝血酶原时间变化，其与未稳定的无去铁胺(0＝0mg/L＝0mM去铁胺)的PT试剂、以及与冻干储存并在相应时间点新鲜溶解的参比试剂(R)比较。这些试剂在37℃的温度下储存。
图3示出了经过几周时间(t)具有利用去铁胺稳定的PT试剂(15＝15mg/L＝0.0228mM去铁胺；75＝75mg/L＝0.114mM去铁胺；150＝150mg/L＝0.228mM去铁胺)的正常质控血浆Ci-Trol 1以秒为单位(PT[s])的凝血酶原时间变化，其与未稳定的无去铁胺(0＝0mg/L＝0M去铁胺)的PT试剂比较。这些试剂在37℃的温度下储存。
图4示出了经过几周时间(t)具有利用去铁胺稳定的PT试剂(15＝15mg/L＝0.0228mM去铁胺；75＝75mg/L＝0.114mM去铁胺；150＝150mg/L＝0.223mM去铁胺)的异常质控血浆Ci-Trol 2以秒为单位((PT[s])的凝血酶原时间变化，其与未稳定的无去铁胺(0＝0mg/L＝0mM去铁胺)的PT试剂比较。这些试剂在37℃的温度下储存。
具体实施方式
以下实施例用于解释本发明，但不应理解为是对本发明的限制。
实施例1：测定利用去铁胺稳定的液态凝血酶原时间试剂的稳定性
在时间点t0，以不同批次将去铁胺(去铁胺甲磺酸盐，Sigma-Aldrich ChemieGmbH，斯坦海姆，德国)以如下最终浓度添加到包括重组人组织因子蛋白、合成磷脂和钙离子的液态凝血酶原时间试剂中：
1.0mM去铁胺，
2.0.0137mM(9mg/L)去铁胺，
3.0.0183mM(12mg/L)去铁胺，
4.0.0228mM(15mg/L)去铁胺，
5.0.114mM(75mg/L)去铁胺，
6.0.228mM(150mg/L)去铁胺。
在
Figure BDA0002511100090000091
CA-1500分析仪(Sysmex Corp.，神户，日本)中，在自动凝血酶原时间测试(PT测试)中使用不同试剂。使用以下规定的质控血浆作为样品：
·
Figure BDA0002511100090000092
凝结控制级别1(Ci-Trol 1)质控血浆；用于确定凝血酶原时间的正常质控；结果与那些新鲜的正常枸橼酸盐血浆类似。
·
Figure BDA0002511100090000093
凝结质控级别2(Ci-Trol 2)质控血浆；用于确定在凝血障碍中可观察到的凝血酶原时间的异常质控；与那些新鲜的正常枸橼酸盐血浆相比，凝血时间延长。
将样品和试剂分别预热至37℃，然后混合。通过添加试剂触发凝结过程，并且测量直到形成纤维蛋白凝块的时间(凝血酶原时间以秒为单位)。
为了测定不同试剂的长期稳定性，将这些试剂以液态在+37℃下在用塞子封闭的玻璃瓶中储存16-18周的时间。大约每两周采集试剂样品，并测定同一参比血浆的凝血酶原时间。作为参比试剂，在每个时间点，将冻干的凝血酶原时间试剂(
Figure BDA0002511100090000101
试剂，西门子医疗诊断产品有限公司，德国)用蒸馏水新鲜重构并进行测量。
在图1(Ci-Trol 1作为样品)和图2(Ci-Trol 2作为样品)中示出了在37℃下经过16周时间的不同凝血酶原时间试剂(0、12、15mg/L去铁胺)的凝血酶原时间。仅利用冻干并分别新鲜溶解的参比试剂(R)以及利用根据本发明的用去铁胺稳定的凝血酶原时间试剂，才能实现经过至少10周时间段与在时间点t0的初始值相比小于20％偏差的稳定的凝血酶原时间。在没有去铁胺的情况下，以液态储存的试剂最迟在4周后就产生剧烈偏差的凝血酶原时间。
在图3(Ci-Trol 1作为样品)和图4(Ci-Trol 2作为样品)中示出了在37℃下经过18周时间的不同凝血酶原时间试剂(15、75、150mg/L去铁胺)的凝血酶原时间。仅利用根据本发明的用去铁胺稳定的凝血酶原时间试剂，才能实现经过至少10周时间与在时间点t0的初始值相比小于20％偏差的稳定的凝血酶原时间。在没有去铁胺的情况下，以液态储存的试剂最迟在4周后就产生剧烈偏差的凝血酶原时间。
实施例2：测定利用不同铁螯合剂稳定的液态凝血酶原时间试剂的稳定性
在时间点t0处，以不同批次将以下金属离子螯合剂分别以0.0228mol/L添加至包含重组人组织因子蛋白、合成磷脂和钙离子的液态凝血酶原时间试剂：
i.荧光铁载体(Pyoverdines，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Steinheim，德国)；
ii.铁色素(来自稗粒黑粉菌(Ustilago sphaerogena)的游离铁铁色素，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，斯坦海姆，德国)；
iii.去铁胺(去铁胺甲磺酸盐，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，斯坦海姆，德国)；去铁胺(去铁胺甲磺酸盐，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，斯坦海姆，德国)；
iv.地拉罗司(Combi-Blocks,Inc.，美国圣地亚哥)；
v.DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)；
vi.EDTA(乙二胺四乙酸)；
vii.BAPTA(1,2-二(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸)。
如实施例1所描述的，在
Figure BDA0002511100090000111
CA-1500分析仪(Sysmex Corp.，神户，日本)中，在自动凝血酶原时间测试(PT测试)中使用不同试剂。使用实施例1中详细描述的质控血浆Ci-Trol 1和Ci-Trol 2作为样品。
为了测定不同试剂的长期稳定性，将试剂以液态在+37℃下在用塞子密封的玻璃瓶中储存经过16-18周的时间。大约每月采集试剂样品，并测定同一参比血浆的凝血酶原时间。
在表1中(Ci-Trol 1质控血浆作为样品)和表2中(Ci-Trol 2质控血浆作为样品)示出了在时间点t0、在两个月和四个月储存(2M，4M)后的不同测量结果(凝血酶原时间，以秒为单位，PT[s])，以及与时间点t0的凝血酶原时间测定的％形式的相应偏差。
表1
Figure BDA0002511100090000121
表2
Figure BDA0002511100090000122
只有利用根据本发明的铁螯合剂，即利用荧光铁载体、铁色素、去铁胺或地拉罗司稳定的凝血酶原时间试剂，才能实现经过四个月(即至少16周)的时间相对于在时间点t0的初始值的偏差小于20％的稳定的凝血酶原时间。不仅是没有螯合剂的液态储存试剂，而且添加有现有技术(US2017/0234895A1)中已知的金属离子螯合剂DTPA、EDTA或BAPTA的液态储存的试剂，均在最迟4个月后就出现严重偏差的凝血酶原时间。
实施例3：测定在存在更高Fe3+离子浓度时利用不同的铁螯合剂稳定的液态凝血酶原时间试剂的稳定性
在时间点t0，将0.00308mM(0.5mg/L)的FeCl3加入到包含重组人组织因子蛋白、合成磷脂和钙离子的液态凝血酶原时间试剂中，然后以不同批次分别添加0.0228mM的实施例2中提及的金属离子螯合剂。
如实施例1所描述的，在
Figure BDA0002511100090000131
CA-1500分析仪(Sysmex Corp.，神户，日本)中，在自动凝血酶原时间测试(PT测试)中使用不同试剂。使用实施例1中详细描述的质控血浆Ci-Trol 1和Ci-Trol 2作为样品。
为了测定在存在更高Fe3+离子浓度时不同试剂的长期稳定性，将试剂以液态在+37℃下在用塞子密封的玻璃瓶中储存经过6周的时间。每周采集试剂样品，并测定同一参比血浆的凝血酶原时间。
在表3(Ci-Trol 1质控血浆作为样品)和表4(Ci-Trol 2质控血浆作为样品)中示出了在时间点t0、储存1周、2周、4周和6周(1W，2W，4W，6W)后的不同测量结果(凝血酶原时间，以秒为单位，PT[s])以及与时间点t0的凝血酶原时间测量值的％形式的相应偏差。
表3
Figure BDA0002511100090000141
表4
Figure BDA0002511100090000142
只有利用根据本发明的铁螯合剂，即利用荧光铁载体、铁色素和去铁胺或者地拉罗司稳定的凝血酶原时间试剂，才能实现在存在更高Fe3+离子时，经过六周时间相对于在时间点t0的初始值偏差小于20％的稳定的凝血酶原时间。不仅没有螯合剂的液态储存试剂，而且添加有现有技术(US2017/0234895A1)中已知的金属离子螯合剂DTPA、EDTA或BAPTA的液态储存试剂均最迟在2周后就出现严重偏差的凝血酶原时间。

Claims (19)

1.一种凝血酶原时间试剂，包含组织因子蛋白和磷脂，其特征在于，所述试剂还包含至少一种铁螯合剂，其中，所述至少一种铁螯合剂选自由铁载体和3,5-二苯基-1,2,4-三唑构成的组中。
2.根据权利要求1所述的凝血酶原时间试剂，其中，所述铁载体选自由去铁胺、荧光铁载体和铁色素构成的组中。
3.根据权利要求1所述的凝血酶原时间试剂，其中，所述3,5-二苯基-1,2,4-三唑选自由地拉罗司、[3,5-二(2-羟苯基)-[1,2,4]三唑-1-基]乙酸乙基酯和3,5-二(2-羟苯基)-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-[1,2,4]三唑构成的组中。
4.根据前述权利要求中任一项所述的凝血酶原时间试剂，包含浓度为0.007至2.5mmol/L，特别优选0.01至0.5mmol/L的至少一种所述铁螯合剂。
5.根据前述权利要求中任一项所述的凝血酶原时间试剂，还包含Ca2+离子。
6.根据权利要求5所述的凝血酶原时间试剂，包含5至500mmol/L的氯化钙。
7.根据前述权利要求中任一项所述的凝血酶原时间试剂，其中，所述组织因子蛋白选自由人或动物重组组织因子蛋白以及来自组织提取物的天然人或动物组织因子蛋白构成的组中。
8.一种用于制备包含组织因子蛋白和磷脂以及可选的Ca2+离子的液态凝血酶原时间试剂的方法，其特征在于，提供液体，所述液体包含组织因子蛋白、磷脂和至少一种铁螯合剂，所述铁螯合剂选自由铁载体和3,5-二苯基-1,2,4-三唑构成的组中；并且将所述液体填充到试剂瓶中，而无需将该液体冻干。
9.一种用于稳定包含组织因子蛋白和磷脂以及可选的Ca2+离子的凝血酶原时间试剂的方法，其特征在于，将至少一种铁螯合剂添加到所述试剂中，所述铁螯合剂选自由铁载体和3,5-二苯基-1,2,4-三唑构成的组中。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，加入一定量的至少一种所述铁螯合剂，使得所述试剂包含的至少一种所述铁螯合剂的浓度为0.007至2.5mmol/L，特别优选0.01至0.5mmol/L。
11.根据权利要求8或9所述的方法，其中，所述铁载体选自由去铁胺、荧光铁载体和铁色素构成的组中。
12.根据权利要求8或9所述的方法，其中，3,5-二苯基-1,2,4-三唑选自由地拉罗司、[3,5-二(2-羟苯基)-[1,2,4]三唑-1-基]乙酸乙基酯和3,5-二(2-羟苯基)-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-[1,2,4]三唑构成的组中。
13.一种根据权利要求1-7中任一项所述的凝血酶原时间试剂在用于确定血浆样品中凝血参数的方法中的应用。
14.一种用于确定血浆样品中凝血参数的方法，其特征在于，将所述血浆样品与根据权利要求1-7中任一项所述的凝血酶原时间试剂混合成反应混合物，并确定所述反应混合物中的凝血参数。
15.根据权利要求14所述的方法，用于确定由凝血酶原时间、导出的纤维蛋白原和凝血酶生成潜力构成的组中的凝血参数。
16.根据权利要求14所述的方法，用于确定凝血酶原时间，其中，以光度法测量所述反应混合物的吸光度变化，并且确定从所述凝血酶原时间试剂与所述血浆样品混合的时间点直至达到阈值为止的时间。
17.一种选自由铁载体和3,5-二苯基-1,2,4-三唑构成的组中的铁螯合剂在制备包含组织因子蛋白和磷脂的凝血酶原时间试剂中的应用。
18.根据权利要求17所述的应用，其中，所述铁载体选自由去铁胺、荧光铁载体和铁色素构成的组中。
19.根据权利要求17所述的应用，其中，3,5-二苯基-1,2,4-三唑选自由地拉罗司、[3,5-二(2-羟苯基)-[1,2,4]三唑-1-基]乙酸乙基酯和3,5-二(2-羟苯基)-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-[1,2,4]三唑构成的组中。
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