CN114858786A - 一种血清淀粉样蛋白a的检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒及其制备方法,包括:R1试剂,所述R1试剂包括:R1稀释剂及包被有血清淀粉样蛋白A抗体的磁珠,其中,所述R1稀释剂包括第一缓冲剂、第一表面活性剂、第一防腐剂、第一盐类化合物、第一抗冻剂、第一蛋白质及糖醇;及,R2试剂,所述R2试剂包括:R2稀释剂及酶标记的所述血清淀粉样蛋白A抗体,其中,所述R2稀释剂包括第二缓冲剂、第二表面活性剂、第二防腐剂、第二盐类化合物、第二抗冻剂、第二蛋白质及第二稳定剂。本发明中,针对磁微粒化学发光设计的血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒,操作简单、快速;同时,R1试剂与R2试剂的成分复配合理,其信号强度高,可进一步提高其灵敏性和拓宽测试范围。
Description
技术领域
本发明属于体外试剂盒领域,具体涉及一种血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A protein,SAA)是一种正向急性时相反应蛋白,是载脂蛋白家族中的一种异质类蛋白质,相对分子质量约为12000。血清淀粉样蛋白A(SAA)作为临床检测常用的炎症指标,在发生细菌、病毒感染时,SAA在病毒或细菌感染后短时间内即有明显升高,SAA作为炎症检测指标具有很强的敏感度。
目前用于检测血清淀粉样蛋白A(SAA)的方法主要有荧光免疫层析法、酶联免疫分析法和胶乳增强免疫比浊法。荧光免疫层析法属层析法,虽有方便快捷,试剂稳定等特点,但有这灵敏度低,线性范围窄的缺点。酶联免疫法操作繁琐,定量检测效果不佳,线性范围窄,测试结果易受人为因素影响。胶乳增强免疫比浊法操作简单、快速,但是灵敏度低、低值重复性差。
发明内容
有鉴于此,本发明提供一种血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒及其制备方法,旨在提供检测灵敏度搞、干扰因素少,试剂稳定性好且操作方法简单的试剂盒。
为达到上述目的,本发明提供一种血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒,所述血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒包括:
R1试剂,所述R1试剂包括:R1稀释剂及包被有血清淀粉样蛋白A抗体的磁珠,其中,所述R1稀释剂包括第一缓冲剂、第一表面活性剂、第一防腐剂、第一盐类化合物、第一抗冻剂、第一蛋白质及糖醇;及,
R2试剂,所述R2试剂包括:R2稀释剂及酶标记的所述血清淀粉样蛋白A 抗体,其中,所述R2稀释剂包括第二缓冲剂、第二表面活性剂、第二防腐剂、第二盐类化合物、第二抗冻剂、第二蛋白质及第二稳定剂。
可选地,所述R1稀释剂中,所述第一缓冲剂包括PBS、MES和Tris中的任意一种;和/或,
所述R1稀释剂的pH为6~7;和/或,
所述第一表面活性剂的包括曲拉通X-100、Tween20、Triton X-405和 Tween-80中的任意一种;和/或,
所述第一防腐剂包括防腐剂Proclin 300和防腐剂Proclin 950中的任意一种;和/或,
所述第一盐类化合物包括氯化钠;和/或,
所述第一抗冻剂为甘油和/或,
所述第一蛋白质包括牛血清白蛋白;和/或,
所述糖醇包括甘露醇和山梨糖醇的任意一种;
所述R1稀释剂中,所述第一缓冲剂的含量为10~30mM,所述第一表面活性剂的含量为0.01%(v/v)~0.1%(v/v),所述第一防腐剂的含量为 0.05%(v/v)~0.15%(v/v),所述第一盐类化合物的含量为 0.8%(w/v)~1.2%(w/v),所述第一抗冻剂的含量为0.5%(w/v)-2%(w/v),所述糖醇的含量为1%(w/v)~3%(w/v),所述第一蛋白质的含量为 1%(w/v)~3%(w/v);和/或,
所述磁珠为羧基磁珠;和/或,
所述R1试剂中,所述包被有血清淀粉样蛋白A抗体的磁珠的含量为 0.05mg/mL~0.2mg/mL;和/或,
所述包被有血清淀粉样蛋白A抗体的磁珠,所述血清淀粉样蛋白A抗体与所述磁珠的质量比为5ug/mg~20ug/mg。
可选地,所述R2试剂中,所述酶标记的所述血清淀粉样蛋白A抗体与所述 R2缓冲液的体积比为1:(1800~2200);和/或,
所述酶为碱性磷酸酶;和/或,
所述R2缓冲液的pH值为6.5~7.2;和/或,
所述第二缓冲剂包括MES、Tris和MOPS中的任意一种;和/或,
所述第二表面活性剂包括曲拉通X-100、Tween20、Triton X-405和Tween80 中的任意一种;和/或,
所述第二防腐剂包括Proclin300、Proclin950和BND-10中的至少一种;和/ 或,
所述第二盐类化合物包括氯化钠;和/或,
所述第二抗冻剂为甘油;和/或,
所述第二蛋白质包括牛血清白蛋白;和/或,
所述第二稳定剂包括海藻糖、蔗糖和乳糖中的任意一种;和/或,
所述R2稀释剂中,所述第二缓冲剂的含量为50~100mM,所述第二表面活性剂的含量为0.01%(v/v)~0.1%(v/v),所述第二防腐剂的含量为0.05%(v/v)~0.15%(v/v),所述第二盐类化合物的含量为 0.8%(w/v)~1.2%(w/v),所述第二抗冻剂的含量为0.5%(v/v)~2%(v/v),所述第二稳定剂的含量为0.5%(w/v)~3%(w/v),所述第二蛋白质的含量为 1%(w/v)~3%(w/v)。
可选地,所述血清淀粉样蛋白检测试剂盒还包括样本稀释液;和/或,
所述血清淀粉样蛋白检测试剂盒还包括发光底物,所述发光底物可与所述酶反应,生成发光基团;和/或,
所述血清淀粉样蛋白检测试剂盒还包括多个不同浓度的血清淀粉样蛋白 A溶液。
可选地,所述样本稀释液包括Tris-HCl、NaCl、BSA、甘露醇、甘油、曲拉通X-100、防腐剂、十二烷基硫酸钠及聚乙烯吡咯烷酮;和/或,
所述发光底物包括3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2- 二氧环乙烷二钠。
此外,本发明还提供一种上述血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒的制备方法,所述血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒的制备方法包括以下步骤:
将所述磁珠与所述血清淀粉样蛋白A抗体偶联,得到磁珠-血清淀粉样蛋白A抗体偶联物;
将所述磁珠-血清淀粉样蛋白A抗体偶联物采用第一封闭液封闭,得到所述包被有血清淀粉样蛋白A抗体的磁珠;
将所述包被有血清淀粉样蛋白A抗体的磁珠与所述R1缓冲液混合,得到所述R1试剂;
将所述酶与所述血清淀粉样蛋白A抗体偶联,得到酶-血清淀粉样蛋白A 抗体偶联物;
将所述酶-血清淀粉样蛋白A抗体偶联物进行封闭,得到酶标记的所述血清淀粉样蛋白A抗体;
将所述酶标记的所述血清淀粉样蛋白A抗体与所述R2缓冲液复配,得到所述R2试剂;
将所述R1试剂与所述R2试剂组装,得到所述血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒。
可选地,所述将所述磁珠与所述血清淀粉样蛋白A抗体偶联,得到磁珠- 血清淀粉样蛋白A抗体偶联物的步骤包括:
将羧基磁珠在氨基有机物作用下,使所述羧基磁珠的羧基与氨基进行缩合,得到活化体系;
往所述活化体系中加入所述血清淀粉样蛋白A抗体,反应3小时~6小时,得到所述磁珠-血清淀粉样蛋白A抗体偶联物,其中,所述血清淀粉样蛋白A 抗体与所述羧基磁珠的质量比为5ug/mg~20ug/mg。
可选地,所述将所述磁珠-血清淀粉样蛋白A抗体偶联物采用第一封闭液封闭,得到所述包被有血清淀粉样蛋白A抗体的磁珠的步骤中,所述第一封闭液为牛血清白蛋白溶液;和/或,
所述采用第一封闭液封闭的时间为40min~80min。
可选地,所述将所述酶与所述血清淀粉样蛋白A抗体偶联,得到酶-血清淀粉样蛋白A抗体偶联物的步骤包括:
将血清淀粉样蛋白A抗体在氨基有机物混合后,发生缩合反应,得到活化后的血清淀粉样蛋白A抗体;
将所述活化后的血清淀粉样蛋白A抗体与碱性磷酸酶混合后,偶联反应1 小时~3小时,得到所述酶-血清淀粉样蛋白A抗体偶联物。
可选地,所述将所述酶-血清淀粉样蛋白A抗体偶联物进行封闭,得到酶标记的所述血清淀粉样蛋白A抗体的步骤包括:
将所述酶-血清淀粉样蛋白A抗体偶联物与含有牛血清白蛋白的缓冲液混合后进行第一阶段封闭反应,然后加入磷酸酯进行第二阶段封闭反应,得到酶标记的所述血清淀粉样蛋白A抗体。
本发明中,针对磁微粒化学发光设计的血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒,通过酶标抗体与磁珠包被抗体,与抗原反应后形成夹心结构产物,后续通过外加磁场收集即可收集产物并对产物操作简单、快速;同时,R1试剂与R2试剂的成分复配合理,其信号强度高,可进一步提高其灵敏性和拓宽测试范围。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为部分实施例试剂盒的线性范围结果;
图2为实施例1试剂盒与罗氏试剂盒的样本比对结果。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例,参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。
需要说明的是,实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外,全文中出现的“和/或”的含义,包括三个并列的方案,以“A和/或B”为例,包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外,各个实施例之间的技术方案可以相互结合,但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础,当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在,也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
鉴于背景技术提出的现有测试血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒难以兼顾难以兼顾检测效率、灵敏性和测试范围的技术问题,本发明提供一种血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒,所述血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒包括:
R1试剂,所述R1试剂包括:R1稀释剂及包被有血清淀粉样蛋白A抗体的磁珠,其中,所述R1稀释剂包括第一缓冲剂、第一表面活性剂、第一防腐剂、第一盐类化合物、第一抗冻剂、第一蛋白质及糖醇;及,
R2试剂,所述R2试剂包括:R2稀释剂及酶标记的所述血清淀粉样蛋白A 抗体,其中,所述R2稀释剂包括第二缓冲剂、第二表面活性剂、第二防腐剂、第二盐类化合物、第二抗冻剂、第二蛋白质及第二稳定剂。
本发明中,针对磁微粒化学发光设计的胎盘生长因子的检测试剂盒,通过酶标抗体与磁珠包被抗体,与抗原反应后形成夹心结构产物,后续通过外加磁场收集即可收集产物并对产物操作简单、快速;同时,R1试剂与R2试剂的成分复配合理,其信号强度高,可进一步提高其灵敏性和拓宽测试范围。
在一些实施例中,所述R1稀释剂中,所述第一缓冲剂包括PBS、Tris和 MES中的任意一种;所述R1稀释剂的pH为6~7。提供抗体抗原反应缓冲环境。
在一些实施例中,所述R1稀释剂中,所述第一缓冲剂包括PBS。
在一些实施例中,所述第一表面活性剂包括曲拉通X-100、Tween20、Triton X405和Tween80中的任意一种。采用上述表面活性剂,可以提高试剂的分散性。
在一些实施例中,所述第一表面活性剂包括曲拉通X-100。
在一些实施例中,所述第一防腐剂包括防腐剂Proclin 300和防腐剂Proclin 950中的任意一种;通过加入相应的防腐剂,可以提高抗体的保存性能。
在一些实施例中,所述防腐剂包括Proclin950有利于进一步提高试剂盒保存性能,提高试剂盒的稳定性。
在一些实施例中,所述第一盐类化合物包括氯化钠;通过加入氯化钠维持体系渗透性。
在一些实施例中,所述第一抗冻剂为甘油;通过加入上述防冻剂可以提高抗体的低温防冻能力。进一步,在一些实施例中,所述第一抗冻剂为甘油。
在一些实施例中,所述第一蛋白质包括牛血清白蛋白。在抗体稀释液中加入牛血清白蛋白可以维持系统的稳定性,为后续的免疫反应进行降噪。
在一些实施例中,所述糖醇包括甘露醇、山梨糖醇中的任意一种;选用甘露醇作为糖醇的功能时,有助于免疫反应,提高信号强度。
在一些实施例中,所述R1稀释剂中,所述第一缓冲剂的含量为10~30mM,所述第一表面活性剂的含量为0.01%(v/v)~0.1%(v/v),所述第一防腐剂的含量为0.05%(v/v)~0.15%(v/v),所述第一盐类化合物的含量为 0.8%(w/v)~1.2%(w/v),所述第一抗冻剂的含量为0.5v/v%-2%(v/v),所述糖醇的含量为1%(v/v)-3v/v%,所述第一蛋白质的含量为1%(w/v)~3%(w/v);R1 稀释剂中的各组分维持在上述含量时,有助于进一步提高信号值,进而提高灵敏度、拓宽测试范围,同时增强其稳定性。
在一些实施例中,所述R1稀释剂中,所述第一缓冲剂的含量为20mM,所述第一表面活性剂的含量为0.05%(v/v),所述第一防腐剂的含量为 0.1%(v/v),所述第一盐类化合物的含量为0.9%(w/v),所述第一抗冻剂的含量为1%(v/v),所述糖醇的含量为2v/v%,所述第一蛋白质的含量为1%(w/v); R1稀释剂中的各组分维持在上述含量时,其信号值最优,灵敏度、测试范围,稳定性均进一步提高。进一步,所述R1稀释剂中,所述第一缓冲剂为PBS,所述第一表面活性剂为曲拉通X-100,所述第一防腐剂为Proclin950,所述第一盐类化为氯化钠,所述第一抗冻剂为甘油,所述第一糖醇为甘露醇,所述第一蛋白质为BSA。
在一些实施例中,所述磁珠为羧基磁珠。试剂盒体系选用羧基磁珠时,选用羧基磁珠,羧基磁珠具有超顺磁性、快速磁响应性、高羧基含量、单分散性和亚微米尺度粒径等特点,能够在特殊化学试剂(如EDC)的作用下将多肽、蛋白、寡聚核苷酸等生物配体共价偶联到微球表面,在免疫诊断领域内得到了广泛的使用,同时其工艺较为成熟,包被抗体为化学偶联,无物理吸附,故该磁珠作为R1工作液的选用磁珠,具有稳定性高的优势。
在一些实施例中,所述R1试剂中,所述包被有血清淀粉样蛋白A抗体的磁珠的含量为0.05mg/mL~0.2mg/mL;根据反应体系的调试,选择适合的磁珠工作液浓度,其信号值满足性能要求
在一些实施例中,所述包被有血清淀粉样蛋白A抗体的磁珠,所述血清淀粉样蛋白A抗体与所述磁珠的质量比为5ug/mg-20ug/mg,其5ug/mg的偶联比例,信号值可以满足性能要求,高比例20ug/mg信号值会逐渐到达平台期。
在一些实施例中,所述R2试剂中,所述酶标记的所述血清淀粉样蛋白A 抗体与所述R2缓冲液的体积比为1:(1800~2200);在一些实施例中,所述 R2缓冲液的pH值为6.5~7.2,其稳定性最佳。进一步,根据pH优化试验,其最适pH为6.8,其稳定性最佳。
在一些实施例中,所述酶为碱性磷酸酶;采用碱性磷酸酶进行酶促化学发光法,反应速度快,在很短时间内提供正确可靠的结果,有利于信号的检测,提供了试剂盒的灵敏度和特异性性能。
在一些实施例中,所述第二缓冲剂包括MES、Tris和MOPS中的任意一种;进一步,第二缓冲剂为MES时,因其碱性磷酸酶在中性pH6.8的缓冲环境下稳定性最为理想,而MES缓冲的有效缓冲pH为中性偏酸,较为理想。
在一些实施例中,所述第二表面活性剂包括曲拉通X-100、Tween20、Triton X-405和Tween80中的任意一种,可以提高试剂的分散性。在一些实施例中,所述第二表面活性剂包括曲拉通X-100,其分散性最好,测试的重复性CV最为理想。
在一些实施例中,所述第二防腐剂包括防腐剂Proclin 300和防腐剂Proclin950、BNP-10中的至少一种;通过加入相应的防腐剂,可以提高抗体的保存性能。
通过加入相应的防腐剂,可以提高溶液的防腐性能,提高抗体的保存性能,同时延长溶液的效期。
在一些实施例中,选用Proclin950和BND-10,采用上述两种成分作为防腐剂有利于进一步提高试剂盒保存性能,提高试剂盒的稳定性。
在一些实施例中,所述第二盐类化合物包括氯化钠;通过加入氯化钠维持体系渗透性。
在一些实施例中,所述第二抗冻剂为甘油;通过加入上述防冻剂可以提高抗体的低温防冻能力。
进一步,在一些实施例中,所述第二抗冻剂为甘油。选用甘油作为防冻剂时,可以进一步提高低温储存能力。
在一些实施例中,所述第二蛋白质包括牛血清白蛋白;在抗体稀释液中加入牛血清白蛋白可以维持系统的稳定性,为后续的免疫反应进行降噪。
在一些实施例中,所述第二稳定剂包括海藻糖、蔗糖和乳糖中的任意一种;选取上述成分作为稳定剂时,可以进一步提高试剂的稳定性。
在一些实施例中,所述第二稳定剂包括海藻糖。采用海藻糖,其试剂稳定性最佳。
在一些实施例中,所述R2稀释剂中,所述第二缓冲剂的含量为50 ~100mM,所述第二表面活性剂的含量为0.01%(v/v)~0.1%(v/v),所述第二防腐剂的含量为0.05%(v/v)~0.15%(v/v),所述第二盐类化合物的含量为 0.8%(w/v)~1.2%(w/v),所述第二抗冻剂的含量为0.5v/v%~2%(v/v),所述第二稳定剂的含量为0.5%(w/v)~3%(w/v),所述第二蛋白质的含量为 1%(w/v)~3%(w/v)。R2稀释剂中的各组分维持在上述含量时,有助于进一步提高信号值,进而提高灵敏度、拓宽测试范围,同时增强其稳定性。
进一步,所述R2稀释剂中,所述第二缓冲剂的含量为50mM,所述第二表面活性剂的含量为0.01%(v/v),所述第二防腐剂的含量为0.1%(v/v),所述第二盐类化合物的含量为0.9%(w/v),所述第二抗冻剂的含量为1%(v/v),所述第二稳定剂的含量为1%(w/v),所述第二蛋白质的含量为1%(w/v)。R2稀释剂中的各组分维持在上述含量时,其信号值最优,灵敏度、测试范围,稳定性均进一步提高。
在一些实施例中,所述血清淀粉样蛋白检测试剂盒还包括样本稀释液。在试剂盒中组装样本稀释液组分,可以直接获取配套的样本稀释液,避免重新配置,进而造成实验误差。
具体地,在一些实施例中,所述样本稀释液包括30mM~50mM Tris-HCl、 0.8%~1.0%(w/v)NaCl、1%~3%(w/v)BSA、1%~3%(v/v)甘露醇、0.01%~0.05%(v/v)十二烷基硫酸钠(SDS、0.02%~0.09%(v/v)聚乙烯吡咯烷酮、 0.5%~2%(v/v)甘油、0.5%~0.15%(v/v)曲拉通X-100及0.5%~0.15%(v/v) 防腐剂。采用上述成分作为稀释液时,有利于拓宽线性范围。
进一步,0.01%-0.1%SDS、0.01%-0.1%PVP。具体地,当样本稀释液包括上述成分时对其线性范围可以得到很大的拓宽,因其SDS、PVP这类表面活性剂可以衰减样本中的抗原,可以起到不加稀释液而起到稀释作用,避免SAA 项目容易产生HOOK的现象,从而起到拓宽线性范围的作用,而减少该项目测试的稀释倍数,从而降低该项目对仪器高倍数稀释的要求。
在一些实施例中,所述血清淀粉样蛋白检测试剂盒还包括发光底物,所述发光底物可与所述酶反应,生成发光基团;通过与酶生成发光基团,可以获取光信号,进而通过光信号对浓度进行计算。在此前提下,可以选取3-(2- 螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐(AMPPD)作为发光底物。
在一些实施例中,所述血清淀粉样蛋白检测试剂盒还包括多个不同浓度的血清淀粉样蛋白A溶液。通过在试剂盒组装不同浓度的血清淀粉样蛋白A溶液,可以做出后期的标准曲线,依照标准曲线可以获取最终浓度。避免测试期间标准溶液的配置,以此减少操作误差。
此外,本发明还提供上述血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒的制备方法,所述血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒的制备方法包括以下步骤:
步骤S10:将所述磁珠与所述血清淀粉样蛋白A抗体偶联,得到磁珠-血清淀粉样蛋白A抗体偶联物;
步骤S20:将所述磁珠-血清淀粉样蛋白A抗体偶联物采用第一封闭液封闭,得到所述包被有血清淀粉样蛋白A抗体的磁珠;
步骤S30:将所述包被有血清淀粉样蛋白A抗体的磁珠与所述R2缓冲液混合,得到所述R1试剂;
步骤S40:将所述酶与所述血清淀粉样蛋白A抗体偶联,得到酶-血清淀粉样蛋白A抗体偶联物;
步骤S50:将所述酶-血清淀粉样蛋白A抗体偶联物进行封闭,得到酶标记的所述血清淀粉样蛋白A抗体;
步骤S60:将所述酶标记的所述血清淀粉样蛋白A抗体与所述R2缓冲液复配,得到所述R2试剂;
步骤S70:将所述R1试剂与所述R2试剂组装,得到所述血清淀粉。
通过上述方法制备出基于针对磁微粒化学发光设计的血清淀粉样蛋白A 的检测试剂盒。
步骤S10包括:
步骤S101:将羧基磁珠在胺基有机物作用下,使羧基与胺基进行缩合,得到活化体系;
步骤S102:往所述活化体系中加入所述血清淀粉样蛋白A抗体,反应3小时~6小时,得到所述磁珠-血清淀粉样蛋白A抗体偶联物,其中,所述血清淀粉样蛋白A抗体与所述羧基磁珠的质量比为5ug/mg-20ug/mg。
通过上述步骤可以提高抗体与羧基磁珠的偶联效率。
进一步,在步骤S101之前还包括:将羧基磁珠采用磁珠处理液洗涤。具体地,所述磁珠处理液包括pH值为5.0的100mM MES缓冲液,0.15M NaCl, 0.05%(v/v)吐温-20。通过上述处理通过置换缓冲液,去除磁珠保存液中的防腐剂等物质,以免影响后续的偶联反应。
进一步,所述步骤S101中,将羧基磁珠重悬于含胺基有机物的重悬液中,所述重悬液包括胺基有机物和磁珠处理液,其中胺基有机物包括1-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),通过上述处理起到磁珠活化的作用,活化后的磁珠可以与抗体中的基团进行化学偶联反应。
步骤S20中,所述第一封闭液为牛血清白蛋白溶液;所述采用第一封闭液封闭的时间为40min~80min。通过上述封闭方法可以提高试剂盒的稳定性。
进一步,所述第一封闭液为10%(w/v)BSA。通过上述处理可以降低本底,减少反应中的非特异性吸附。
步骤S40包括:
步骤S401:将血清淀粉样蛋白A抗体在胺基有机物混合后,发生缩合反应,得到活化后的血清淀粉样蛋白A抗体;
步骤S402:将所述活化后的血清淀粉样蛋白A抗体与碱性磷酸酶混合后,偶联反应1小时~3小时,得到所述酶-血清淀粉样蛋白A抗体偶联物。通过上述处理可以提高抗体与酶的偶联效率。
步骤S50包括:
将所述酶-血清淀粉样蛋白A抗体偶联物与含有牛血清白蛋白的缓冲液混合后进行第一阶段封闭反应,然后加入磷酸酯进行第二阶段封闭反应,得到酶标记的所述血清淀粉样蛋白A抗体。通过两步封闭,可以进一步提高的稳定性。
在一些实施例中,所述步骤S70中,所述将所述R1试剂与所述R2试剂组装的同时,组装样本稀释剂和/或多个不同浓度的血清淀粉样蛋白A溶液。以此,减少检测的操作步骤,减少实验误差。
本试剂盒的使用方法为:以全自动化学发光仪(CL-2000)为检测工具,加入10μL的待测样本与40μL R1,反应2min,磁珠富集后吸取10uL溶液加入新的反应管中再加入新的R1和R2应,清洗后,测试。若大于上限的样本,可以采用R3稀释液进行样本稀释,选择10μL样本+90μLR3,再吸取10μL稀释后的样本,执行上述操作。
仪器通过该富集的处理可以进一步提高其线性范围,较单纯的 R1+R2+R3+样本反应模式,该反应模式可以拓宽有、近一倍的线性范围,减少该项目仪器反应的稀释倍数。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明,应当理解,以下实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例1~实施例5
实施例1~实施例5提供一种血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒,具体包括以下组分:
R1试剂、R2试剂、AMPPD、样本稀释剂(后简称R3);其中,R1试剂包括包被有血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的羧基磁珠(后简称为包被磁珠)和 R1稀释剂,其中,R1稀释剂包括第一缓冲剂、第一表面活性剂、第一防腐剂、第一盐类化合物、第一抗冻剂、第一蛋白质及糖醇,其具体组分与含量如表1 所示;R2试剂包括碱性磷酸酶标记的血清淀粉样蛋白A单克隆抗体(后简称为标记反应抗体)及pH为6.8的R2稀释剂,R2稀释剂包括第二缓冲剂、第二表面活性剂、第二防腐剂、第二盐类化合物、第二抗冻剂、第二蛋白质及第二稳定剂,其具体组分与含量如表2所示;R3包括第三缓冲剂、第三盐类化合物、第三蛋白质、第三糖醇、第三防冻剂、第三表面活性剂及第三防腐剂,其具体组分与含量如表3所示。
表1实施例1~实施例5R1试剂各组分成分与含量
表2实施例1~实施例5R2试剂各组分成分与含量
表3实施例1~实施例5R3试剂各组分成分与含量
实施例1~实施例5还提供对应检测试剂盒的检测方法,具体操作如下:
步骤S101:取羧基磁珠(JSR),每毫克羧基磁珠加入0.1mL MES缓冲液中(pH值为5.0的100mM MES,0.15M NaCl,0.05%(v/v)吐温-20)的缓冲液中清洗3次,弃上清,每毫克羧基重悬于已加入浓度为10mg/mL的EDC和NHS 的0.1mL的MES缓冲液中(pH值5.0的100mMMES,0.15MNaCl,0.05%(v/v) 吐温-20),置于室温的旋转混匀器上避光活化反应1h,活化结束后进行磁分离清洗,清洗去除多余的活化剂EDC和NHS,每毫克羧基磁珠使用0.1mL的MES缓冲液(pH值5.0为100mM MES,0.15M NaCl,0.05%(v/v)吐温-20)清洗3次,重悬于MES缓冲液中(100mM MES,pH值5.0,0.15MNaCl,0.05%吐温-20)中;
步骤S102:加入血清淀粉样蛋白A单克隆抗体(购于南京信帆生物),混匀置于室温的旋转混匀仪上旋转混匀反应4小时。
步骤S20:反应结束后直接按每毫克对应10μL的量化关系加入 10%(w/v)BSA的封闭液,继续放置在旋转混匀器上封闭反应1小时,反应结束后,每毫克磁珠使用对应0.1毫升R1稀释液进行清洗三次1。
步骤S30:对应表1重悬于R1稀释液中,即为R1试剂。
步骤S401:取血清淀粉样蛋白A单克隆抗体,浓度为0.1M,pH值为7.0的 PBS缓冲液,混匀,加入20ul新配置的10.0mg/ml EDC水溶液,活化30分钟,其中,抗体、PBS缓冲液以及EDC水溶液的体积比为10:25:2。
步骤S402:加入浓度为5mg/ml的碱性磷酸酶溶液混匀,室温避光保存2 小时后取出,其中,血清淀粉样蛋白A单克隆抗体与碱性磷酸酶溶液的体积比为1:2。
步骤S50:用含1%(w/v)BSA的pH值为7.4的0.1M Tris缓冲液与酶进行偶联后的抗体在室温封闭反应30min,再加入0.5%(v/v)磷酸二乙脂于室温下继续反应30min,用30KD的超滤柱除盐纯化,收集的剩余体积溶液加一半甘油,保存于-20度备用。
步骤S60:取标记好的血清淀粉样蛋白A酶标记物,按表2对应R2稀释剂进行稀释,即为R2组分。
步骤S70:将R1试剂,R2试剂,样品稀释剂和浓度为0mg/L、5mg/L、 20mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L的血清淀粉样蛋白A溶液进行组装得到试剂盒。
实施例6~8
实施例6~8分别提供了一种血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒,具体成分与制备方法与实施例1大体相同,唯一不同的是,实施例6中的样品稀释剂无SDS,无PVP;实施例7中的样品稀释剂无PVP;实施例8中的样品稀释剂无SDS。
实施例9~11
实施例9~11分别提供了一种血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒,具体成分与制备方法与实施例1大体相同,唯一不同的是,实施例9中第二防腐剂为 Proclin300,实施例10中的第二防腐剂为BND-10,实施例11中的第二防腐剂为 Proclin950。
实施例12~实施例16
实施例12~16分别提供了一种血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒,具体成分与制备方法与实施例1大体相同,唯一不同的是实施例12步骤S101中,MES的缓冲液的pH为4.5;实施例13步骤S101中,MES的缓冲液的pH为5.5;实施例 14步骤S101中,MES的缓冲液的pH为6.0;实施例15步骤S101中,MES的缓冲液的pH为6.5;实施例16步骤S101中,MES的缓冲液的pH为7.0。
实施例17
本实施例测试部分实施例的试剂盒光信号强度,具体操作步骤为:
测试其浓度为0、20、100mg/L的样品,测试结果如表4所示。
表4部分实施例试剂盒光信号强度测试结果
浓度(mg/L) | 0 | 20 | 100 |
发光值 | 发光值 | 发光值 | |
实施例1 | 2414 | 262339 | 1238231 |
实施例2 | 2453 | 257634 | 1214567 |
实施例3 | 2432 | 261045 | 1226843 |
实施例4 | 2467 | 260384 | 1204784 |
实施例5 | 2475 | 260657 | 1197659 |
实施例12 | 2366 | 181673 | 904346 |
实施例13 | 2450 | 248602 | 1150169 |
实施例14 | 2418 | 219874 | 1097488 |
实施例15 | 2470 | 191899 | 1006456 |
实施例16 | 2447 | 169675 | 727414 |
从上述检测结果可知,EDC活化步骤中,其pH为5~6.5时,试剂盒具有良好的发光特性,当pH为5时,性能最佳。
实施例18
本实施例对部分实施例试剂盒进行线性范围测试,具体为:
对浓度为0mg/L、3mg/L、5mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/L、 200mg/L定标品做线性拟合曲线分析,测试结果如表5所示,其中, 实施例1计算线性相关系数r=0.9989,该试剂盒的线性范围为 3~200mg/L。
表5部分试剂盒线性范围测试结果
从上述检测结果以及图1可知,当稀释剂中包含SDS与PVP时,具有良好的线性范围,尤其是当样品稀释剂的组分同时包含SDS与PVP时,线性范围进一步拓宽。
实施例19
本实施例对部分实施例试剂盒进行热稳定性测试,具体操作为:
将其试剂配制好后均分为2份,其中一份置于4℃冰箱保存,另一份置于 37℃恒温箱保存,7天后拿出进行室温平衡,测试其抗原校准品,验证其37℃加速的热稳定性,结果如表6所示。
表6部分试剂盒热稳定性测试结果
从上述结果可知,本发明试剂盒均具有良好的稳定性,尤其是,当试剂盒的R2稀释剂包含Proclin950、BND-10时,性能最佳。
实施例20
本实施例提供实施例1试剂盒的性质测试,具体操作如下:
1、实施例灵敏度的检测:
参照CLSI EP17-A文件推荐的实验方案,计算血清淀粉样白蛋白A酶促测定试剂盒的灵敏度,取浓度为零的的血清淀粉样蛋白A校准品为检测样本进行检测,重复测定20次,计算其均值M和标准差SD值,取一相邻校准品重复测试3次,计算其均值,根据零浓度检测样本与相邻校准品之间的浓度-RLU值结果进行两点回归拟合得出一次方程,将M+2SD的RLU值带入上述方程中,得出血清淀粉样蛋白A测定试剂盒的灵敏为3mg/L。
2、临床样本测试比对
用本试剂盒与罗氏公司试剂盒同时检测50例临床血清。其检测结果见下图。以某国产上市试剂盒测得的结果为横坐标X,浓度为mg/L,以本发明测定的结果作为纵坐标y,浓度单位为pg/mL,作回归方程,其结果如图2所示,相关方程为:y=1.0298x+25.819,相关系数为0.9924,K值为1.0298,其相关性很好。
3、重复性
取本试剂盒测定浓度为10mg/L和100mg/L的样本,各平行测定10次,取均值,计算其变异系数CV。其CV应≤10.00%,测试结果如表7所示:
表7实施例1试剂盒重复性测试结果
4、稳定性
将试剂分为两份,其中一份置于4℃保存7天,另一份置于37℃恒温箱保存7天,7天后拿出试剂,平衡试剂温度,测试浓度为10mg/L和100mg/L的校准品,各重复测试3次,计算其均值,结果如表6所示,以及37℃加速较4℃保存的试剂的相对偏差。其7天加速后掉值均在±10.00%以内,稳定性良好。
表8实施例1试剂盒稳定性测试结果
以上仅为本发明的优选实施例,并非因此限制本发明的专利范围,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒,其特征在于,所述血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒包括:
R1试剂,所述R1试剂包括:R1稀释剂及包被有血清淀粉样蛋白A抗体的磁珠,其中,所述R1稀释剂包括第一缓冲剂、第一表面活性剂、第一防腐剂、第一盐类化合物、第一抗冻剂、第一蛋白质及糖醇;及,
R2试剂,所述R2试剂包括:R2稀释剂及酶标记的所述血清淀粉样蛋白A抗体,其中,所述R2稀释剂包括第二缓冲剂、第二表面活性剂、第二防腐剂、第二盐类化合物、第二抗冻剂、第二蛋白质及第二稳定剂。
2.如权利要求1所述的血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒,其特征在于,所述R1稀释剂中,所述第一缓冲剂包括PBS、MES和Tris中的任意一种;和/或,
所述R1稀释剂的pH为6~7;和/或,
所述第一表面活性剂的包括曲拉通X-100、Tween20、Triton X-405和Tween-80中的任意一种;和/或,
所述第一防腐剂包括防腐剂Proclin 300和防腐剂Proclin 950中的任意一种;和/或,
所述第一盐类化合物包括氯化钠;和/或,
所述第一抗冻剂为甘油;和/或,
所述第一蛋白质包括牛血清白蛋白;和/或,
所述糖醇包括甘露醇和山梨糖醇的任意一种;和/或,
所述R1稀释剂中,所述第一缓冲剂的含量为10~30mM,所述第一表面活性剂的含量为0.01%(v/v)~0.1%(v/v),所述第一防腐剂的含量为0.05%(v/v)~0.15%(v/v),所述第一盐类化合物的含量为0.8%(w/v)~1.2%(w/v),所述第一抗冻剂的含量为0.5%(w/v)-2%(w/v),所述糖醇的含量为1%(w/v)~3%(w/v),所述第一蛋白质的含量为1%(w/v)~3%(w/v);和/或,
所述磁珠为羧基磁珠;和/或,
所述R1试剂中,所述包被有血清淀粉样蛋白A抗体的磁珠的含量为0.05mg/mL~0.2mg/mL;和/或,
所述包被有血清淀粉样蛋白A抗体的磁珠,所述血清淀粉样蛋白A抗体与所述磁珠的质量比为5ug/mg~20ug/mg。
3.如权利要求1所述的血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒,其特征在于,所述R2试剂中,所述酶标记的所述血清淀粉样蛋白A抗体与所述R2缓冲液的体积比为1:(1800~2200);和/或,
所述酶为碱性磷酸酶;和/或,
所述R2缓冲液的pH值为6.5~7.2;和/或,
所述第二缓冲剂包括MES、Tris和MOPS中的任意一种;和/或,
所述第二表面活性剂包括曲拉通X-100、Tween20、Triton X-405和Tween80中的任意一种;和/或,
所述第二防腐剂包括Proclin300、Proclin950和BND-10中的至少一种;和/或,
所述第二盐类化合物包括氯化钠;和/或,
所述第二抗冻剂为甘油;和/或,
所述第二蛋白质包括牛血清白蛋白;和/或,
所述第二稳定剂包括海藻糖、蔗糖和乳糖中的任意一种;和/或,
所述R2稀释剂中,所述第二缓冲剂的含量为50~100mM,所述第二表面活性剂的含量为0.01%(v/v)~0.1%(v/v),所述第二防腐剂的含量为0.05%(v/v)~0.15%(v/v),所述第二盐类化合物的含量为0.8%(w/v)~1.2%(w/v),所述第二抗冻剂的含量为0.5%(v/v)~2%(v/v),所述第二稳定剂的含量为0.5%(w/v)~3%(w/v),所述第二蛋白质的含量为1%(w/v)~3%(w/v)。
4.如权利要求1所述的血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒,其特征在于,所述血清淀粉样蛋白检测试剂盒还包括样本稀释液;和/或,
所述血清淀粉样蛋白检测试剂盒还包括发光底物,所述发光底物可与所述酶反应,生成发光基团;和/或,
所述血清淀粉样蛋白检测试剂盒还包括多个不同浓度的血清淀粉样蛋白A溶液。
5.如权利要求4所述的所述的血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒,其特征在于,所述样本稀释液包括Tris-HCl、NaCl、BSA、甘露醇、甘油、曲拉通X-100、防腐剂、十二烷基硫酸钠及聚乙烯吡咯烷酮;和/或,
所述发光底物包括3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠。
6.一种如权利要求1~5任一项所述的血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒的制备方法,其特征在于,所述血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒的制备方法包括以下步骤:
将所述磁珠与所述血清淀粉样蛋白A抗体偶联,得到磁珠-血清淀粉样蛋白A抗体偶联物;
将所述磁珠-血清淀粉样蛋白A抗体偶联物采用第一封闭液封闭,得到所述包被有血清淀粉样蛋白A抗体的磁珠;
将所述包被有血清淀粉样蛋白A抗体的磁珠与所述R1缓冲液混合,得到所述R1试剂;
将所述酶与所述血清淀粉样蛋白A抗体偶联,得到酶-血清淀粉样蛋白A抗体偶联物;
将所述酶-血清淀粉样蛋白A抗体偶联物进行封闭,得到酶标记的所述血清淀粉样蛋白A抗体;
将所述酶标记的所述血清淀粉样蛋白A抗体与所述R2缓冲液复配,得到所述R2试剂;
将所述R1试剂与所述R2试剂组装,得到所述血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒。
7.如权利要求6所述的血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒的制备方法,其特征在于,所述将所述磁珠与所述血清淀粉样蛋白A抗体偶联,得到磁珠-血清淀粉样蛋白A抗体偶联物的步骤包括:
将羧基磁珠在氨基有机物作用下,使所述羧基磁珠的羧基与氨基进行缩合,得到活化体系;
往所述活化体系中加入所述血清淀粉样蛋白A抗体,反应3小时~6小时,得到所述磁珠-血清淀粉样蛋白A抗体偶联物,其中,所述血清淀粉样蛋白A抗体与所述羧基磁珠的质量比为5ug/mg~20ug/mg。
8.如权利要求6所述的血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒的制备方法,其特征在于,所述将所述磁珠-血清淀粉样蛋白A抗体偶联物采用第一封闭液封闭,得到所述包被有血清淀粉样蛋白A抗体的磁珠的步骤中,所述第一封闭液为牛血清白蛋白溶液;和/或,
所述采用第一封闭液封闭的时间为40min~80min。
9.如权利要求6所述的血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒的制备方法,其特征在于,所述将所述酶与所述血清淀粉样蛋白A抗体偶联,得到酶-血清淀粉样蛋白A抗体偶联物的步骤包括:
将血清淀粉样蛋白A抗体在氨基有机物混合后,发生缩合反应,得到活化后的血清淀粉样蛋白A抗体;
将所述活化后的血清淀粉样蛋白A抗体与碱性磷酸酶混合后,偶联反应1小时~3小时,得到所述酶-血清淀粉样蛋白A抗体偶联物。
10.如权利要求6所述的血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒的制备方法,其特征在于,所述将所述酶-血清淀粉样蛋白A抗体偶联物进行封闭,得到酶标记的所述血清淀粉样蛋白A抗体的步骤包括:
将所述酶-血清淀粉样蛋白A抗体偶联物与含有牛血清白蛋白的缓冲液混合后进行第一阶段封闭反应,然后加入磷酸酯进行第二阶段封闭反应,得到酶标记的所述血清淀粉样蛋白A抗体。
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