CN110777137A - 用于纯化组织因子的缓冲组合物、纯化制剂、pt检测组合物以及pt检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测领域,特别涉及用于纯化组织因子的缓冲组合物、纯化制剂、PT检测组合物以及PT检测试剂盒。本发明所用到的关键原材料组织凝血活酶是通过基因工程的手段制备得到的,通过发酵技术,纯化技术大规模获得,并得到高纯度的r‑TF,代替了兔脑,胎盘等组织的来源难,批间差大,敏感性低的问题。本发明基于重组组织因子r‑TF液体型的高敏凝血酶原PT诊断试剂盒,稳定性好,批间差小,敏感性高,主要用于临床外源性凝血途径的筛查,口服华法林药物的监控,肝病等疾病的辅助诊断,且可溯源至国际标准品PT试剂上,使得不同参考实验室,不同厂家试剂之间的检测具有可比性。
Description
技术领域
本发明涉及检测领域,特别涉及用于纯化组织因子的缓冲组合物、纯化制剂、PT检测组合物以及PT检测试剂盒。
背景技术
凝血四项属于检验科临检检查项目之一,归属于常规筛查检查,主要针对外源性凝血因子的检测。PT的检测原理为:在受检血浆中加入过量的组织凝血活酶和钙离子,使凝血酶原转变为凝血酶,后者使纤维蛋白原转变为纤维蛋白。检测血浆凝固的时间即为凝血酶原时间。凝血酶原时间(PT)是凝血常规四项之一,PT试剂盒用于外源性凝血途径的筛查和华法林的监控以及其他疾病的辅助诊断。
其最重要的应用是检测结果换算得到的国际标准化比值(INR)成为口服抗凝药物治疗监测的首选指标。PT试剂中的组织凝血活酶,一般来源于人、牛兔、猴的脑或肺组织提取物。来源不同的组织凝血活酶敏感性不同。1984年国际血液学标准化委员会(ICSH)和国际血栓与止血委员会(ICTH),提出用国际敏感指数(ISI)标记凝血活酶,并采用国际标准化比值(INR)报告方式报告PT测定结果,其计算公式为INR=PTRISI,其中PTR是PT的比率,即被检测患者的PT(s)/正常人均值MNPT(s),ISI为国际敏感性指数,国际敏感度指数越小,其敏感度越高。
凝血活酶多来自兔脑、胎盘及肺组织的浸出液。sysmex公司的PT试剂的凝血活酶来自胎盘,stago公司、上海太阳等公司的PT凝血活酶来自兔脑组织。由于不同公司的凝血活酶来源不同,浓度不同,敏感度不同,造成产品质量差、不稳定、敏感度差等问题。凝血活酶的主要成分为组织因子(TF)和磷脂。
组织因子(TF)是一个由263个氨基酸残基组成的跨膜单链糖蛋白,分子量约为47kDa。有三个结构域,胞外区,跨膜区和胞内区,主要发挥作用的是胞外区含有3~5个二硫键结构,具有丝氨酸蛋白酶活性,是激活凝血的重要部位,紧随其后的23个氨基酸则穿过细胞膜,为跨膜区,与细胞膜表面的磷脂结合,提供了与下游因子包括Ca2+和VII(七因子)结合的表面。TF是凝血酶原时间检测试剂的主要活性成分,是影响凝血酶原时间测定的主要因素,高质量的组织因子能敏感的反应出凝血因子是否异常。
发明内容
有鉴于此,本发明提供一种用于纯化组织因子的缓冲组合物、纯化制剂、PT检测组合物以及PT检测试剂盒。本发明通过基因重组技术,构建表达并纯化得到有活性的人基因重组组织因子,并提供用于纯化组织因子的缓冲组合物及纯化试剂获得纯度高的组织因子,再通过脂化工艺,配制出液体剂型的PT试剂。该试剂批间差小、灵敏度高、抗肝素干扰、对凝血七因子(FVII)敏感,并且溯源到国际标准品。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种用于纯化组织因子的缓冲组合物,包括Triton、Hepes、NaCl和咪唑,所述Triton的体积浓度为0.5%。
在本发明的一些具体实施方案中,包括平衡缓冲液和洗脱缓冲液;所述平衡缓冲液包括如下组分:
所述洗脱缓冲液包括如下组分:
在上述研究的基础上,本发明还提供了所述的缓冲组合物在制备组织因子纯化制剂中的应用。
本发明还提供了组织因子纯化制剂,包括上样缓冲液和所述的缓冲组合物;所述上样缓冲液包括如下组分:
本发明还提供了所述的组织因子纯化制剂在纯化组织因子中的应用。
在上述研究的基础上,本发明还提供了PT检测组合物,包括所述的组织因子纯化制剂和检测试剂;所述检测试剂包括组织因子、磷脂和表面活性剂。
在本发明的一些具体实施方案中,所述组织因子、所述磷脂和所述表面活性剂的质量比为3:10:30。
在本发明的一些具体实施方案中,所述表面活性剂包括Chaps、脱氧胆酸钠中的一种或两者的混合物;所述磷脂包括兔脑磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸中的一种或两者以上的混合物;
所述PT检测组合物还包括肝素拮抗剂。在本发明的一些具体实施方案中,所述肝素拮抗剂包括聚凝胺、鱼精蛋白中的一种或两者的混合物。
本发明还提供了所述的PT检测组合物在制备PT检测试剂盒中的应用。
在上述研究的基础上,本发明还提供了PT检测试剂盒,包括所述的PT检测组合物及可接受的助剂。
本发明公开了一种重组因子的制备工艺,构建PT试剂盒的方法,解决了由于兔脑组织物的PT试剂盒的所带来的缺点。目前市面上使用的凝血酶原PT试剂盒主要原材料多为兔脑,胎盘等组织物,其存在着生物活性低,稳定性差,批间差大,来源困难等缺点,而随着基因工程技术的发展,重组TF的制备技术应运而生。本专利旨在通过分子克隆,发酵,纯化,脂化等技术的研究,制备出一种相较于兔脑冻干型的PT试剂有着低ISI值,具备高敏特性的凝血酶原液体型诊断试剂。本发明所用到的关键原材料组织凝血活酶是通过基因工程的手段制备得到的,通过发酵技术,纯化技术大规模获得,并得到高纯度的r-TF,代替了兔脑,胎盘等组织的来源难,批间差大,敏感性低的问题。本发明基于重组组织因子r-TF液体型的高敏凝血酶原PT诊断试剂盒,稳定性好,批间差小,敏感性高,主要用于临床外源性凝血途径的筛查,口服华法林药物的监控,肝病等疾病的辅助诊断,且可溯源至国际标准品PT试剂上,使得不同参考实验室,不同厂家试剂之间的检测具有可比性。
本发明的有益效果有且不限于:敏度高(ISI低)并且可调节,液体试剂不需要复溶,减少了操作步骤及复溶带来的偏差,抗肝素效果明显。
具体实施方式
本发明公开了一种用于纯化组织因子的缓冲组合物、纯化制剂、PT检测组合物以及PT检测试剂盒,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
术语解释:
PT(Prothrombin time):即凝血酶原时间,通过体外添加组织凝血活酶,钙离子,使凝血酶原转变为凝血酶,生成的凝血酶使纤维蛋白原转变为纤维蛋白,通过计算缺乏血小板的血浆凝固所需时间即为凝血酶原时间PT。
r-TF(Recombinant tissue factor):即重组组织因子,也是凝血III因子,组织因子存在于组织胎盘,脑,心肺等器官中,是外源性凝血途径激活的关键物质,可以进一步激活凝血VII因子,并与之结合,激活X因子,同时可以通过旁路途径激活IX因子,继而激活内源凝血途径。r-TF利用基因工程的方法,通过分子克隆,蛋白体外表达,纯化得到的组织因子。
ISI(International Sensitivity Index):即国际敏感指数,用于计算国际标准化比率INR,各试剂厂家会在不同仪器上给出不同批次的ISI值。
INR(International Normalized Ratio):即国际标准化比率,用凝血活酶所测得的参比血浆与正常血浆的PT比值和所用试剂标出的ISI值计算出INR,使得不同凝血活酶试剂测得的结果具有可比性。通过公式来计算:
提取组织中的RNA(核糖核酸),设计引物,通过PCR(聚合酶链式反应)大量扩增,导入重组质粒中,转化导入感受态,得到重组菌株,发酵表达,破碎菌体细胞后经过亲和层析纯化得到TF纯化蛋白。纯化后得到的TF用BCA法通过蛋白定量测定试剂盒检测其浓度。
制备流程:包括两部分内容,TF的获得和PT试剂盒的构建。TF的获得通过甘油菌扩增发酵培养,蛋白上清液的获得,蛋白纯化及定量来得到。PT试剂盒的构建主要包括脂化工艺,灵敏度的调节,性能指标的测定以及溯源至国际标准品的过程。详细实现方案如下:
(1)菌种的扩增及发酵:从-80℃冰箱中取出一支甘油菌,当天晚上在超净工作台中接种至LB培养基,先转到小瓶培养,加入卡那抗生素,抗生素浓度至50mg/L在摇床中37℃,200rpm条件下过夜培养12-16小时后,第二天早上转大瓶,按照菌与培养基1:25的比例加入大瓶中,再次加入卡那抗生素,继续进行培养3小时后,使用紫外分光光度计检测OD至0.6-1.0后进行IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导,IPTG至终浓度0.5mM,16℃低温表达蛋白至过夜,第三天早上离心收集得到菌体。抗生素浓度始终保持工作浓度50mg/L。
(2)离心,破碎:预先称重离心桶,放入菌液后配平离心8000G离心5min弃上清,再称重,两个质量差即为湿菌重量。每克湿菌加入25mL破碎缓冲液重悬,800bar高压破碎3次。破碎后的菌体12000G离心40min,收获上清。加入1%的Triton(曲拉通)过夜搅拌,破碎过程让样品在冰浴中冷却。
(3)蛋白纯化及各纯化缓冲液配制:
破碎缓冲液:25mM Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷),150mM NaCl,25mM咪唑,调pH8.0。(无Triton)
10%(v/v)Triton破碎缓冲液:用破碎缓冲液稀释即1份的100%Triton加入到9份的破碎缓冲液中。
上样缓冲液:用破碎缓冲液稀释,加1%的Triton。
平衡缓冲液:25mM Hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸),150mM NaCl,25mM咪唑,0.5%Triton,调pH 8.0。
洗脱缓冲液:25mM Hepes,150mM NaCl,250mM咪唑,0.5%Triton,调pH 8.0。
将过夜搅拌的破碎上清,用抽滤泵过滤,离心去掉沉淀。准备进行纯化。
(4)TF蛋白中表面活性剂的加入。向纯化前的TF蛋白向中加入表面活性剂。只有加入表面活性剂才能打开蛋白的结构,使TF重组蛋白表现出活性,且这种表面活性剂可以是TritonX-100或者NP40(乙基苯基聚乙二醇),此步骤在蛋白纯化前加入,整个纯化过程保持有表面活性剂。
使用预装镍柱纯化,纯化流速各步骤保持5mL/min,镍柱先用5个柱体积上样缓冲液平衡,然后上样,上样结束后用10个柱体积平衡缓冲液平衡,最后用3个柱体积洗脱缓冲液洗脱样品,收集洗脱样品。用BCA试剂盒测试蛋白浓度稀释至1mg/mL用于PT试剂盒的构建。
(5)PT试剂的配制。将TF蛋白用含有表面活性剂的纯化洗脱液稀释成1mg/ml的浓度。兔脑磷脂用纯水配制成20mg/ml,超声混匀。Chaps(表面活性剂)用纯水配制成6%的浓度。三者的含量比为TF:兔脑磷脂:chaps为3:10:30,37℃温育脂化2h,形成脂化物。取出脂化物加缓冲液,脂化物与缓冲液体积比为1:36。缓冲液为60mM hepes,4%甘氨酸,0.015mg/ml聚凝胺,16mM氯化钙,pH7.4。TF:兔脑磷脂:chaps最佳质量比为3:10:30,调整其比值可以改变PT正常质控秒值。
(6)PT试剂的灵敏度。通过调节TF、兔脑磷脂和chaps混合物与缓冲液的体积比可以调节PT试剂的灵敏度,当混合物的体积升高时,灵敏度随着升高。FVII敏感性也与灵敏度表现出相同的特点。
(7)PT试剂的抗肝素性能。通过添加肝素拮抗剂聚凝胺来达到抗肝素的效果。聚凝胺的加入使正常质控秒值延长。随着聚凝胺的量的增加抗肝素效果增加,当增加到0.015mg/ml及以上时,抗肝素效果很明显,不需要再增加,但是聚凝胺的量不能无限升高,当其浓度超过0.15mg/ml,会使秒值不正常增加。
(8)ISI溯源。遵循GB/T21415-2008/ISO 17511:2003《体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品和质控物质赋值的计量学溯源性》国家/国际标准,用于计量可追溯性。购买WHO第五代凝血凝血活酶参考品RTF/16,对PT试剂进行溯源。在赛科希德半自动凝血仪上其ISI值为1.127。
本发明通过基因重组技术,构建表达并纯化得到有活性的人基因重组组织因子,通过脂化工艺,配制出液体剂型的PT试剂。该试剂批间差小、灵敏度高、抗肝素干扰、对凝血七因子(FVII)敏感,并且溯源到国际标准品。
本发明提供的纯化组织因子的缓冲组合物、纯化制剂、PT检测组合物以及PT检测试剂盒中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1培养基及各缓冲液配方
LB培养基:1L纯水中溶解10g的胰蛋白胨,5g的酵母提取物,10g的NaCl,调节pH7.2左右。
破碎缓冲液:25mM Tris-HCl,150mM NaCl,25mM咪唑,调pH 8.0。(无Triton)。
10%(v/v)Triton破碎缓冲液:用破碎缓冲液稀释即1份的100%Triton加入到9份的破碎缓冲液中。
上样缓冲液:用破碎缓冲液稀释,加1%的Triton溶液(用配制的10%(v/v)Triton破碎缓冲液稀释成1%的Triton溶液)。
平衡缓冲液:25mM Hepes,150mM NaCl,25mM咪唑,0.5%Triton(用配制的10%(v/v)Triton破碎缓冲液稀释成0.5%的Triton溶液),调pH 8.0。
洗脱缓冲液:25mM Hepes,150mM NaC,250mM咪唑,0.5%Triton(用配制的10%(v/v)Triton破碎缓冲液稀释成0.5%的Triton溶液),调pH 8.0。
实施例2发酵培养
重组甘油菌的构建:人组织因子基因序列来自于Genbank,NCBI ReferenceSequence:NM_001993.4,得到的序列信息交由第三方机构(第三方机构为生物制品研究所)进行重组质粒构建。
方法如下:人组织因子基因序列来自于Genbank,NCBI Reference Sequence:NM-001993.4,选取胞外区和跨膜区的序列信息,通过设计引物交由上海生工生物公司合成胞外区与跨膜区的片段,通过酶切酶连,克隆入Pet48b质粒,并转化DE3(BL21),用于后续的菌株发酵和蛋白纯化。
从-80℃冰箱中取出一支甘油菌(转化后的DE3(BL21)),当天晚上在超净工作台中接种至LB培养基,先转到小瓶培养,加入卡那抗生素,抗生素工作浓度至50mg/L。在摇床中37℃,200rpm条件下过夜培养12-16小时后,第二天早上转大瓶,按照菌与培养基1:25的比例加入大瓶中,再次加入卡那抗生素,继续进行培养3小时后,使用紫外分光光度计检测OD至0.6-1.0后进行IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导,IPTG至终浓度0.5mM,16℃低温表达蛋白至过夜,第三天早上离心收集得到菌体。
实施例3蛋白纯化
将过夜搅拌的破碎上清,用抽滤泵过滤,离心去掉沉淀。准备进行纯化。
在蛋白纯化前加入表面活性剂。只有加入表面活性剂才能打开蛋白的结构,使TF重组蛋白表现出活性,且这种表面活性剂可以是TritonX-100或者NP40(乙基苯基聚乙二醇),加入量为0.5~2%(v/v)。并使整个纯化过程保持有表面活性剂。
使用预装镍柱纯化,纯化流速各步骤保持5mL/min,镍柱先用5个柱体积上样缓冲液平衡,然后上样,上样结束后用10个柱体积平衡缓冲液平衡,最后用3个柱体积洗脱缓冲液洗脱样品,收集洗脱样品。用BCA试剂盒测试蛋白浓度稀释至1mg/mL用于PT试剂盒的构建。
实施例4 PT试剂的配制
将TF蛋白用含有表面活性剂的洗脱缓冲液(实施例1制得)稀释成1mg/ml的浓度。兔脑磷脂用纯水配制成20mg/ml,超声混匀。Chaps(表面活性剂)用纯水配制成6%(w/v)的浓度。
考察TF:兔脑磷脂:chaps的质量比对PT正常质控秒值的影响:
检测条件为:(1)复溶正常质控血浆:血浆室温放置20min,用纯水复溶;(2)试剂37℃温育10min;(3)反应体系:血浆50微升37℃温育3min,加100微升试剂反应,计算血浆加入到凝固所用的时间。
三者的含量比为TF:兔脑磷脂:chaps为3:10:30最优,37℃温育脂化2h,形成脂化物。
表1
TF:兔脑磷脂:chaps(质量比) | 正常质控秒值(s) |
3:10:30 | 12.5 |
3:10:60 | 13.2 |
3:10:120 | 15.3 |
3:5:30 | 13.2 |
3:5:60 | 14 |
3:5:120 | 16.1 |
3:20:30 | 13.5 |
3:20:60 | 15.1 |
3:20:120 | 16.7 |
实验结果表明,PT试剂配制中,TF和兔脑磷脂和chaps不同比例配比对PT试剂的正常质控秒值结果具有重要影响,最终选取3:10:30。
实施例5PT试剂灵敏度的评价
缓冲液为:60mM hepes,4%甘氨酸,0.015mg/ml聚凝胺,16mM氯化钙,pH7.4。
取实施例4制得的脂化物加缓冲液,考察实施例4制得的脂化物与缓冲液的体积比对PT试剂的灵敏度的影响:ISI值越低,敏感度越高。实验结果表明,当实施例4制得的脂化物与缓冲液的体积比升高时,灵敏度随着升高。FVII敏感性也与灵敏度表现出相同的特点。
本试剂的ISI值溯源至国际标准品rTF16,具体溯源程序见说明书。
本发明优选的,脂化物与缓冲液体积比为1:36。
表2
实施例6抗肝素性能的实现
考察添加肝素拮抗剂聚凝胺或鱼精蛋白对抗肝素的效果的影响。
表3
本发明通过添加肝素拮抗剂聚凝胺来达到抗肝素的效果。聚凝胺的加入使正常质控秒值延长。随着聚凝胺的量的增加抗肝素效果增加,当增加到0.015mg/ml及以上时,抗肝素效果很明显,不需要再增加,但是聚凝胺的量不能无限升高,当其浓度超过0.15mg/ml,会使秒值不正常增加。
试剂分为不添加肝素拮抗剂试剂、肝素拮抗剂为0.015mg/ml试剂和肝素拮抗剂为0.03mg/ml试剂。将外购的肝素钠用纯水复溶,稀释成肝素钠浓度为0.5IU/ml。分别用纯水和含0.5IU/ml的肝素钠溶液复溶正常质控血浆。然后用上述3种PT试剂同时测用肝素钠溶液为0IU/ml、0.5IU/ml正常质控血浆,即可得到上述秒值。
实施例7敏感度的比较
分别对实验组(实施例4制得的PT试剂)、对照组A(兔脑粉原材料,购自stago)、对照组B(胎盘原材料,购自西门子)的ISI值进行检测,结果如下:
ISI值溯源至国际标准品rTF16,具体溯源程序见说明书。
表4
组别 | ISI |
对照组A(兔脑粉原材料) | 1.25 |
对照组B(胎盘原材料) | 1.1 |
实验组:本产品(实施例4制得的PT试剂) | 1 |
ISI值越低,敏感度越高。实验结果表明,本产品的灵敏度较兔脑粉为原材料和胎盘为原材料的PT试剂高。1.25>1.1>1,ISI值越低,灵敏度越高。
实施例8对VII因子的敏感性比较
分别对实验组(实施例4制得的PT试剂)、对照组A(A公司:stago)、对照组B(B公司:西门子)试剂的正常质控秒值进行检测,结果如下:测试条件:凝血VII因子测试采购Helena乏VII因子血浆,具体测试条件见其说明书。表5
表6
随着VII因子浓度的降低,本产品较其他两家产品的PT检测结果表现出秒值延长的更明显。对PT秒值结果取对数与VII因子含量分别取对数进行线性相关,斜率a值的绝对值越大越敏感。
实施例9不同表面活性剂种类对正常质控秒值结果的影响
TF蛋白质纯化洗脱过程中,向洗脱液中加入表面活性剂,加入的表面活性剂的种类分别加了Tween20、TritonX-100、Chaps、OG、Birl-35、NP40,浓度均为0.5%,洗脱后的TF用于配制PT试剂,测正常质控血浆,秒值如下。
表7
表面活性剂种类 | 表面活性剂含量 | 正常质控秒值(s) |
Tween20 | 0.5% | 17.7 |
TritonX-100 | 0.5% | 13.9 |
Chaps | 0.5% | 21.9 |
OG | 0.5% | 31.1 |
Birl-35 | 0.5% | 21.2 |
NP40 | 0.5% | 14.6 |
只有加入0.5%TritonX-100的TF蛋白制备的PT试剂测试正常质控血浆时,秒值在11s-14s之间。最终选取TritonX-100作为表面活性剂
实施例10 Triton含量对正常质控秒值结果的影响
实施例9可以看出,选择TritonX-100作为纯化TF过程的表面活性剂,TF制备的PT试剂测正常质控的秒值在正常范围内,详细优化TritonX-100的浓度,其浓度分别为0%、0.5%、1%、2%,纯化后含不同浓度TritonX-100的TF蛋白制备PT试剂,测试正常质控和异常质控,结果如表8所示。
表8
只有加入0.5%TritonX-100的TF蛋白制备的PT试剂测试正常质控血浆时,秒值在11s~14s之间。Triton含量过高或无Triton会影响PT秒值。最终选择0.5%的TritonX-100。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.用于纯化组织因子的缓冲组合物,其特征在于,包括Triton、Hepes、NaCl和咪唑,所述Triton的体积浓度为0.5%。
3.如权利要求1或2所述的缓冲组合物在制备组织因子纯化制剂中的应用。
5.如权利要求4所述的组织因子纯化制剂在纯化组织因子中的应用。
6.PT检测组合物,其特征在于,包括如权利要求4所述的组织因子纯化制剂和检测试剂;所述检测试剂包括组织因子、磷脂和表面活性剂。
7.如权利要求6所述的PT检测组合物,其特征在于,所述组织因子、所述磷脂和所述表面活性剂的质量比为3:10:30。
8.如权利要求7所述的PT检测组合物,其特征在于,所述表面活性剂包括Chaps、脱氧胆酸钠中的一种或两者的混合物;所述磷脂包括兔脑磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸中的一种或两者以上的混合物;
所述PT检测组合物还包括肝素拮抗剂。
9.如权利要求6至8任一项所述的PT检测组合物在制备PT检测试剂盒中的应用。
10.PT检测试剂盒,其特征在于,包括如权利要求6至8任一项所述的PT检测组合物及可接受的助剂。
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