CN112481355A - 液体型凝血酶原时间测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于体外检测试剂盒领域，具体涉及液体型凝血酶原时间测定试剂盒及其制备方法。本发明的液体型凝血酶原时间测定试剂盒包括凝血活酶、稳定剂、表面活性剂、盐离子和缓冲液。本发明的有益效果：通过多种来源凝血活酶组合使用使试剂的敏感度可控，解决了批间差问题；通过添加表面活性剂，提高了试剂的均匀性，进而提高了试剂的准确性；通过优化保护剂和防腐剂配方，提高了试剂的稳定性，使其可制作成液体型试剂，无需冻干，简化了试剂配制生产工艺，试剂生产后开瓶即用，简化了终端客户的使用操作过程。

Description

液体型凝血酶原时间测定试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于体外检测试剂盒领域，具体涉及液体型凝血酶原时间测定试剂盒及其制备方法。
背景技术
凝血酶原时间(PT)测定的原理是依据“瀑布学说”外源凝血途径的凝血理论，实验室通常使用Quick法。凝血的机制是组织凝血活酶加入待测血浆后，其蛋白质的部分与血浆中凝血因子Ⅶ形成复合物，并激活血浆中凝血因子X和Xa，后者在组织凝血活酶提供的磷脂表面通过钙离子与V因子形成凝血酶原激活物，使凝血酶原变为凝血酶，进而催化凝血反应。
血浆凝血酶原时间(PT)敏感、快速、实用，是监测口服抗凝剂疗法的首选指标，也是检查外源性凝血途径的重要过筛试验。凝血酶原时间测定结果准确与否,直接影响着临床的诊断和治疗，而机体凝血因子受多种因素干扰，因此，临床上在测定PT时，有效提高PT测定的准确性尤为重要。
试剂是造成实验室室间结果差异大的主要原因。各类PT试剂中关键成分是“凝血物质”，即凝血活酶。不同来源、不同制备方法的组织凝血活酶对结果影响很大，易造成结果的稳定性、可比性很差，且不同试剂(凝血活酶)测定同一标本的凝血酶原时间比值(PTR)的对数呈线性关系，为便于PT的标准化，WHO提出使用INR作为一个新的参数将PT结果标准化，引入一个校正系统将PT检测结果和WHO标准相连。该系统将一份非常敏感的人脑提取物指定为国际参考物“(IRP)67/40”(international reference prepa-ration，IRP)，并将这份IRP的ISI定义为1.0，以此将各种商品化的试剂组织凝血活酶的敏感性与IRP相比，得出其ISI值。运用ISI值进行INR结果的计算：INR＝PTR ISI，PTR为患者血浆凝血酶原时间比值；ISI为所用组织凝血活酶的ISI值，PTR＝患者血浆凝血活酶原时间/正常血浆的平均凝血酶原时间。不同ISI值的试剂测得的INR结果差异非常显著，将试剂的PT秒值结果和ISI值控制在一定的范围内，能够大大提高试剂的准确度。
目前，市售凝血酶原时间测定试剂盒大部分为冻干剂型，虽然效期相对较长，但是，由于冻干粉试剂需要冷冻干燥工序，生产过程复杂，且成本投入大，另外，在使用时候还需要复溶。从生产到使用的过程中包括分装、冻干、复溶等多个步骤都可能会带来试剂的不同程度的瓶间差别，从而导致批间差异明显。
发明内容
本发明的目的在于提供一种液体型凝血酶原时间测定试剂盒。
本发明的再一目的在于提供上述液体型凝血酶原时间测定试剂盒的制备方法。
根据本发明具体实施方式的液体型凝血酶原时间测定试剂盒，所述试剂盒包括凝血活酶、稳定剂、表面活性剂、盐离子和缓冲液，其中，
所述凝血活酶选自重组人组织因子、兔脑粉、卵磷脂中的至少两个组分；
所述稳定剂占缓冲液的0.01～8wt％；
所述表面活性剂占缓冲液重量的0.01～10wt％；
所述盐离子的浓度为10～200mM；
所述缓冲液的pH为6.0～8.0，所述缓冲液的浓度为10～150mM。
根据本发明具体实施方式的液体型凝血酶原时间测定试剂盒，兔脑粉占缓冲液的1～10wt％，组织因子占缓冲液的0.01～1wt％，卵磷脂占缓冲液的0.1～15wt％。
根据本发明具体实施方式的液体型凝血酶原时间测定试剂盒，所述稳定剂稳定剂包括A组分和B组分，A组分：B组分的重量比为1:0.5～800，其中A组分包括叠氮钠、ProClin300、山梨酸钾、苯甲酸、苯甲酸钠、庆大霉素硫酸盐、乳酸钠中的一种或几种，B组分包括牛血清白蛋白、甘氨酸、海藻糖、甘露醇或蔗糖的一种或几种。
根据本发明具体实施方式的液体型凝血酶原时间测定试剂盒，所述盐离子为包括氯化钙，还包括氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸钠、硫酸镁、硫酸钾的一种或几种。
根据本发明具体实施方式的液体型凝血酶原时间测定试剂盒，所述表面活性剂为聚乙二醇6000、吐温20、吐温80、曲拉通100、聚氧乙烯月桂醚、硬脂酸钠中的一种或几种。
根据本发明具体实施方式的液体型凝血酶原时间测定试剂盒，所述缓冲液为3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、氨丁三醇盐酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液中的一种或几种。
根据本发明具体实施方式的液体型凝血酶原时间测定试剂盒的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)配制缓冲液，并将缓冲液的pH调至6.0～8.0；
(2)向缓冲液中分别加入盐离子、稳定剂、表面活性剂，盐离子的浓度为10～200mM，表面活性剂占缓冲液重量的0.01～10wt％，稳定剂占缓冲液的0.01～8wt％；
(3)加入凝血活酶，溶解，即得。
根据本发明具体实施方式的液体型凝血酶原时间测定试剂盒的制备方法，所述稳定剂包括A组分和B组分，A组分：B组分的重量比为1:0.5～800，其中A组分包括叠氮钠、ProClin300、山梨酸钾、苯甲酸、苯甲酸钠、庆大霉素硫酸盐、乳酸钠中的一种或几种，B组分包括牛血清白蛋白、甘氨酸、海藻糖、甘露醇或蔗糖的一种或几种。
根据本发明具体实施方式的液体型凝血酶原时间测定试剂盒的制备方法，所述盐离子包括氯化钙，还包括氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸钠、硫酸镁、硫酸钾的一种或几种。
根据本发明具体实施方式的液体型凝血酶原时间测定试剂盒的制备方法，所述缓冲液为3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、氨丁三醇盐酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液中的一种或几种。
本发明的有益效果：
本发明的液体型凝血酶原时间测定试剂盒通过多种来源凝血活酶组合使试剂的敏感度可控，解决了批间差问题；通过添加表面活性剂，提高了试剂的均匀性，进而提高了检测的准确性；通过优化稳定剂配方，将两种成分进行复配，提高试剂盒的稳定性，并通过优化盐离子的配方，校正异常数据。本发明的试剂盒提高了试剂的稳定性，使其可制作成液体型试剂，无需冻干，简化了试剂配制生产工艺，试剂生产后开瓶即用，简化了终端客户的使用操作过程。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
1.1本发明的液体型凝血酶原时间测定试剂盒，包括：
凝血活酶为重组人组织因子和兔脑粉，重组人组织因子占缓冲液重量的0.05wt％，兔脑粉占缓冲液重量的5wt％；
稳定剂为海藻糖、山梨酸钾和庆大霉素硫酸盐，海藻糖占缓冲液重量的2wt％，山梨酸钾占缓冲液重量的1wt％，庆大霉素硫酸盐占缓冲液重量的0.01wt％；
表面活性剂为聚乙二醇6000和聚氧乙烯月桂醚，聚乙二醇6000占缓冲液重量的9wt％，聚氧乙烯月桂醇占缓冲液重量的0.5wt％；
盐离子为氯化钙、氯化钠和硫酸钾，氯化钙的浓度为15mM，氯化钠的浓度为25mM，硫酸钾的浓度为2mM；
缓冲液为MOPSO-MOPSO/Na缓冲液，pH值为6.5，缓冲液的浓度为50mM。
上述试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)按照配比配制缓冲液，将pH调至6.5；
(2)向缓冲液中分别加入盐离子、稳定剂、表面活性剂，混匀备用；
(3)用步骤(2)配好的溶液按照配比溶解凝血活酶，由于配方中含有兔脑粉，需要30℃加热助溶2小时，并在溶解后离心取上清，再向上清液中添加重组人组织因子；所有物料添加完成后，混匀试剂，平衡一段时间后分装并密封保存，即制得液体型凝血酶原时间测定试剂盒。
1.2本发明的液体型凝血酶原时间测定试剂盒，包括：
凝血活酶为重组人组织因子和卵磷脂，重组人组织因子占缓冲液重量的0.1wt％、卵磷脂占缓冲液的6wt％；
稳定剂为牛血清白蛋白、蔗糖、叠氮钠和乳酸钠，牛血清白蛋白占缓冲液重量的0.5wt％，蔗糖占缓冲液重量的6wt％，叠氮钠占缓冲液重量的0.1wt％，乳酸钠占缓冲液重量的0.01％；
表面活性剂为吐温20和曲拉通100，吐温20占缓冲液重量的0.2wt％，曲拉通100占缓冲液重量的0.1wt％；
盐离子为氯化钙、氯化钾、硫酸镁，氯化钙的浓度为20mM，氯化钾的浓度为50mM，硫酸镁的浓度为2mM；
缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，pH值为7.0，浓度为100mM。
上述测定试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)按照配比配制缓冲液，将pH调至7.0；
(2)按照配比向缓冲液中分别加入盐离子、稳定剂、表面活性剂，混匀备用；
(3)用步骤(2)配好的溶液按照配比溶解凝血活酶；所有物料添加完成后，混匀试剂，平衡一段时间后分装并密封保存，即制得液体型凝血酶原时间测定试剂盒。
1.3本发明的液体型凝血酶原时间测定试剂盒，包括：
凝血活酶为兔脑粉和卵磷脂，兔脑粉占缓冲液重量的3wt％，卵磷脂占缓冲液的5wt％；
稳定剂为甘氨酸、甘露醇、ProClin300和苯甲酸钠，甘氨酸占缓冲液重量的1wt％，甘露醇占缓冲液的3wt％，ProClin300占缓冲液的0.08wt％，苯甲酸钠占缓冲液的0.1wt％；
表面活性剂为吐温80、曲拉通100和硬脂酸钠，吐温80占缓冲液重量的0.05wt％，曲拉通100占缓冲液的0.5wt％，硬脂酸钠占缓冲液的0.02wt％；
盐离子为氯化钙、氯化镁和硫酸钠，氯化钙的浓度为12mM，氯化镁的浓度为40mM，硫酸钠的浓度为5mM；
缓冲液为Tris-盐酸缓冲液，pH值为7.5，缓冲液的浓度为200mM。
上述测定试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)按照配比配制缓冲液，将pH调至7.5；
(2)按照配比向缓冲液中分别加入盐离子、稳定剂、表面活性剂，混匀备用；
(3)再步骤(2)配好的溶液按照配比溶解凝血活酶，由于配方中含有兔脑粉，需要30℃加热助溶2小时，并在溶解后离心取上清，再向上清液中添加卵磷脂；所有物料添加完成后，混匀试剂，平衡一段时间后分装并密封保存，即制得液体型凝血酶原时间测定试剂盒。
实施例2验证本发明试剂盒的效果
2.1重复性试验
按照本发明的实施例1中的3个配方进行试剂配制生产，生产出的试剂与市售试剂在日本SYSMEX(希森美康)株式会社生产的CA1500全自动血凝仪上同时测试simens的凝血质控血浆水平1和水平2的凝血酶原时间(PT)，每个水平质控重复测定10次，计算10个测量值的平均值
Figure BDA0002780656180000071
标准差(SD)和变异系数(CV)，测定结果对比如表1所示。
表1重复性测试结果比对表
Figure BDA0002780656180000072
由表1可知，本发明试剂盒的重复性测试结果的变异系数(CV)值≤1.20％，小于市售试剂的重复性测试结果的变异系数，并且远小于YY/T 1158-2009凝血酶原时间检测试剂(盒)标准规定的重复性变异系数(5％)，说明本发明试剂的重复性好。
2.2比较批次间差异
按照本发明的实施例1中的3个配方(1.1、1.2和1.3)和2个对比例，各进行三批试剂配制生产，生产出的试剂在希森美康CA1500全自动血凝仪上进行批间差测试。
对比例1：凝血活酶为重组人组织因子，占缓冲液重量的0.1wt％，其他组分同实施例1.2；
对比例2：凝血活酶为兔脑粉，占缓冲液重量的3wt％，其他组分同实施例1.2。
测试方法为：用正常值质控血浆分别测试3个不同批号的试剂，每个批号测试10次，计算30个测量值的平均值
Figure BDA0002780656180000081
标准差(SD)和变异系数(CV)。
批间差测试结果如表2所示。
表2本发明试剂的批间差测试结果
Figure BDA0002780656180000082
Figure BDA0002780656180000091
如表2所示，本发明试剂的变异系数(CV)值均＜1.5％，远小于YY/T1158-2009凝血酶原时间检测试剂(盒)标准规定的批间差(不超过10％)，而对比例1、2的只有单一凝血活酶成分配制的试剂的测定结果不好控制，正常凝血酶原时间测定结果应在10s-14s之间，单一凝血活酶组分配制的试剂无法很好地控制在上述范围内，所得的变异系数(CV)值均大于本发明试剂的变异系数。因此，本发明的试剂盒通过将凝血活酶的成分复配可以有效的控制批间差。
2.3比较本发明的检测试剂盒与对比实施例及市售品的稳定性
将实施例1中的3个配方(1.1、1.2和1.3)、对比例3及市售试剂同时做37℃加速处理，每隔一段时间取出一部分样品进行质控测试(测试simens的凝血质控血浆水平1的凝血酶原时间(PT)，重复测定3次，计算平均值)，比较多次测定结果平均值的变化趋势，分析本发明的试剂盒、对比例3及市售品的稳定性。
对比例3：稳定剂为庆大霉素硫酸盐，占缓冲液重量的0.01wt％，其他组分同实施例1.1。
加速稳定性结果如表3所示。
表3本发明试剂与市售试剂稳定性比较
Figure BDA0002780656180000092
Figure BDA0002780656180000101
如表3所示，经过加速处理后，市售试剂和只加防腐剂的对比例3第5天出现了质控测定结果上升的情况，第7天后变化趋势非常显著；而本发明试剂加速处理10天内的质控测试结果均较好，变化趋势不显著，本发明试剂具有良好的稳定性。因此，说明本发明中复配的稳定剂能够提高试剂的稳定性。
2.4本发明的检测试剂盒对标本测试情况
将实施例1中的3个配方(1.1、1.2和1.3)、对比例4及市售试剂同时做临床样本测定，对比本发明试剂、对比例4与市售品的样本测定一致性。
对比例4：盐离子为只有单一的氯化钙，浓度为15mM，不添加其他的盐离子，其他成分同实施例1.2。
临床样本测定结果如表4所示。
表4本发明试剂和对比实施例与市售品临床样本测定结果
Figure BDA0002780656180000102
Figure BDA0002780656180000111
如表4所示，本发明试剂测定样本凝血酶原时间的偏差(本发明的测定结果与市售品测定的结果的差值)在0.1～1.4s之间，对比例4测定样本凝血酶原的偏差(对比例4测定样本凝血酶原时间的结果与市售品测定结果的差值)在0.4～6.1s之间，本发明试剂测定结果的符合性明显好于对比例4的样本测定结果，说明通过添加盐离子可以调节试剂测试样本的结果，校正异常数据，使不同试剂盒配方测试临床样本的结果更准确。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.液体型凝血酶原时间测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括凝血活酶、稳定剂、表面活性剂、盐离子和缓冲液，其中，
所述凝血活酶选自重组人组织因子、兔脑粉、卵磷脂中的至少两个组分；
所述稳定剂占缓冲液的0.01～8wt％；
所述表面活性剂占缓冲液的0.01～10wt％；
所述盐离子的浓度为10～200mM；
所述缓冲液的pH为6.0～8.0，所述缓冲液的浓度为10～150mM。
2.根据权利要求1所述的液体型凝血酶原时间测定试剂盒，其特征在于，所述稳定剂包括A组分和B组分，A组分：B组分的重量比为1:0.5～800，其中，A组分包括叠氮钠、ProClin300、山梨酸钾、苯甲酸、苯甲酸钠、庆大霉素硫酸盐、乳酸钠中的一种或几种，B组分包括牛血清白蛋白、甘氨酸、海藻糖、甘露醇或蔗糖的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的液体型凝血酶原时间测定试剂盒，其特征在于，兔脑粉占缓冲液的1～10wt％，组织因子占缓冲液的0.01～1wt％，卵磷脂占缓冲液的0.1～15wt％。
4.根据权利要求1所述的液体型凝血酶原时间测定试剂盒，其特征在于，所述盐离子包括氯化钙，还包括氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸钠、硫酸镁、硫酸钾的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的液体型凝血酶原时间测定试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、氨丁三醇盐酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液中的一种或几种。
6.权利要求1所述的液体型凝血酶原时间测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)配制浓度为10～150mM缓冲液，并将缓冲液的pH调至6.0～8.0；
(2)向缓冲液中分别加入盐离子、稳定剂、表面活性剂，盐离子的浓度为10～200mM，表面活性剂占缓冲液重量的0.01～10wt％，稳定剂占缓冲液的0.01～8wt％；
(3)加入凝血活酶，溶解，即得，其中，所述凝血活酶选自重组人组织因子、兔脑粉、卵磷脂中的至少两个组分。
7.根据权利要求6所述的液体型凝血酶原时间测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述稳定剂包括A组分和B组分，A组分：B组分的重量比为1:0.5～800，其中，A组分包括叠氮钠、ProClin300、山梨酸钾、苯甲酸、苯甲酸钠、庆大霉素硫酸盐、乳酸钠中的一种或几种，B组分包括牛血清白蛋白、甘氨酸、海藻糖、甘露醇或蔗糖的一种或几种。
8.根据权利要求6所述的液体型凝血酶原时间测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述盐离子包括氯化钙，还包括氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸钠、硫酸镁、硫酸钾的一种或几种。
9.根据权利要求6所述的液体型凝血酶原时间测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、氨丁三醇盐酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液中的一种或几种。
10.根据权利要求6所述的液体型凝血酶原时间测定试剂盒的制备方法，其特征在于，兔脑粉占缓冲液的1～10wt％，组织因子占缓冲液的0.01～1wt％，卵磷脂占缓冲液的0.1～15wt％。
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