DE102012003480A1

DE102012003480A1 - Temperierte Meßkammer für photo/luminometrische Untersuchungen

Info

Publication number: DE102012003480A1
Application number: DE201210003480
Authority: DE
Inventors: Igor Popov; Gudrun Lewin; Michail Popov
Original assignee: Individual
Current assignee: Lewin Gudrun Dr De; Popov Igor Dr De; Popov Michail De
Priority date: 2012-02-21
Filing date: 2012-02-21
Publication date: 2013-08-22

Abstract

Die Erfindung betrifft eine thermostatierbare Vorrichtung für photometrische bzw. luminometrische Messungen nach dem Durchflussprinzip vorzugsweise auf dem Gebiet der medizinischen Labordiagnostik. Das Wesen der Erfindung besteht darin, dass die in die beheizbare lichtdichte Meßkammer eingebaute Meßküvette mit in der Mitte vertieften Boden mit durchsichtigen voneinander entfernten Zu- und Abflussröhrchen ausgestattet ist, deren beiden unteren Öffnungen dicht zueinander in unmittelbarer Nähe zur Bodenmitte der Küvette platziert sind. Dank dieser Gestaltung der Meßküvette ist es möglich, sowohl photometrische Messungen basierend auf dem Prinzip des segmentierten Flusses als auch luminometrische Messungen basierend auf den Prinzipien des segmentierten bzw. kontinuierlichen Flusses durchzuführen.

Description

Einleitung
Bekanntlich ist ein Hauptmerkmal der wichtigsten Krankheiten des Menschen (die sog. „Zivilisationskrankheiten” wie Krebs, Atherosklerose und Herzinfarkt, Allergien, Rheuma, Diabetes u. v. a.), aber auch der Alterung eine durch freie Radikale initiierte oxidative Zellschädigung, die ihrerseits durch die Oxidation aller Arten von Molekülen (Proteine, Lipide, Kohlenwasserstoffe und Nukleinsäuren) gekennzeichnet ist.
Das Ziel des gegenwärtigen gesundheitspolitischen Wandels ist die Reduzierung der Ausgaben bei der Behandlung manifestierter Krankheiten durch Verbesserung der Früherkennung und Vorsorge. Ein wesentlicher Schritt in Richtung Realisierung dieses Ziels besteht in der Ausstattung der niedergelassenen Ärzte, Apotheker und Heilpraktiker mit einfachen in der Bedienung und universellen in ihrem Einsatz Geräten für biochemische Analysen der Körperflüssigkeiten.
Neben den klassischen Parameter kommt in der Labordiagnostik in den letzten Jahren immer größere Bedeutung der Bestimmung der Antioxidantien und des Grades der oxidativen Schädigung von Blutbestandteilen als frühzeitiges Merkmal pathologischer Prozesse im menschlichen Organismus zu. Dies kann mittels verschiedener photometrischer und luminometrischer Verfahren realisiert werden [1, 2, 3]. Dazu gehören Messungen von Antioxidantien (u. a. Vitamine C und E) [4, 5, 6], Quantifizierung der oxidativ bedingten Modifikation von Blutplasmaproteinen [7, 8] und Untersuchungen der Funktionsfähigkeit von weißen Blutzellen [9].
Durch Anwendung dieser Methoden sind eine frühzeitige Erkennung des prämorbiden Zustandes bereits im sog. „prä-präklinischen” Stadium, bei dem etablierte biochemische Methoden der klinischen Diagnostik nicht ausreichend sensitiv bzw. informativ sind, der Nachweis von gesundheitlichen Entgleisungen im Sport, unter Stress, in umweltbelasteten Gebieten und am Arbeitsplatz (professionelle Schadstoffexposition) sowie eine Beurteilung der Wirksamkeit konventioneller und alternativer Therapien möglich.
Beschreibung
Die Aufgabe der Erfindung bestand darin, eine universell einsetzbare Messzelle zu entwickeln, die es erlaubt, mit einem Gerät Messungen basiert auf photometrischen und luminometrischen (thermoinitiierte bzw. photosensibilisierte Chemolumineszenz) Prinzipien die Quantifizierung antiradikaler Eigenschaften von Stoffen (antioxidative Abwehr) und Untersuchungen zur Stimulierbarkeit von weißen Blutzellen (Immunabwehr) durchzuführen.
In der Publikation [10] ist eine thermostatierbare Durchflußküvette für zelluläre Untersuchungen beschrieben, die eine spindelförmige Gestalt hat und mit Wasser von einem externen Umlaufthermostat allseits umspült wird: . Dadurch wird im Vergleich mit Geräten mit austauschbaren Einwegreagenzgläsern als Meßküvetten, bei denen immer eine schlechtleitende Luftschicht zwischen dem Erwärmungskörper und der Küvettenwand vorhanden ist, eine bessere Wärmeübertragung und dementsprechend schnellere Erwärmung der Probe gewährleistet. Die Wand der Messzelle ist aus einem weißen lichtreflektierenden und thermoisolierenden Material (Teflon) gestaltet. Die Notwendigkeit eines Umlaufthermostats ist aber aus verschiedenen Gründen als ein Nachteil zu werten: Ein zusätzliches Gerät nimmt Platz im Labor, es braucht Wartung, gewährleistet eine unzureichende Stabilität der Temperatur, das Wasser kann die Wände der Meßküvette durch Ablagerungen verschmutzen und dadurch optische Störungen verursachen.
Für die Antioxidantienmessungen sind aus der Literatur zwei Lösungen bekannt. Die Messungen mittels der photosensibilisierten Chemolumineszenz erfolgen nach dem Zirkulationsprinzip [3]. Die Messlösung fließt durch eine U- bzw. Ω-förmig gebogene nicht thermostatierte Glaskapillare (Gesamtvolumen ca. 25 μl), die unmittelbar vor dem Fotoempfänger platziert ist: . Zu den Nachteilen dieser Lösung gehören die Abhängigkeit der Messergebnisse von der Zimmertemperatur und die Anwendbarkeit des Messgerätes ausschließlich für diese Art der Messungen.
Die Antioxidantienbestimmungen mittels der thermoinitiierten Chemolumineszenz [1, 11] erfolgen in einem Luminometer mit der nach dem Prinzip aus [10] gebauten Küvette (Gesamtvolumen ca. 2,5 ml) mit den Unterschieden, dass die Meßküvette am Boden keine Öffnung hat, das Absaugen ihres Inhaltes nach der Messung mittels einer bis zum Boden reichenden Kapillare aus rostfreiem Stahl erfolgt und die Temperierung nicht vom Außenthermostat, sondern durch die direkt an den Aluminiumkörper des Meßblocks angebrachten elektrischen Heizelemente erfolgt: . Diese Konstruktion hat ebenso wie die vorherige nur begrenzte Einsatzmöglichkeiten: Thermoinitiierte Chemolumineszenz und zelluläre Untersuchungen. Die für die Auswertung der Messergebnisse der oxidativen Schädigung von Proteinen notwendige Bestimmung des Proteingehaltes in der Probe muss mit einem externen Photometer realisiert werden, die photochemoluminometrischen Messungen sind mit der Konstruktion nicht möglich. Außerdem muss der Meßblock häufig gereinigt werden, da das zwischen dem Aluminiumkörper des Meßblocks und der Meßküvette befindliche Wasser die innere Oberfläche des Meßblocks oxidiert und dadurch die lichtreflektierenden Eigenschaften beeinträchtigt, was sich in der langsamen (über Wochen) Abnahme der Signalstärke zeigt und die Notwendigkeit der erneuten Kalibration des Gerätes zur Folge hat.
Wie bereits angegeben, bestand die Aufgabe der Erfindung darin, eine temperierbare Meßkammer zu entwickeln, die eine optimale Thermostatierung der Probe während der Messung gewährleistet, sowohl luminometrische als auch photometrische Bestimmungen gestattet und frei von den oben erwähnten Nachteilen ist.
Die Aufgabe der Erfindung wurde dadurch gelöst, dass die für die Messungen der photosensibilisierten Chemolumineszenz nach dem Zirkulationsprinzip (kontinuierlicher Fluss) aus einer Glaskapillare angefertigte „Minimeßküvette” in zwei gleiche Teile zerlegt wurde und in die „Makroküvette” für die Messung der thermoinitiierten Chemolumineszenz so eingeführt wurde, dass sich die Öffnungen der zerlegten Stelle der Miniküvette dicht zueinander am Boden der Makroküvette befinden und der Abstand zwischen beiden senkrechten Teilen der Miniküvette so gewählt wird, dass dazwischen ausreichend Platz für einen fokussierten Lichtstrahl für photometrische Messungen vorhanden bleibt: . Nach langzeitigen Testungen verschiedener Flüssigkeiten für die Wärmeübertragung von dem Aluminiumkörper des geheizten Meßblocks zur Meßküvette hat sich das Polyethylenglikol-500 als vorteilhaft bezüglich der Langzeitstabilität, optischen Neutralität und Wärmeleitfähigkeit gezeigt.
Funktionsbeschreibung der Messkammer.
1. Messung der thermoinitiierten Chemolumineszenz.
Der eine thermolabile Azoverbindung als Radikalquelle und Luminol als Nachweissubstanz für freie Radikale enthaltene Messeinsatz wird über das Röhrchen 4 mit Hilfe einer an das Röhrchen 5 angeschlossenen Schlauchpumpe analog der Vakuumpumpe in der in die Meßküvette angesaugt (das Röhrchen 6 bleibt dabei verschlossen). Während der Registrierung der Chemolumineszenz bleibt das gesamte Volumen der Lösung im Sichtfeld des Photoempfängers (punktierter Kreis in der ). Nach der Messung wird die Küvette entleert, indem die Schlauchpumpe mittels eines elektrisch getriebenen Ventils an das Röhrchen 6 angeschlossen wird. Das Röhrchen 5 bleibt dabei verschlossen.
2. Untersuchung einer Zellsuspension.
Die für die Messung der stimulierten Chemolumineszenz vorgesehene Suspension reiner weißen Blutzellen bzw. Vollblut wird über das Röhrchen 4 in die Meßküvette übertragen. Die für die Messung erforderliche Vermischung der Zellen während der Messung erfolgt durch die aus dem unteren Ende des Röhrchens 4 steigenden Luftblasen bei dem langsamen Absaugen der Luft mittels der Schlauchpumpe über das Röhrchen 5.
3. Messung der photosensibilisierten Chemolumineszenz.
In dem Fall wird die Meßküvette der . über die Röhrchen 4 und 6 an die Bestrahlungsküvette der . statt der dort durch 6 gekennzeichneten Meßküvette angeschlossen. Das Röhrchen 5 bleibt verschlossen. Die Strahlung der während der Messung der Photochemolumineszenz über die durchsichtigen Glaskapillaren (Röhrchen 4 und 6) zirkulierenden Flüssigkeit wird durch den Photoempfänger im vollen Umfang erfasst, da die Kapillaren sich analog der Konstruktion der mit der Ω-förmigen Durchflußküvette im Sichtfeld des Fotoempfängers befinden. Die Tatsache, dass die Mikroküvette in der Mitte nicht hermetisch ist, spielt keine Rolle, da während des Meßvorganges in der mit der Atmosphäre nicht verbundenen Makroküvette ein relatives Vakuum herrscht, so dass das Auslaufen und die Anhäufung der Flüssigkeit am Boden der Küvette nicht vorkommen.
4. Photometrische Untersuchungen.
Die Küvette 1 wird dabei über das Röhrchen 4 gefüllt und über das Röhrchen 6 entleert. Zwischendurch kann sie auf ähnliche Weise mit reinem Wasser gespült werden. Neben der Bestimmung klassischer Laborparameter werden dadurch auch Anwendungen alternativen Methoden der Beurteilung des antioxidativen Schutzes (12) ermöglicht.
Literatur:

1. Popov, I., G. Lewin: Verfahren zur Beurteilung der antiradikalen Eigenschaften von Stoffen. Offenlegungsschrift DE 103 27 971 A1 .
2. Popov, I., G. Lewin: Verfahren zur Bestimmung der antiradikalen Aktivität von Stoffen. Patent DR 249618.
3. Popov, I., G. Lewin: Photochemiluminescent detection of antiradical activity. II. Testing of nonenzymic water-soluble antioxidants. Free Rad. Biol. & Med. 17 (1994) 267–271.
4. Popov, I., G. Lewin: Photochemiluminescent detection of antiradical activity; IV: testing of lipid-soluble antioxidants. J. Biochem. Biophys. Meth. 31 (1996) 1–8.
5. Popov, I., G. Lewin: Verfahren und Testbesteck zur Bestimmung von Askorbinsäure in biologischen Proben. Patent DE 43 04 728 C2 .
6. Lewin, G., I. Popov: Photochemiluminescent detection of antiradical activity. III. A simple assay of ascorbate in blood plasma. J. Biochem. Biophys. Meth. 28 (1994) 277–282.
7. Popov, I., G. Lewin: Verfahren zur Beurteilung der oxidativen Modifikation proteinhaltiger Stoffe mittels Messung ihrer antiradikalen Aktivität. Patent DE 198 46 148 C2 .
8. Popov, I., G. Lewin: Photochemiluminescent detection of antiradical activity. VI. Antioxidant characteristics of human blood plasma, low density lipoprotein, serum albumin and aminoacids during in vitro oxidation. Luminescence, 14 (1999) 169–174.
9. Falck, P., Grunow, R., Schnitzler, S., Popov, I., D. Scholz: Chemilumineszenz als Indikator der Aktivierung von menschlichen Lymphozyten. Dt. Gesundh.-Wesen, 37 (1982) 466–470.
10. Popov, I., G. Lewin: Entwicklung einer neuen Küvette für Bio- und Chemolumineszenzmessungen. Z. med. Labor.-Diagn. 25 (1984) 440–443.
11. Popov, I., G. Lewin: Photochemiluminescent detection of antiradical activity. VII. Comparison with a modified method of thermo-initiated free radical generation with chemiluminescent detection. Luminescence, 20 (2005) 321–325.
12. Pellegrini, N., Serafini, M., Colombi, B., Del Rio, D., Salvatore, S., Bianchi, M., Brighenti, F.: Total Antioxidant Capacity of Plant Foods, Beverages and Oils Consumed in Italy Assessed by Three Different In Vitro Assays. J. Nutr. 133 (2003) 2812–2819.

Bezugszeichenliste
Abb. 1.

Querschnitt durch eine Vorrichtung für Bio- und Chemolumineszenzmessungen [10]: 1 – Meßküvette; 2 – Thermostatierende Kammer für die Meßküvette; 3 – Fotoempfänger; 4 – Glasscheibe; 5 – Lichtreflektierendes und thermoisolierendes Gehäuse der thermostatierenden Kammer; 6, 7 – Röhrchen für die Zufuhr der wärmeaustauschenden Flüssigkeit in die thermostatierende Kammer; 8, 9 – Röhrchen für die Zufuhr der Lösungen in die Meßküvette; 10 – Röhrchen für das Einspritzen des Untersuchungsmaterials in die Meßküvette; 11 – Thermomeßsonde; 12 – Lumineszenzdiode; 13 – Lichtundurchlässiges Gehäuse.

Abb. 2.

Schaltbild des Gerätes Photochem^® für Messungen der photosensibilisierten Chemolumineszenz. 1 – Bestrahlungsküvette, 2 – UV-A Quecksilberlampe, 3 – Lichtverschluss, 4 – Ansaugröhrchen für die Probe, 5 – Schlauchpumpe, 6 – Ω-förmige Glaskapillare als Meßküvette, 7 – Sekundärelektronenvervielfacher, 8 – Computer.

Abb. 3.

Schaltbild des Gerätes Minilum^® für Messungen der thermoinitiierten Chemolumineszenz. 1 – Meßküvette, 2 – Ansaugröhrchen für die Probe, 3 – Beheiztes Wasserbad, 4 – Photodiode, 5 – Stromverstärker, 6 – A/D Wandler und USB Interface, 7 – Computer, 8 – Vakuumpumpe, 9 – Dreiwegeventil.

Abb. 4.

Universelle Meßküvette im Heizblock, Querschnitt. Draufsicht von der Seite des Photoempfängers. Der punktierte Kreis zeigt das Sichtfeld des Photoempfängers z. B. Sekundärelektronenvervielfacher. Der graue Punkt in der Mitte symbolisiert den Lichtstrahl von einer Lichtquelle z. B. Lumineszenzdiode im photometrischen Registriermodus. 1 – Meßküvette; 2 – Heizblock aus Aluminium; 3 – Thermoleitende durchsichtige Flüssigkeit im Zwischenraum; 4 – Ansaugröhrchen; 5 – Verbindungsröhrchen mit einer Vakuumpumpe; 6 – Ansaugröhrchen.

Claims

Temperierte Meßkammer für photo/luminometrische Untersuchungen biologischer Proben, vorzugsweise von Blutbestandteilen, bestehend aus einer in einen aus Metall gefertigten elektrisch geheizten Block eingebauten hermetisch verschlossenen Meßküvette in Form eines Reagenzglases mit rundem halbkugel- bzw. konusförmigen Boden und drei von oben eingeführten Röhrchen zum Füllen und Entleeren der Küvette, in der der Raum zwischen dem Heizblock und der Meßküvette mit einer thermoleitenden Flüssigkeit gefüllt ist dadurch gekennzeichnet, dass die unteren Öffnungen der Zu- und Abflussröhrchen dicht zueinander in unmittelbarer Nähe zum Küvettenboden in seinem tiefsten Punkt platziert sind.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zu- und Abflussröhrchen aus durchsichtigem Material, z. B. Glas angefertigt sind.
Vorrichtung nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Zu- und Abflussröhrchen im Füllbereich der Meßküvette soweit voneinander entfernt sind, dass dazwischen ausreichend Platz für einen fokussierten Lichtstrahl für photometrische Untersuchungen der Probe vorhanden ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die thermoleitende Flüssigkeit bezüglich des Materials der Meßkammer chemisch neutral und im gesamten optischen Bereich der Messungen durchsichtig ist.