CN117434269B - 中枢神经退行性疾病相关标志物试剂盒及检测方法 - Google Patents

中枢神经退行性疾病相关标志物试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种中枢神经退行性疾病相关标志物试剂盒及检测方法，所述试剂盒使用双抗体夹心检测方法，能够在同一样品中同时完成阿尔茨海默病5种相关蛋白的检测。采取兔抗标记的A微球；在孵育过程中震荡，并添加孵育剂，包括多元醇、高分子聚合物、非离子表面活性剂、螯合剂，上述组分相互协同作用保持微球的长效悬浮效果，促进孵育过程的反应进行，减少微球团聚的形成，减少非特异性结合；去除检测抗体的Fc片段，排除了非特异性反应的干扰。上述改进提高了检测阿尔茨海默病相关蛋白的准确性，更方便了临床的检测应用，可降低试剂和人工的成本，而且特异性强、灵敏度高、重复性好，具有较好的应用前景。

Description

中枢神经退行性疾病相关标志物试剂盒及检测方法
本申请主张中国在先申请，申请号：202211116011.7，申请日2022年9月14日的优先权；该申请的说明书，权要求书，摘要以及附图组作为本身的一部分全部引用。
技术领域
本发明涉及流式细胞技术领域，具体涉及一种中枢神经退行性疾病相关标志物试剂盒及制备方法。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)，俗称老年痴呆，是一种起病隐匿的，进展性的中枢神经退行性疾病。阿尔茨海默病典型的组织病理学改变为β淀粉样蛋白(Aβ)沉积导致的老年斑，Tau蛋白异常磷酸化引起的神经纤维缠结，以及神经元和突触的丢失。根据淀粉样蛋白级联假说，Aβ病理是AD的上游事件，驱动着新皮质tau病理与神经变性的发生，Aβ1-42、Aβ1-40、T-Tau、P-Tau是目前国内外被广泛认可的AD生物标志物。研究表明，AD患者的血浆中Aβ1-42与Aβ1-42/Aβ1-40表达下调、而T-Tau和p-Tau-181的表达升高。
Aβ1-42和Aβ1-40是由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)经BACE和γ-分泌酶水解后产生，可在膜外逐渐积聚形成Aβ蛋白聚合物，并对神经元产生毒性作用，导致神经元变性。与Aβ1-40相比，Aβ1-42的凝集性非常高，在老人斑形成早期就已经逐渐积累。血浆Aβ1-42含量与Aβ1-42/Aβ1-40比率反映了大脑中的Aβ病理情况，能用于早期评估AD痴呆和轻度认知功能障碍(Mild Cognitive Impairment,MCI)的患病风险。其中Aβ1-42甚至会在Aβ正电子发射计算机断层显像(Amyloid-βpositron emission tomography，Aβ-PET)异常之前就发生下降。
Tau蛋白是微管相关蛋白(microtubule-associated proteins，MAPs)，在中枢神经系统的神经元中含量很高，主要功能是调节轴突微管的稳定性。它同时也是一种磷蛋白，具有多个磷酸化位点，其中研究最多的主要有p-Tau-181、p-Tau-217等。磷酸化的Tau会与微管蛋白竞争结合正常Tau蛋白及其他微管相关蛋白，导致微管解聚，在神经元内形成成对螺旋丝(PHF)，影响Tau蛋白的正常生理功能。研究表明，血浆T-Tau浓度在克罗伊茨费尔特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease，CJD)和额颞叶痴呆(frontotemporal lobardementia，FTD)中也会升高，是CJD的重要预测因子；而血浆p-Tau-181水平可以反应AD中Aβ与tau的病理情况，区分阿尔茨海默病与其他神经退行性疾病(如帕金森病和血管性痴呆等等)，并在整个临床进程中监测AD患者的病情进展。
α-突触核蛋白(α-synuclein)是一种大小为14kDa的可溶性蛋白质，主要在大脑的突触前末梢表达，具有调节神经元膜的稳定性、影响突触前信号传导和膜运输等作用。与tau蛋白类似，α-synuclein也容易发生病理性的错误折叠和聚集，导致一些神经退行性疾病的发生，如帕金森病(PD)、路易体痴呆(DLB)和多系统萎缩(MSA)等，这些疾病又统称为α-突触核蛋白病，其与AD生物标志物联合检测可以进一步区分AD与α-突触核蛋白病。
综上可知，Aβ1-42、Aβ1-40、T-Tau和p-Tau-181的联合检测可提高AD判定的准确性，而通过α-synuclein的加入可排除α-突触核蛋白病。故通过联合检测人体血浆中Aβ1-42、Aβ1-40、T-Tau、p-Tau-181和α-synuclein的浓度，可用于AD的辅助诊断。
目前，市面上定量检测Aβ1-42、Aβ1-40、T-Tau、p-Tau-181、α-synuclein、的产品主要方法学有酶联免疫法。酶联免疫法法手工操作步骤繁琐，结果重复性差。免疫透射比浊操作简便，适用于普通的自动生化分析仪和普通的分光光度计，不足的是灵敏度和精密度欠佳，所需的血浆量大，检测的周期较长。目前Aβ1-42、Aβ1-40、T-Tau、p-Tau-181、α-synuclein检测技术中一般都是单独检测，试剂灵敏度、精密度等性能欠佳，且检测时间长、操作复杂；因此亟需一种能够同时检测出几种AD标志物的性能优良的试剂。
因此，有必要提供一种新型的试剂盒及其制备方法以解决现有技术中存在的上述问题。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种中枢神经退行性疾病相关标志物试剂盒及制备方法，所述试剂盒用于检测人血浆中阿尔茨海默病相关蛋白。本发明试剂盒使用双抗体夹心检测方法，选取阿尔茨海默病的高相关性蛋白的组合进行检测，能够在同一样品中同时完成阿尔茨海默病至少3种相关蛋白的检测，提高了检测阿尔茨海默病相关蛋白的准确性，更方便了临床的检测应用，可降低试剂和人工的成本，而且特异性强、灵敏度高、重复性好，具有较好的应用前景。
本发明对微球的标记抗体类型进行了筛选，发现仅有鼠抗和兔抗标记能够实现检测，而其中兔抗标记的效果显著好于鼠抗标记，使用兔抗标记的微球具有更强的特异性和更高的检测灵敏度。更换兔抗(偶联微球的抗体为兔单克隆抗体)后，Aβ1-40、Aβ1-42、T-Tau、p-Tau-181、α-synuclein的检出限降低，检测灵敏度明显提高。上述结果可能的原因在于：兔抗能够识别人类抗原上在啮齿动物中没有免疫原性的表位，增加了可靶向表位的总数；兔抗对小分子和半抗原有强烈的免疫反应，这在啮齿类动物中并不常见；近交品系的家兔更为稀少，而大多数小鼠品系是近交系，因此家兔具有更多的免疫反应多样性；家兔使用独特的机制来遗传产生和多样化抗体，使其具有高亲和力和特异性。
本发明对微球进行了筛选，发现A微球(5μm的羧基微球)对本发明检测Aβ1-42、Aβ1-40、T-Tau、p-Tau-181、α-synuclein的效果最好，低浓度下测定结果准确，定量限更低，高浓度测定精密度高，使得整体线性区间更大。
本发明对微球的孵育过程进行了探索研究，发现在孵育过程中，震荡能使微球在一定程度保持悬浮而不沉降，促进孵育过程的反应进行，以此改善检测效果，提高检测灵敏度，但是震荡的效果与微球、蛋白的物理化学性质相关，在本发明中，对T-Tau、P-Tau-181、α-synuclein能够产生降低检出限的有益效果，但对Aβ1-40、Aβ1-42的检测没有明显效果。
本发明在孵育过程中添加孵育剂，孵育剂包括多元醇、高分子聚合物、非离子表面活性剂、螯合剂，多元醇、高分子聚合物、非离子表面活性剂的添加能够显著降低Aβ1-40、Aβ1-42的检出限，螯合剂的添加能够进一步提高整体检测结果的准确性与灵敏度，尤其对Aβ1-40、Aβ1-42的检出限有显著的降低作用；
多元醇类物质可增大保存液密度，使得微球可以以悬浮的形式存在，减少微球团聚、交联的概率，进而达到促进反应发生的效果，避免因免疫微球结块或团聚时间过长后会导致免疫微球结合牢固，从而很难通过震荡再次分散的问题；
非离子表面活性剂也叫两性表面活性剂，可以吸附到包被后的免疫微球表面未完全封闭掉的位点上，从而提高了免疫微球表面的空间位阻，进一步降低其他蛋白的非特异性吸附，同时还会提高微球的分散性，与多元醇协同作用，减少微球团聚的形成，从而提高检测结果的准确性与灵敏度；
高分子聚合物可以将血清血浆样本中的干扰蛋白包裹或聚合在一起，消除纤维蛋白等大分子蛋白的干扰，使得杂蛋白无法通过弱相互作用于抗原/抗体，同时减少样本与微球之间可能的非特异性抗原/抗体结合；
螯合剂能够促进微球分散、保持分散的体系结构，与上述组分相互协同作用保持微球的长效悬浮效果，从而提高检测结果的准确性与灵敏度，其中透明质酸钠还有额外作用：增加水剂粘度而使沉积难度加大、沉降速度减弱，这使得柠檬酸钠搭配透明质酸钠产生的效果最佳。
抗体Fc片段是抗体的恒定区，在这个恒定区域内氨基酸的序列在不同的抗体中呈现相同的状态，抗体的不同类型，由抗体Fc片段的特异性结构来进一步决定。抗体Fc片段是处于免疫球蛋白上的一个小片段，当免疫球蛋白和相应的抗原结合形成一个复合体以后，此复合体需要在体内进行处理，对于复合体被处理的标志就是抗体Fc片段，体内的吞噬细胞能够识别出抗体Fc片段，在识别以后就会发挥其本身的功能。抗体是外形基本呈Y形的蛋白质，在Y的上面与抗原表位进行结合，在其下面的一竖则叫做Fc，也就是可以结晶的片段。抗体是一种蛋白质，是抗原刺激机体后产生的能与抗原特质性结合的一种物质，抗体Fc片段则是抗体的一部分。抗体Fc片段发生结构性改变是在免疫球蛋白与抗原结合以后，其会有各种生物效应产生，抗原与抗体的复合物通过Fc受体，从而对细胞产生一定介导作用，在免疫功能中起着比较大的作用。
本发明通过大量试验研究，发现在本发明的检测过程中，非特异性干扰会对检测产生较大影响。本发明在研究过程中，将非特异性样本稀释后测试，其测试浓度与原液测试浓度的比例明显不同于稀释倍数。使用同型对照抗体测试非特异性样本，其测试浓度明显高于本底，这表明非特异性反应主要由抗体的Fc片段引起。
本发明通过试验研究，只有去除Aβ1-40抗体、Aβ1-42抗体、p-Tau-181抗体、T-Tau抗体的Fc片段才能最大程度排除上述非特异性反应的干扰，提高灵敏度；而对α-synuclein抗体去除Fc片段，可能由于抗体的蛋白构型发现变化，灵敏度反而降低。
一方面，本发明提供了一种用于检测人血中阿尔茨海默病相关蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括偶联抗体的微球溶液、生物素偶联抗体、孵育剂；孵育剂包括山梨醇、聚乙烯吡咯烷酮、Triton X-100、柠檬酸钠、透明质酸钠；所述抗体为Aβ1-40抗体、Aβ1-42抗体、p-Tau-181抗体、T-Tau抗体、α-synuclein抗体中的一种或多种。
进一步的，所述偶联抗体的微球为A微球，A微球为5μm羧基微球，包括A1微球、A2微球、A3微球、A4微球、A5微球，A1～A5微球荧光强度不同。
进一步的，所述Aβ1-40抗体偶联A1微球、Aβ1-42抗体偶联A2微球、p-Tau-181抗体偶联A3微球、T-Tau抗体偶联A4微球、α-synuclein抗体偶联A5微球；所述A1～A5微球为荧光强度不同的5μm羧基微球。
进一步的，所述偶联微球的抗体为兔单克隆抗体。
进一步的，所述Aβ1-40抗体、Aβ1-42抗体、p-Tau-181抗体、T-Tau抗体去除Fc片段。
进一步的，还包括荧光试剂，所述荧光试剂为生物素-BSA-SA-PE,所述生物素-BSA-SA-PE为与生物素-BSA交联的链霉亲和素与藻红蛋白偶联物。
进一步的，还包括阻断剂，所述阻断剂为灭活的鼠IgG、抗HAMA多克隆抗体。
还包括样品稀释液、反应缓冲液、洗涤缓冲液，所述样品稀释液包括三羟甲基氨基甲烷缓冲液、氯化钠、Proclin300；所述反应缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷缓冲液、氯化钠、牛血清白蛋白、阻断剂、Proclin300、吐温-20；所述洗涤缓冲液包括磷酸盐缓冲液、吐温-20。
进一步的，还包括校准品、质控品。
另一方面，本发明提供了一种上述试剂盒的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
S1：向样本管中依次加入所述反应缓冲液、偶联抗体的微球溶液和待测样本；
S2：向所述步骤S1所得混合物中加入生物素偶联抗体、孵育剂，将得到的混合物在2-8℃下避光震荡孵育；
S3：向所述步骤S2所得混合物中加入荧光试剂，将得到的混合物在室温下避光震荡孵育，得到第一复合物；
S4：在流式细胞仪上检测所述第一复合物的荧光类型和荧光信号强度，计算得到所述待测样品中所述Aβ1-42、Aβ1-40、T-Tau、p-Tau-181、α-synuclein的含量。
在一些方式中，所述震荡的频率为300-500r/min。
另一方面，本发明提供了一种孵育剂用于制备保持微球悬浮的制剂的用途，所述孵育剂包括柠檬酸钠、透明质酸钠。
本发明取得的有益效果：
1、本发明试剂盒使用双抗体夹心检测方法，选取阿尔茨海默病的高相关性蛋白的组合进行检测，能够在同一样品中同时完成阿尔茨海默病至少3种相关蛋白的检测，提高了检测阿尔茨海默病相关蛋白的准确性，更方便了临床的检测应用，可降低试剂和人工的成本，而且特异性强、灵敏度高、重复性好，具有较好的应用前景。
2、本发明对微球的标记抗体进行了筛选，发现兔抗标记的微球具有更强的特异性和更高的灵敏度，显著降低了Aβ1-40、Aβ1-42、T-Tau、p-Tau-181、α-synuclein的检出限。
3、本发明对微球进行了筛选，发现A微球对本发明检测Aβ1-42、Aβ1-40、T-Tau、p-Tau-181、α-synuclein的效果最好，低浓度下测定结果准确，定量限更低，高浓度测定精密度高，使得整体线性区间更大。
4、本发明对微球的孵育过程进行了探索研究，发现在孵育过程中震荡能使微球在一定程度保持悬浮而不沉降，减少微球团聚的发生，促进孵育过程的反应进行，以此改善检测效果，提高检测灵敏度，对T-Tau、P-Tau-181、α-synuclein的检测能够产生降低检出限的有益效果。
5、本发明在孵育过程中添加孵育剂，包括多元醇、高分子聚合物、非离子表面活性剂、螯合剂，上述组分相互协同作用保持微球的长效悬浮效果，促进孵育过程的反应进行，减少微球团聚的形成，减少样本与微球之间可能的非特异性抗原/抗体结合，从而提高检测结果的准确性与灵敏度。
6、本发明去除检测抗体的Fc片段，排除了非特异性反应的干扰，提高检测结果的准确性与灵敏度。
附图说明
图1a为本发明实施例试剂盒去除检测抗体的Fc片段的检测原理示意图；
图1b为本发明实施例试剂盒未去除检测抗体的Fc片段的检测原理示意图；
图2为本发明实施例抗体偶联的微球的分布情况；
图3为本发明第三实施例的流式荧光检测Aβ1-40、Aβ1-42、T-Tau、p-Tau-181和α-synuclein的校准曲线；
图4为本发明实施例的Aβ1-40的线性评价结果；
图5为本发明实施例的Aβ1-42的线性评价结果；
图6为本发明实施例的T-Tau的线性评价结果；
图7为本发明实施例的p-Tau-181的线性评价结果；
图8为本发明实施例的α-synucleinuclein的线性评价结果；
图9为本发明实施例中健康人与AD患者的Aβ1-40检测量比对图；
图10为本发明实施例中健康人与AD患者的Aβ1-42检测量比对图；
图11为本发明实施例中健康人与AD患者的T-Tau检测量比对图；
图12为本发明实施例中健康人与AD患者的p-Tau-181检测量比对图；
图13为本发明实施例中健康人与AD患者的α-synucleinuclein检测量比对图；
图14为本发明实施例中健康人与AD患者的Aβ1-42/Aβ1-40比值的检测量比对图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另外定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本文中使用的“包括”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。
图1a、图1b为本发明实施例中特异性抗体、微球、检测抗体和藻红蛋白之间的关系示意图。
参照图1a，抗体蛋白2偶联的聚苯乙烯微球1、待测样本3、生物素5偶联的检测抗体4、链霉亲和素6与藻红蛋白7的偶联物和生物素偶联的BSA8形成的网状结构结合形成免疫复合体，其中，聚苯乙烯微球1由兔抗标记，生物素5偶联有去除Fc片段的抗体，流式细胞仪发射的两束不同波长激发光照射免疫复合体，由不同抗体偶联的微球的荧光强度确定检测指标类型、由藻红蛋白的荧光强度确定各项检测指标含量。
参照图1b，抗体蛋白2偶联的聚苯乙烯微球1、待测样本3、生物素5偶联的检测抗体4、链霉亲和素6与藻红蛋白7的偶联物和生物素偶联的BSA8形成的网状结构结合形成免疫复合体，其中，聚苯乙烯微球1由兔抗标记，生物素5偶联有未去除Fc片段的抗体，流式细胞仪发射的两束不同波长激发光照射免疫复合体，由不同抗体偶联的微球的荧光强度确定检测指标类型、由藻红蛋白的荧光强度确定各项检测指标含量。
实施例1：试剂盒的制备、使用与效果评价
一、试剂盒的制备
根据不同的检测指标，可以制备：1)第一试剂盒：同时检测Aβ1-42、Aβ1-40、p-Tau-181的试剂盒，具体组成如表1所示；2)第二试剂盒：同时检测Aβ1-42、Aβ1-40、p-Tau-181、α-synuclein的试剂盒，具体组成如表2所示；3)第三试剂盒：Aβ1-42、Aβ1-40、T-Tau、p-Tau-181、α-synuclein，具体组成如表3所示。
表1：第一试剂盒组成
表2：第二试剂盒组成
表3：第三试剂盒组成
以同时检测Aβ1-42、Aβ1-40、T-Tau、p-Tau-181、α-synuclein的第三试剂盒为例，其制备方法如下，第一试剂盒和第二试剂盒根据检测指标的不同，减少相应试剂即可：
(1)制备偶联抗体的微球溶液
取第一荧光微球、第二荧光微球、第三荧光微球、第四荧光微球、第五荧光微球，表4为制备抗体偶联的荧光微球中各原料的厂家、型号及荧光强度。
表4：微球
微球 厂家 型号 荧光强度
第一荧光微球(A1微球) Biolegend 740167 4000
第二荧光微球(A2微球) Biolegend 740168 20000
第三荧光微球(A3微球) Biolegend 740169 50000
第四荧光微球(A4微球) Biolegend 740170 110000
第五荧光微球(A5微球) Biolegend 740171 140000
下述抗人Aβ1-42抗体、抗人Aβ1-40抗体、抗人T-Tau抗体、抗人p-Tau-181抗体、抗人α-synuclein抗体均为兔单克隆抗体，抗人Aβ1-42抗体购自ABclonal，抗人Aβ1-40抗体购自Cell Signaling Technology，抗人T-Tau抗体、抗人α-synuclein抗体购自Thermo，抗人p-Tau-181抗体购自abcam；所述Aβ1-40抗体偶联A1微球、Aβ1-42抗体偶联A2微球、p-Tau-181抗体偶联A3微球、T-Tau抗体偶联A4微球、α-synuclein抗体偶联A5微球；所述A1～A5微球为荧光强度不同的5μm羧基微球，荧光强度如表4所示。
制备Aβ1-40抗体偶联的微球步骤：取第一荧光微球5×106个，加入PBST缓冲液(磷酸盐缓冲剂，含0.05％ TWEEN-20，pH 7.4，购于sigma)清洗2次，在清洗后的所述第一荧光微球中加入100μg的EDC(N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐，，购于sigma)和50μg的NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐，购于Aladdin)放置30分钟以活化微球，加入100μg抗人Aβ1-40的抗体在室温旋转反应5小时以清洗微球去除多余抗体，清洗所述第一荧光微球去除多余所述抗人Aβ1-40抗体后加入质量分数为5％的脱脂奶粉封闭30分钟，去除封闭液后加入pH为7.2的Tris缓冲液保存；
制备Aβ1-42抗体偶联的微球步骤：取第二荧光微球5×106个，加入PBST缓冲液清洗2次，在清洗后的所述第二荧光微球中加入100μg的EDC和50μg的NHS放置30分钟以活化微球，加入100μg抗人Aβ1-42抗体在室温旋转反应5小时以清洗微球去除多余抗体，清洗所述第二荧光微球去除多余所述抗人Aβ1-42抗体后加入质量分数为5％的脱脂奶粉封闭30分钟，去除脱脂奶粉后加入pH为7.2的Tris缓冲液保存；
制备p-Tau-181抗体偶联的微球步骤：取第三荧光微球5×106个，加入PBST缓冲液清洗2次，在清洗后的所述第三荧光微球中加入100μg的EDC和50μg的NHS放置30分钟以活化微球，加入100μg抗人p-Tau-181抗体在室温旋转反应5小时以清洗微球去除多余抗体，清洗所述第三荧光微球去除多余所述抗人p-Tau-181抗体后加入质量分数为5％的脱脂奶粉封闭30分钟，去除脱脂奶粉后加入pH为7.2的Tris缓冲液保存；
制备α-synuclein抗体偶联的微球步骤包括，取第四荧光微球5×106个，加入PBST缓冲液清洗2次，在清洗后的所述第四荧光微球中加入100μg的EDC和50μg的NHS放置30分钟以活化微球，加入100μg抗人α-synuclein抗体在室温旋转反应5小时以清洗微球去除多余抗体，清洗所述第四荧光微球去除多余所述抗人α-synuclein抗体后加入质量分数为5％的脱脂奶粉封闭30分钟，去除脱脂奶粉后加入pH为7.2的Tris缓冲液保存，制得α-synuclein抗体偶联的微球。
制备T-Tau抗体偶联的微球步骤：取第五荧光微球5×106个，加入PBST缓冲液清洗2次，在清洗后的所述第五荧光微球中加入100μg的EDC和50μg的NHS放置30分钟以活化微球，加入100μg抗人T-Tau抗体在室温旋转反应5小时以清洗微球去除多余抗体，清洗所述第五荧光微球去除多余所述抗人T-Tau抗体后加入质量分数为5％的脱脂奶粉封闭30分钟，去除脱脂奶粉后加入pH为7.2的Tris缓冲液保存；
取pH为7.2的Tris缓冲液98mL，根据试剂盒的检测指标，分别加入Aβ1-40、Aβ1-42、T-Tau、p-Tau-181、α-synuclein抗体偶联的微球各0.5mL，配制成所述偶联抗体的微球溶液。
(2)制备生物素偶联抗体
对购买的抗人Aβ1-40抗体、抗人Aβ1-42抗体、抗人T-Tau抗体、抗人p-Tau-181抗体去除Fc片段，方法如下：
1、使用PH＝5的0.1mol/L醋酸钠缓冲液，含0.1mol/L的NaCl透析抗体5mg/mL；
2、将胃蛋白酶0.3mg溶解到透析后的抗体溶液中，在37℃培养18小时；
3、将PH调整为7.0，使用Sephacryl S-200HR，以0.1mol/L磷酸钠缓冲液(PH＝7.0)为洗脱液，按照速度0.35mL/min进行凝胶过滤；
4、取出F(ab`)2组分进行浓缩。测量280nm处的吸光度，用以计算浓度，加入1％(V/V)的浓度为100mg/mL的叠氮化钠并保存，备用。
5、用PH＝6的磷酸钠缓冲液将上述F(ab`)2稀释至0.4mg/mL，取0.9mL并加入0.1mL2-巯基乙胺溶液。在37℃培养90min。
6、用PH＝6的磷酸钠溶液(含5mmol/l的EDTA)在Ultrogel AcA44柱中按照速度0.35mL/min进行凝胶过滤。
7、取出Fab`组分，测量280nm处的吸光度并计算浓度；
取处理后的抗人Aβ1-40抗体、抗人Aβ1-42抗体、抗人T-Tau抗体、抗人p-Tau-181抗体和抗人α-synuclein抗体各100μg，分别按照抗体与生物素的摩尔比为1:30添加生物素，在室温下孵育5小时后，得到所述生物素偶联的抗人Aβ1-40抗体、所述生物素偶联的抗人Aβ1-42抗体、所述生物素偶联的抗人T-Tau抗体、所述生物素偶联的抗人p-Tau-181抗体和所述生物素偶联的抗人α-synuclein抗体，去除未结合生物素后用0.01mol/L的PBS溶液分别稀释所述生物素偶联的抗人Aβ1-40抗体、所述生物素偶联的抗人Aβ1-42抗体、所述生物素偶联的抗人T-Tau抗体、所述生物素偶联的抗人p-Tau-181抗体和所述生物素偶联的抗人α-synuclein抗体分别至4μg/mL；
分别取上述浓度为4μg/mL生物素偶联的抗人Aβ1-40抗体、所述生物素偶联的抗人Aβ1-42抗体、所述生物素偶联的抗人T-Tau抗体、所述生物素偶联的抗人p-Tau-181抗体和所述生物素偶联的抗人α-synuclein抗体各25mL混合，配制成所述生物素偶联抗体。则每种生物素标记抗体的浓度为0.8μg/mL。
(3)制备校准品，不同浓度的Aβ1-40、Aβ1-42、T-Tau、p-Tau-181、α-synuclein蛋白，经样品稀释液稀释至不同浓度后分别冻干，组合得到校准品，用以建立检测时的校准曲线，具体配置见表3。表5为校准品蛋白Aβ1-40、Aβ1-42、T-Tau、p-Tau-181、α-synuclein的厂家、型号。
表5：蛋白来源
校准品蛋白 厂家 型号
Aβ1-40 Abcam ab120479
Aβ1-42 Abcam ab120301
T-Tau MilliporeSigma T0576
p-Tau-181 Abcam ab269022
α-synuclein MilliporeSigma S7820
(4)制备质控品，所述质控品由Aβ1-40、Aβ1-42、T-Tau、p-Tau-181、α-synuclein重组蛋白的高值和中值冻干品，以判断检测结果的可靠性，具体配置见表3。所述质控品蛋白的来源参照表5。
(5)制备荧光试剂，SA-PE采购自thermofisher，稀释至4μg/mL备用，制备生物素-BSA，取BSA100μg按照BSA与生物素的摩尔比为1:30添加生物素，在室温下孵育5小时后，去除未结合生物素，得到所述生物素偶联BSA，后按1μg/mL生物素偶联BSA稀释至含4μg/mLSA-PE的溶液中备用。
(6)制备孵育剂，6.057g的三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶于1000mL纯水，再加入9g山梨醇、10mL聚乙烯吡咯烷酮、5g Triton X-100、12g柠檬酸钠、20g透明质酸钠，混合备用；
(7)制备样品稀释液、反应缓冲液、洗涤缓冲液：
制备样品稀释液，将9g氯化钠(NaCl)、6.057g的三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶于1000mL纯水，加入质量浓度为1％的Proclin300防腐剂，调节pH至7.4备用；
制备反应缓冲液，取9g的NaCl、6.057g的Tris溶于1000mL纯水，加入质量浓度为1％的牛血清白蛋白(BSA)、质量浓度为5％的阻断剂(灭活的鼠IgG、抗HAMA多克隆抗体)、质量浓度为0.1％的Proclin300防腐剂、质量浓度为0.1％的吐温-20，调节pH至7.4备用；
制备洗涤缓冲液(10×)，将2.4g的磷酸二氢钾(KH2PO4)、36.32g的十二水合磷酸氢二钾(K2HPO4·12H2O)、8g的NaCl、2g的KCl溶于1000mL纯水中，加入25g的BSA、质量浓度为1％的Proclin300防腐剂、质量浓度为0.5％的吐温-20，混合备用。
二、试剂盒的使用方法
去除多余检测指标后，第一及第二试剂盒的使用方法与第三试剂盒相同，以第三试剂盒为例，第三试剂盒的具体使用方法如下：
向样本管、校准曲线管和质控管中加入25μL反应缓冲液、25μL偶联抗体的微球溶液，充分混合均匀，震荡器震荡30秒以上；
向样本管加入样本，向校准曲线管加入校准品，向质控管中加入质控品；
向样本管、校准曲线管和质控管中加入25μL生物素偶联抗体，加入25μL孵育剂；
将样本管、校准曲线管和质控管在2-8℃冷藏避光震荡孵育18小时，震荡频率为300-500r/min，本发明实施例中涉及震荡的频率均为500r/min；
向样本管、校准曲线管和质控管中加入荧光试剂，室温避光震荡孵育0.5小时；
向样本管、校准曲线管和质控管中加入1000μL的1×洗涤缓冲液，通过涡旋将微球重悬，充分混合均匀，震荡器震荡30秒以上，然后在300g下离心5分钟，弃掉上清；
向样本管、校准曲线管和质控管中加入150μL-300μL的1×洗涤缓冲液，通过涡旋将微球重悬，充分混合均匀，震荡器震荡30秒以上，在迈瑞公司生产的BriCyte E6流式细胞仪上检测荧光类型和荧光信号强度。
本发明的试剂盒所需样本量少，需25μL血浆即可。
图2为本发明实施例抗体偶联的微球的分布情况。参照图2，以侧向散射光(sidescatter,SSC)为纵坐标，别藻蓝蛋白(APC)为横坐标。纵坐标确定微球复杂程度位置区间，横坐标区分不同微球所带APC荧光强度，图2可以区分四种结合了Aβ1-40、Aβ1-42、T-Tau、p-Tau-181、α-synuclein抗体偶联的微球，其中P1代表本发明实施例Aβ1-40抗体偶联的微球的SSC和APC分布，P2代表本发明实施例Aβ1-42抗体偶联的微球的SSC和APC分布，P3代表本发明实施例T-Tau抗体偶联的微球的SSC和APC分布，P4代表本发明实施例p-Tau-181抗体偶联的微球的SSC和APC分布，P5代表本发明实施例α-synuclein抗体偶联的微球的SSC和APC分布。
三、试剂盒检测结果评价
对第三试剂盒检测样品中Aβ1-40、Aβ1-42、T-Tau、p-Tau-181、α-synuclein进行性能评价。具体的性能评价方法为：
(a)1×洗涤缓冲液的配制：
①将10×洗涤缓冲液稳定到室温；
②用纯化水将10×洗涤缓冲液按1：9比例(1份10×洗涤缓冲液加9份纯化水)稀释成1×洗涤缓冲液备用。
(b)校准品的制备
①向校准品冻干粉中加入1mL样品稀释液，使冻干粉完全溶解；
②室温下静置15分钟，此溶液浓度为最高浓度，将其标记为C1；
③准备11只空管，分别标记为C10、C9、C8、C7、C6、C5、C4、C3、C2、C1、C0；
④每只管中加入75μL样品稀释液，并进行2倍倍比稀释，即取75μL C1溶液到C2中，充分混匀；
⑤同样的方法进行稀释，分别得到C10、C9、C8、C7、C5、C4、C3、C2、C1校准品。C0中只加入样品稀释液。
(c)性能评价
向样本管、校准曲线管和质控管中加入25μL反应缓冲液、25μL偶联抗体的微球溶液，充分混合均匀，震荡器震荡30秒以上；
向样本管加入样本，向校准曲线管加入校准品，向质控管中加入质控品；
向样本管、校准曲线管和质控管中加入25μL生物素偶联抗体，加入25μL孵育剂；
将样本管、校准曲线管和质控管在2-8℃冷藏避光孵育18小时；
向样本管、校准曲线管和质控管中加入荧光试剂，室温避光0.5小时；
向样本管、校准曲线管和质控管中加入1000μL的1×洗涤缓冲液，通过涡旋将微球重悬，充分混合均匀，震荡器震荡30秒以上，然后在300g下离心5分钟，弃掉上清；
向样本管、校准曲线管和质控管中分别加入150μL-300μL的1×洗涤缓冲液，通过
涡旋将微球重悬，充分混合均匀，震荡器震荡30秒以上，在迈瑞公司生产的BriCyte E6流式细胞仪上检测荧光类型和荧光信号强度。
图3为本发明第三实施例的流式荧光检测Aβ1-40、Aβ1-42、T-Tau、p-Tau-181和α-synuclein的校准曲线。在流式细胞仪上分别检测Aβ1-40、Aβ1-42、T-Tau、p-Tau-181和α-synuclein的不同浓度的校准品，得到图3的校准曲线。
(d)线性、空白限、检出限评价
用接近线性范围上限的高浓度样本稀释成至少5个不同浓度(xi)的样本，每个浓度测试3次，分别求出检测结果的均值(yi)。以稀释浓度(xi)为自变量，以检测结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程，计算线性回归的相关系数(R)。
空白限的检测方法：用零浓度校准品作为样本进行检测，重复测定20次，根据试剂盒所用校准品的曲线方程得出20次测量结果的浓度值，计算其平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD，即为空白限值。
检出限的检测方法：对5份浓度近似检出限的低值样本(近似检出限按照所得空白限值进行估计，略高于空白限)进行检测，每份样本检测5次，对检测结果按照大小进行排序，低于空白限数值(Aβ1-42、Aβ1-40、T-Tau、p-Tau-181、α-synuclein空白限分别为0.54pg/mL、0.57pg/mL、0.73pg/mL、0.37pg/mL、16.30pg/mL)的检测结果的数量应小于或等于3个。
图4为本发明实施例的Aβ1-40的线性评价结果，图5为本发明实施例的Aβ1-42的线性评价结果，图6为本发明实施例的T-Tau的线性评价结果，图7为本发明实施例的p-Tau-181的线性评价结果，图8为本发明实施例的α-synuclein的线性评价结果。参照图4-8，Aβ1-40线性回归方程为y＝25.451x+44.431，R2＝0.9988；Aβ1-42线性回归方程为y＝1.0269x-2.1728，R2＝0.9994；T-tau线性回归方程为y＝0.9022x+10.331，R2＝0.9958；p-Tau-181线性回归方程为y＝0.9944x+0.1521，R2＝0.9994；α-synuclein线性回归方程y＝1.0235x-3.448，R2＝0.9997。
采用本发明的试剂盒，可以检测到的Aβ1-40线性区间不窄于[9.77,1250]pg/mL，Aβ1-42线性区间不窄于[4.88,625]pg/mL，T-Tau线性区间不窄于[9.77，1250]pg/mL，p-Tau-181线性区间不窄于[1.25,160]pg/mL，α-synuclein线性区间不窄于[250，32000]pg/mL线性区间内，线性相关系数∣R∣不小于0.990。
表6为检出限试验(pg/mL)结果。参照表10，Aβ1-40、Aβ1-42、T-Tau、p-Tau-181、α-synuclein检出限分别为：0.60pg/mL、0.64pg/mL、0.75pg/mL、0.44pg/mL、18.10pg/mL。可见，Aβ1-40、Aβ1-42、T-Tau、p-Tau-181、α-synuclein的检出限分别不高于2.5pg/mL、2.5pg/mL、1.5pg/mLl、1pg/mL、100pg/mL，本发明试剂盒的检测灵敏度高。
表6：检出限试验(pg/mL)
/>
(e)重复性与批间差评价
重复性：分别检测高、低两个浓度水平样本的Aβ1-40、Aβ1-42、T-Tau、p-Tau-181和α-synuclein样本，各重复检测10次，计算10次结果的平均值M和标准差SD，计算变异系数CV。
表7为重复性试验(pg/mL)结果，参照表11，Aβ1-40、Aβ1-42、T-Tau、p-Tau-181和α-synuclein高值、低值校准品重复性变异系数CV均在10％以内。
表7：重复性试验(pg/mL)
批间差：取三个批次的试剂盒，分别重复检测同1份参考品，各重复检测10次，计算30次测量结果的平均值M和标准差SD，计算变异系数CV。
表8为批间差(pg/mL)评价结果，参照表12，Aβ1-40、Aβ1-42、T-Tau、p-Tau-181和α-synuclein的3个批次批间差CV均在10％以内。
表8：批间差(pg/mL)
通过重复性与批间差评价可知，本发明试剂盒具有较好的重复性和批间差，批内实验的变异系数(CV)不大于15％，批间差CV不大于15％。
由上述实例可知本发明提供的流式荧光技术的同时检测Aβ1-40、Aβ1-42、T-Tau、p-Tau-181、α-synuclein的试剂盒能够用于不同样本中Aβ1-40、Aβ1-42、T-Tau、p-Tau-181、α-synuclein浓度的测定，线性范围广、精密度高、特异性好，测定结果稳定。
四、实际应用
第一、第二、第三试剂盒检测AD患者样本与健康样本比对评价。分别选取60-80岁年龄段健康人样本、AD患者样本各20例进行比对分析。
第一试剂盒：
图9为本发明实施例中健康人与AD患者的Aβ1-40检测量比对图，图10为本发明实施例中健康人与AD患者的Aβ1-42检测量比对图，图12为本发明实施例中健康人与AD患者的p-Tau-181检测量比对图，图14为本发明实施例中健康人与AD患者的Aβ1-42/Aβ1-40比值的检测量比对图。参照图9、10、12、14，AD患者血液中Aβ1-42、Aβ1-42/Aβ1-40比值的中值分别为：11.7(5.8,22.4)、0.06(0.02,0.11)，健康人血液中Aβ1-42、Aβ1-42/Aβ1-40比值的中值分别为：17.5(11.4,45.6)、0.08(0.06,0.13)，AD患者血液中Aβ1-42、Aβ1-42/Aβ1-40比值的中值较健康人有下降趋势。AD患者血液中p-Tau-181的中值2.6(0.8,6.6)较健康人血液中p-Tau-181的中值1.2(0,3.9)有上升趋势。本发明的试剂盒能够同时、且更准确地检测血液中Aβ1-40、Aβ1-42、p-Tau-181，更方便临床应用。
第二试剂盒：
图13为本发明实施例中健康人与AD患者的α-synuclein检测量比对图。参照图9、10、12、13、14，AD患者血液中Aβ1-42、Aβ1-42/Aβ1-40比值的中值分别为：11.7(5.8,22.4)、0.06(0.02,0.11)，健康人血液中Aβ1-42、Aβ1-42/Aβ1-40比值的中值分别为：17.5(11.4,45.6)、0.08(0.06,0.13)，AD患者血液中Aβ1-42、Aβ1-42/Aβ1-40比值较健康人有下降趋势；AD患者血液中p-Tau-181的中值2.6(0.8,6.6)较健康人血液中p-Tau-181的中值1.2(0,3.9)有上升趋势，健康人血液中α-synuclein的中值9885.4(4565.6,14862.3)，AD患者血液中α-synuclein与健康人基本持平。本发明的试剂盒能够同时、且更准确地检测Aβ1-40、Aβ1-42、p-Tau-181、α-synuclein，更方便临床应用。
第三试剂盒：
图12为本发明实施例中健康人与AD患者的p-Tau-181检测量比对图，参照图9-14，对于Aβ1-42、Aβ1-42/Aβ1-40比值，AD患者血液中Aβ1-42、Aβ1-42/Aβ1-40比值的中值分别为：11.7(5.8,22.4)、0.06(0.02,0.11)，健康人血液中Aβ1-42、Aβ1-42/Aβ1-40比值的中值分别为：17.5(11.4,45.6)、0.08(0.06,0.13)，AD患者血液中Aβ1-42、Aβ1-42/Aβ1-40比值较健康人有下降趋势；对于p-Tau-181，AD患者血液中p-Tau-181的中值2.6(0.8,6.6)较健康人血液中p-Tau-181的中值1.2(0,3.9)有上升趋势，对于T-tau、α-synuclein，AD患者血液中T-tau、α-synuclein的中值分别为：5.6(2.5,9.8)、9763.1(4565.6,14667.7)，健康人血液中T-tau、α-synuclein的中值分别为5.3(2.6,7.9)、9885.4(4565.6,14862.3)，AD患者血液中T-tau、α-synuclein与健康人基本持平。本发明的试剂盒能够同时、且更准确地检测Aβ1-40、Aβ1-42、T-tau、p-Tau-181、α-synuclein，更方便临床应用。
实施例2：微球及微球包被抗体筛选试验
p-Tau-181在现有试剂盒和现有检测方法中检测灵敏度均不高，检测结果不稳定，我们更换不同微球以尝试改善p-Tau-181的检测，按照实施例1的方法对平均荧光强度进行测试(区别在于抗人p-Tau-181的抗体偶联上不同的微球：A3微球，Y7微球，L10微球)，如表9所示；A3微球为5μm羧基微球，Y7为4μm羧基微球、L10为5μm氨基微球。
表9：不同微球下p-Tau-181平均(测试10次)荧光强度
结果显示：Y7微球下p-Tau-181平均荧光强度不高，在低浓度下较难实现检测，灵敏度低；L10微球下p-Tau-181低浓度下干扰大，检测结果不准确；A3微球可较为明显的提高检测效价1倍左右，灵敏度高。
相同地，我们对其余抗体偶联的微球进行了试验，发现5μm羧基微球(A微球)能够提高检测灵敏度，检测结果与表9结果呈现相同趋势。为了区分五种检测指标，我们将其分别偶联于不同荧光强度的A微球：Aβ1-40抗体偶联A1微球、Aβ1-42抗体偶联A2微球、p-Tau-181抗体偶联A3微球、T-Tau抗体偶联A4微球、α-synuclein抗体偶联A5微球。
同时，本发明也选取了鼠单抗进行对比试验，按照实施例2的方法测定鼠抗微球和兔抗微球下Aβ1-40、Aβ1-42、T-Tau、p-Tau-181、α-synuclein的检出限，结果如表10所示。
表10：微球包被抗体筛选(pg/mL)
Aβ1-40 Aβ1-42 T-Tau p-Tau-181 α-synuclein
鼠抗微球 1.28 1.33 1.78 1.05 33.74
兔抗微球 0.60 0.64 0.75 0.44 18.10
结果显示：使用兔抗标记的微球具有更强的特异性和更高的检测灵敏度。更换兔抗微球后，Aβ1-40、Aβ1-42、T-Tau、p-Tau-181、α-synuclein的检出限降低，检测灵敏度明显提高。
上述结果可能的原因在于：
i.兔抗能够识别人类抗原上在啮齿动物中没有免疫原性的表位，增加了可靶向表位的总数；
ii.兔抗对小分子和半抗原有强烈的免疫反应，这在啮齿类动物中并不常见；
iii.近交品系的家兔更为稀少，而大多数小鼠品系是近交系，因此家兔具有更多的免疫反应多样性；
iv.家兔使用独特的机制来遗传产生和多样化抗体，使其具有高亲和力和特异性。
实施例3：孵育条件的筛选试验
如实施例1，我们在添加反应缓冲液、偶联抗体的微球、生物素偶联抗体后需要进行孵育，孵育条件直接影响了反应的充分与否，影响后续检测，若反应进行不充分，后续流式细胞仪检测得到的平均荧光强度不准确，导致检测结果也不准确。而现有技术对孵育往往是混合后室温孵育一定时间，微球容易沉积进而导致反应进行不充分。
本发明的第一个改进在于调整孵育的时间与温度；我们设置了三组孵育方案：
方案一，添加反应缓冲液、微球、校准品蛋白、检测抗体后室温孵育2h，后添加生物素-BSA-SA-PE孵育30min；
方案二，添加反应缓冲液、微球、校准品蛋白、检测抗体后室温孵育4h，后添加物素-BSA-SA-PE孵育30min；
方案三，添加反应缓冲液、微球、校准品蛋白、检测抗体后2～8℃过夜孵育18h，后添加物素-BSA-SA-PE孵育30min。
其他步骤同实施例1，流式细胞仪检测平均荧光强度，Aβ1-40、Aβ1-42、p-Tau-181、T-Tau四项结果2-8℃孵育18h结果明显效价提高1倍；、α-synuclein2-8℃孵育18h测试结果较4h孵育结果一致；因此为改善检测效果，应选择方案三进行孵育。
本发明在孵育添加试剂的方法进行了大量研究，发现了使用生物素标记BSA，再将得到的生物素-BSA与SA-PE结合形成网状结构，使用上述网状结构的试剂进行孵育能取得更好的效果，五种检测指标趋势类似，p-Tau-181平均荧光强度能够反映整体结果，检测结果如表11所示。
表11：p-Tau-181平均(测试10次)荧光强度
结论：以往生物素+SA-PE体系仅为通过抗体上的生物素与SA-PE结合，起到的放大效果仅为一个抗体上结合多个生物素后在与SA-PE结合，体系内多余的生物素抗体未能发挥其本身能达到的逐级放大的作用,本项目SA-PE在使用时按合适比例与生物素标记的BSA结合提前形成网状结构后加入到反应体系中放大检测信号值。以生物素标记BSA后与SA-PE先行结合形成网状结构后再使用，根据组合配制结果其中最优浓度(1μg/mL生物素-BSA+4μg/mLSA-PE)搭配测试结果为SA-PE单独使用的4倍左右。
在上述孵育方法的基础上，我们发现震荡能够使微球保持一定程度的悬浮而不沉降，从而使反应更加充分，可以提高检测灵敏度，我们按照实施例2的方法对比震荡与不震荡的检出限，震荡频率为震荡500r/min以保证微球保持一定程度的悬浮而不沉降，均不加入孵育剂，结果如表12所示。
表12：震荡孵育灵敏度优化(pg/mL)
Aβ1-40 Aβ1-42 T-Tau p-Tau-181 α-synuclein
不震荡孵育 3.54 3.91 1.96 1.61 31.8
震荡孵育 3.51 3.87 1.40 0.98 23.3
震荡并不一定能够在免疫定量中提高灵敏度，其效果与微球、抗体等免疫定量过程中涉及的物质的物理化学性质有关，在本发明中，我们就能够看到，震荡对T-Tau、p-Tau-181、α-synuclein能够显著提高灵敏度，而对Aβ1-40、Aβ1-42的灵敏度没有明显效果；为提高整体灵敏度，我们需要在孵育过程中进行震荡。
为进一步提高Aβ1-40、Aβ1-42的灵敏度，我们在进行上述震荡孵育的基础上，尝试在孵育液中额外添加能够降低微球沉降、促进反应充分进行的孵育剂，孵育剂的成分按照作用方式分为多元醇、高分子聚合物、非离子表面活性剂；多元醇我们加入山梨醇、丙三醇；高分子聚合物我们加入聚乙二烯、聚乙烯吡咯烷酮；非离子表面活性剂我们加入Tetronic1307、吐温表面活性剂、Triton表面活性剂、硬脂酸聚氧乙烯酯表面活性剂；每种试剂均按照实施例1中相同类别试剂的摩尔浓度进行配置，其他均按照实施例1进行，结果如表13所示。
表13：添加试剂灵敏度优化(pg/mL)
结果显示：多元醇中山梨醇能有效降低Aβ1-40、Aβ1-42的检出限；高分子聚合物中聚乙二烯、聚乙烯吡咯烷酮均能够降低Aβ1-40、Aβ1-42的检出限，聚乙烯吡咯烷酮效果更好；非离子表面活性剂均能够降低Aβ1-40、Aβ1-42的检出限，其中Tetronic1307、吐温-80、硬脂酸聚氧乙烯酯效果一般，Triton X-100效果较好；我们将山梨醇、聚乙烯吡咯烷酮、Triton X-100三者组合作为孵育剂加入，共同发挥效果降低了五种检测指标的检出限，但是Aβ1-40、Aβ1-42的检出限依然较高。
于是我们在上述山梨醇、聚乙烯吡咯烷酮、Triton X-100三者组合的基础上增加螯合剂，我们对大量螯合剂进行了筛选，发现了有三种螯合剂对本发明的五种检测指标能起到提高灵敏度的效果，上述螯合剂的添加、检出限的测定按照实施例1的方法进行，结果如表14所示。
表14：添加试剂灵敏度优化(pg/mL)
螯合剂 Aβ1-40 Aβ1-42 T-Tau p-Tau-181 α-synuclein
空白 1.50 1.69 0.88 0.53 21.2
柠檬酸钠 1.04 1.21 0.80 0.48 20.4
EDTA 0.92 1.02 0.80 0.48 20.2
透明质酸钠 0.98 1.14 0.83 0.51 20.8
柠檬酸钠+透明质酸钠 0.60 0.64 0.75 0.44 18.10
结果显示：在柠檬酸钠、EDTA、透明质酸钠中，透明质酸钠的效果最好，对每一种检测指标的灵敏度都有所提升，尤其是对Aβ1-40、Aβ1-42的检出限的降低起到了显著效果；特别是本发明对上述三种的组合也进行了试验，发现其中只有柠檬酸钠和透明质酸钠能共同发挥效果，使得本发明五种检测指标的检出限进一步降低。
从原理上看：多元醇类物质可增大保存液密度，使得微球可以以悬浮的形式存在，减少微球团聚、交联的概率，进而达到促进反应发生的效果，避免因免疫微球结块或团聚时间过长后会导致免疫微球结合牢固，从而很难通过震荡再次分散的问题。非离子表面活性剂也叫两性表面活性剂，可以吸附到包被后的免疫微球表面未完全封闭掉的位点上，从而提高了免疫微球表面的空间位阻，进一步降低其他蛋白的非特异性吸附，同时还会提高微球的分散性，与多元醇协同作用，减少微球团聚的形成，从而提高检测结果的准确性与灵敏度。高分子聚合物可以将血清血浆样本中的干扰蛋白包裹或聚合在一起，消除纤维蛋白等大分子蛋白的干扰，使得杂蛋白无法通过弱相互作用于抗原/抗体，同时减少样本与微球之间可能的非特异性抗原/抗体结合；
螯合剂能够促进微球分散、保持分散的体系结构，与上述组分相互协同作用保持微球的长效悬浮效果，从而提高检测结果的准确性与灵敏度，其中透明质酸钠还有额外作用：增加水剂粘度而使沉积难度加大、沉降速度减弱，这使得柠檬酸钠搭配透明质酸钠产生的效果最佳。
实施例4：抗体处理的筛选试验
在免疫定量中，非特异性干扰会对检测产生较大影响。本发明在研究过程中，将非特异性样本稀释后测试，其测试浓度与原液测试浓度的比例明显不同于稀释倍数。使用同型对照抗体测试非特异性样本，其测试浓度明显高于本底，这表明非特异性反应主要由抗体的Fc片段引起。
因此，本实施例对抗体处理的方法进行筛选试验，尝试找到一种抗体处理的方法使得检测能够最大限度避免非特异性反应的干扰。
我们首先尝试添加被动阻断剂、主动阻断剂以阻断非特异性反应，但效果一般，然后我们尝试去除抗体的Fc片段，去除Fc片段后效果最为明显。我们分别进行了上述的实验，被动阻断剂为灭活的鼠IgG，主动阻断剂为抗HAMA多克隆抗体，其添加量同实施例1；去除Fc片段的方法同实施例1；做被动阻断、主动阻断的试验时，只加入对应的被动或主动阻断剂，且不对抗体去除Fc片段；做去除Fc片段的试验时，不加入被动阻断剂和主动阻断剂。
用于测试的非特异性样本为实验内筛选稀释后不成比例的异常样本；用样品稀释液稀释10倍，按照实施例1的方法分别上机测试MFI值和浓度值，求原液浓度值与稀释液浓度值的比例，Aβ1-40、Aβ1-42、p-Tau-181、T-Tau的浓度值测定结果显示这四种检测指标的趋势相同，此处以p-Tau-181为例，结果如表15所示。
表15：不同抗体处理方法下非特异性样本p-Tau-181的浓度值
抗体处理 原液浓度值 稀释液浓度值 比例
空白 3.24 0.60 5.40
被动阻断 4.32 0.58 7.44
主动阻断 4.89 0.65 7.54
去除Fc片段 6.08 0.62 9.81
试验结果显示在去除Fc片段的处理后，原液和稀释液测定浓度接近稀释比例，这表明非特异性反应几乎不发生，检测灵敏度高，Aβ1-40、Aβ1-42、T-Tau的测定结果与p-Tau-181趋势相同，检测灵敏度高。
但是，对α-synuclein抗体进行上述不同处理，原液与稀释液的MFI值的测定结果呈现不同的趋势，结果如表16所示。
表16：不同抗体处理方法下非特异性样本α-synuclein的MFI值(测试10次)
抗体处理 原液MFI 稀释液MFI 比例
空白 4538.2 811.53 5.6
被动阻断 6741.57 801.37 8.4
主动阻断 7106.12 805.24 8.8
去除Fc片段 1320.89 158.86 8.3
根据试验结果，对α-synuclein去除Fc片段，去干扰效果和加入阻断剂接近，但是原液和稀释液的MFI值降低，灵敏度降低；因此在本发明中，我们不去除Fc片段，在反应缓冲液中加入阻断剂以保证α-synuclein检测的灵敏度。
可能的原因在于，对α-synuclein抗体去除Fc片段导致了α-synuclein抗体的蛋白构型发现了变化，反而降低了α-synuclein抗体的灵敏性，导致误差增大。
综上所述，本发明仅对Aβ1-40抗体、Aβ1-42抗体、p-Tau-181抗体、T-Tau抗体去除Fc片段，不对α-synuclein去除Fc片段。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。

Claims (5)

1.一种用于检测人血中阿尔茨海默病相关蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括偶联抗体的微球溶液、生物素偶联抗体、孵育剂；孵育剂包括山梨醇、聚乙烯吡咯烷酮、TritonX-100、柠檬酸钠、透明质酸钠；所述抗体为Aβ1-40抗体、Aβ1-42抗体、p-Tau-181抗体、T-Tau抗体、α-synuclein抗体中的一种或多种；所述偶联抗体的微球为A微球，A微球为5μm羧基微球，包括A1微球、A2微球、A3微球、A4微球、A5微球，A1~A5微球荧光强度不同；偶联微球的抗体为兔单克隆抗体；所述Aβ1-40抗体、Aβ1-42抗体、p-Tau-181抗体、T-Tau抗体去除Fc片段；试剂盒还包括荧光试剂，所述荧光试剂为生物素-BSA-SA-PE，所述生物素-BSA-SA-PE为与生物素-BSA交联的链霉亲和素与藻红蛋白偶联物。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述Aβ1-40抗体偶联A1微球、Aβ1-42抗体偶联A2微球、p-Tau-181抗体偶联A3微球、T-Tau抗体偶联A4微球、α-synuclein抗体偶联A5微球。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括阻断剂，所述阻断剂为灭活的鼠IgG、抗HAMA多克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括样品稀释液、反应缓冲液、洗涤缓冲液、校准品、质控品，所述样品稀释液包括三羟甲基氨基甲烷缓冲液、氯化钠、Proclin300；所述反应缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷缓冲液、氯化钠、牛血清白蛋白、阻断剂、Proclin300、吐温-20；所述洗涤缓冲液包括磷酸盐缓冲液、吐温-20。
5.一种孵育剂用于制备在振荡孵育时提高微球悬浮效果从而提高检测灵敏度的试剂盒的用途，其特征在于，所述孵育剂包括山梨醇、聚乙烯吡咯烷酮、TritonX-100、柠檬酸钠、透明质酸钠；振荡孵育的频率为500r/min；所述检测灵敏度为同时检测人血中Aβ1-40蛋白、Aβ1-42蛋白、p-Tau-181蛋白、T-Tau蛋白和α-synuclein蛋白的检测灵敏度；所述试剂盒为权利要求1所述的试剂盒。
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