CN117538541A - α-突触核蛋白检测试剂盒 - Google Patents

α-突触核蛋白检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及检测α‑突触核蛋白（α‑syn）的试剂盒，所述试剂盒基于以计数为特征的单分子检测技术来检测α‑突触核蛋白。另外，还涉及用于检测α‑突触核蛋白的单分子检测系统。本发明能够在快速检测的同时实现高的灵敏度，而且试剂盒的稳定性高。

Description

α-突触核蛋白检测试剂盒
技术领域
本发明涉及免疫检测领域，尤其是涉及一种基于单分子计数的检测α-突触核蛋白(α-syn)的试剂盒、以及用于检测α-突触核蛋白的单分子检测系统。
背景技术
α-突触核蛋白(α-syn)是一种140个氨基酸的非常保守的酸性小蛋白质，分子量为19kDa，其由位于4号染色体上的SNCA基因编码。它以高浓度位于中枢神经系统的突触前神经末梢，在此其对突触小泡生物学发挥作用。突触核蛋白病是一组与神经元和神经胶质的选择性群体中a-syn的纤维性聚集体的沉积有关的神经退行性病症。这些沉积物可见于神经胞体(如路易体(LB))中或如帕金森病(PD)或路易体痴呆(DLB)的疾病的营养不良神经突起中；或多系统萎缩症(MSA)的神经胶质细胞质包涵体中。
目前已知的α-突触核蛋白检测方法主要有化学发光法(参见专利文献1)、ELISA法(参见专利文献2和3)、电化学发光免疫分析法(参见专利文献4)等。
具体而言，专利文献1提供一种采用磁微粒化学发光法测定人体液样本中α-突触核蛋白(SNCA)含量的试剂盒，所述试剂盒包括校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物。
专利文献2公开了一种丝氨酸129位磷酸化alpha突触核蛋白聚集体的ELISA检测方法和试剂盒，所述试剂盒包含小鼠源单克隆抗体C140S、兔源多克隆抗体SN16、ELISA酶标板、PBS、NaHCO3缓冲液、封闭液和PBST等。
专利文献4公开了检测口腔黏膜蛋白的产品在制备用于辅助诊断神经退行性疾病的试剂或试剂盒中的用途，其中，检测基于电化学发光免疫分析。
以计数为特征的单分子检测技术因其原理上的突破，与现有的基于整体光强度的酶联免疫法、化学发光法相比，灵敏度得到提升，因而正在研究应用单分子检测技术来定量检测含量较低的生物标志物。本申请的发明人提出了一种独特的单分子检测方法(参见专利文献5)，其中，使用了原位信号增强纳米粒子和磁珠，基于双抗夹心法，对cTnI蛋白、IL-6蛋白、DNA等进行了单分子检测，获得了较低的检测下限，但未提及如何检测α-突触核蛋白，也未关注缓冲体系等对α-突触核蛋白检测的影响。
现有技术文献
专利文献1：CN112710850A；
专利文献2：CN106568969A；
专利文献3：CN105466912A；
专利文献4：CN115032400A；
专利文献5：CN111771126A
发明内容
发明所要解决的课题
众所周知，当以较长的检测时间(尤其是孵育时间)进行检测时，能够提高检测灵敏度，缩短检测时间和提高检测灵敏度之间存在一定的trade-off关系，难以同时实现检测时间的缩短和灵敏度的提高。专利文献5未提及如何检测α-突触核蛋白，也未关注缓冲体系等对α-突触核蛋白检测的影响。本申请的发明人尝试将专利文献5的单分子检测方法用于α-突触核蛋白试剂盒的开发，但由于α-突触核蛋白与该文献中记载的cTnI抗原、IL-6抗原、DNA等完全不同，在将其实施例中记载的针对cTnI抗原、IL-6抗原、DNA等的检测体系直接应用于α-突触核蛋白的检测时，出现灵敏度无法令人满意的状况。
为了解决上述课题，申请人针对捕获抗体的种类、检测抗体的种类、荧光染料的种类、磁珠的基团种类等均反复进行了优化，但灵敏度仍然无法令人满意。关于缓冲体系，本申请的发明人在初始优化过程中尝试使用现有的针对α-突触核蛋白的试剂盒中的缓冲液，但发现将这些缓冲液体系直接应用于以计数为特征的单分子检测方法时，即使延长孵育时间，最佳的灵敏度也无法令人满意，无法满足对于微量α-突触核蛋白的检测要求，而且这些缓冲体系组分较多，配制成本较高。申请人经过仔细分析后，认为这可能是由于现有的针对α-突触核蛋白的试剂盒中的缓冲液均是与各自的方法所配合使用的，在将这些缓冲液体系直接用于以计数为特征的单分子检测方法时可能与方法中的其他组分存在不利的相互作用。也即，需要寻找一种能够与以计数为特征的单分子检测方法体系中的诸如特定粒径(180～450nm)的荧光染料体系、磁珠等恰当地配合的缓冲体系。
本发明是鉴于上述问题而做出的，目的在于提供能够在快速检测的同时实现高的灵敏度且稳定性好的α-突触核蛋白试剂盒。
用于解决课题的手段
为了解决上述课题，本申请的发明人反复进行深入研究，结果发现了一种能够在快速检测的同时实现较高的灵敏度且稳定性好的α-突触核蛋白试剂盒。
本申请的一个技术方案如下。
基于单分子计数的检测α-突触核蛋白的试剂盒，其特征在于，包含经捕获抗体包被的磁珠、标记有荧光染料的检测抗体、用于前述经捕获抗体包被的磁珠的缓冲体系，
其中，前述捕获抗体和检测抗体分别能够与α-突触核蛋白的不同位点结合，
前述荧光染料含有荧光材料和载体，且粒径为180～450nm，每100mL前述缓冲体系包含0.5～2.0g的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、0.5～2.0g的表面活性剂、0.5～2.0g的鱼皮明胶、2.5～4.0g的无机金属盐、0.02～0.08mL的防腐剂、和0.3mL～1.0mL的阻断剂。
优选地，前述表面活性剂为表面活性剂S9，且在每100mL所述缓冲液中，其质量为0.8～1.5g。
优选地，前述无机碱金属盐为氯化钠或氯化钾，优选为氯化钠，且在每100mL所述缓冲液中，其质量为3.0～3.5g。
优选地，前述防腐剂为PC-300，且在每100mL所述缓冲液中，其含量为0.02～0.08mL。
优选地，前述阻断剂包含0.1～0.4mL的Mak33和0.2～0.6mL的TRU Block 2。
优选地，前述试剂盒还包含α-突触核蛋白校准品和α-突触核蛋白质控品。
优选地，前述荧光材料为荧光素类发光材料、罗丹明类发光材料、聚集诱导发光材料、或量子点类发光材料，所述载体为二氧化硅、聚丙烯酰胺或聚苯乙烯。。
本申请的另一个技术方案如下。
用于检测α-突触核蛋白的单分子检测系统，其包括上述的试剂盒、和光学成像设备，
前述光学成像设备包括光源和光学信号采集单元，并且前述检测系统不包括全内反射显微镜、近场显微镜和艾里斑聚焦检测设备，也不包括体积为纳升级别、皮升级别或飞升级别的微反应腔。
本发明的效果
本发明的检测α-突触核蛋白的试剂盒能够在快速检测的同时实现高的灵敏度，且稳定性好。本申请的发明人发现，在用于α-突触核蛋白(α-突触核蛋白)的检测时，一些实施方式中，针对α-突触核蛋白的灵敏度可达到50pg/mL(优于本领域中检测α-突触核蛋白的最佳灵敏度)，在一些实施方式中，针对α-突触核蛋白的灵敏度可达到30pg/mL，在一些实施方式中，针对α-突触核蛋白的灵敏度可达到20pg/mL。并且，本申请能够在保证较高灵敏度的基础上以较短的时间实现对α-突触核蛋白的检测，具体而言，能够使孵育时间压缩至5分钟左右(从进样到结果输出大约5分40秒)，从而极大地缩短临床上的检测时间。另外，试剂盒具有高度稳定性，在一年时间内检测结果的相对误差(Relative Error；RE)和变异系数(Coefficient of variation；CV)均低于10％。此外，本发明能够以全血样品、血清样品或血浆样品等作为样本进行α-突触核蛋白的检测，而无需使用取自脑脊液的样本，对患者的损伤小，大幅降低检测费用。
与现有的基于酶联免疫吸附测定法、化学发光法等试剂盒(如专利文献1～4)相比，本发明的基于特定体系的以单分子计数为特征的α-突触核蛋白检测试剂盒能够在显著缩短检测时间的同时使灵敏度得到提高，而且，稳定性也大致相当，另外动态范围宽。由于使用本发明的检测试剂盒时能够较宽地获得结果，因此，能够控制测定产生的信号量，从而减少信号的过饱和现象，hook效应更低。基于上述理由，本发明的试剂盒具有广泛的商业应用前景。
附图说明
图1为实施例1中得到的标准曲线，其中，纵坐标为单分子信号数，横坐标为浓度(单位pg/mL)。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制。本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。除非另有说明，本文使用的所有技术术语的含义与本领域技术人员通常理解的含义相同。如有冲突，以本说明书为准。说明书中数值范围的叙述明确包括范围内具有相同精度的每个中间数。例如，对于范围0.5～2.0g，除了0.5和2.0之外，同样包括0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8和1.9，对于范围0.02～0.08mL，明确包括数值0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08。
一、<试剂盒>
本申请的第一实施方式涉及基于单分子计数的检测α-突触核蛋白的试剂盒，其特征在于，包含经捕获抗体包被的磁珠、标记有荧光染料的检测抗体、用于前述经捕获抗体包被的磁珠的缓冲体系，
其中，前述捕获抗体和检测抗体分别能够与α-突触核蛋白的不同位点结合，
前述荧光染料含有荧光材料和载体，且粒径为180～450nm，每100mL前述缓冲体系包含0.5～2.0g的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、0.5～2.0g的表面活性剂、0.5～2.0g的鱼皮明胶、2.5～4.0g的无机金属盐、0.02～0.08mL的防腐剂、和0.3mL～1.0mL的阻断剂。
本说明书中使用的单分子计数，是指针对经荧光染料标记的α-突触核蛋白，通过对单个分子进行计数的方式而非测定溶液整体的荧光强度的方式来测定α-突触核蛋白的浓度。
α-突触核蛋白是一种大小为14kDa的可溶性蛋白质，主要在大脑的突触前末梢表达，具有调节神经元膜的稳定性、影响突触前信号传导和膜运输等作用。
试剂盒是指用于盛放检测化学成分、药物残留、病毒种类等化学试剂的盒子，在本说明书中特指用于检测样品中α-突触核蛋白浓度的包含多种试剂的盒子。另外，试剂盒还包含配套的说明书、反应杯、废杯等，在此省略详细说明。
本说明书中使用的“抗体”，是指单克隆抗体、单特异性抗体(例如，既可以为单克隆抗体，也可以是普通生殖细胞产生抗体之外的其他方法所产生的抗体)、多特异性抗体、人源抗体、人源化抗体(完全或部分人源化的抗体)、动物抗体(例如但不限于：鸟类(例如鸭或鹅)、鲨鱼、鲸鱼和哺乳动物，包括非灵长类(例如牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔子、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠、小鼠等)、或者非人灵长类(例如，猴子、黑猩猩等)、重组抗体、嵌合抗体、单链Fv(“scFv”)、单链抗体、单域抗体、Fab片段、F(ab’)片段、F(ab’)2片段等，优选单/多克隆的鼠/兔抗。另外，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即含有分析物结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、任何类别(例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或任何亚类的蛋白分子，优选IgG。为了简便起见，本说明书中对抗α-突触核蛋白的抗体通常称为α-突触核蛋白抗体。
本发明也是基于双抗夹心法的试剂盒，在双抗夹心法中，捕获抗体和检测抗体与抗原(α-突触核蛋白)的不同表位相结合。理想情况下，捕获抗体与α-突触核蛋白表位的结合不会干扰检测抗体与α-突触核蛋白表位的结合。单克隆或多克隆抗体均可用作夹心免疫测定中的捕获抗体和检测抗体。捕获抗体按照抗体特异性特性分类，可以为多克隆抗体和单克隆抗体中的一种或两种，按照来源分类，可以为鼠源抗体、兔源抗体、羊源抗体以及羊驼源抗体中的一种或多种。检测抗体按照抗体特异性特性分类，可以为多克隆抗体和单克隆抗体中的一种或两种，按照来源分类，可以为鼠源抗体、兔源抗体、羊源抗体以及羊驼源抗体中的一种或多种。
磁珠可以是铁磁性的、亚铁磁性的、顺磁性的、超顺磁性的或铁磁流体的。典型的铁磁性材料包括Fe、Co、Ni、Gd、Dy、CrO2、MnAs、MnBi、EuO和NiO/Fe。亚铁磁材料的实例包括NiFe2O4、CoFe2O4、Fe3O4(FeO·Fe2O3)。磁珠可以是由一个或多个非磁性层包围的磁性固体核心。磁性部分也可以是围绕非磁核心的一层。磁珠的表面修饰有能够与抗体进行共价偶联的活性官能团，例如羟基、羧基、氨基、琥珀酰亚胺酯基、磺酰基(如甲苯磺酰基)及它们的衍生基团中的一种或多种。
所谓“经捕获抗体包被的磁珠”，是指捕获抗体与表面修饰有能够与捕获抗体进行共价偶联的活性官能团的磁珠结合而得的复合物，其制备过程可包括磁珠清洗、活化处理、磁珠与捕获抗体的偶联、偶联后清洗及封闭处理等步骤。关于活化处理中的活化剂，例如，磁珠表面的修饰基团为羧基时，活化剂可以为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、SulfoNHS、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)等中的一种或多种，修饰基团为氨基时，活化剂可以为琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐(SMCC)、Sulfo-SMCC等。
上述“经捕获抗体包被的磁珠”的制备过程可包括下述步骤：磁珠清洗、磁珠活化、磁珠抗体偶联、偶联后清洗、磁珠封闭和保存磁珠工作液，其中，在磁珠封闭之后进行的磁珠工作液的保存中加入了上述“用于经捕获抗体包被的磁珠的缓冲体系”，故其又可以称为磁珠保存液。本领域中，通常认为磁珠保存液对检测效果影响不大，不会造成灵敏度的较大波动，然而，本申请人意外地发现，在本发明这样的基于特定粒径的单分子检测体系中，在检测α-突触核蛋白这一特定蛋白时，磁珠保存液的组成和浓度对其灵敏度造成了较大影响。本申请的发明人着眼于以往未加以关注的磁珠保存液，经过反复试验，发现了一种能够良好地与单分子检测体系配合使用从而显著提高α-突触核蛋白的检测灵敏度的缓冲体系，具体而言，每100mL前述缓冲体系包含0.5～2.0g的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、0.5～2.0g的表面活性剂、0.5～2.0g的鱼皮明胶、2.5～4.0g的无机金属盐、0.02～0.08mL的防腐剂、和0.3mL～1.0mL的阻断剂。其中，作为蛋白质，使用了特定的鱼皮明胶，较之其他蛋白，显著适合于α-突触核蛋白的检测。此外，缓冲体系中使用了高浓度的无机金属盐，这样的高浓度是以往体系未曾使用过的。
所谓“标记有荧光染料的检测抗体”，是指荧光染料直接或间接与检测抗体结合而得的复合物，其中，直接与检测抗体结合是指检测抗体通过物理吸附或化学修饰的方法直接吸附或偶联在荧光染料上，间接与检测抗体结合是指通过抗检测抗体(即二抗)或生物素-链霉亲和素体系进行结合，将荧光染料特异性标记在检测抗体上。
本说明书中所用的检测灵敏度又称检测限(LoD)，是指在特定置信水平下可以检测出的被测变量(即，计划测量的数量)的最低浓度。置信水平通常为95％，假阴性测量的可能性为5％。灵敏度是有可能可靠区别于空白限(LoB)并且可进行检测的最低分析物浓度。
本发明的荧光染料是在原位(in-situ)将荧光信号增强至能够被常规光学成像设备检测到的水平的材料，其含有荧光材料和载体这两部分。
所述荧光染料中，载体发挥非常重要的作用，例如，可以结合更多的荧光材料，使得发光信号更强；为官能化修饰提供位点，能够结合大量抗体，提高反应活性；为常规荧光显微镜实现单分子检测提供可能性，如果没有载体则无法实现单分子检测。所述载体按照结构分类，可以为中空结构、核壳结构、多孔结构、合金结构以及水凝胶结构中的一种或多种。其中，从使荧光材料均匀分布、使荧光材料的亮度高的观点考虑，载体优选为二氧化硅、聚丙烯酰胺、和聚苯乙烯。
所述荧光染料中的荧光材料也是实现单分子检测所必须的。所述荧光材料可以为荧光素类发光材料、罗丹明类发光材料、聚集诱导发光材料、或量子点类发光材料。
本申请中，荧光染料优选为二氧化硅包裹荧光染料分子(如荧光素)而成的荧光粒子、聚丙烯酰胺包裹荧光染料分子(如荧光素)而成的荧光粒子、聚苯乙烯包裹量子点而成的荧光粒子、聚苯乙烯包裹罗丹明而成的荧光粒子、聚丙烯酰胺包裹聚集诱导发光材料(如四苯基乙烯衍生物)等。
本发明中，荧光染料的粒径需要控制在180～450nm范围内，例如为190nm、200nm、210nm、220nm、230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、290nm、300nm、310nm、320nm、330nm、340nm、350nm、360nm、370nm、380nm、390nm、400nm、410nm、420nm、430nm、440nm。若荧光染料的粒径小于180nm，例如150nm，则在常规光学成像设备中检测不到任何信号，若粒径大于450nm，例如为460nm，则检测灵敏度较低，难以达到临床所要求的灵敏度。需要说明的是，所述粒径可以是一次粒径，也可以是二次粒径。所述二次粒径是指一级颗粒与二级颗粒团聚后形成的粒径。
另外，试剂盒中，需要但未提供的物品包括反应杯、洗液、废杯盒和流通池护理液等。
本发明的试剂盒可以用于神经退行性疾病(帕金森病、路易小体引起的痴呆、脑血管性痴呆症、亨延顿氏舞蹈病、肌肉萎缩性轴突硬化症等)等疾病的快速诊断。
二、<用于检测α-突触核蛋白的单分子检测系统>
所述检测系统包括上述的试剂盒、和光学成像设备，所述光学成像设备包括光源和光学信号采集单元，并且所述检测系统不包括全内反射显微镜、近场显微镜和艾里斑聚焦检测设备，也不包括体积为纳升级别、皮升级别或飞升级别的微反应腔，也无需如文献CN110249226A中使用的基于纳米孔、纳米井的高昂检测设备。
本发明中，所述光学成像设备主要包括以下部件：激发光源、物镜、滤光片、感光元件、数据采集模块、数据处理模块以及二向色镜(若为正置显微镜，则也可以没有二向色镜)。其中，所述激发光源是用于将反应后的样品激发出光学信号的光学发射装置。所述物镜用于待测样品的信号采集和放大。所述二向色镜用于激发光路的反射和样品光学信号的采集。所述滤光片用于激发光波段的过滤和样品发射光信号的过滤。所述感光元件用于样品光学信号的采集。所述数据采集模块配置为接收感光元件捕获的光学信号，并转换为数字信号。所述数据处理模块配置为数字信号的转换以及光学图像的形成和处理。
在该设备的一些实施方式中，所述激发光源包括气体激光器、固体激光器、半导体激光器、液体激光器以及自由电子激光器中的一种或几种。在该设备的一些实施方式中，所述物镜按照倍率分类，包括1X～5X、1X～10X、1X～20X、1X～40X中的一种或几种；所述物镜按照场曲校正分类，包括平面物镜或曲面物镜。在该设备的一些实施方式中，所述感光元件包括CCD(Charge Coupled Device，电荷耦合装置)或CMOS(Complementary Metal-OxideSemiconductor，互补金属氧化物半导体)中的一种或两种。
本发明的光学成像设备为常规的光学成像设备(即未突破光学衍射极限的光学成像设备)即可，无需全内反射荧光显微镜、落射荧光显微镜、扫描近场光学显微镜、共聚焦荧光显微镜、宽场荧光显微镜等昂贵的、突破了光学衍射极限的成像设备。
实施例
以下，举出实施例和比较例进一步详细地说明本发明，但本发明并不限定于此。关于荧光染料的粒径的测定、单分子成像和标准曲线绘制方法，参见本申请人申请的专利文献5的实施例部分，具体如下。
1、原位信号增强纳米粒子的粒径的测定
以二氧化硅荧光纳米粒子为例，将各实施例和比较例中得到的二氧化硅荧光纳米粒子用水稀释1000倍，然后取100μL滴加在洁净硅片表面，晾干，使用小型溅射仪在其表面溅射沉积5nm的铂，使用SEM(日本日立高新技术公司制SU3900)进行成像分析，求出粒径。
以聚丙烯酰胺荧光纳米粒子为例，用纯水将得到的聚丙烯酰胺荧光纳米粒子稀释1000倍，使用马尔文粒度分析仪(Zetasizer Nano S90)测定粒子的粒径。
2、单分子成像
使用常规荧光显微镜例如尼康Eclipse Ti-U荧光显微镜、Olympus公司的荧光显微镜等进行单分子成像，此外，也可采用尼康Eclipse Ti系列的其他荧光显微镜、莱卡DMi8荧光显微镜等。
3、标准曲线绘制方法
本申请中，单分子计数模式与荧光强度积分模式的联合使用能够显著提高检测标志物标准曲线的动态检测范围。具体实施方法如下：
在待测分子的浓度较低时，磁珠数量多于与磁珠结合的待测分子数量，因此使用单分子计数模式对不同浓度的待测分子样本进行标准曲线绘制；
当待测分子的浓度超过一定阈值时，一个磁珠表面可能结合有1个以上的待测分子，单分子信号容易叠加，导致检测结果出现偏差，因此更适合使用荧光强度积分模式。
具体而言，当一张成像图片中的单分子数量不超过设定的阈值时，使用单分子计数模式进行标准曲线的绘制；当一张成像图片中的单分子数量超过设定的阈值时，使用荧光强度积分模式，并将总荧光强度面积除以每个分子的平均荧光强度面积，换算为“近似单分子数量”，从而进行标准曲线绘制。
最后，将利用单分子计数模式得到的标准曲线与利用荧光强度积分模式得到的标准曲线合并，并利用拟合公式进行曲线拟合，绘制完整的标准曲线。
4、缓冲液1：
准备50mL无菌蒸馏水，加入最终浓度为1.2g的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES，购自赛默飞世尔)、1.0g的表面活性剂S9(购自美国Braveds)、1.0g的鱼皮明胶(购自Sigma-Aldrich)、3.25g的氯化钠(购自北京伊诺凯科技)、0.05mL的PC300(购自Biosharp)、0.25mL的Mak33(购自瑞典Roche)和0.40mL的TRU Block 2(购自Meridian)，最后加入余量无菌蒸馏水混合均匀并定容至100mL。
5、缓冲液2～11
除了变更上述各成分的量以外，与缓冲液1的制备同样地操作，得到缓冲液2～11，将这些缓冲液中的各组分含量示于下述表1中。
表1
HEPES S9 鱼皮明胶 NaCl PC300 阻断剂
缓冲液2 0.5g 1.0g 1.0g 3.25g 0.05mL 0.25mLMak33+0.40mLBlock2
缓冲液3 2.0g 1.0g 1.0g 3.25g 0.05mL 0.25mLMak33+0.40mLBlock2
缓冲液4 1.0g 0.5g 1.0g 3.25g 0.05mL 0.25mLMak33+0.40mLBlock2
缓冲液5 1.0g 2.0g 1.0g 3.25g 0.05mL 0.25mLMak33+0.40mLBlock2
缓冲液6 1.0g 1.0g 0.5g 3.25g 0.05mL 0.25mLMak33+0.40mLBlock2
缓冲液7 1.0g 1.0g 2.0g 3.25g 0.05mL 0.25mLMak33+0.40mLBlock2
缓冲液8 1.0g 1.0g 1.0g 2.5g 0.05mL 0.25mLMak33+0.40mLBlock2
缓冲液9 1.0g 1.0g 1.0g 4.0g 0.05mL 0.25mLMak33+0.40mLBlock2
缓冲液10 1.0g 1.0g 1.0g 3.25g 0.05mL 0.65mLMak33
缓冲液11 1.0g 1.0g 1.0g 3.25g 0.05mL 0.65mLBlock2
6、比较缓冲液1～12
除了变更上述各成分的量或者蛋白、阻断剂的种类以外，与缓冲液1的制备同样地操作，得到比较缓冲液1～12，将这些缓冲液中的各组分含量示于下述表2中。
表2
HEPES S9 鱼皮明胶 NaCl PC300 阻断剂
比较缓冲液1 1.0g 1.0g 无，更换为1.0g的BSA 3.25g 0.05mL 同缓冲液1
比较缓冲液2 1.0g 1.0g 无，更换为1.0g的酪蛋白 3.25g 0.05mL 同上
比较缓冲液3 1.0g 1.0g 1.0g 2.4g 0.05mL 同上
比较缓冲液4 0.48g 1.0g 1.0g 3.25g 0.05mL 同上
比较缓冲液5 2.1g 1.0g 1.0g 3.25g 0.05mL 同上
比较缓冲液6 1.0g 0.48g 1.0g 3.25g 0.05mL 同上
比较缓冲液7 1.0g 2.1g 1.0g 3.25g 0.05mL 同上
比较缓冲液8 1.0g 1.0g 0.49g 3.25g 0.05mL 同上
比较缓冲液9 1.0g 1.0g 2.05g 3.25g 0.05mL 同上
比较缓冲液10 1.0g 1.0g 1.0g 3.25g 0.05mL 0.25mLMak33
比较缓冲液11 1.0g 1.0g 1.0g 3.25g 0.05mL 1.1mLMak33
比较缓冲液12 1.0g 1.0g 1.0g 3.25g 0.05mL 1.1mLBlock2
10、试剂盒的制备例
(1)实验组分
羧基活化磁珠(购自Merck)、α-突触核蛋白捕获抗体(自研)、α-突触核蛋白检测抗体(自研)、硅烷偶联剂(APTES)、包裹有罗丹明的聚苯乙烯微球、待测血清样本、PBS缓冲液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、微球保存液、样品稀释液、PBS洗液、标记封闭液(0.01％NaCl、0.5％BSA溶于10mM PBS，pH＝7.4)、标记分散液(0.01％NaCl、0.1％BSA溶于10mM PBS，pH＝7.4)、标记保存液(0.01％NaCl、0.1％BSA溶于10mM PBS，pH＝7.4)、磁珠清洗液(PBST溶液)、交联剂溶解液(DMSO)、磁珠偶联液(TRIS缓冲液)、磁珠封闭液(0.01％NaCl、0.2％BSA和0.02％PC300溶于10mM PBS，pH＝7.4)和磁珠保存液(上述缓冲液1～11及比较缓冲液1～12)。
(2)包被有α-突触核蛋白捕获抗体的磁珠溶液的制备
a、取50μL的经羧基修饰的磁珠(购自Merck)，使用10mM PBS缓冲液清洗3次，移除缓冲液。
b、取50μg的α-突触核蛋白捕获抗体，加入到(1)的磁珠中，混合均匀，于25℃，在滚轴孵育器上孵育1.5h，转速：60rpm/min。
c、加入磁珠清洗液清洗，混匀后置于磁力架上，进行磁分离。
d、向包被管中加入磁珠封闭液，于滚轴孵育器上孵育30min，转速：60rpm/min，磁分离后去除上清液。
e、取上述缓冲液1～11、及比较缓冲液1～12加入离心管，混匀后得到包被有α-突触核蛋白捕获抗体的磁珠溶液。
(3)、标记有荧光染料的α-突触核蛋白检测抗体溶液的制备
a、制备荧光染料的稀释液
取20μL缓冲液PBS将15μL荧光染料(包裹有罗丹明的聚苯乙烯微球，粒径为250nm)稀释；
b、制备标记孵育液
将0.004g活化剂EDC溶解于20μL的PBS缓冲液中，制成溶解有活化剂的缓冲溶液。将该溶液加入经稀释的荧光染料中，混匀后离心，加入缓冲溶液而制成标记孵育液，备用。
c、制备标记工作液
将20μg的α-突触核蛋白检测抗体原液加入上述标记孵育液中，混匀后孵育1小时。
d、将标记工作液封闭
取20μL标记封闭液加入上述标记工作液中，混匀后孵育1小时。
e、洗涤标记工作液
f、保存标记工作液
取标记分散液加入离心管中并混匀，混匀后加入标记保存液置于冰箱中于2～8℃进行保存。
(4)、将上述步骤中制得的包被有α-突触核蛋白捕获抗体的磁珠溶液、标记有荧光染料的α-突触核蛋白检测抗体溶液和α-突触核蛋白的质控品和校准品配合，构成试剂盒1～11及比较试剂盒1～12。
实施例1：使用试剂盒1基于单分子检测技术对α-突触核蛋白的浓度进行测定
(1)将α-突触核蛋白的浓度分别稀释为0、17.15、51.44、154.32、462.96、1388.89、4166.67、16666.67、33333.33、50000pg/mL。
(2)按AST-Dx90全自动荧光免疫分析仪(苏州宇测生物科技自研设备)的要求将样本、试剂按顺序装载至指定位置，准备就绪后启动测试，设备自动将样本送入上样位置，同时将反应杯载入孵育盘中，取样针从样本管中吸取20μL(1)中得到的各浓度的样品加入反应杯，试剂针从试剂盒1中吸取25μL包被有α-突触核蛋白捕获抗体的磁珠溶液(试剂1)加入反应杯，混匀孵育3min，试剂1中修饰表面特异性抗体的磁珠能够识别捕获样本中含量极低的靶标分子。
(3)试剂针从试剂盒1中吸取15μL标记有荧光染料的α-突触核蛋白检测抗体(试剂2)加入反应杯，混匀孵育2min，试剂2中含有修饰检测抗体的单分子信号标记物，能够将靶标分子转化为单分子信号。
(4)检测针将反应体系转移至流通池中，利用磁分离将磁珠吸引至流通池底部并平铺于检测孔的表面，洗涤去除其他组分，使用普通荧光显微镜(购自Olympus)进行单分子成像，联合使用单分子计数模式和荧光强度积分模式来完成后续单分子计数统计和分析。需要说明，孵育时间为5分钟，从进样至输出结果的时间为5分40秒。
(5)完成一系列浓度检测，每个浓度点重复6次，根据检测结果绘制标准曲线。
检测结果如图1所示，可知该实施例中，α-突触核蛋白的检测范围为20pg/mL～5ng/mL，在该区间内，单分子信号数与样品浓度呈良好的线性关系(R2接近1)，其检测下限可达20pg/mL，且从进样至输出结果的时间只需5分40秒。另外，CV值只要4％，显著低于10％。
另外，根据相隔2个月的6次独立实验的结果显示，本发明的α-突触核蛋白试剂盒具有高度稳定的检测结果，具体而言，根据6次独立实验的结果计算得到的相对误差均低于10％。
实施例2～11、比较例1～12(分别使用上述试剂盒2～11、比较试剂盒1～12)
针对上述试剂盒2～11、比较试剂盒1～12，与实施例1同样地操作(孵育时间均为5分钟，从进样至输出结果的时间均为5分40秒)，得到检测下限和CV值，将检测下限和CV值的结果分别示于表3和表4中。
表3
表4

Claims (8)

1.基于单分子计数的检测α-突触核蛋白的试剂盒，其特征在于，包含经捕获抗体包被的磁珠、标记有荧光染料的检测抗体、用于所述经捕获抗体包被的磁珠的缓冲体系，
其中，所述捕获抗体和检测抗体分别能够与α-突触核蛋白的不同位点结合，
所述荧光染料含有荧光材料和载体，且粒径为180~450nm，
每100mL所述缓冲体系包含0.5~2.0g的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、0.5~2.0g的表面活性剂、0.5~2.0g的鱼皮明胶、2.5~4.0g的无机金属盐、0.02~0.08mL的防腐剂、和0.3mL~1.0mL的阻断剂。
2.如权利要求1所述的检测α-突触核蛋白的试剂盒，其中，所述表面活性剂为表面活性剂S9，且在每100mL所述缓冲液中，其质量为0.8~1.5g。
3.如权利要求1或2所述的检测α-突触核蛋白的试剂盒，其中，所述无机碱金属盐为氯化钠或氯化钾，优选为氯化钠，且在每100mL所述缓冲液中，其质量为3.0~3.5g。
4.如权利要求1~3中任一项所述的检测α-突触核蛋白的试剂盒，其中，所述防腐剂为PC-300，且在每100mL所述缓冲液中，其含量为0.02~0.08mL。
5.如权利要求1~4中任一项所述的检测α-突触核蛋白的试剂盒，其中，所述阻断剂包含0.1~0.4mL的Mak33和0.2~0.6mL的TRU Block 2。
6.如权利要求1~5中任一项所述的检测α-突触核蛋白的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含α-突触核蛋白校准品和α-突触核蛋白质控品。
7.如权利要求1~6中任一项所述的检测α-突触核蛋白的试剂盒，其中，所述荧光材料为荧光素类发光材料、罗丹明类发光材料、聚集诱导发光材料、或量子点类发光材料，所述载体为二氧化硅、聚丙烯酰胺或聚苯乙烯。
8.一种用于检测α-突触核蛋白的单分子检测系统，其包含权利要求1~7中任一项所述的试剂盒、和光学成像设备，
所述光学成像设备包含光源和光学信号采集单元，并且所述检测系统不包括全内反射显微镜、近场显微镜和艾里斑聚焦检测设备，也不包括体积为纳升级别、皮升级别或飞升级别的微反应腔。
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