CN116338209A - 神经丝轻链蛋白检测试剂盒 - Google Patents

神经丝轻链蛋白检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及诊断神经退行性疾病标志物的试剂盒，尤其涉及检测神经丝轻链蛋白(NF‑L)的试剂盒，所述试剂盒基于单分子检测技术来检测NF‑L。另外，还涉及用于检测NF‑L的单分子检测系统。本发明能够在快速检测的同时实现极高的灵敏度，而且试剂盒的稳定性高、体系简单、成本低。

Description

神经丝轻链蛋白检测试剂盒
技术领域
本发明涉及免疫检测领域，尤其是涉及一种基于单分子计数的检测神经丝轻链蛋白(NF-L)的试剂盒、以及用于检测神经丝轻链蛋白的单分子检测系统。
背景技术
神经丝轻链蛋白(NF-L)是神经丝(NFs)的一个组成部分，与神经胶质丝一起，是神经系统中间丝(IFs)的主要类型。其生理功能是通过保持特征细胞形状、轴突和树突之间的细胞内交通调节，以及间接的神经传导速度调节来维持轴突直径，从而赋予机械应力抗性。最近的研究表明，它们对正常的突触功能也很重要。轴突功能障碍和退行性变是神经退行性疾病(NDDs)发病机制中的重要步骤，早在神经细胞死亡之前就已发生，通常在可检测到的错误折叠蛋白质沉积之前。在这些过程中，神经丝轻链蛋白重新释放到细胞外空间，从而进入体液，如脑脊液(CSF)和血液。
神经丝轻链蛋白浓度是轴突变性的重要指标。血清/血浆神经丝轻链蛋白浓度与脑脊液神经丝轻链蛋白密切相关，直接反映中枢神经系统内的神经退行性变。在多方面的场景中，神经丝轻链蛋白是目前最有希望的早期识别一般神经退行性过程的候选生物标记物，能够支持疾病诊断、预后和进展，以及监测最终的疾病改善治疗。因此，研究开发神经丝轻链蛋白诊断试剂盒具有非常重要的临床价值。
目前已知的NF-L检测方法主要有酶联免疫吸附测定法(参见专利文献1)、化学发光法(参见专利文献2～4)、基于化学发光的单分子检测法(参见专利文献5)、免疫层析法(参见专利文献6)、荧光免疫分析法等。
具体而言，专利文献1公开了用于发光酶联免疫吸附(ELISA)的试剂盒及体外检测设备，所述试剂盒包括：体液样品稳定化用水溶液，体液样品中含有神经损伤标志性蛋白成分，在该体液样品稳定化用水溶液中，溶质包括人血清、动物血清白蛋白、无机碱金属盐、Tris碱、蛋白变性剂以及非离子型表面活性剂，该水溶液的pH值为6.7～7.6；以及，任选地包括的抗神经损伤标志性蛋白成分的抗体。其采用发光ELISA法，虽然较之常规的ELISA法获得了更高的灵敏度，但操作步骤仍然繁琐，耗时长(1～2小时，由ELISA方法自身特点决定)，且灵敏度也只有20pg/mL左右。
专利文献2公开了一种测定人体神经丝轻链蛋白含量的磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于：包括：R1试剂、R2试剂、磁分离试剂、校准品液系列和化学发光底物液；其中，R1试剂为异硫氰酸荧光素标记的抗神经丝轻链蛋白单克隆抗体稀释液，R2试剂为碱性磷酸酶标记的抗神经丝轻链蛋白抗体稀释液，磁分离试剂为抗异硫氰酸荧光素单克隆抗体包被的磁微粒稀释剂，校准品液系列为含有不同浓度神经丝轻链蛋白的抗原稀释液，化学发光底物液为碱性磷酸酶催化发光的底物液。其中，用于制备R1试剂的缓冲液pH值为7.2～8.0，缓冲液包括浓度为12.0～12.3g/L的Tris、浓度为1.98～1.99g/L的叠氮钠、浓度为5.7～5.9g/L的氯化钠、摩尔浓度为1M的氯化镁溶液0.8～1.2mL/L、摩尔浓度为0.1M的氯化锌溶液0.8～1.2mL/L、浓度为5-20g/L的鱼皮明胶、浓度为2～5g/L的牛血清白蛋白以及浓度为10～50g/L的新生牛血清，其余为去离子水；用于制备磁分离试剂的缓冲液的pH值为7.5～9.0，缓冲液组分为包括浓度为10.5～11.3g/L的Tris、浓度为1.91～1.95g/L的叠氮钠、浓度为5.5～5.7g/L的氯化钠、摩尔浓度为1M的氯化镁溶液0.8～1.2mL/L、摩尔浓度为0.1M的氯化锌溶液0.8～1.2mL/L、浓度为4.7～4.9g/L的牛血清白蛋白以及浓度为4.8～5.0g/L的特级马血清，其余组分为去离子水。该方法基于传统的化学发光法，体系复杂，步骤繁杂。缓冲液成分也较多，成本高。另外，该方法所达到的灵敏度为0.1pg/mL，虽然较之传统的ELISA试剂盒(0.1ng/mL)有提高，但仍然不够优异，无法满足对极微量NF-L的检测需要。还需说明，虽然其表2记载灵敏度达到0.009pg/mL(与说明书0033段的内容明显矛盾)，但本领域技术人员从其仅给出A、B两点的浓度及标准曲线的制作可确定这属于明显笔误，其不可能达到如此低的检测灵敏度。
专利文献5为基于化学发光的单分子检测法，该方法基于美国Quanterix公司的特殊单分子检测技术，将待测分子分散至体积极小(纳升级别)的腔室中，这使得该类技术操作繁琐，对操作经验的要求高，需要高精密度的液滴生成辅助设备。另外，其公开的试剂盒的成分也较为复杂，缓冲液体系成分多，进一步增加了成本。另外，根据美国Quanterix公司公布的针对NF-L的检测数据，其最佳灵敏度为约0.038pg/mL，这是本领域目前所能达到的最优结果。
专利文献6公开了一种阿尔茨海默病生物标志物的快速检测方法，所述检测方法包括以下步骤：(1)制备用于检测阿尔茨海默病生物标志物的侧向流试纸条；(2)将待检测的样品溶液滴加到试纸条的样品垫上；(3)静置10-30分钟后，用拉曼光谱仪对试纸条上的质控线进行拉曼光谱分析：若所得到的质控线的拉曼光谱中出现所使用的所有拉曼标签的特征峰，则表明试纸条检测结果有效，否则需要更换新的试纸条再次进行检测；若所得到的质控线的拉曼光谱中出现所使用的所有拉曼标签的特征峰，则再用拉曼光谱仪对试纸条上的检测线进行拉曼光谱分析，即可得到相应的阿尔茨海默病生物标志物的浓度。该方法耗时较长(约半小时)，也未公开针对NF-L的具体灵敏度数据，一般认为免疫层析方法作为一种半定量方法难以达到较高的灵敏度。
以计数为特征的单分子检测技术因其原理上的突破，与现有的基于整体光强度的酶联免疫法、化学发光法相比，灵敏度得到大的提升，因而正在研究应用单分子检测技术来定量检测含量较低的生物标志物(如专利文献5)。本申请的发明人提出了一种独特的单分子检测方法(参见专利文献7)，其中，使用了原位信号增强纳米粒子和磁珠，基于双抗夹心法，对cTnI蛋白、IL-6蛋白、DNA等进行了单分子检测，获得了较低的检测下限，但未提及如何检测神经丝轻链蛋白，也未关注缓冲体系等对神经丝轻链蛋白检测的影响。
现有技术文献
专利文献1：CN109696549A；
专利文献2：CN110531085A；
专利文献3：CN115166229A；
专利文献4：CN114184604A；
专利文献5：WO2019199871A1；
专利文献6：CN111781376A；
专利文献7：WO2020156029A1
发明内容
发明所要解决的课题
众所周知，当以较长的检测时间(尤其是孵育时间)进行检测时，能够提高检测灵敏度，缩短检测时间和提高检测灵敏度之间存在一定的trade-off关系，难以同时实现检测时间的缩短和灵敏度的提高。专利文献7未提及如何检测神经丝轻链蛋白，也未关注缓冲体系等对神经丝轻链蛋白检测的影响。本申请的发明人尝试将专利文献7的单分子检测方法用于神经丝轻链蛋白试剂盒的开发，但由于神经丝轻链蛋白与该文献中记载的cTnI抗原、IL-6抗原、DNA等完全不同，在将其实施例中记载的针对cTnI抗原、IL-6抗原、DNA等的检测体系直接应用于神经丝轻链蛋白的检测时，出现灵敏度无法令人满意的状况。
为了解决上述课题，申请人针对捕获抗体的种类、检测抗体的种类、荧光染料的种类、磁珠的基团种类等均反复进行了优化，但灵敏度仍然无法令人满意。关于缓冲体系，本申请的发明人在初始优化过程中尝试使用现有的针对NF-L的试剂盒中的缓冲液，例如专利文献1～5中记载的缓冲液，但发现将这些缓冲液体系直接应用于以计数为特征的单分子检测方法时，即使延长孵育时间，最佳的灵敏度也无法令人满意，无法满足对于极微量NF-L的检测要求，而且这些缓冲体系组分较多，配制成本较高。申请人经过仔细分析后，认为这是由于现有的针对NF-L的试剂盒中的缓冲液均是与各自的方法所配合使用的，在将这些缓冲液体系直接用于以计数为特征的单分子检测方法时可能与方法中的其他组分(例如原位信号增强粒子)存在不利的相互作用。也即，需要寻找一种能够与以计数为特征的单分子检测方法体系中的诸如特定粒径(180～450nm)的荧光染料体系、磁珠等恰当地配合的缓冲液。
本发明是鉴于上述问题而做出的，目的在于提供能够在快速检测的同时实现高的灵敏度且稳定性好的神经丝轻链蛋白试剂盒。
用于解决课题的手段
为了解决上述课题，本申请的发明人反复进行深入研究，结果发现了一种能够在快速检测的同时实现较高的灵敏度且稳定性好的神经丝轻链蛋白试剂盒。
本申请的一个技术方案如下。
基于单分子计数的检测神经丝轻链蛋白的试剂盒，其特征在于，包含经捕获抗体包被的磁珠、标记有荧光染料的检测抗体、用于前述经捕获抗体包被的磁珠的缓冲液1和用于前述标记有荧光染料的检测抗体的缓冲液2，
其中，前述捕获抗体和检测抗体分别能够与神经丝轻链蛋白的不同位点结合，
前述荧光染料含有荧光材料和载体，且粒径为180～450nm，
前述缓冲液1的pH为5.5～6.5，每100mL缓冲液由40mM～60mM的MES(吗啉乙磺酸)、0.8g～1.2g的动物血清白蛋白、0.8mL～1.2mL的非离子表面活性剂、500～700mM的无机碱金属盐、和无菌蒸馏水组成，
前述缓冲液2的pH为7.0～7.6，每100mL缓冲液由20mM～40mM的PBS(又称磷酸盐缓冲液)、0.3g～0.6g的动物血清白蛋白、100～200mM的无机碱金属盐、和无菌蒸馏水组成。需要说明，此处的“无机碱金属盐”不包括PBS中的NaCl、KCl等。
优选地，前述非离子表面活性剂为吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80或它们中的至少两种的混合物，优选为吐温-20，且在每100mL前述缓冲液1中，前述非离子表面活性剂为0.9mL～1.1mL。
优选地，前述无机碱金属盐为氯化钠或氯化钾，优选缓冲液1和2中的无机碱金属盐均为氯化钠，
且在每100mL前述缓冲液1中，无机碱金属盐为550～650mM，
在每100mL前述缓冲液2中，无机碱金属盐为120～180mM。
优选地，前述动物血清白蛋白为牛血清白蛋白(BSA)，且在每100mL所述缓冲液1中，其质量为0.9g～1.1g，在每100mL所述缓冲液2中，其质量为0.4g～0.6g。
优选地，前述荧光材料为聚集诱导发光材料、荧光素类发光材料、罗丹明类发光材料、或量子点类发光材料，前述载体为二氧化硅、聚丙烯酰胺或聚苯乙烯。
本申请的另一个技术方案如下。
用于检测神经丝轻链蛋白的单分子检测系统，其包括上述的试剂盒、和光学成像设备，
前述光学成像设备包括光源和光学信号采集单元，并且前述检测系统不包括全内反射显微镜、近场显微镜和艾里斑聚焦检测设备，也不包括体积为纳升级别、皮升级别或飞升级别的微反应腔。
本发明的效果
本发明的检测神经丝轻链蛋白的试剂盒能够在快速检测的同时实现高的灵敏度，且稳定性好。本申请的发明人发现，在用于神经丝轻链蛋白(NF-L)的检测时，一些实施方式中，针对NF-L的灵敏度可达到0.035pg/mL(优于本领域中检测NF-L的最佳灵敏度)，在一些实施方式中，针对NF-L的灵敏度可达到0.025pg/mL。并且，本申请能够在保证较高灵敏度的基础上以较短的时间实现对NF-L的检测，具体而言，能够使孵育时间压缩至5分钟左右(从进样到结果输出大约5分40秒)，从而极大地缩短临床上的检测时间。另外，试剂盒具有高度稳定性，在一年时间内检测结果的相对误差(Relative Error；RE)和变异系数(Coefficient ofvariation；CV)均低于10％。此外，本发明能够以全血样品、血清样品或血浆样品等作为样本进行神经丝轻链蛋白的检测，而无需使用取自脑脊液的样本，对患者的损伤小，大幅降低检测费用。
与现有的基于酶联免疫吸附测定法、化学发光法、基于化学发光的单分子检测法、免疫层析法等的试剂盒(如专利文献1～6)相比，本发明的基于特定体系的以单分子计数为特征的NF-L检测试剂盒能够在显著缩短检测时间的同时使灵敏度得到提高，而且，稳定性也大致相当，另外动态范围宽。由于使用本发明的检测试剂盒时能够较宽地获得结果，因此，能够控制测定产生的信号量，从而减少信号的过饱和现象，hook效应更低。此外，本申请中，针对标记有荧光染料的检测抗体和经捕获抗体包被的磁珠的缓冲体系简单，成分较少，而且使用的成分价格低廉、容易获得，因此成本也较低。基于上述理由，本发明的试剂盒具有广泛的商业应用前景。
附图说明
图1为实施例1中得到的标准曲线，其中，纵坐标为单分子信号数。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制。本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。除非另有说明，本文使用的所有技术术语的含义与本领域技术人员通常理解的含义相同。如有冲突，以本说明书为准。说明书中数值范围的叙述明确包括范围内具有相同精度的每个中间数。例如，对于范围40mM～60mM，除了40mM和60mM之外，同样包括41mM、42mM、43mM、44mM、45mM、46mM、47mM、48mM、49mM、50mM、51mM、52mM、53mM、54mM、55mM、56mM、57mM、58mM、59mM和60mM，对于范围5.5～6.5，明确包括数值5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5。
一、<试剂盒>
本申请的第一实施方式涉及基于单分子计数的检测神经丝轻链蛋白的试剂盒，其特征在于，包含经捕获抗体包被的磁珠、标记有荧光染料的检测抗体、用于前述经捕获抗体包被的磁珠的缓冲液1和用于前述标记有荧光染料的检测抗体的缓冲液2，
其中，前述捕获抗体和检测抗体分别能够与神经丝轻链蛋白的不同位点结合，
前述荧光染料含有荧光材料和载体，且粒径为180～450nm，
前述缓冲液1的pH为5.5～6.5，每100mL缓冲液由40mM～60mM的MES、0.8g～1.2g的动物血清白蛋白、0.8mL～1.2mL的非离子表面活性剂、500～700mM的无机碱金属盐、和无菌蒸馏水组成，
前述缓冲液2的pH为7.0～7.6，每100mL缓冲液由20mM～40mM的PBS、0.3g～0.6g的动物血清白蛋白、100～200mM的无机碱金属盐、和无菌蒸馏水组成。
本说明书中使用的单分子计数，是指针对经荧光染料标记的NF-L，通过对单个分子进行计数的方式而非测定溶液整体的荧光强度的方式来测定NF-L的浓度。
神经丝轻链蛋白(NF-L)是一种神经元特异性的细胞骨架蛋白，分子量为68kDa，是神经丝蛋白中最先被表达的亚结构，特别是在大口径的有髓轴突中表达。它可以主动(例如，通过外泌体)或被动地从神经元中释放出来，继发于轴突损伤和神经元膜完整性丧失，进入脑间质，与脑脊液(CSF)自由交换。
试剂盒是指用于盛放检测化学成分、药物残留、病毒种类等化学试剂的盒子，在本说明书中特指用于检测样品中NF-L浓度的包含多种试剂的盒子。另外，试剂盒还包含配套的说明书、反应杯、废杯等，在此省略详细说明。
本说明书中使用的“抗体”，是指单克隆抗体、单特异性抗体(例如，既可以为单克隆抗体，也可以是普通生殖细胞产生抗体之外的其他方法所产生的抗体)、多特异性抗体、人源抗体、人源化抗体(完全或部分人源化的抗体)、动物抗体(例如但不限于：鸟类(例如鸭或鹅)、鲨鱼、鲸鱼和哺乳动物，包括非灵长类(例如牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔子、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠、小鼠等)、或者非人灵长类(例如，猴子、黑猩猩等)、重组抗体、嵌合抗体、单链Fv(“scFv”)、单链抗体、单域抗体、Fab片段、F(ab’)片段、F(ab’)2片段等，优选单/多克隆的鼠/兔抗。另外，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即含有分析物结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、任何类别(例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或任何亚类的蛋白分子，优选IgG。为了简便起见，本说明书中对抗NF-L的抗体通常称为NF-L抗体。
本发明也是基于双抗夹心法的试剂盒，在双抗夹心法中，捕获抗体和检测抗体与抗原(NF-L)的不同表位相结合。理想情况下，捕获抗体与NF-L表位的结合不会干扰检测抗体与NF-L表位的结合。单克隆或多克隆抗体均可用作夹心免疫测定中的捕获抗体和检测抗体。捕获抗体按照抗体特异性特性分类，可以为多克隆抗体和单克隆抗体中的一种或两种，按照来源分类，可以为鼠源抗体、兔源抗体、羊源抗体以及羊驼源抗体中的一种或多种。检测抗体按照抗体特异性特性分类，可以为多克隆抗体和单克隆抗体中的一种或两种，按照来源分类，可以为鼠源抗体、兔源抗体、羊源抗体以及羊驼源抗体中的一种或多种。
磁珠可以是铁磁性的、亚铁磁性的、顺磁性的、超顺磁性的或铁磁流体的。典型的铁磁性材料包括Fe、Co、Ni、Gd、Dy、CrO2、MnAs、MnBi、EuO和NiO/Fe。亚铁磁材料的实例包括NiFe2O4、CoFe2O4、Fe3O4(FeO·Fe2O3)。磁珠可以是由一个或多个非磁性层包围的磁性固体核心。磁性部分也可以是围绕非磁核心的一层。磁珠的表面修饰有能够与抗体进行共价偶联的活性官能团，例如羟基、羧基、氨基、琥珀酰亚胺酯基、磺酰基(如甲苯磺酰基)及它们的衍生基团中的一种或多种。
所谓“经捕获抗体包被的磁珠”，是指捕获抗体与表面修饰有能够与捕获抗体进行共价偶联的活性官能团的磁珠结合而得的复合物，其制备过程可包括磁珠清洗、活化处理、磁珠与捕获抗体的偶联、偶联后清洗及封闭处理等步骤。关于活化处理中的活化剂，例如，磁珠表面的修饰基团为羧基时，活化剂可以为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、SulfoNHS、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)等中的一种或多种，修饰基团为氨基时，活化剂可以为琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐(SMCC)、Sulfo-SMCC等。
上述“经捕获抗体包被的磁珠”的制备过程可包括下述步骤：磁珠清洗、磁珠活化、磁珠抗体偶联、偶联后清洗、磁珠封闭和保存磁珠工作液，其中，在磁珠封闭之后进行的磁珠工作液的保存中加入了上述“用于经捕获抗体包被的磁珠的缓冲液1”，故其又可以称为磁珠保存液。本领域中，通常认为磁珠保存液对检测体系影响不大，不会造成灵敏度的较大波动，然而，本申请人意外地发现，在本发明这样的基于特定粒径的单分子检测体系中，在检测NF-L这一特定蛋白时，磁珠保存液的组成和浓度对其灵敏度造成了较大影响。本申请的发明人着眼于以往未加以关注的磁珠保存液，经过反复试验，发现了一种能够良好地与下述“用于标记有荧光染料的检测抗体的缓冲液2”配合使用从而显著提高NF-L的检测灵敏度的缓冲体系，具体而言，其pH为5.5～6.5，每100mL缓冲液由40mM～60mM的MES、0.8g～1.2g的动物血清白蛋白(优选为BSA)、0.8mL～1.2mL的非离子表面活性剂(优选为吐温-20)、500～700mM的无机碱金属盐(优选为NaCl)、和无菌蒸馏水组成。
所谓“标记有荧光染料的检测抗体”，是指荧光染料直接或间接与检测抗体结合而得的复合物，其中，直接与检测抗体结合是指检测抗体通过物理吸附或化学修饰的方法直接吸附或偶联在荧光染料上，间接与检测抗体结合是指通过抗检测抗体(即二抗)或生物素-链霉亲和素体系进行结合，将荧光染料特异性标记在检测抗体上。该标记有荧光染料的检测抗体的制备过程可包括下述步骤：
(1)制备荧光染料的稀释液
取缓冲液a(如碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液PBS或硼酸盐缓冲液)将荧光染料稀释成规定浓度；
(2)制备标记孵育液
将活化剂溶解于PBS缓冲液中，制成溶解有活化剂的缓冲溶液。将该溶液加入经稀释的荧光染料中，混匀后离心，加入缓冲溶液而制成标记孵育液，备用。
(3)制备标记工作液
将检测抗体原液加入上述标记孵育液中，混匀后孵育1小时。
(4)将标记工作液封闭
取封闭液加入上述标记工作液中，混匀后孵育1小时。
(5)洗涤标记工作液
(6)保存标记工作液
其中，在步骤(6)中，使用了上述“用于标记有荧光染料的检测抗体的缓冲液2”，具体而言，吸取该缓冲液加入至装有经洗涤的标记工作液的离心管中，将标记工作液保存待用。故该缓冲液又可以称为标记保存液。申请人分析，通过采用本发明的特定组成和浓度的缓冲液将特定的标记工作液(也即，包含标记有特定荧光染料的检测抗体的液体)加以保存，能够使得本发明中使用的特定粒径的荧光染料能够稳定地存在而不至于过度聚集，避免荧光淬灭的产生，从而能够实现较高的灵敏度。另外，还推测本发明的特定组成和浓度的缓冲液与针对NF-L的检测抗体的相容性较好，保证了体系的稳定性，进而也有助于检测灵敏度和保存稳定性的提高。该用于标记有荧光染料的检测抗体的缓冲液2的pH为7.0～7.6，每100mL缓冲液由20mM～40mM的PBS、0.3g～0.6g的动物血清白蛋白、100～200mM的无机碱金属盐、和无菌蒸馏水组成。
本说明书中所用的检测灵敏度又称检测限(LoD)，是指在特定置信水平下可以检测出的被测变量(即，计划测量的数量)的最低浓度。置信水平通常为95％，假阴性测量的可能性为5％。灵敏度是有可能可靠区别于空白限(LoB)并且可进行检测的最低分析物浓度。
本发明的荧光染料是在原位(in-situ)将荧光信号增强至能够被常规光学成像设备检测到的水平的材料，其含有荧光材料和载体这两部分。
所述荧光染料中，载体发挥非常重要的作用，例如，可以结合更多的荧光材料，使得发光信号更强；为官能化修饰提供位点，能够结合大量抗体，提高反应活性；为常规荧光显微镜实现单分子检测提供可能性，如果没有载体则无法实现单分子检测。所述载体按照材料分类，可以为二氧化硅、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚(甲基)丙烯酸甲酯、葡聚糖、琼脂糖以及无机金属化合物中的一种或多种。所述载体按照结构分类，可以为中空结构、核壳结构、多孔结构、合金结构以及水凝胶结构中的一种或多种。其中，从使荧光材料均匀分布、使荧光材料的亮度高的观点考虑，载体优选为二氧化硅、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯和葡聚糖。
所述荧光染料中的荧光材料也是实现单分子检测所必须的。所述荧光材料可以为荧光染料分子、稀土元素、稀土螯合物、荧光蛋白、量子点、聚集诱导发光材料以及上转换纳米粒子中的一种或多种。荧光材料优选为荧光素类(如异硫氰酸荧光素)、罗丹明类(如罗丹明绿、罗丹明B等)、香豆素类、量子点类(如CdS、CdSe、CdTe、ZnSe)、稀土元素(如Eu、Ce)及其配合物等。所述荧光材料通过共价修饰、螯合作用、空间包裹、疏水作用以及静电吸附作用中的一种或多种而吸附或包裹于载体表面或内部。需要说明，从有利于光学成像识别和提高灵敏度的观点考虑，优选的是，荧光材料被均匀地包裹于载体的内部。
本申请中，荧光染料优选为二氧化硅包裹荧光染料分子(如荧光素)而成的荧光粒子、聚丙烯酰胺包裹荧光染料分子(如荧光素)而成的荧光粒子、聚苯乙烯包裹量子点而成的荧光粒子、聚苯乙烯包裹稀土元素或稀土鳌合物而成的荧光粒子、葡聚糖包裹荧光蛋白而成的荧光粒子以及交联琼脂糖包裹量子点而成的荧光粒子等。
本发明中，荧光染料的粒径需要控制在180～450nm范围内，例如为190nm、200nm、210nm、220nm、230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、290nm、300nm、310nm、320nm、330nm、340nm、350nm、360nm、370nm、380nm、390nm、400nm、410nm、420nm、430nm、440nm。若荧光染料的粒径小于180nm，例如150nm，则在常规光学成像设备中检测不到任何信号，若粒径大于450nm，例如为460nm，则检测灵敏度较低，难以达到临床所要求的灵敏度。需要说明的是，所述粒径可以是一次粒径，也可以是二次粒径。所述二次粒径是指一级颗粒与二级颗粒团聚后形成的粒径。
另外，试剂盒中，需要但未提供的物品包括反应杯、洗液、废杯盒和流通池护理液等。
本发明的试剂盒可以用于创伤性脑损伤或者原发性脑损伤的快速诊断，尤其适合用于神经退行性疾病(阿尔茨海默病、脑血管性痴呆症、帕金森病、亨延顿氏舞蹈病、肌肉萎缩性轴突硬化症等)等疾病的快速诊断。
二、<用于检测神经丝轻链蛋白的单分子检测系统>
所述检测系统包括上述的试剂盒、和光学成像设备，所述光学成像设备包括光源和光学信号采集单元，并且所述检测系统不包括全内反射显微镜、近场显微镜和艾里斑聚焦检测设备，也不包括体积为纳升级别、皮升级别或飞升级别的微反应腔，也无需如文献CN110249226A中使用的基于纳米孔、纳米井的高昂检测设备。
本发明中，所述光学成像设备主要包括以下部件：激发光源、物镜、滤光片、感光元件、数据采集模块、数据处理模块以及二向色镜(若为正置显微镜，则也可以没有二向色镜)。其中，所述激发光源是用于将反应后的样品激发出光学信号的光学发射装置。所述物镜用于待测样品的信号采集和放大。所述二向色镜用于激发光路的反射和样品光学信号的采集。所述滤光片用于激发光波段的过滤和样品发射光信号的过滤。所述感光元件用于样品光学信号的采集。所述数据采集模块配置为接收感光元件捕获的光学信号，并转换为数字信号。所述数据处理模块配置为数字信号的转换以及光学图像的形成和处理。
在该设备的一些实施方式中，所述激发光源包括气体激光器、固体激光器、半导体激光器、液体激光器以及自由电子激光器中的一种或几种。在该设备的一些实施方式中，所述物镜按照倍率分类，包括1X、2X、4X、5X、10X、20X、40X、50X以及100X中的一种或几种；所述物镜按照场曲校正分类，包括平面物镜或曲面物镜。在该设备的一些实施方式中，所述感光元件包括CCD(Charge Coupled Device，电荷耦合装置)或CMOS(Complementary Metal-Oxide Semiconductor，互补金属氧化物半导体)中的一种或两种。
本发明的光学成像设备为常规的光学成像设备(即未突破光学衍射极限的光学成像设备)即可，无需全内反射荧光显微镜、落射荧光显微镜、扫描近场光学显微镜、共聚焦荧光显微镜、宽场荧光显微镜等昂贵的、突破了光学衍射极限的成像设备。
实施例
以下，举出实施例和比较例进一步详细地说明本发明，但本发明并不限定于此。关于荧光染料的粒径的测定、单分子成像和标准曲线绘制方法，参见本申请人申请的专利文献7的实施例部分，具体如下。
1、原位信号增强纳米粒子的粒径的测定
以二氧化硅荧光纳米粒子为例，将各实施例和比较例中得到的二氧化硅荧光纳米粒子用水稀释1000倍，然后取100μL滴加在洁净硅片表面，晾干，使用小型溅射仪在其表面溅射沉积5nm的铂，使用SEM(日本日立高新技术公司制SU3900)进行成像分析，求出粒径。
以聚丙烯酰胺荧光纳米粒子为例，用纯水将得到的聚丙烯酰胺荧光纳米粒子稀释1000倍，使用马尔文粒度分析仪(Zetasizer Nano S90)测定粒子的粒径。
2、单分子成像
使用常规荧光显微镜例如尼康Eclipse Ti-U荧光显微镜、Olympus公司的荧光显微镜等进行单分子成像，此外，也可采用尼康Eclipse Ti系列的其他荧光显微镜、莱卡DMi8荧光显微镜等。
3、标准曲线绘制方法
本申请中，单分子计数模式与荧光强度积分模式的联合使用能够显著提高检测标志物标准曲线的动态检测范围。具体实施方法如下：
在待测分子的浓度较低时，磁珠数量多于与磁珠结合的待测分子数量，因此使用单分子计数模式对不同浓度的待测分子样本进行标准曲线绘制；
当待测分子的浓度超过一定阈值时，一个磁珠表面可能结合有1个以上的待测分子，单分子信号容易叠加，导致检测结果出现偏差，因此更适合使用荧光强度积分模式。
具体而言，当一张成像图片中的单分子数量不超过设定的阈值时，使用单分子计数模式进行标准曲线的绘制；当一张成像图片中的单分子数量超过设定的阈值时，使用荧光强度积分模式，并将总荧光强度面积除以每个分子的平均荧光强度面积，换算为“近似单分子数量”，从而进行标准曲线绘制。
最后，将利用单分子计数模式得到的标准曲线与利用荧光强度积分模式得到的标准曲线合并，并利用拟合公式进行曲线拟合，绘制完整的标准曲线。
4、缓冲液1的制备例1：(缓冲液1的制备)
准备50mL无菌蒸馏水，加入最终浓度为40mM的MES(购自Sigma-Aldrich)、0.8g牛血清白蛋白(购自Sigma-Aldrich)、500mM氯化钠(购自北京伊诺凯科技)和0.8mL的吐温-20(购自Sigma-Aldrich)，最后加入余量无菌蒸馏水混合均匀并定容至100mL，pH为6左右。
5、缓冲液1的制备例2～8(缓冲液2～8的制备)
除了变更上述各成分的量以外，与制备例1同样地操作，得到缓冲液2～8，将这些缓冲液中的各组分含量示于下述表1中。
表1
MES BSA NaCl Tween-20
缓冲液2 50mM 1g 600mM 1mL
缓冲液3 50mM 1g 600mM 1.2mL
缓冲液4 60mM 0.8g 600mM 1mL
缓冲液5 60mM 1.2g 600mM 1mL
缓冲液6 40mM 0.8g 700mM 0.8mL
缓冲液7 40mM 1g 700mM 0.8mL
缓冲液8 40mM 1g 500mM 0.8mL
6、缓冲液1的比较制备例1～8(比较缓冲液1～8的制备)
除了变更上述各成分的量以外，与制备例1同样地操作，得到比较缓冲液1～8，将这些缓冲液中的各组分含量示于下述表2中。
表2
MES BSA NaCl Tween-20
比较缓冲液1 35mM 1g 600mM 1mL
比较缓冲液2 65mM 1g 600mM 1mL
比较缓冲液3 50mM 0.7g 600mM 1mL
比较缓冲液4 50mM 1.3g 600mM 1mL
比较缓冲液5 50mM 1g 450mM 1mL
比较缓冲液6 50mM 1g 750mM 1mL
比较缓冲液7 50mM 1g 600mM 0.7mL
比较缓冲液8 50mM 1g 600mM 1.3mL
7、缓冲液2的制备例1’：(缓冲液1’的制备)
准备50mL无菌蒸馏水，加入最终浓度为30mM的PBS(购自赛默飞)、0.5g牛血清白蛋白(购自Sigma-Aldrich)、150mM氯化钠(购自北京伊诺凯科技)，最后加入余量无菌蒸馏水混合均匀并定容至100mL，pH为7.4左右。
8、缓冲液2的制备例2’～7’(缓冲液2’～7’的制备)
除了变更上述各成分的量以外，与制备例1同样地操作，得到缓冲液2’～7’，将这些缓冲液中的各组分含量示于下述表3中。
表3
PBS BSA NaCl
缓冲液2’ 20mM 0.5g 150mM
缓冲液3’ 60mM 0.5g 150mM
缓冲液4’ 30mM 0.3g 150mM
缓冲液5’ 30mM 0.6g 150mM
缓冲液6’ 30mM 0.5g 100mM
缓冲液7’ 30mM 0.5g 200mM
9、缓冲液2的比较制备例1’～6’(比较缓冲液1’～6’的制备)
除了变更上述各成分的量以外，与制备例1’同样地操作，得到比较缓冲液1’～6’，将这些缓冲液中的各组分含量示于下述表4中。
表4
PBS BSA NaCl
比较缓冲液1’ 18mM 0.5g 150mM
比较缓冲液2’ 64mM 0.5g 150mM
比较缓冲液3’ 30mM 0.2g 150mM
比较缓冲液4’ 30mM 0.7g 150mM
比较缓冲液5’ 30mM 0.5g 96mM
比较缓冲液6’ 30mM 0.5g 210mM
10、试剂盒的制备例
(1)实验组分
羧基活化磁珠(购自Merck)、NF-L捕获抗体(自研)、NF-L检测抗体(自研)、硅烷偶联剂(APTES)、包裹有异硫氰酸荧光素(FITC)的二氧化硅微球、包裹有荧光染料的聚丙烯酰胺、待测血清样本、PBS缓冲液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、微球保存液、样品稀释液、PBS洗液、标记封闭液(0.01％NaCl、0.5％BSA溶于10mM PBS，pH＝7.4)、标记分散液(0.01％NaCl、0.1％BSA溶于10mM PBS，pH＝7.4)、标记保存液(上述制备例1’～7’中得到的缓冲液1’～7’，pH为7.4左右；及比较制备例1’～6’中得到的比较缓冲液1’～6’)、磁珠清洗液(PBST溶液)、交联剂溶解液(DMSO)、磁珠偶联液(TRIS缓冲液)、磁珠封闭液(0.01％NaCl、0.2％BSA和0.02％PC300溶于10mM PBS，pH＝7.4)和磁珠保存液(上述制备例1～8中得到的缓冲液1～8，pH为6.0左右；及比较制备例1～8中得到的比较缓冲液1～8)。
(2)包被有NF-L捕获抗体的磁珠溶液的制备
a、取100μL的经羧基修饰的磁珠(购自Merck)，使用15mM PBS缓冲液清洗5次，移除缓冲液。
b、取70μg的NF-L捕获抗体，加入到(1)的磁珠中，混合均匀，于20℃，在滚轴孵育器上孵育1.5h，转速：80rpm/min。
c、加入磁珠清洗液清洗，混匀后置于磁力架上，进行磁分离。
d、向包被管中加入磁珠封闭液，于滚轴孵育器上孵育40min，转速：80rpm/min，磁分离后去除上清液。
e、取上述制备例1～8中得到的缓冲液1～8(pH为6.0左右)、及比较制备例1～8中得到的比较缓冲液1～8加入离心管，混匀后得到包被有NF-L捕获抗体的磁珠溶液。
(3)、标记有荧光染料的NF-L检测抗体溶液的制备
a、制备荧光染料的稀释液
取20μL缓冲液PBS将20μL荧光染料(包裹有FITC的二氧化硅微球，粒径为250nm)稀释；
b、制备标记孵育液
将0.004g活化剂EDC溶解于20μL的PBS缓冲液中，制成溶解有活化剂的缓冲溶液。将该溶液加入经稀释的荧光染料中，混匀后离心，加入缓冲溶液而制成标记孵育液，备用。
c、制备标记工作液
将25μg的NF-L检测抗体原液加入上述标记孵育液中，混匀后孵育1小时。
d、将标记工作液封闭
取25μL标记封闭液加入上述标记工作液中，混匀后孵育1小时。
e、洗涤标记工作液
f、保存标记工作液
取标记分散液加入离心管中并混匀，混匀后加入标记保存液(即上述制备例1’～7’中得到的缓冲液1’～7’；及比较制备例1’～6’中得到的比较缓冲液1’～6’)置于冰箱中于2～8℃进行保存。
(4)、将上述步骤中制得的包被有NF-L捕获抗体的磁珠溶液、标记有荧光染料的NF-L检测抗体溶液和NF-L的质控品和校准品配合，构成试剂盒1～8及比较试剂盒1～10。将各试剂盒中使用的磁珠保存液和标记保存液的组合示于下表5和6。
表5
Figure BDA0004157634900000201
表6
Figure BDA0004157634900000202
实施例1：使用试剂盒1基于单分子检测技术对NF-L的浓度进行测定
(1)将NF-L的浓度分别稀释为0、0.034、0.103、0.31、0.93、2.78、8.33、33.33、66.67以及100pg/mL。
(2)按AST-Dx90全自动荧光免疫分析仪(苏州宇测生物科技自研设备)的要求将样本、试剂按顺序装载至指定位置，准备就绪后启动测试，设备自动将样本送入上样位置，同时将反应杯载入孵育盘中，取样针从样本管中吸取20μL(1)中得到的各浓度的样品加入反应杯，试剂针从试剂盒1中吸取25μL包被有NF-L捕获抗体的磁珠溶液(试剂1)加入反应杯，混匀孵育3min，试剂1中修饰表面特异性抗体的磁珠能够识别捕获样本中含量极低的靶标分子。
(3)试剂针从试剂盒1中吸取15μL标记有荧光染料的NF-L检测抗体(试剂2)加入反应杯，混匀孵育2min，试剂2中含有修饰检测抗体的单分子信号标记物，能够将靶标分子转化为单分子信号。
(4)检测针将反应体系转移至流通池中，利用磁分离将磁珠吸引至流通池底部并平铺于检测孔的表面，洗涤去除其他组分，使用普通荧光显微镜(购自Olympus)进行单分子成像，联合使用单分子计数模式和荧光强度积分模式来完成后续单分子计数统计和分析。需要说明，孵育时间为5分钟，从进样至输出结果的时间为5分40秒。
(5)完成一系列浓度检测，每个浓度点重复6次，根据检测结果绘制标准曲线。
检测结果如图1所示，可知该实施例中，NF-L的检测范围为0.025pg/mL～100pg/mL，在该区间内，单分子信号数与样品浓度呈良好的线性关系(R2接近1)，其检测下限可达0.025pg/mL，且从进样至输出结果的时间只需5分40秒。另外，CV值也低于10％。
另外，根据相隔2个月的6次独立实验的结果显示，本发明的NF-L试剂盒具有高度稳定的检测结果，具体而言，根据6次独立实验的结果计算得到的相对误差均低于10％。
实施例2～12、比较例1～16(分别使用上述试剂盒2～12、比较试剂盒1～16)
针对上述试剂盒2～12、比较试剂盒1～16，与实施例1同样地操作(孵育时间均为5分钟，从进样至输出结果的时间均为5分40秒)，得到检测下限和CV值，将检测下限和CV值的结果分别示于表7和表8中。
表7
Figure BDA0004157634900000221
表8
Figure BDA0004157634900000222

Claims (7)

1.基于单分子计数的检测神经丝轻链蛋白的试剂盒，其特征在于，包含经捕获抗体包被的磁珠、标记有荧光染料的检测抗体、用于所述经捕获抗体包被的磁珠的缓冲液1和用于所述标记有荧光染料的检测抗体的缓冲液2，
其中，所述捕获抗体和检测抗体分别能够与神经丝轻链蛋白的不同位点结合，
所述荧光染料含有荧光材料和载体，且粒径为180～450nm，
所述缓冲液1的pH为5.5～6.5，每100mL缓冲液由40mM～60mM的MES、0.8g～1.2g的动物血清白蛋白、0.8mL～1.2mL的非离子表面活性剂、500～700mM的无机碱金属盐、和无菌蒸馏水组成，
所述缓冲液2的pH为7.0～7.6，每100mL缓冲液由20mM～40mM的PBS、0.3g～0.6g的动物血清白蛋白、100～200mM的无机碱金属盐、和无菌蒸馏水组成。
2.如权利要求1所述的检测神经丝轻链蛋白的试剂盒，其中，所述非离子表面活性剂为吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80或它们中的至少两种的混合物，优选为吐温-20，且在每100mL所述缓冲液1中，所述非离子表面活性剂为0.9mL～1.1mL。
3.如权利要求1或2所述的检测神经丝轻链蛋白的试剂盒，其中，所述无机碱金属盐为氯化钠或氯化钾，优选缓冲液1和2中的无机碱金属盐均为氯化钠，
且在每100mL所述缓冲液1中，无机碱金属盐为550～650mM，
在每100mL所述缓冲液2中，无机碱金属盐为120～180mM。
4.如权利要求1～3中任一项所述的检测神经丝轻链蛋白的试剂盒，其中，所述动物血清白蛋白为牛血清白蛋白，
且在每100mL所述缓冲液1中，其质量为0.9g～1.1g，
在每100mL所述缓冲液2中，其质量为0.4g～0.6g。
5.如权利要求1～4中任一项所述的检测神经丝轻链蛋白的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含神经丝轻链蛋白校准品和神经丝轻链蛋白质控品。
6.如权利要求1～5中任一项所述的检测神经丝轻链蛋白的试剂盒，其中，所述荧光材料为荧光素类发光材料、罗丹明类发光材料、聚集诱导发光材料、或量子点类发光材料，所述载体为二氧化硅、聚丙烯酰胺或聚苯乙烯。
7.一种用于检测神经丝轻链蛋白的单分子检测系统，其包含权利要求1～6中任一项所述的试剂盒、和光学成像设备，
所述光学成像设备包含光源和光学信号采集单元，并且所述检测系统不包括全内反射显微镜、近场显微镜和艾里斑聚焦检测设备，也不包括体积为纳升级别、皮升级别或飞升级别的微反应腔。
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