CN118150842A - 用于检测AβN3pE的单分子检测方法及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及检测AβN3pE浓度的基于计数的单分子检测方法及试剂盒。本发明首次将基于计数的单分子检测方法用于AβN3pE浓度的检测中，本发明的方法通过普通荧光显微镜即可实现，对设备的要求低，并且检测下限低（灵敏度高），检测动态范围宽，且CV值低。

Description

用于检测AβN3pE的单分子检测方法及试剂盒
技术领域
本发明属于单分子检测领域，具体涉及用于检测焦谷氨酸化淀粉样蛋白β肽(以下，简称为AβN3pE)的单分子检测方法、相关试剂盒及单分子检测方法在检测AβN3pE中的应用。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种以记忆损害为主要表现渐进性发展的神经退行性疾病，随着老龄化社会发展发病率呈上升趋势，带来巨大的社会经济负担。最近，越来越多的证据表明N-末端修饰的Aβ肽变体参与阿尔茨海默病，其中，N-末端截短的经焦谷氨酸修饰的Aβ肽(AβN3pE)受到了越来越多的关注，其代表了AD大脑内Aβ的主要成分，与全肽段Aβ相比，AβN3pE较Aβ1-42具有更高的聚集倾向和更好的稳定性，并显示了更强的毒性。针对活组织检查显示Aβ1-40和Aβ1-42不仅存在于阿尔茨海默病患者的大脑中，而且还存在于未患病个体的老年斑中，但是，N-末端截短的经焦谷氨酸修饰的AβN3pE-40/AβN3pE-42几乎仅存在于阿尔茨海默病患者的斑块内，使得这种Aβ变体成为合格的诊断标志物和药物开发的潜在靶标。
对于AβN3pE浓度的检测，现有技术中报道较少，目前主要依靠ELISA法进行检测(参见专利文献1)。市面上也有些针对AβN3pE的ELISA试剂盒销售，其检测下限为μg/ml或ng/ml级别，无法满足要求。
单分子检测(SMD)是以单个分子的分析为基础构建的一种方法，到目前为止，它已经在生命科学的研究中备受关注。近几年来，该方法被应用于细胞成像、蛋白质相互作用的研究以及蛋白质和核酸的定量检测中。在上述提及的应用中，定量检测是以对目标物分子的一个接一个的计数来实现的，这种定量检测手段代表了检测的最终极限。传统的平均测定方法如免疫层析、化学发光、酶联免疫等是以信号强度和目标物浓度之间的关系来定量的。信号强度越高，被测定目标物的浓度越高。与平均测定方法所不同的是，在SMD定量方法中，对可以产生信号的分子进行计数，更具有可视性和数字性，保证了较高的重现性。由于SMD定量检测方法具有平均测定所无法比拟的优点，目前，已经有工作将SMD应用到定量分析之中(参见专利文献2～3)。
具体而言，专利文献2为本申请发明人的在先申请，涉及利用具有特定粒径(180～400nm)的原位信号增强粒子对待测分子进行标记，使得单分子信号能够被光学成像设备捕获和识别，实现待测分子的超高灵敏度定量检测。其中，使用了原位信号增强粒子和磁珠，基于双抗夹心法，对cTnI蛋白、IL-6蛋白、DNA等进行了单分子检测，获得了较低的检测下限，但未提及如何检测AβN3pE。需要说明的是，AβN3pE与cTnI蛋白、IL-6蛋白等的结构和分子量差别较大。
专利文献2为深圳光与生物科技有限公司提出的申请，其涉及一种基于上转换荧光材料的单分子检测方法，具体而言，将被检测样品稀释后滴加到玻璃片或硅片这样的检测基板上，被检测物与生物活性分子B结合，完成后冲洗检测基板，然后滴加已稀释的免疫荧光材料，使生物活性分子A与已经和生物活性分子B结合的被检测物结合，完成后冲洗检测基板；将处理后的检测基板置于荧光显微镜下，对免疫荧光材料数目进行计数。该文献通过用高浓度稀土掺杂在上转换纳米材料颗粒中，使上转换纳米材料颗粒具有较大的反斯托克斯位移，相比传统使用的有机染料而言，激发光源和发射波段无重叠，且可有效抑制自发荧光背景噪声，能够显著提高检测信号的信噪比。其使用玻璃片或硅片作为载体，而且同样不涉及如何检测AβN3pE。
现有技术文献
专利文献1：CN111670196A；
专利文献2：CN111771126A；
专利文献3：CN111735964A。
发明内容
发明所要解决的课题
免疫诊断领域中，常见的方法有胶体金法、酶联免疫法、免疫层析法、荧光免疫分析法、化学发光法等，本领域技术人员面对多种选择。如何从种类繁多的检测方法中选择能够良好地适合于AβN3pE这种特定蛋白质的方法是本发明要解决的问题。
鉴于上述现有技术的状况，本申请的目的在于提供一种以低的成本(不使用微流控芯片，也不使用非常规荧光显微镜)实现优异的检测灵敏度(较低的检测下限)、较宽的检测动态范围和较优异的变异系数的针对AβN3pE的检测方法及相关检测试剂盒。
用于解决课题的手段
申请人对AβN3pE的检测方法进行了深入研究，令人惊讶地发现，以计数为特征的单分子检测方法特别适合于AβN3pE的检测。进一步还发现，通过将本发明人之前开发的以具有特定粒径的原位信号增强粒子和双抗夹心法为特征的单分子检测体系应用于AβN3pE的检测中时，可获得令人满意的检测灵敏度、较宽的动态检测范围和极低的变异系数，能够满足对痕量AβN3pE的检测需求。进一步还发现，检测体系中特定步骤的特定pH可以为检测方法带来更显著优异的灵敏度。还发现，若采用特定磁珠，可进一步提升灵敏度。
本申请的一个技术方案如下。
检测AβN3pE浓度的基于计数的单分子检测方法，其包括以下步骤：
(1)将能够与AβN3pE结合的捕获抗体固定到磁珠上，加入含有AβN3pE的样品，使AβN3pE的第一位点与捕获抗体结合，从而捕获样品中的AβN3pE；
(2)加入能够与AβN3pE的第二位点结合的检测抗体，使检测抗体与AβN3pE的第二位点结合，然后加入能够直接或间接与检测抗体结合的原位信号增强粒子；或者先将检测抗体与原位信号增强粒子结合而形成复合物，再将该复合物加入；所述原位信号增强粒子的粒径为180nm～350nm，且含有荧光材料及载体，
(3)用光学成像设备将所述原位信号增强粒子发出的荧光信号成像；(4)对原位信号增强粒子的个数进行统计，进一步计算得到样品中AβN3pE的浓度，
其中，步骤(1)和(2)可以分别替换为下述的步骤(1’)和(2’)，
(1’)将检测抗体与样品混合，使其与样品中的AβN3pE的第二位点结合，然后加入能够直接或间接与检测抗体结合的原位信号增强粒子；或者先使原位信号增强粒子与检测抗体结合而形成复合材料，再将该复合材料加入样品中，使该复合材料与样品中的AβN3pE的第二位点结合；其中，所述原位信号增强粒子与所述步骤(1)中的原位信号增强粒子相同；
(2’)将能够与AβN3pE结合的捕获抗体固定至磁珠上，然后加入至步骤(1’)的体系中，使所述捕获抗体与所述AβN3pE的第一位点结合，从而将AβN3pE捕获。
优选地，其中，所述原位信号增强粒子的粒径为200～300nm，粒径的变异系数(CV值)为1％～10％。
优选地，其中，所述载体为聚乙二醇、苯乙烯-(甲基)丙烯酸共聚物、二氧化硅、聚苯乙烯、或聚丙烯酰胺，优选为聚乙二醇、聚丙烯酰胺或二氧化硅。
优选地，其中，步骤(2)和步骤(1’)中的AβN3pE的第二位点与检测抗体的结合在pH8～10的范围内进行。
优选地，所述磁珠由磁性羧基取代的聚苯乙烯微球、嘧啶、无水硝酸汞、超支化聚缩水甘油醚组装而成。
本申请还涉及单分子检测方法在检测AβN3pE的浓度中的应用。
本申请还涉及用于检测AβN3pE的基于单分子计数的试剂盒，其包含原位信号增强粒子和磁珠，其特征在于，所述原位信号增强粒子包含荧光材料和载体，且平均粒径为180～350nm，粒径的变异系数(CV值)为1％～10％。
优选地，其还包含分别与AβN3pE的第一位点结合的捕获抗体和与AβN3pE的第二位点结合的检测抗体。
优选地，其还包含缓冲体系，所述缓冲体系的pH为8～10，能够使来自样品的AβN3pE的第二位点与检测抗体的结合在pH8～10的范围内进行。
优选地，所包含的磁珠为由磁性羧基取代的聚苯乙烯微球、嘧啶、无水硝酸汞、超支化聚缩水甘油醚组装而成的磁珠。
所述试剂盒不包含酶、化学发光试剂。
本申请中的粒径使用扫描电子显微镜(SEM)，以在1个视野中可观察到约100个原位信号增强粒子的倍率来观察粒子，用卡尺测定随机选择的50个含荧光材料和载体的原位信号增强粒子的最长直径，求出该值的数均值，将其作为平均粒径。上述原位信号增强粒子的粒径的变异系数通过下式来计算。
粒径的变异系数(CV值)＝粒径的标准偏差/平均粒径本发明的效果根据本发明，能够提供以低的成本(不使用微流控芯片，也不使用非常规荧光显微镜)实现优异的检测灵敏度、较宽的检测动态范围和极低的变异系数的单分子检测方法。
附图说明
图1示出实施例1中得到的标准曲线(纵坐标为单分子信号数)。
具体实施方式
用于检测AβN3pE的单分子检测方法，其包括以下步骤：(1)将能够与AβN3pE结合的捕获抗体固定到磁珠上，加入含有AβN3pE的样品，使AβN3pE的第一位点与捕获抗体结合，从而捕获样品中的AβN3pE；(2)加入能够与AβN3pE的第二位点结合的检测抗体，使检测抗体与AβN3pE的第二位点结合，然后加入能够直接或间接与检测抗体结合的原位信号增强粒子；或者先将检测抗体与原位信号增强粒子结合而形成复合物，再将该复合物加入；上述原位信号增强粒子的粒径为180nm～350nm，且含有荧光材料及载体，(3)用光学成像设备将上述原位信号增强粒子发出的荧光信号成像；(4)对原位信号增强粒子的个数进行统计，进一步计算得到样品中AβN3pE的浓度，
其中，步骤(1)和(2)可以分别替换为下述的步骤(1’)和(2’)，
(1’)将检测抗体与样品混合，使其与样品中的AβN3pE的第二位点结合，然后加入能够直接或间接与检测抗体结合的原位信号增强粒子；或者先使原位信号增强粒子与检测抗体结合而形成复合材料，再将该复合材料加入样品中，使该复合材料与样品中的AβN3pE的第二位点结合；其中，所述原位信号增强粒子与所述步骤(1)中的原位信号增强粒子相同；
(2’)将能够与AβN3pE结合的捕获抗体固定至磁珠上，然后加入至步骤(1’)的体系中，使所述捕获抗体与所述AβN3pE的第一位点结合，从而将AβN3pE捕获。
上述检测方法基于双抗体夹心免疫法来检测AβN3pE的浓度。磁珠用于检测样品及试剂的分离和清洗。上述捕获抗体通过物理吸附或化学修饰的方式固定在磁珠表面，并且能够与AβN3pE的一个结合位点相结合，使AβN3pE从样品中分离。
上述检测抗体能够与待测分子AβN3pE的另一个结合位点结合。上述的原位信号增强粒子直接与检测抗体结合，是指检测抗体通过物理吸附或化学修饰的方法，直接吸附或偶联在原位信号增强粒子上，实现原位信号增强粒子对待测分子识别和标记的功能化修饰。上述的“原位信号增强粒子间接与检测抗体结合”是指通过抗检测抗体(即二抗)或生物素-链霉亲和素体系进行结合，将原位信号增强粒子特异性标记在检测抗体上。
上述磁珠的表面修饰有能够与抗体进行共价偶联的活性官能团，例如羟基、羧基、氨基、琥珀酰亚胺酯基、磺酰基(如甲苯磺酰基)及它们的衍生基团中的一种或多种。优选地，所述磁珠由磁性羧基取代的聚苯乙烯微球、嘧啶、无水硝酸汞、超支化聚缩水甘油醚组装而成。这样的磁珠的制备可以通过将磁性羧基取代的聚苯乙烯微球、嘧啶、无水硝酸汞、超支化聚缩水甘油醚混合，进行加热反应，并在酸(比如乙酸)的存在下水解而得到。所述磁性羧基取代的聚苯乙烯微球与嘧啶、无水硝酸汞、超支化聚缩水甘油醚的质量比为1：0.6～0.9：0.2～0.3：1～3。所述反应优选在惰性气体氛围下进行。所述磁性羧基取代的聚苯乙烯微球通过将羧基聚苯乙烯粒子(购自齐岳生物)、纤维素类高分子表面活性剂(如羟丙基纤维素)、硫酸亚铁七水合物和三氯化铁六水合物混合，室温搅拌，加入酸性水溶液(如磷酸)，得到磁性羧基取代的聚苯乙烯微球。所述超支化聚缩水甘油醚(HPG)作为市售品有售，无需其它修饰，合成方法也可见文献“超支化聚缩水甘油醚研究进展”，朱宝库等，高分子通报，第4期，2007年4月。
上述捕获抗体按照抗体特异性特性分类，可以为多克隆抗体和单克隆抗体中的一种或两种。上述捕获抗体按照来源分类，可以为鼠源抗体、兔源抗体、羊源抗体、羊驼源抗体中的一种或多种。
所述检测抗体按照抗体特异性特性分类，可以为多克隆抗体和单克隆抗体中的一种或两种。所述检测抗体按照来源分类，可以为鼠源抗体、兔源抗体、羊源抗体以及羊驼源抗体中的一种或多种。
上述抗检测抗体按照检测抗体来源分类，可以为抗鼠抗体、抗兔抗体、抗羊抗体、抗羊驼抗体中的一种或多种。所述抗检测抗体按照来源分类，可以为鼠源二抗、兔源二抗、羊源二抗以及羊驼源二抗中的一种或多种。
本说明书中所用的检测灵敏度又称检测限(LoD)，是指在特定置信水平下可以检测出的被测变量(即，计划测量的数量)的最低浓度。置信水平通常为95％，假阴性测量的可能性为5％。灵敏度是有可能可靠区别于空白限(LoB)并且可进行检测的最低分析物浓度。
本发明的原位信号增强粒子是在原位(in-situ)将荧光信号增强至能够被常规光学成像设备检测到的水平的材料，其含有荧光材料和载体这两部分。
所述原位信号增强粒子中，载体发挥非常重要的作用，例如，可以结合更多的荧光材料，使得发光信号更强；为官能化修饰提供位点，能够结合大量抗体，提高反应活性；为常规荧光显微镜实现单分子检测提供可能性，如果没有载体则无法实现单分子检测。所述载体按照材料分类，可以为聚乙二醇、苯乙烯-(甲基)丙烯酸共聚物、二氧化硅、聚苯乙烯、或聚丙烯酰胺中的一种或多种。所述载体按照结构分类，可以为中空结构、核壳结构、多孔结构、合金结构以及水凝胶结构中的一种或多种。其中，从使荧光材料均匀分布、使荧光材料的亮度高的观点考虑，载体优选为聚乙二醇、二氧化硅和聚丙烯酰胺。
所述原位信号增强粒子中的荧光材料也是实现单分子检测所必须的。所述荧光材料可以为荧光染料分子、稀土元素、稀土螯合物、荧光蛋白、量子点、聚集诱导发光材料、半导体共轭聚合物荧光材料以及上转换纳米粒子中的一种或多种。荧光材料优选为荧光素类(如异硫氰酸荧光素)、罗丹明类(如罗丹明绿、罗丹明B等)、香豆素类、量子点类(如ZnO)、稀土元素(如Eu、Ce)及其配合物等。所述荧光材料通过共价修饰、螯合作用、空间包裹、疏水作用以及静电吸附作用中的一种或多种而吸附或包裹于载体表面或内部。需要说明，从有利于光学成像识别和提高灵敏度的观点考虑，优选的是，荧光材料被均匀地包裹于载体的内部。
本申请中，荧光染料优选为PEG包裹荧光量子点ZnO、二氧化硅包裹荧光染料分子(如荧光素)而成的荧光粒子、聚丙烯酰胺包裹荧光染料分子(如荧光素)而成的荧光粒子、聚苯乙烯包裹量子点而成的荧光粒子、聚苯乙烯包裹稀土元素或稀土鳌合物而成的荧光粒子等。
本发明中，原位信号增强粒子的粒径需要控制在180～350nm范围内，例如为190nm、200nm、210nm、220nm、230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、290nm、300nm、310nm、320nm、330nm、340nm、350nm。若荧光染料的粒径小于180nm，例如150nm，则在常规光学成像设备中检测不到任何信号，若粒径大于350nm，例如为360nm，则检测灵敏度无法满足要求，难以达到临床所要求的灵敏度。需要说明的是，所述粒径可以是一次粒径，也可以是二次粒径。所述二次粒径是指一级颗粒与二级颗粒团聚后形成的粒径。原位信号增强粒子的粒径可以通过调节荧光材料与载体的质量比、反应温度、反应时间、搅拌的转速以及溶剂的用量等参数来控制。
本申请中，所述原位信号增强粒子的表面修饰有能够与抗体共价偶联的活性官能团，包括羟基、羧基、氨基、巯基、烯基、炔基、琥珀酰亚胺酯基团及其衍生基团中的一种或多种。
本申请中，所述原位信号增强粒子的表面可以修饰有一定长度的连接臂，所述连接臂包括多碳直链、多碳支链、聚合物链、肽链、蛋白质。所述连接臂的长度优选为180～350nm，进一步优选为2～20nm，最优选为5～10nm。
本申请的步骤(1)中，样品与捕获抗体的孵育温度为10～50℃，优选为20～40℃，尤其优选为37℃，孵育时间为1min～60min，优选为3min～30min，尤其优选为10min～30min。本申请的步骤(2)中，检测抗体(或结合有检测抗体的原位信号增强粒子)与样品的孵育温度为10～50℃，优选为20～40℃，尤其优选为37℃，孵育时间为1min～60min，优选为2min～30min，尤其优选为15min～25min。
本申请的发明人在深入研究后意外地发现，步骤(2)和步骤(1’)中的AβN3pE的第二位点与检测抗体的结合条件尤其是pH对于灵敏度、动态范围及变异系数也有影响。具体而言，在双抗夹心免疫测定法中，待测蛋白与检测抗体的结合通常在中性条件下(pH为7.4左右)进行，申请人在对cTnI蛋白、IL-6蛋白、p-Tau181蛋白、p-Tau217蛋白、Aβ40蛋白、Aβ42蛋白、及NF-L蛋白等的检测中，也均遵循的是本领域中的该常规pH条件。但在实际试验时发现，对于AβN3pE，常规的中性条件虽然也能够对其进行单分子检测，但效果方面还存在改进的空间。申请人进一步深入研究后意外地发现，将步骤(2)和步骤(1’)中的AβN3pE的第二位点与检测抗体的结合时的pH控制在碱性条件下、例如8～10(特别是9左右)时，能够显著地改善灵敏度、动态范围和变异系数。因此，优选将步骤(2)和步骤(1’)中的AβN3pE的第二位点与检测抗体的结合时的pH控制在8～10(特别是9左右)的范围内。
本申请中，作为测定对象，没有特别限定，可例举各种生物试样，例如血液、血清、血浆、脑脊液、尿、唾液、咳痰、鼻涕、鼻腔擦拭液、咽喉擦拭液、泪液等体液，优选为血液、血清、血浆或脑脊液。
本申请中，所述光学成像设备主要包括以下部件：激发光源、物镜、滤光片、感光元件、数据采集模块、数据处理模块以及二向色镜(若为正置显微镜，则也可以没有二向色镜)。其中，所述激发光源是用于将反应后的样品激发出光学信号的光学发射装置。所述物镜用于待测样品的信号采集和放大。所述二向色镜用于激发光路的反射和样品光学信号的采集。所述滤光片用于激发光波段的过滤和样品发射光信号的过滤。所述感光元件用于样品光学信号的采集。所述数据采集模块配置为接收感光元件捕获的光学信号，并转换为数字信号。所述数据处理模块配置为数字信号的转换以及光学图像的形成和处理。
在该设备的一些实施方式中，所述激发光源包括气体激光器、固体激光器、半导体激光器、液体激光器以及自由电子激光器中的一种或几种。在该设备的一些实施方式中，所述物镜按照倍率分类，包括1X、2X、4X、5X、10X、20X、40X、50X以及100X中的一种或几种；所述物镜按照场曲校正分类，包括平面物镜或曲面物镜。在该设备的一些实施方式中，所述感光元件包CCD(Charge Coupled Device，电荷耦合装置)或CMOS(Complementary Metal-OxideSemiconductor，互补金属氧化物半导体)中的一种或两种。
本申请通过采用特定的检测体系，从而对光学成像设备的要求低，为常规的光学成像设备(即未突破光学衍射极限的光学成像设备)即可，无需全内反射荧光显微镜、落射荧光显微镜、扫描近场光学显微镜、共聚焦荧光显微镜等昂贵的、突破了光学衍射极限的成像设备。
本申请中，AβN3pE浓度的计算方式有单分子计数模式和荧光强度积分模式这两种。其中，就所述单分子计数模式而言，直接对生成的图像中的由原位信号增强粒子形成的亮斑个数进行分析和统计，通过亮斑个数直接或间接换算为AβN3pE在样品中的浓度信息。所谓“直接换算为AβN3pE在样品中的浓度信息”，是指绝对定量，也即，无需标准曲线校正即可换算为浓度信息。所谓“间接换算为AβN3pE在样品中的浓度信息”，是指通过亮斑个数和标准曲线(或校正参数)换算为浓度信息。就所述荧光强度积分模式而言，对生成的图像中的由原位信号增强粒子形成的亮斑面积进行统计和积分，通过将积分结果除以特定参数，例如平均每个原位信号纳米粒子所形成的平均亮斑面积或亮斑面积相关变量(例如幂方、开方以及多项式等)，从而换算得到原位信号增强粒子的近似个数，再将该数值换算为AβN3pE在样品中的浓度信息。其中，平均亮斑面积是通过在较低浓度下对单个分子的亮斑面积进行统计并取平均值而得到的。从获得更大的检测动态范围的方面考虑，重要的是，在低浓度区间使用单分子计数模式、并在高浓度区间使用荧光强度积分模式，然后将这两种模式下绘制的标准曲线合并，从而绘制完整的标准曲线。需要说明，上述低浓度与高浓度的分界线一般为一个磁珠表面上结合有超过一个的待测分子时的浓度，也可以根据标准曲线拟合结果优选为一个磁珠表面上平均结合有0.5个待测分子时的浓度或2个待测分子时的浓度。
实施例
以下，举出实施例和比较例进一步详细地说明本申请，但本申请并不限定于此。
1、原位信号增强粒子的粒径和变异系数的测定
以聚乙二醇负载荧光粒子、苯乙烯-(甲基)丙烯酸共聚物负载荧光粒子、二氧化硅负载荧光粒子为例，将各原位信号增强粒子用水稀释1000倍，然后取100μL滴加在洁净硅片表面，晾干，使用小型溅射仪在其表面溅射沉积5nm的铂，使用SEM(日本日立高新技术公司制SU3900)进行成像分析，求出粒径。
粒径的变异系数通过下式来计算。
粒径的变异系数(CV值)＝粒径的标准偏差/平均粒径
以聚丙烯酰胺负载荧光粒子为例，用纯水将得到的聚丙烯酰胺荧光纳米粒子稀释1000倍，使用马尔文粒度分析仪(Zetasizer Nano S90)测定粒子的粒径。
2、单分子成像
使用常规荧光显微镜例如尼康Eclipse Ti-U荧光显微镜进行单分子成像，此外，也可采用尼康Eclipse Ti系列的其他荧光显微镜、莱卡DMi8荧光显微镜等。
3、标准曲线绘制方法
本申请中，联合使用单分子计数模式与荧光强度积分模式，具体实施方法如下：在待测分子的浓度较低时，磁珠数量多于与磁珠结合的待测分子数量，因此使用单分子计数模式对不同浓度的待测分子样本进行标准曲线绘制；当待测分子的浓度超过一定阈值时，一个磁珠表面可能结合有1个以上的待测分子，单分子信号容易叠加，导致检测结果出现偏差，因此更适合使用荧光强度积分模式。
具体而言，当一张成像图片中的单分子数量不超过设定的阈值时，使用单分子计数模式进行标准曲线的绘制；当一张成像图片中的单分子数量超过设定的阈值时，使用荧光强度积分模式，并将总荧光强度面积除以每个分子的平均荧光强度面积，换算为“近似单分子数量”，从而进行标准曲线绘制。
最后，将利用单分子计数模式得到的标准曲线与利用荧光强度积分模式得到的标准曲线合并，并利用拟合公式进行曲线拟合，绘制完整的标准曲线。
4、原位信号增强粒子的制备
(a)以聚乙二醇为载体的原位信号增强粒子的制备为例，步骤如下。
将聚乙二醇和荧光材料以规定的比例溶于有机溶剂中，搅拌并微热，将该溶液滴入含表面活性剂如Pluronic F-127的水溶液中，超声而形成乳液，再次与含表面活性剂的水溶液混合，磁力搅拌后蒸发除去有机溶剂，离心后洗涤，得到包埋有上述荧光材料的以聚乙二醇为载体的原位信号增强粒子。
(b)以苯乙烯-(甲基)丙烯酸共聚物为载体的原位信号增强粒子可以采用下述方法制造：
(1)制备含有苯乙烯-(甲基)丙烯酸共聚物的种粒子分散液的工序，具体而言，向具备搅拌机、回流冷凝器、温度传感器、氮导入管的反应器中，添加400g纯水、1g甲基丙烯酸、10g苯乙烯、0.20g过硫酸钾(引发剂)，对容器进行氮气置换后，于65℃以200rpm的速度进行搅拌，聚合24小时。聚合结束后，将溶液用滤纸过滤，取出胶乳粒子，然后用透析膜进行48小时的透析处理，得到作为种粒子的胶乳粒子；
(2)制备含有上述荧光材料和有机溶剂的乳化液的工序，具体而言，使作为发光材料的荧光材料0.4g溶解于乙酸乙酯31g而制成溶液，将该溶液添加至溶解有0.1g苯乙烯磺酸钠的水溶液(水为150g)中，进行混合，由此制备乳化液；
(3)以荧光材料的质量成为种粒子质量的0.11倍的方式，向上述种粒子分散液中加入上述乳化液，使上述种粒子吸收上述荧光材料和上述有机溶剂而得到溶胀粒子液滴分散液的工序；和(4)将上述溶胀粒子液滴的分散液一边在65℃下以200rpm的速度搅拌24h，一边将上述有机溶剂干燥，得到包含上述荧光材料的以苯乙烯-(甲基)丙烯酸共聚物为载体的原位信号增强粒子的工序，其中，荧光材料的质量分数为10％。
当载体为苯乙烯时，原位信号增强粒子可以参照苯乙烯-(甲基)丙烯酸共聚物为载体时类似的方法来合成(将(甲基)丙烯酸省去)，当载体为二氧化硅、或聚丙烯酰胺时，原位信号增强粒子的制造方法可以参见专利文献1中实施例的记载。
5、磁珠的制备
将购买的4g羧基聚苯乙烯粒子分散至150mL水与60mL乙醇的混合液中，加入0.6g数均分子量为6000的羟丙基纤维素、5g硫酸亚铁七水合物和6g三氯化铁六水合物，室温搅拌1小时，加入50mL 2M磷酸水溶液，然后升温至75℃继续搅拌2小时，反应结束后反应液抽滤并用水洗涤至中性，得磁性羧基取代的聚苯乙烯微球。
在氮气氛围下，将8mg上述制备得到的磁性羧基聚苯乙烯微球分散于100mL二氯甲烷中，加入7mg嘧啶、少量三乙胺，置于常温常压下密闭搅拌反应24小时后，加入30mL的无水乙腈和2mg的无水硝酸汞，加热回流1天后，滴加2mL 8mg/mL的溶于二甲基甲酰胺的HPG(超支化聚缩水甘油醚)溶液，于摇床中反应50min。反应结束后，向反应体系中加入2mL 50mMPBS溶液继续反应30min，使用50mM磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液，pH＝7.4)清洗三次，清洗过程中使用磁性分离架分离磁性微球，清洗结束后，使用2mL 50mM PBS溶液(pH＝7.4)重悬，得到专用于GDF15的单分子检测的磁珠。
实施例1：用于人血清中AβN3pE的检测(使用PEG包裹量子点ZnO作为原位信号增强粒子，粒径为200nm)。
1、部分实验组分
上文制备的磁珠、捕获抗体(自研)、检测抗体(自研)、硅烷偶联剂(APTES)、氨水、正硅酸乙酯(TEOS)、PEG包裹量子点ZnO(平均粒径为200nm，粒径的CV值为5％，购自齐岳生物)、丁二酸酐、待测血清样本、PBS缓冲液、Buffer C(3mM(NH4)2SO4溶于10mM PBS缓冲液，pH＝7.4)、Buffer D(0.01％NaCl，0.5％BSA溶于10mM PBS，pH＝7.4)、Buffer E(0.0088％NaCl，0.1％BSA溶于10mM PBS，pH＝7.4)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、增强粒子保存液、pH为9的Tris缓冲液、样品稀释液以及PBS洗液。
2.1、磁珠与捕获抗体的共价偶联
(1)取166.6μL的20mg/mL上文制备的磁珠，使用10mM的PBS缓冲液清洗5次，移除缓冲液。
(2)取110μg的捕获抗体，用100μL的10mM PBS缓冲液稀释后加入到(1)的磁珠中，混合均匀，加入110μL的Buffer C，于37℃旋转混匀，反应60min。
(3)使用10mM的PBS缓冲液清洗5次，加入1mL的Buffer D进行封闭反应。于37℃旋转混匀，反应50min。
(4)使用12mM的PBS缓冲液清洗5次，使用200μL的Buffer E保存，待用。
2.3、检测抗体与原位信号增强粒子的共价偶联
(1)取10μL的保存于增强粒子保存液中的原位信号增强粒子，加入60μL的PBS缓冲液超声1min。
(2)取0.005g的EDC，溶于50μL的PBS缓冲液，另取0.0135g的NHS溶于90μL的PBS缓冲液。
(3)以10000rpm的速度将原位信号增强粒子离心，去除上清液，加入60μL的PBS缓冲液重悬，超声1min后加入2.5μL的EDC溶液，超声1min后再加入10μL的NHS溶液，混匀后于37℃旋转混匀反应15min，以10000rpm的转速离心20min，去除上清液，使用60μL的PBS缓冲液将纳米粒子重悬。
(4)加入18μg的检测抗体(自研)，于37℃旋转混匀反应2h。
(5)加入20μL的Buffer D，于37℃封闭反应60min后，以10000rpm离心10min，使用120μL的Buffer E重悬保存。
3、实验方法标准曲线的制作
(1)使用胎牛血清将AβN3pE抗原的浓度分别稀释为0、2.54、7.62、22.86、68.59、205.76、617.28、1851.85、5555.56、16666.67、50000.00pg/mL。
(2)将标记有捕获抗体的磁珠稀释为1mg/mL，取50μL，在pH为7.4的条件下，分别加入50μL(1)中得到的各浓度的样品，于37℃孵育60min。使用200μL清洗缓冲液洗三次，洗去残余样品，吸干上清液。
(3)在用缓冲液将(2)中得到的混合液调节至pH为9的情况下，加入20μL结合有检测抗体的原位信号增强粒子，于37℃孵育60min，使用清洗缓冲液洗5次，洗去残余的原位信号增强粒子，去除上清液。
(4)加入10μL检测液将磁珠重悬，转移至检测孔，使用磁铁将磁珠吸引至检测孔的底部，使用荧光显微镜(尼康Eclipse Ti-U)进行单分子成像，联合使用单分子计数模式和荧光强度积分模式来完成后续单分子计数统计和分析。
(5)完成一系列浓度检测，每个浓度点重复6次，根据检测结果绘制标准曲线，计算每个点的CV％值。
4、实验结果
标准曲线的结果如图1所示，可知该实施例中，AβN3pE的检测范围为1pg/mL～100ng/mL，在该区间内单分子信号数与样品浓度呈良好的线性关系(十分接近1)，其检测下限可达1pg/mL，检测灵敏度较高。而且，检测动态范围也宽，变异系数CV值只有2％。
实施例2
除了将检测抗体与样品的第二位点结合时的pH调节为7.4以外，与实施例1同样地操作，结果，AβN3pE的检测范围为15pg/mL～100ng/mL，在该区间内单分子信号数与样品浓度呈良好的线性关系，其检测下限为15pg/mL，检测灵敏度尚可。变异系数CV值为8％，可满足要求。
实施例3
除了将检测抗体与样品的第二位点结合时的pH调节为8.0以外，与实施例1同样地操作，结果，AβN3pE的检测范围为5pg/mL～100ng/mL，在该区间内单分子信号数与样品浓度呈良好的线性关系，其检测下限为5pg/mL，检测灵敏度较优异。变异系数CV值为5％。
实施例4
除了将检测抗体与样品的第二位点结合时的pH调节为10.0以外，与实施例1同样地操作，结果，AβN3pE的检测范围为6pg/mL～100ng/mL，在该区间内单分子信号数与样品浓度呈良好的线性关系，其检测下限为6pg/mL，检测灵敏度较优异。变异系数CV值为4％。
实施例5
除了将检测抗体与样品的第二位点结合时的pH调节为10.5以外，与实施例1同样地操作，结果，AβN3pE的检测范围为12pg/mL～100ng/mL，在该区间内单分子信号数与样品浓度呈良好的线性关系，其检测下限为12pg/mL，检测灵敏度尚可。变异系数CV值为9％，可满足要求。
实施例6
除了将实施例1中的磁珠替换为常规的羧基取代磁珠(购自默克化学)以外，与实施例1同样地操作，结果检测下限为20pg/mL，变异系数为9％。
实施例7
除了将实施例1中的磁珠替换为常规的氨基取代磁珠(购自默克化学)以外，与实施例1同样地操作，结果检测下限为25pg/mL，变异系数为8％。
实施例8
除了将实施例1中制备磁珠的条件中的磁性羧基取代的聚苯乙烯微球替换为磁性氨基取代的聚苯乙烯微球以外，与实施例1同样地操作，结果检测下限为30pg/mL，变异系数为8％。
实施例9
除了将实施例1中制备磁珠的条件中的嘧啶替换为4’-(4-羧基苯基)-2,2’:6’,2”-三联吡啶以外，与实施例1同样地操作，结果检测下限为28pg/mL，变异系数为9％。
实施例10
除了将实施例1中制备磁珠的条件中的无水硝酸汞替换为无水醋酸汞以外，与实施例1同样地操作，结果检测下限为25pg/mL，变异系数为8％。
实施例11
除了将实施例1中制备磁珠的条件中的超支化聚缩水甘油醚替换为经琥珀酰亚胺基碳酸酯修饰的超支化聚缩水甘油醚以外，与实施例1同样地操作，结果检测下限为30pg/mL，变异系数为9％。
比较例1
利用免疫检测领域中的常见酶联免疫法(ELISA)来测定AβN3pE的浓度，试剂盒购自其他公司的商业可售试剂盒，检测下限为0.6μg/mL，变异系数为17％。
比较例2
基于市面已有的其他公司的各单分子检测技术，结果，最优的检测下限为60pg/mL左右，差的检测下限为100pg/mL左右，变异系数为18％～25％。

Claims (10)

1.检测AβN3pE浓度的基于计数的单分子检测方法，其包括以下步骤：
（1）将能够与AβN3pE结合的捕获抗体固定到磁珠上，加入含有AβN3pE的样品，使AβN3pE的第一位点与捕获抗体结合，从而捕获样品中的AβN3pE；
（2）加入能够与AβN3pE的第二位点结合的检测抗体，使检测抗体与AβN3pE的第二位点结合，然后加入能够直接或间接与检测抗体结合的原位信号增强粒子；或者先将检测抗体与原位信号增强粒子结合而形成复合物，再将该复合物加入；所述原位信号增强粒子的粒径为180nm~350nm，且含有荧光材料及载体，
（3）用光学成像设备将所述原位信号增强粒子发出的荧光信号成像；
（4）对原位信号增强粒子的个数进行统计，进一步计算得到样品中AβN3pE的浓度，
其中，步骤（1）和（2）可以分别替换为下述的步骤（1’）和（2’），
（1’）将检测抗体与样品混合，使其与样品中的AβN3pE的第二位点结合，然后加入能够直接或间接与检测抗体结合的原位信号增强粒子；或者先使原位信号增强粒子与检测抗体结合而形成复合材料，再将该复合材料加入样品中，使该复合材料与样品中的AβN3pE的第二位点结合；其中，所述原位信号增强粒子与所述步骤（1）中的原位信号增强粒子相同；
（2’）将能够与AβN3pE结合的捕获抗体固定至磁珠上，然后加入至步骤（1’）的体系中，使所述捕获抗体与所述AβN3pE的第一位点结合，从而将AβN3pE捕获。
2.如权利要求1所述的单分子检测方法，其中，所述原位信号增强粒子的粒径为200~300nm，粒径的变异系数（CV值）为1%~10%。
3.如权利要求1或2所述的单分子检测方法，其中，所述载体为聚乙二醇、苯乙烯-（甲基）丙烯酸共聚物、二氧化硅、聚苯乙烯、或聚丙烯酰胺，所述荧光材料为荧光染料、量子点、聚集诱导发光材料或半导体共轭聚合物荧光材料。
4.如权利要求1或2所述的单分子检测方法，其中，步骤（2）和步骤（1’）中的AβN3pE的第二位点与检测抗体的结合在pH8~10的范围内进行。
5.如权利要求1或2所述的单分子检测方法，其中，所述磁珠由磁性羧基取代的聚苯乙烯微球、嘧啶、无水硝酸汞、超支化聚缩水甘油醚组装而成。
6.权利要求1~5中任一项所述的单分子检测方法在检测AβN3pE的浓度中的应用。
7.用于检测AβN3pE的基于单分子计数的试剂盒，其包含原位信号增强粒子和磁珠，所述原位信号增强粒子包含荧光材料和载体，且平均粒径为180~350nm，粒径的变异系数（CV值）为1%~10%。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其中，所述载体为聚乙二醇、苯乙烯-（甲基）丙烯酸共聚物、二氧化硅、聚苯乙烯、或聚丙烯酰胺，所述荧光材料为荧光染料、量子点、聚集诱导发光材料或半导体共轭聚合物荧光材料。
9.如权利要求7或8所述的试剂盒，其还包含分别与AβN3pE的第一位点结合的捕获抗体和与AβN3pE的第二位点结合的检测抗体。
10.如权利要求7或8所述的试剂盒，其还包含缓冲体系，所述缓冲体系的pH为8~10，能够使来自样品的AβN3pE的第二位点与检测抗体的结合在pH8~10的范围内进行，所述磁珠由磁性羧基取代的聚苯乙烯微球、嘧啶、无水硝酸汞、超支化聚缩水甘油醚组装而成。
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