CN210037831U - 一种轮状病毒检测试纸卡 - Google Patents
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Abstract
一种检测轮状病毒的试纸卡，所述试纸卡包括支持底板及其上依次排列的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述结合垫含有近红外荧光标记物标记的第一抗轮状病毒抗体和质控抗原；所述硝酸纤维素膜上依次设置检测线和质控线，所述检测线包含第二抗轮状病毒抗体，所述质控线包含抗质控抗原的抗体。本实用新型提供的方法与胶体金法相比，具有低背景荧光、检测灵敏度高的特点；相比于电镜技术、酶联免疫吸附试验、反转录聚合酶链式反应等方法，操作简单；配合便携式荧光扫描仪使用，适用于轮状病毒现场快速检测。
Description
技术领域
本实用新型涉及一种检测轮状病毒的试纸卡，特别涉及一种基于近红外免疫层析技术的轮状病毒检测试纸卡及其制备方法和应用，本实用新型属于荧光免疫层析领域。
背景技术
轮状病毒(rotavirus,简称RV)是一种双链核糖核酸病毒，属于呼肠孤病毒科。它是婴儿与幼儿腹泻的单一主因，几乎世界上每个大约五岁的小孩都曾感染过轮状病毒至少一次。感染轮状病毒后主要表现为厌食、呕吐、腹泻、脱水等症状，严重者可导致死亡。轮状病毒总共有七个类群，以英文字母编号为A、B、C、D、E、F与G。其中，A群是最为常见的一种，而人类轮状病毒感染超过90％的案例也都是该种造成的。
目前，我国对轮状病毒病的经典检测方法是电镜技术、酶联免疫吸附试验(ELISA)、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、胶体金法等。电镜技术、酶联免疫吸附试验(ELISA)、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)等方法要求具备特殊设备和专业技术人才，基层单位普及困难，应用受到限制，而且只适用于实验室检测，不适于现场检测。常见的荧光标记物光谱范围大多在可见光区(400-750nm)，由于生物体的蛋白、核酸等在紫外光的激发下会产生荧光，因此，使用可见光区的荧光标记物会产生较强的背景荧光，干扰检测信号，降低了检测的灵敏度。利用胶体金显色技术可以使试纸显示一定的颜色，通过颜色来判断样品是呈阴性还是阳性，但其灵敏度较低，若样品浓度过低则无法显色，同时无法定量分析。近红外荧光材料的发射波长范围在650-1000nm，在这个范围内，生物体自发荧光较弱，使用近红外荧光材料作为检测荧光标记物，具有低背景荧光、检测信噪比高，检测灵敏度高的特点。
发明内容
本实用新型所要解决的技术问题是提供一种简单快速、适用于现场检测的轮状病毒检测试纸卡及其制备方法和应用，以降低检测误差，提高检测结果的准确度。
为了达到上述目的，本实用新型采用了以下技术手段：
本实用新型利用双抗体夹心原理，构建一种轮状病毒检测试纸卡，包括支持底板及其上依次排列的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述结合垫含有近红外荧光标记物标记的第一抗轮状病毒抗体和质控抗原；所述硝酸纤维素膜上依次设置检测线和质控线，所述检测线包含第二抗轮状病毒抗体，所述质控线包含抗质控抗原的抗体。
本实用新型所述质控抗原可以为任何已知抗原，所述抗质控抗原的抗体为相应质控抗原的单克隆或多克隆抗体。在本发明的一些实施方案中，质控抗原为鸡IgY，抗质控抗原的抗体为羊抗鸡IgY多克隆抗体。
本实用新型所述第一抗轮状病毒抗体和所述第二抗轮状病毒抗体为不同的抗体，优选为不同的单克隆抗体。
本实用新型所述近红外荧光标记材料为发射波长在650-l000nm的染料，优选为NHS活化的近红外荧光染料Dylight800。
本实用新型所述荧光扫描仪器可以为市场上可获得的任何可识别近红外波长光波的扫描仪，优选为中国专利CN201220372662.8公开的便携式高灵敏度近红外点荧光扫描仪。
进一步地，本实用新型提供了一种制备所述轮状病毒检测试纸卡的方法，包括以下步骤：
(1)用近红外荧光染料标记第一抗轮状病毒抗体和质控抗原；
(2)将含1～5％BSA，0.1～0.5％Tween 20的PBS缓冲液加于样品垫，室温风干；
(3)将步骤(1)制备的近红外荧光染料标记的第一抗轮状病毒抗体和质控抗原加于结合垫，室温风干；
(4)取第二抗轮状病毒抗体和抗质控抗原抗体，用划膜仪在硝酸纤维素膜上分别制成质控线和检测线，室温风干；
(5)将步骤(2)制备的样品垫、步骤(3)制备的结合垫、步骤(4) 制备的硝酸纤维素膜、以及吸水垫依次置于支持底板上，组装成轮状病毒检测试纸卡。
进一步的，本实用新型还提供了所述的近红外荧光免疫层析试纸条在制备轮状病毒检测试剂中的应用。
更进一步的，本实用新型还提供了一种检测轮状病毒的方法，包括，使用本发明制备的轮状病毒检测试纸卡按照以下步骤进行：
(1)在样品垫上滴加50～150μL测试样品，室温放置5～15min后，用便携式荧光扫描仪读数；
(2)结果判定：
所述质控线和所述检测线都出现荧光发射峰，判定为阳性结果；
仅在所述质控线出现荧光发射峰，判定为阴性结果；
所述质控线无荧光发射峰出现，不论所述检测线是否出现荧光发射峰，判定结果无效。
与现有技术相比，本实用新型具有如下有益效果：与胶体金法相比，具有低背景荧光、检测灵敏度高的特点；相比于电镜技术、酶联免疫吸附试验(ELISA)、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)等方法，操作简单；配合便携式荧光扫描仪使用，适用于轮状病毒现场快速检测。
附图说明
图1为检测试纸卡的侧面示意图；
1：吸水垫；
2：硝酸纤维膜；
3：结合垫；
4：反应支持PVC底板；
5：检测线；
6：质控线；
7：样品垫。
图2轮状病毒定性检测结果。
图3轮状病毒特异性检测结果。
具体实施方式
实施例1轮状病毒检测试纸卡的制备
1材料与试剂
1.1材料
硝酸纤维素膜(M135)购自美国Millipore，玻璃纤维膜、样品垫、吸水纸、PVC板、快速检测塑料卡购自北京艾德康瑞科技有限公司。
1.2病毒与细胞
轮状病毒、腺病毒、诺如病毒、肠道病毒EV71均由本实验室保存。 MA-104细胞由本实验室保存。
1.3主要试剂
荧光染料Dylight800购自美国Thermo，轮状病毒单克隆抗体购自珠海博美生物科技有限公司，鸡Ig Y和羊抗鸡Ig Y多克隆抗体购自英国 Abcam。
2实验方法
2.1近红外荧光染料标记抗体的制备
将荧光染料Dylight800原液用PBS缓冲液1:10稀释，分别取7uL与 100uL 1mg/mL第一抗轮状病毒抗体和1mg/mL鸡Ig Y混合均匀后于室温避光反应1h。反应完毕后，转移标记溶液至透析袋中，于PBS溶液中 4℃透析过夜以去除未结合的染料，标记好的抗体添加终浓度为1％BSA， 0.1％Tween 20和叠氮化钠0.1‰，4℃保存。
2.2轮状病毒免疫层析试纸条的制备
2.2.1样品垫制备
选取纤维素膜带作为样品垫，喷涂含5％BSA，0.1％Tween 20的PBS 缓冲液，室温风干。
2.2.2结合垫制备
选取玻璃纤维素带作为结合垫固相材料，在条带上喷涂近红外荧光染料标记的第一抗轮状病毒抗体和质控抗原，室温风干条带。
2.2.3硝酸纤维素膜制备
将羊抗鸡Ig Y多克隆抗体和第二抗轮状病毒抗体，用划膜仪在硝酸纤维素膜上制成质控线和检测线，质控线和检测线的间距为0.5cm，室温风干。
2.2.4组装检测试纸卡
将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫及反应支持PVC底板如图1方式按照顺序安装好，然后用切割机切成试纸条，放入塑料卡槽中，组装成品试纸卡。
2.3定性检测
无菌条件下，分别取实验室保存的轮状病毒原液和轮状病毒感染患儿粪便上清稀释后各50μl，加50μl层析液混匀滴加到样品垫上，室温放置 15min后，用便携式荧光扫描仪读数。以层析液为空白对照组进行相同操作。
2.4特异性检测
无菌条件下，分别取实验室保存的轮状病毒、腺病毒、诺如病毒、肠道病毒EV71原液稀释后各50μl，加50μl层析液混匀滴加到样品垫上，室温放置15min后，用便携式荧光扫描仪读数。以层析液为空白对照组进行相同操作。
3结果
3.1轮状病毒定性检测结果
实验采用近红外荧光染料标记的双抗体夹心免疫层析试纸条检测轮状病毒。实验发现，检测中所使用的近红外荧光染料为发射波长位于 777nm的有机分子，优选NHS活化的近红外荧光染料Dylight 800。所述的基于低噪声激发式荧光标记的轮状病毒免疫层析试纸条，低噪声激发式荧光染料为发射波长为650～1000nm。分别测定检测线和质控线区域的荧光强度，若质控线区域出现荧光发射峰，则表明该试纸条有效，反之则无效；若检测线区域同时出现荧光发射峰则为阳性结果，反之则为阴性。检测结果见图2。
3.2特异性检测结果
分别取轮状病毒、腺病毒、诺如病毒、肠道病毒EV71原液稀释后，滴加到轮状病毒免疫层析试纸条进行检测。除轮状病毒检测为阳性外，腺病毒、诺如病毒、肠道病毒EV71均为阴性。由此证明本发明建立的双抗体夹心法免疫层析试纸条特异性良好，不与其他病毒发生交叉反应。检测结果见图3。
以上实施例仅是范例性的，并不对本实用新型的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本实用新型的精神和范围下可以对本实用新型技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本实用新型的保护范围内。
Claims (8)
1.一种轮状病毒检测试纸卡，其中，所述试纸卡包括支持底板及其上依次排列的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述结合垫含有近红外荧光标记物标记的第一抗轮状病毒抗体和质控抗原；所述硝酸纤维素膜上依次设置检测线和质控线，所述检测线包含第二抗轮状病毒抗体，所述质控线包含抗质控抗原的抗体；所述质控抗原为鸡IgY，所述抗质控抗原的抗体为羊抗鸡IgY多克隆抗体。
2.如权利要求1所述轮状病毒检测试纸卡，其中，所述支持底板为PVC板。
3.如权利要求1所述轮状病毒检测试纸卡，其中，所述结合垫为玻璃纤维膜。
4.如权利要求1至3任一所述轮状病毒检测试纸卡，其中，所述近红外荧光标记物为发射波长在650-l000nm的染料。
5.如权利要求4所述轮状病毒检测试纸卡，其中，所述近红外荧光标记物为NHS活化的近红外荧光染料Dylight800。
6.如权利要求1所述轮状病毒检测试纸卡，其中，所述羊抗鸡IgY多克隆抗体的使用浓度为0.5～2mg/mL。
7.如权利要求1所述轮状病毒检测试纸卡，其中，所述第一抗轮状病毒抗体和所述第二抗轮状病毒抗体为不同的抗体。
8.如权利要求7所述轮状病毒检测试纸卡，其中，所述第二抗轮状病毒抗体的使用浓度为0.5～2mg/mL。
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