CN107656075A - 雌二醇快速时间分辨免疫层析定量检测试纸条 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种应用于水产中雌二醇快速时间分辨免疫层析定量检测试纸条。该试纸条由Fusion5膜、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜和吸水纸三部分组成，通过竞争法原理利用时间分辨荧光微球作为免疫标记物对水产中的雌二醇进行准确快速的定量检测。

Description

雌二醇快速时间分辨免疫层析定量检测试纸条
技术领域
本发明属于食品安全检测领域，具体涉及水产品中有害残留物的检测方法，特别是雌二醇定量检测的时间分辨免疫层析试纸条及其制备方法及应用。
背景技术
雌激素类化合物的研究己有数十年的历史，具有一定的生物效价，但往往由于雌活力高、副作用大而使临床应用受到极大限制。研究发现其可以扰乱体内正常的内分泌功能，改变机体在发育阶段胞内信号传导过程，从而造成生殖、免疫、神经等系统的多种病变。如17-β雌二可促进儿童性早熟，提高男性前列腺癌，妇女乳腺癌和子宫癌并发率，此外它还会影响女性的生理规律，甚至导致不孕。痕量级别的雌二醇就能引起体液免疫和细胞免疫的失调，导致生殖免疫、心血管和神经系统的病变，对人的危害是长期、积累性的，严重威胁人类健康，在农业部发布的《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》已将其列入其中。由于其可提高饲料转化率并促进动物生长，提高生产率和产量，目前在水产养殖上经常偷偷大量使用，屡禁不止，往往造成环境污染和食品安全等问题出现。为了保证广大消费者的身体健康，规范水产品市场，建立一个可靠快速的雌二醇检测方法是显得非常必要而又迫切。
目前由于多以胶体金、彩色乳胶微球或荧光素作为标记物免疫层析快速检测试纸条具有特异性强、简便、快速等特点得到大量医学工作者的青睐，但其也存在的一些不足，影响了其使用范围。胶体金标记技术开发的快速检测试纸条，只能定性或者半定量，批间差异较大等问题；虽然彩色乳胶微球作为标记物开发的快速检测试纸条批间差异有所改善，但灵敏度依然较低，也只能定性或半定量；荧光素标记技术的免疫层析快速检测试纸条灵敏度有了较大改善，具备定量检测能力，但是由于样本存在较高的荧光本底信号，且stock位移较小，对检测产生较大影响。
时间分辨荧光免疫分析技术是20世纪80年代发展起来的一种新的荧光标记技术。其应用特殊稀土金属，能够区分背景光的散射所引起的干扰，从而大大地提高了分析的灵敏度，是目前被公认为是灵敏度最高的分析方法之一。时间分辨荧光属于一种非同位素荧光标记物，故其无放射性污染危害。与普通荧光相比，具有灵敏度高，达到10-19，稳定性好，stock位移大，荧光寿命长等特点，可以有效的避免样品中的本底荧光，以及激发光等杂散光的影响，因此相比普通荧光具有更高的灵敏度和抗干扰能力。
本发明将时间分辨免疫荧光微球标记和免疫层析两大技术结合，利用Fusion5替代传统的样品垫、滤血膜、结合垫，将原有的四层甚至五层膜系统简化，开发出只需要三层膜结构的快速定量免疫层析检测试纸，不仅简化了生产工艺，而且有效的降低了产品的批内差和批间差，提高了检测灵敏度，本发明还成功制备了雌二醇单克隆抗体，可快速定量检测水产品样品雌二醇含量，具有极高的实用价值和经济效益。
发明内容
本发明的目的在于根据目前技术不足及检测需要，提供一种新型、特异、能快速定量检测水产品中雌二醇的时间分辨免疫层析检测试纸条及其制备方法和应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
本发明第一方面公开了雌二醇快速时间分辨免疫层析定量检测试纸条，该试纸条包括Fusion5膜、PVDF膜及吸水纸三部分，PVDF膜位于中间，Fusion5膜和吸水纸分别搭接于PVDF膜左右两端，Fusion5膜上有加样区和微球区，微球区上有雌二醇单克隆抗体时间分辨免疫荧光微球与鼠IgG时间分辨免疫荧光微球的混合微球混合液；PVDF膜上有质控线和检测线，质控线上包被羊抗鼠IgG抗体，检测线上包被雌二醇抗原，试纸底部设有塑料底板。所述时间分辨免疫荧光微球，包括质控微球及检测微球，分别为表面包被有雌二醇单克隆抗体(C3D2，G6B7)的荧光微球和鼠IgG荧光微球。
所述时间分辨免疫荧光微球的粒径范围为50-1500μm，外部包裹羧基、醛基等活性基团并包被铕螯合物。所述PVDF膜上的质控线和检测线，分别包被羊抗鼠IgG抗体和雌二醇抗原(A1：E2-3-MCPE-A，A2：E2-6-MCPE-A)。
本发明第二方面公开了雌二醇快速时间分辨免疫层析定量检测试纸条的制备方法，其制备步骤如下：
(1)质控微球制备：用鼠IgG包被荧光微球；
(2)检测微球制备：用雌二醇单抗包被荧光微球；
(3)空白大卡粘贴：将PVDF膜粘贴在塑料底板中间，Fusion5膜与吸水纸分别搭接于PVDF膜左右两端；
(4)喷膜：将包被鼠IgG的荧光微球和雌二醇单抗的荧光微球采用缓冲液混合稀释到一定浓度喷到Fusion5膜微球区；雌二醇抗原(A1：E2-3-MCPE-A，A2：E2-6-MCPE-A)和羊抗鼠IgG抗体稀释后分别喷到PVDF膜的T线和C线位置；
(5)干燥及切条：将上述喷好试剂的大卡烘干、切条。
(6)检测：
步骤(4)稀释后检测微球终浓度为0.4-2mg/mL，质控微球终浓度为0.04-0.1mg/mL；T线雌二醇抗原终浓度0.2-2mg/mL，C线羊抗鼠IgG抗体终浓度0.2-2mg/mL；C、T线喷膜液量为0.5-15μL/cm，微球喷膜液量为0.5-15μL/cm。
步骤(5)烘干条件为37℃12-18小时。
本发明的雌二醇快速时间分辨免疫层析定量检测试纸条灵敏度高，批内精密度可达10％，批间精密度可达15％。
附图说明
图1本发明试纸条结构示意图(1.塑料底板，2.Fusion5膜，3.PVDF膜，4.吸水纸，5.加样区，6.微球区，7.T线区，8.C线区)。
图2为本发明的试纸条的标准曲线。
图3为本发明所用多肽A和多肽B，以及分别针对雌二醇3号和6号位点得到A1：E2-3-MCPE-A，A2：E2-6-MCPE-A，B1：E2-3-MCPE-B，B2：E2-6-MCPE-B四种抗原电泳图。
具体实施方式
下面结合具体实施实例对本发明做进一步的描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。
实施例1试纸条各成分的制备
1.1质控微球的制备
向15mg醛基修饰的微球中加入0.5mg鼠IgG，补加0.1M CBS缓冲液(pH8.0，0.01％Na2CO3，0.5％NaHCO3)至总体积为500μL，旋转反应3h。12000rpm离心20分钟，弃上清，加入1mL封闭液(0.5％BSA，0.01％Na2CO3，0.5％NaHCO3)旋转反应1.5h，离心20分钟，弃上清，1mLMES缓冲液(0.05M pH6.0)重复洗涤两次，加入1mL MES缓冲液(0.05M pH6.0)重悬微球。
1.2检测微球的制备
1.2.1雌二醇单克隆抗体的制备
1.2.1.1雌二醇半抗原的制备
称取15mg雌二醇溶于1mL DMSO中，加入1mg无水碳酸钾和0.5mg-溴2-甲基丁酸乙酯，于65℃下搅拌反应，2h后将反应产物加入预冷的蒸馏水中得乳浊液，用0.5mL乙酸乙酯进行萃取，蒸馏水洗涤后使用无水NaSO4对萃取物进行干燥，于氮吹仪上进行吹干。将产物用1mL甲醇进行溶解，加入0.5mL 3mol/L NaOH溶液进行水解，待水解完全后逐滴加6mol/LHCl溶液，使pH至3.5，此时溶液析出大量沉淀，再次使用乙酸乙酯进行萃取，然后重复上述洗涤、干燥、氮吹步骤即得到雌二醇半抗原。
1.2.1.2雌二醇完全抗原的制备
将合成制得的雌二醇半抗原采用活泼酯法与多肽偶联制备完全抗原。用DMSO溶解18mg雌二醇半抗原，分别加入的7mg羟琥珀亚酰胺和10mg 1-(3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，搅拌反应4h后，将上述溶液缓慢加入35mg多肽的0.05mol/L PB(pH 7.4)溶液中，室温搅拌反应14h，将反应产物经Sephadex G-25凝胶层析柱纯化，吸收波长为278nm，纯化仪首先出现的为大分子蛋白峰，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白纯度，BSA法检测蛋白浓度。
1.2.1.3动物免疫
选用3只6～8周龄的SD大鼠，将免疫原雌二醇-多肽以生理盐水稀释，佐剂完全混合后经背部及双后趾皮下多位点注射大鼠，免疫剂量为100μg/只。初次免疫后的第14天和28天各加强免疫一次，剂量和方法同初次免疫。从第二次免疫后第7天尾静脉采血，用间接ELISA检测抗血清，待血清效价和特异性稳定后，进行抗血清的采集。
1.2.1.4微球包被雌二醇单克隆抗体
向15mg活化后的微球中加入0.5mg雌二醇单克隆抗体，补加0.1M CBS缓冲液(pH8.0，0.01％Na2CO3，0.5％NaHCO3)至总体积为500μL，旋转反应2h。12000rpm离心20分钟，弃上清，加入1mL封闭液(0.5％BSA，0.01％Na2CO3，0.5％NaHCO3)旋转反应1.5h，12000rpm离心20分钟，弃上清液，1mL MES缓冲液(0.05M pH6.0)重复洗涤两次，加入1mL MES缓冲液(0.05M pH6.0)重悬微球。
1.3微球溶液的配置
将质控微球和检测微球配制成时间分辨荧光微球混合液，质控微球终浓度为0.1mg/mL，检测微球终浓度为0.5mg/mL。
1.4检测线(T线)溶液的配制
用1OmM PB溶液将雌二醇抗原稀释成0.3mg/mL。
1.5质控线(C线)溶液的配制
用1OmM PB溶液将羊抗鼠IgG抗体稀释成0.3mg/mL。
实施例2试纸条的制备
2.1空白大卡粘贴
按照附图1的膜组合方式，PVDF膜3位于中间，Fusion5膜2与吸水纸4分别搭接于PVDF膜左右两端，粘贴在带有背胶的塑料底板上。
2.2喷膜
分别在图1中T线7、C线8位置喷上T、C线溶液，C、T线喷膜液量为1μL/cm；在图1中6位置喷上微球溶液，微球溶液喷膜量为5μL/cm。
2.3烘干
将步骤(2)中喷好试剂的大卡在恒温烘箱中37℃烘干18小时。
2.4切条
将烘干的雌二醇大卡切割成4mm宽度的纸条，即得到雌二醇试纸条。
实施例3试纸条的定量检测
2.5检测仪的应用
将含有雌二醇的鱼肉经预处理后，将检测样品放入样品检测池中，光源发出激光波长为375±5nm波长，穿过紫外石英玻璃检测池，样品吸收激发光后产生荧光，经聚焦透镜聚焦，再经光栅分光，得到波长为440±5nm的光，经光电倍增管将光信号转变为电信号，同时将电信号放大后输入A/D转换器，最后输出读数装置处理，记录数据。
3试纸条的定量检测
3.1绘制标准曲线
在制备好的雌二醇试纸条加样区中加入不同浓度的雌二醇抗原标准品(取五个不同的浓度，分别为0、1、5、25、50、100pg/mL，每个浓度设5个重复)，滴加上样缓冲液(PBS，含有1.6％BSA，0.1％Tween20，防腐剂)，膜层析10分钟以后，按2.5步骤仪器读取C、T线信号，实验结果及分析见图2。
3.2样品检测
在雌二醇试纸条加样区依次加入待测样品，加上样缓冲液，膜层析10分钟后，按2.5步骤仪器读取C、T线信号，根据步骤3.1的标准曲线计算检测样品雌二醇含量。
实施例4试纸条的性能
1.分析灵敏度
不大于1pg/mL。
2.线性范围
线性范围为1pg/mL-100pg/mL，通过最小二乘法的数学模型拟合线性，相关系数(r)不低于0.9900。
3.批内精密度
不大于10％。
4.批间精密度
不大于15％。
5.特异性
雌三醇、睾酮及孕酮对本试纸条的均无交叉反应。

Claims (9)

1.雌二醇快速时间分辨免疫层析定量检测试纸条，其特征在于：包括Fusion5膜、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜以及吸水纸三部分，PVDF膜位于中间，Fusion5膜与吸水纸分别搭接于PVDF膜左右两端，Fusion5膜上有加样区和微球区，微球区上有雌二醇单克隆抗体时间分辨免疫荧光微球和IgG时间分辨免疫荧光微球；PVDF膜上有检测线和质控线，检测线上包被雌二醇抗原，质控线上包被抗鼠IgG抗体，试纸底部设有塑料底板。
2.根据权利要求1的试纸条，其制备步骤如下：
(1)质控微球制备：用IgG包被荧光微球；
(2)检测微球制备：雌二醇单抗包被荧光微球；
(3)空白大卡粘贴：将PVDF膜粘贴在塑料底板中间，Fusion5膜与吸水纸分别搭接于PVDF膜左右两端；
(4)喷膜：将兔抗标记蛋白的荧光微球和雌二醇单抗的荧光微球采用缓冲液混合稀释到一定浓度喷到Fusion5膜微球区；雌二醇抗原和抗鼠抗体稀释后分别喷到PVDF膜的T线和C线位置；
(5)干燥及切条：将上述喷好试剂的大卡烘干、切条。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征还在于步骤(2)雌二醇单抗荧光微球制备步骤如下：
(1)雌二醇半抗原的制备。
(2)雌二醇完全抗原的制备。
(3)将上述雌二醇完全抗原免疫大鼠，得到雌二醇单抗。
(4)微球包被雌二醇单克隆抗体。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征还在于所述的步骤(1)：称取10-15mg雌二醇溶于0.5-2mL DMSO中，加入0.2-1mg无水碳酸钾和0.2-1mg 4-溴化丁酸酯类化合物，于50-80℃下搅拌反应，2-4h后加入预冷的蒸馏水，用0.5-2mL乙酸乙酯萃取，蒸馏水洗涤，无水NaSO4进行干燥，用于氮吹仪上吹干。1mL甲醇溶解产物，加入0.5mL2-4mol/L NaOH溶液水解，待水解完全后滴加2-6mol/L HCl溶液，调pH至3.5，再次使用乙酸乙酯进行萃取沉淀，然后重复上述洗涤、干燥、氮吹步骤2-4次。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征还在于所述的4-溴化丁酸酯类化合物为2、3位碳取代分别为甲基、甲氧基或全为甲基或甲氧基的1-8个碳链结构的酯类，所得半抗原的连接臂为一类醚化合物。
6.如权利要求3所述的制备方法，其特征还在于所述的步骤(2)：将雌二醇半抗原采用活泼酯法分别与多肽A、多肽B偶联制备完全抗原，所用多肽A分子量为1000-5000，不少于8个羧基的链式多肽，多肽B分子量为10000-20000，不少于16个羧基的链式多肽，分别针对3号和6号位点得到A1：E2-3-MCPE-A，A2：E2-6-MCPE-A，B1：E2-3-MCPE-B，B2：E2-6-MCPE-B四种抗原。
7.如权利要求3所述的制备方法，其特征还在于所述的步骤(3)：将雌二醇完全抗原B1、B2分别加入佐剂混匀后经背部及双后趾皮下多位点注射大鼠，免疫剂量为50-200μg/只，所得雌二醇单抗C3D2和G6B7。
8.如权利要求3所述的制备方法，其特征还在于所述的步骤(4)所述的单抗C3D2，G6B7分别连接微球或混合连接微球，C3D2∶G6B7＝(50-5)∶1。
9.如权利要求2所述的制备方法，其特征还在于步骤(4)稀释后检测微球终浓度为0.4-2mg/mL，质控微球终浓度为0.04-0.1mg/mL；T线抗原终浓度0.2-2mg/mL，C线抗鼠IgG抗体终浓度0.2-2mg/mL；C、T线喷膜液量为0.5-15μL/cm，微球喷膜液量为0.5-15μL/cm。
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