JP2004510968A - バイオチップ、生物材料を特定する光ルミネセンス方法並びにそれら方法およびバイオチップに使用する装置。 - Google Patents

Abstract

【課題】サンプル内の分子に標識付けすることなく、分子の結合を検出する。
【解決方法】一本鎖核酸配列と光ルミネッセンス材料をそれぞれの層に備えるセンサを使用する。一本鎖核酸配列が関心のある材料と結合するのに十分な時間にわたりセンサを生物サンプルにさらした後、センサからの光ルミネッセンスを測定することができる。分子の結合を標識付けすることなく検出する装置も提供される。標識付けすることのないセンサも提供される。抗原の結合を標識付けすることなく検出する方法とそれに関連するデバイスも開示されている。

Description

【０００１】
【発明の分野】
本発明は、概括的には核酸に関し、詳しくいうと一本鎖核酸をサンプル内の関心のある生物材料と結合しその材料を特定することに関する。
【０００２】
【発明の背景】
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）や蛋白質核酸（ＰＮＡ）等の核酸は生体の基本構成要素である。核酸は一般的に一定の構成要素、つまり塩基対から成る。これらの塩基対の配列の仕方は膨大である。核酸配列解析、つまり、核酸サンプルの塩基対を特定し配列を決定することは、重要な技術である。核酸配列の解読は、病気の診断、薬の設計や様々な生物構造の理解のために重要である。１９９６年以前は、遺伝子の塩基対の配列を１つづつ苦労して“読む”という伝統的方法であった。
【０００３】
１９９６年頃、アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）社が、ＤＮＡチップを使って同時にいくつかの塩基対を読み取れる大規模な並列（ｐａｒａｌｌｅｌ）配列読み取りを開発した。特定の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）断片の単層をピクセル（〜１−１００μｍ^２）の配列上に集める。ｓｓＤＮＡのタイプはピクセル毎に異なってもよい。これらのｓｓＤＮＡ断片は“化学的なピンセット”のように働き、特定の相補的に標識付けられたｓｓＤＮＡをサンプルから選び、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を形成する。つまり、ハイブリダイゼーションが起きる。ｓｓＤＮＡプローブ断片にさらす前にサンプル内のＤＮＡに蛍光ラベルすることによって、ハイブリダイズされる領域を観測する。そのプロセスは、単一塩基対の方法よりもスピーディで、具体的で、複数のヌクレオチド配列を分析可能で、何百もの遺伝子配列とそれらの変化を同時に処理可能で、有利に小さいチップを使う。並列配列読み取り技術の実用的な応用としては、癌（特に乳癌）のｐ５３遺伝子異常（変異）のアフィメトリクス社の研究、細胞の急激な増殖時のＤＮＡ配列の変化についてのメルク（Ｍｅｒｃｋ）社の研究（腫瘍形成の理解のため）、Ｉｎｃｙｔｅ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社の薬の設計のための特定の病気のチップ、がある。また、大規模に並列で、早く、感度が高く、正確なバイオチップ方法はヒトゲノムプロジェクトを促進するかもしれない。
【０００４】
しかしながら、アフィメトリクス社のアプローチは、未知の、配列を読み取られるＤＮＡを、蛍光色素で標識付けするため、サンプルを変えてしまうので、他のテストに再利用することが通常不可能となってしまう。また、アフィメトリクス社のチップはピクセル毎に、少なくとも約５％のエラーが生じるため、エラー分を補うため、チップは繰り返されるピクセルを多数含む。アフィメトリクス社のチップの製造プロセスは高価であり、リソグラフィーの技術を必要とする。
【０００５】
ＤＮＡ配列読み取りや他の蛋白質の識別技術、特に早い並列アプローチは、重要な実用的応用ができる。病気の診断、薬の設計、遺伝子や癌の検診、遺伝子コードの解読や機能の研究（変異、遺伝子表現等）、様々な生体の理解、犯罪調査などである。ＤＮＡ配列読み取りや他の蛋白質配列読み取り技術の進歩は近年のことであるので、配列読み取りの結果を待つ技術者に、制限をかけたり遅延させたりしている。
【０００６】
ＤＮＡ配列読み取りや他の蛋白質配列読み取りに依存する仕事をする人々にとって、速い読み取り、簡略化した読み取り、および／または、正確さと厳密さの向上は役立つであろう。また、例えば、患者の癌が最終的には進行するのか、どの位の速さで人体が特定の抗癌剤を分解するか、をチェックする、医者の診療室で使える小さなポータブルの装置が、一般的に関心を集めてきている。これら全ての応用のため、いくつかの特定遺伝子（低濃度）のための小さいサイズのサンプルを核酸分析できる道具が強く求められているが、従来は提供されていない。むしろ、従来のバイオチップ方法は、残念ながら、サンプルの標識付けおよび他の不都合（製造方法が高価である、ピクセル当たりの断片の数が不確かである、等）を伴う。
【０００７】
【発明の概要】
それゆえ、本発明の目的は、サンプルに標識付けする必要がなく、核酸分子のハイブリダイゼーション状態を分析する、方法と製品を提供することにある。本発明は、ＤＮＡ配列等の未知の核酸の配列分析に使うことができる。いくつかの遺伝子を同時に調べることができる。本発明の配列読み取りは、比較的簡単で速く、正確で厳密な配列情報を提供する。本発明は、溶液内で１または複数の特定の核酸断片（遺伝子等）を同時に分析するためのバイオチップおよびその他の製品を提供する。
【０００８】
本発明のこれらの目的およびそれ以外の目的を達成するために、好ましい実施例において、本発明は、分子の結合を検出する標識付けなしの方法であって、Ａ一本鎖核酸配列を含む第１の層と、光ルミネセンス材料を含む第２の層とを含むセンサを準備するステップと、Ｂ前記一本鎖核酸配列が生物サンプル内で関心のある材料と結合するのに十分な時間にわたり前記センサを前記生物サンプルにさらすステップと、Ｃ前記センサを光にさらし前記センサからの光ルミネセンスを測定するステップとを含む方法を提供する。特に好ましいこの発明の創意に富む標識付けなしの方法においては、測定ステップは、２００−７００ｎｍの範囲の波長の紫外線が第１の層にあてられたとき第２の層からの光ルミネセンス光を感知することを含む。特に好ましい実施例において、あてられる紫外線の波長の範囲は２６０‐２６５ｎｍである。特に好ましい実施例において、第１の層は第２の層の第１の側に位置し、測定するステップは第２の層の第２の側からの光ルミネセンスを測定する。もう一つの実施例において、第２の側は第２の層上の第１の層の反対側である。さらにもう一つの好ましい実施例においては、前記第１の層は第２の層の第１の側に位置し、前記測定するステップは前記第２の層の前記第１の側から反射する光ルミネセンスを測定する。
【０００９】
もう一つの好ましい実施例において、本発明は、一本鎖核酸配列を含む第１の層と、光ルミネセンス材料を含む第２の層と、を備える標識付けなしのセンサを提供する。
【００１０】
さらにもう一つの好ましい実施例において、本発明は、光源と、核酸の層と光ルミネセンスの層とをもつセンサと、光ルミネセンス検出器とを含む、分子の結合を標識付けなしで分析する装置を提供する。特に好ましい実施例においては、光源は紫外光線源、赤外光線源、または可視光線源である。他の特に好ましい実施例において、検出器は、赤外線から紫外線の範囲の光の検出器である。紫外光線源が使われるとき、紫外光線源は特に好ましい実施例においては、２６０−２６５ｎｍの範囲の紫外線を提供する。
【００１１】
もう一つの好ましい実施例において、本発明は、光ルミネセンス材料で一本鎖核酸配列に接触することを含む、標識付けなしのセンサを作る方法を提供する。このような創意に富む方法の特に好ましい実施例は、基板上に光ルミネセンス材料を設け表面を形成し、その後、金属塩とのイオン交換によってその表面を改質し、イオンを埋め込み、イオンを埋め込んだ材料を反射媒体にさらして光ルミネセンス粒子を作ることを含む。
【００１２】
上記方法、製品および装置において、本発明の特に好ましい実施例は、一本鎖核酸として、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはＰＮＡを使う。特に好ましい実施例において、第１の層はｓｓＤＮＡ単層を備える。特に好ましい実施例において、センサは、第２の層にグラフトされた前記第１の層としてｓｓＤＮＡを含む。
【００１３】
好ましい実施例において、核酸配列は、５塩基対から２００塩基対の間である。特に好ましい実施例において、その配列は約２５塩基対である。他の特に好ましい実施例は、前記第１の層の異なる部分に異なる核酸配列を含備える連続の第１の層を提供する。
【００１４】
本発明のさらにもう一つの好ましい実施例は、抗原の結合を検出する標識付けなしの方法であって、Ａ抗体を含む第１の層と、光ルミネセンス材料を含む第２の層とを備えるセンサを準備するステップと、Ｂ前記抗体が生物サンプル内で関心のある抗原と結合するのに十分な時間にわたり前記センサを前記生物サンプルにさらすステップと、Ｃ前記センサからの光ルミネセンスを測定するステップとを含む方法を提供する。特に好ましい実施例において、第１の層は不連続であり異なる抗体を含む。
【００１５】
もう一つの好ましい実施例において、本発明は、光源と、抗体を含む第１の層および第２の光ルミネセンスの層をもつセンサと、光検出器と、を備える、抗体の結合を標識付けなしで分析する装置、を提供する。
【００１６】
さらに、本発明の他の好ましい実施例は、抗体を含む第１の層と、光ルミネセンス材料を含む第２の層と、を備える標識付けなしのセンサを提供する。特に好ましい実施例において、第１の層は不連続であり、異なる抗体を備える。他の特に好ましい実施例において、異なる既知の抗体が含まれる。
【００１７】
上述の発明の方法、製品および装置のさらに詳細な実施例は、以下の通りである。
【００１８】
本発明の他の特に好ましい実施例は、第２層において、芳香族ポリマー、ドープした、または、ドープしてない金属酸化物、硫化物、セレン化物、ヒ化物、テルル化物、および／または、窒化物と燐化物のナノ複合材料を使う。他の好ましい実施例において、第２の層は、マトリックス材料を備えてもよく、前記光ルミネセンス材料は前記マトリックス材料と関連づけられている。さらに好ましい実施例において、前記光ルミネセンス材料が前記マトリックス材料に埋め込まれる。特に好ましい実施例において、第２の層はポリスチレンを含む。特に好ましい実施例において、第２の層はポリマーマトリックス内に光ルミネセンス粒子を備える。さらに好ましい実施例において、光ルミネセンス粒子は、第ＩＩ族および第ＶＩ族からなる群から選ばれたドープされた、またはドープされていない化合物である。他の好ましい実施例において、そのような化合物として、ドープされた、または、されていない硫化亜鉛を使う。他の特に好ましい実施例において、第２の層は、ナノ複合材料を備える。さらに好ましい実施例にいて、第２の層は、薄膜または支持体を備える。他の好ましい実施例において、第２の層は、ポリマーを備える。他の好ましい実施例において、第２の層は、２００‐７００ｎｍの範囲の波長の光に励起されると蛍光発光する。
【００１９】
【好ましい実施例の詳細な説明】
第１の好ましい実施例において、図１に例示したとおり、本発明は核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＰＮＡ等）や蛋白質の配列分析を標識付け（蛍光色素標識等）なしに達成し、標識付けなしの塩基配列決定に有用な製品および装置を提供する。分子の一本鎖核酸配列との結合を従来の標識付けを使わずに検出できる。本発明は、光ルミネセンスである材料を使い、その材料は、あらゆる波長で光る（ｇｌｏｗ）、または光子により発光する（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅ）材料を広く含む。本発明では、光をあてるが、あてる光には、制限はなく、紫外線、可視光線、赤外線、またはそれ以外の光である。
【００２０】
そのような標識付けなしの方法の発明の一実施例において、既知の配列の一本鎖核酸材料が与えられる。その一本鎖核酸材料は例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡである。一本鎖核酸材料の配列の長さは、どの位の長さでもよく、好ましい例では２５ｂｐであるが、５〜２００ｂｐの幅でよい。
【００２１】
本発明による検出システムの例である図１を参照すると分かるように、測定または観測１００は、ある既知の一本鎖核酸にのみ行われてもよい。数値の測定は必ずしも必要ではないが、較正測定または観測の範疇であるベースラインの測定は、本発明の範囲内である。本発明は、（絶対的というよりは）差の測定または観測である。実施例によっては、測定または観測１００は省略できる。
【００２２】
測定／観測１００の後、その既知の一本鎖核酸の配列を、生物材料サンプルにさらす。そのサンプルは、その既知の一本鎖核酸配列に対し補補的な材料をその中に含むかにつき情報が望まれている生物材料を含むサンプルである。例えば、サンプルは、アイデンティティが未知の変性ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＰＮＡを含んでもよい。
【００２３】
サンプルを一本鎖核酸に接触させるため、既知の方法、例えば、一本鎖核酸をバイオチップの上に置き、ピペットで少量のサンプルの溶液をバイオチップのくぼみに入れる方法、が用いられてもよい。生物サンプルを既知の一本鎖核酸材料と接触する際の条件は、生物サンプル内で、一本鎖核酸材料を少なくとも１つの蛋白質またはヌクレオチドと結合し、複合体、つまり、ハイブリダイゼーション条件を形成する条件である。ハイブリダイゼーション条件は当業者には知られている。このように一本鎖核酸の配列を生物材料にさらすと、相補的材料が生物サンプルに含まれていれば、結合、ハイブリダイゼーション、複合体の形成が起こる。温度や塩濃度を変えることによって、ハイブリダイゼーション条件を効果的にするソフトウェアが知られている。
【００２４】
このようにさらした後、（もしあれば）光ルミネセンスの変化を観測または測定するため、観測または測定２００が行われる。例えば、一本鎖核酸をバイオチップの上に設けたとき、一本鎖核酸と二本鎖核酸が異なって吸収する波長の光でバイオチップが照射されてもよい。さらす過程で何が起きたかにより、変化なし２１０が測定／観測されるかもしれないし、変化２２０が測定／観測されるかもしれない。変化なし２１０となったならば、サンプルは、既知の一本鎖核酸配列と結合するのに十分な相補的材料に欠けていたということである。
【００２５】
変化２２０が見られたならば、サンプル内の十分な相補的材料が、既知の一本鎖核酸配列と結合したということである。既知の一本鎖核酸配列のアイデンティティから、結合した相補的材料のアイデンティティが推測できる。変化２２０の量は、一本鎖ＤＮＡと生物材料間の相補性の程度によって、変化する。変化２２０は、光ルミネセンスの変化の作用であり、それは一本鎖ＤＮＡの底の支持体から測定できる。サンプルからのより多くの生物材料が一本鎖ＤＮＡに結合すると、検出可能な発光に、より大きな違いが生じる。これは核酸の物質的特徴が、一本鎖の状態と結合した状態との間で変化したことによる。
【００２６】
本発明の好ましい実施例において、既知の一本鎖配列は基板、プローブ、バイオチップまたはその他の固体の上に置かれ、生物サンプルは液体の状態で、その固体と接触する。本発明の他の実施例において、未知の、または配列を読み取られる、生物材料は、基板、プローブ、バイオチップまたはその他の固体の上に置かれ、光ルミネセンス材料と結びついた既知の一本鎖核酸配列を含むセンサ粒子から成る液体プローブに接触する。
【００２７】
本発明の方法や製品は、核酸分子（ＤＮＡやＲＮＡやＰＮＡ等）または他の蛋白質の配列を読み取るために使われてもよい。例えば、１または複数の特定のＤＮＡ断片（例えば遺伝子）でアイデンティティと配列が未知であるものを、分析してもよい。試される生物サンプルの材料に、特に限定はなく、いかなる核酸、または蛋白質を含む生物材料（血、組織、切った爪等）でもよい。血などの未処理の生物材料は、同業者に既知の方法で、テスト可能な断片に処理され、溶液に入れられる。
【００２８】
本発明で使われる一本鎖核酸配列はその使われる形態に特に限定はなく、単層等の形態が使われてもよい。特に単層は好ましい。
【００２９】
好ましい実施例において、本発明の一本鎖核酸は、光ルミネセンス材料と結合している。グラフトによる結合が好ましい。“グラフト”は、一本鎖核酸の一部を光ルミネセンス材料に共有結合（例えば、リジンまたはヒスチジンのアミノ酸連鎖による）でもよいし、光ルミネセンス材料の上の物理吸収でもよいし、一本鎖核酸の一部が自由に関心のある他の生物材料と結合する様に、一本鎖核酸と光ルミネセンス材料を結合させる、他の結合でもよい。光ルミネセンス材料の例は、限定はなく、光学活性薄膜、芳香族ポリマー、または金属酸化物やマンガンをドープした硫化亜鉛等の硫化物を含むマトリックス材料でもよい。
【００３０】
限定のない例として、一本鎖核酸の単層が光学活性薄膜にグラフトされる実施例において、一本鎖核酸の単層が光にされされたとき、結合した光学活性薄膜から出る光の量は、一本鎖核酸の層による吸収による。一本鎖核酸の層が相補的分子と接触すると、一本鎖核酸の層は相補的分子と結合する。特に、ｓｓＤＮＡはｄｓＤＮＡになる。一本鎖核酸の結合は、結合する光ルミネセンス材料からの蛍光発光の強度に変化をもたらす。ｓｓＤＮＡが一本鎖核酸配列として使われていると、観測されるｓｓＤＮＡの蛍光強度は、ｄｓＤＮＡと２６０ｎｍ異なる（ｓｓＤＮＡの吸収はｄｓＤＮＡに比べ高いため）。蛍光強度は、結合した形態（変化してできるｄｓＤＮＡ等）のほうが高く、この蛍光強度を観測することで、テストされるサンプル内の相補的配列の存在を確認できる。
【００３１】
本発明の好ましい材料として、例えばｓｓＤＮＡに結合する光ルミネセンスの層としてポリスチレンを使うと、ｓｓＤＮＡがｄｓＤＮＡになるとき、光ルミネセンス強度の違いは約２―４％のみであり、強度の観測は特に劇的なものではない。しかしながら、本発明により、２６０〜２６５ｎｍでは、吸収が変化するだけでなく、屈折率が変化し、それにより、反射率が変化するという重要な確認ができた。以下の理由により、ＤＮＡに結合したポリスチレンに届く光の量は、２００％もの変化もする。
【００３２】
ＤＮＡは通常２６０〜２６５ｎｍの範囲（紫外線）で吸収し、（結合してない）一本鎖核酸の上層にその放射が当たることにより、放射の吸収、反射および散乱が起こる。当てられた光の残りは、光ルミネセンス材料（ポリスチレン等）の中に移り、異なる長さの波長で放射する。例えば、ポリスチレンの光ルミネセンスは約３２５ｎｍである。しかしながら、一本鎖核酸が結合して二本鎖になると、核酸は異なる量の励起波長を吸収、散乱、反射するため、光ルミネセンスの底の層による放射の量は、結合前の場合と異なってくる。それにより、光ルミネセンス材料の出す光ルミネセンス強度は異なる。屈折率が変化し、それにより反射率が変化する。光ルミネセンス材料の底に届く光の量は２００％かそれ以上変わるかもしれない。これは主に屈折率の変化により、これにより、反射率が変化し、光ルミネセンスの層への励起光に大きな変化をもたらす。このように、核酸配列に結合した光ルミネセンス材料からの光の量を調べると、核酸配列が結合する前と後では劇的な違いが生ずることがわかる。
【００３３】
本発明の例示的形態のバイオチップデバイスの一部が、図２Ａに示されている。図２Ａのデバイスにおいては、光学活性層２がナノ複合材料または光ルミネセンスポリマー等の光ルミネセンス材料を含み、この図２Ａのデバイスは以下のように使われる。光ルミネセンス材料であるナノ複合材料をマトリックス材料の中に入れ、マトリックス材はオプションとして励起波長で光ルミネセンスされてもよい。図２Ａの部分拡大図である図２Ｂにおいて、層３を構成する各一本鎖核酸配列が３ａである。発明によるデバイスを使う一例として、図２Ｃを参照すると、デバイスは一本鎖核酸の層３に相補的な生物サンプル材料にさらされ、一本鎖核酸３ａがサンプル内で相補的配列３ｂと結合して二本鎖核酸の形態３３になり、光ルミネセンス層への入射光（励起光）が変化する。光ルミネセンス層への入射項の変化は、ＤＮＡの層が一本鎖から二本鎖になるときの、ＤＮＡの反射率、吸収、散乱の変化によって起きる。つまり、一本鎖から二本鎖になる結合の結果、放射される光ルミネセンス光の強度が変化する。この放射される光ルミネセンス光の強度の変化は、ＣＣＤカメラを介した共焦点顕微鏡や、ファイバーオプティクス等によって記録できる。集積光学によりアプローチすると、溶液内でのハイブリダイゼーションの間、オンライン測定が可能である。本発明のオンラインでの実施例は、いくつかの遺伝子を同時に調べるために使われてもよい。
【００３４】
好ましい実施例において、図２Ａによるデバイスを使う例では、デバイスの上の一本鎖核酸として既知の配列のｓｓＤＮＡを使い、様々な未知の核酸断片の溶液にデバイスを浸す。デバイス上のｓｓＤＮＡに相補的な塩基が溶液内にあれば、ハイブリダイゼーションが起き、デバイス上のｓｓＤＮＡはｓｓＤＮＡからｄｓＤＮＡになる。本発明は、ｓｓＤＮＡがｄｓＤＮＡになるかを調べて、生物サンプルの溶液内に、特別な遺伝子（デバイス上の既知のｓｓＤＮＡに相補的な）が存在するかを決定する。サンプルに接触したデバイスの光ルミネセンスを読み取った後、サンプルからの結合したあらゆる材料は同業者に既知の技術を使い緩めることができ、他のテストや応用に使うことができる。
【００３５】
本発明による調査は、図３に示すように、光ルミネセンス光の変化の測定であり、それは図１の発明の方法や図２Ａの発明のデバイスでの吸収に関係する。図３を参照すると、Ｉ_０は２６５ｎｍの波長（名目上（ｎｏｍｉｎａｌｌｙ）ＤＮＡの吸収の最大値）における入射紫外線の強さである。紫外線が光ルミネセンス材料２の層により吸収されると、光ルミネセンス粒子がＩ_１、Ｉ_２またはＩ_３の強さ（グラフトＤＮＡ（すなわち、少なくとも１つの共有結合により表面上に固定されたＤＮＡ）がない場合の強さ）の可視光線を出す。ΔＩ＝Ｉ_２−Ｉ_３が測定されたら、ハイブリダイゼーション反応が起きている。ΔＩは溶液内でその場で（ｉｎ−ｓｉｔｕ）起きる。なぜなら、溶液による吸収によってＩ_０はコンスタントに弱まり、可視光線のＤＮＡや溶液による吸収は取るに足らない。
【００３６】
図２Ａに示されたデバイスの、ファイバーオプティクスモードの調査が図３Ａ、３Ｂ、３Ｃに示されている。図３ＡのＩ_１は光学活性な層２からの光ルミネセンスの強さであり、本例において、光学活性な層２は入射紫外線Ｉ_０に対するナノ複合材料である。ｓｓＤＮＡ３（図３Ｂ）を置くと出力される強さはＩ_２に弱まり、これがナノ複合材料である光学活性な層２に入射する紫外線の強さを更に弱める。その結果、図３Ｃによるデバイスの光ルミネセンスの強さはＩ_３である。関連シグナル（ｒｅｌｅｖａｎｔ ｓｉｇｎａｌ）はΔＩ＝Ｉ_２−Ｉ_３である。
【００３７】
図２Ａのデバイスはオプションとして、エンドユーズに応じて、反射率を高めるために金の層４等の反射率の高い層を含んでもよい。オプションの反射する層は、好ましくは、非酸化材料から成るとよく、金が好ましい。例えば、図２Ａに見られるように、反射モードにおいて、反射率の高い金の層４が、デバイス上側の光ルミネセンス材料によって生じた可視光線を屈折させる。トランスミションモード（デバイスの本来の特性である）において、図２Ａの金の層４は削除されてもよく、可視の光ルミネセンス光がサンプルの逆側で検出できる。ファイバーオプティクスモードにおいて、金の層４は必要ではない。
【００３８】
本発明による配列の読み取りは、テストされるＤＮＡに標識を付けずに達成することもできることがわかろう。標識を付けずに、刺激にさらされる“前”“後”のＤＮＡの構造を調べる。例えば、紫外線による遺伝子の変異は、既知のＤＮＡチップによって分析できる。本発明は、変異プロセスの速度、変異の位置を調べ、そして重要なことは、（薬が存在するならば）特定の変異プロセスの抑制または加速への薬物作用の役割を評価することができる。
【００３９】
もう一つの実施例において、本発明によるＤＮＡ配列の読み取りにオンラインの集積光学が使える。このような構成で、デバイスを溶液に浸して、特定の遺伝子配列のアイデンティティとそのハイブリダイゼーションの速度を測定する。
【００４０】
更なる実施例において、本発明は、物理的または化学的処理の“前”“後”のＤＮＡを調べるために使うこともでき、これは特に薬の設計への応用に役立つだろう。
【００４１】
ＤＮＡ遺伝子配列の読み取りの応用や他の上記応用に加え、本発明の光ルミネセンスの実施例は、標識付けの方法でのデバイスには不可能である応用に使える。さらに、本発明による調査は広範囲のデバイスでよいので、高い精度や感度で一本鎖核酸断片の混合から既知の配列を分離するために使われてもよい。本発明のセンサはオンラインで作られてもよいので、本発明のセンサを、ＰＣＲのオンライン・センサとして応用してもよい。
【００４２】
本発明の実施に使われる既知の一本鎖核酸配列を備えるデバイスは、図４Ａから４Ｄに示された方法などによって簡単に作ることができる。本発明によるデバイスの例は、プローブ、バイオチップ、標識付けなしの配列読み取りに有益なその他の製品である。
【００４３】
本発明では既知の一本鎖核酸配列が使われるが、その配列の長さは約５塩基対から約２００塩基対が好ましく、２５塩基対の配列が最も好ましい。
【００４４】
本発明の例としてのデバイスを作るために、（好ましくは既知の配列である）一本鎖核酸配列は光ルミネセンス材料に結合してもよい。核酸の結合の技術は、同業者は知っているが、グラフト、固定、イオン結合、共有結合、吸収、ファン・デル・ワールス力など、限りがない。好ましい結合は、核酸配列と光ルミネセンス材料の共有結合である。核酸と光ルミネセンス材料を直接結合してもよいし、リンカーや接着を促進するもの等により、核酸と光ルミネセンス材料を間接的に結合してもよい。
【００４５】
本発明の好ましい例において、一本鎖核酸は基板１の上に直接または間接に置かれる（図２Ａ）。なお、この基板には特に制限はない。基板は反射または非反射どちらでもよいが、非反射の基板が好ましい。基板１に特に制限はなくエンドユーザのプローブ方法に応じて選んでよい。基板を本発明において必ずしも使わなくてもよい。
【００４６】
本発明の、光ルミネセンス材料は、それが結合するＤＮＡの層が一本鎖から二本鎖の核酸配列になると、光学活性が異なるものが使われる。本発明で使う光ルミネセンス材料は、それが結合する一本鎖核酸配列が非結合であるときと結合したときで、異なる光学的反応をもつ材料であればよい。そのような光ルミネセンス材料の例としては、ポリスチレンや他のポリマー等の芳香族分子である（全ての芳香族ポリマーは光ルミネセンスの現象を示す）。本発明のデバイスで使われる光ルミネセンス材料は、生物サンプル材料に光ルミネセンスの標識付けの必要がない。本発明で使う光ルミネセンス材料（ポリマー等）としては、一本鎖核酸と結合したときと、二本鎖核酸と結合したときで、異なる光ルミネセンスが観測されるものが選ばれる。光ルミネセンス材料としては、核酸に結合した光ルミネセンス材料からの蛍光発光の強度に基づきＤＮＡが一本鎖から二本鎖へなると、ＤＮＡの光学的性質（複素屈折率等）が変化するものが好ましい。本発明で使う光ルミネセンス材料の好ましい例は、ポリスチレンである。ポリスチレンがｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡと結合した場合、ｓｓＤＮＡの吸収はｄｓＤＮＡに比べ２６０ｎｍ高く、蛍光発光の強さから観測できる。
【００４７】
光ルミネセンス材料は、ナノ複合材料、サブミクロンからナノスケールの光ルミネセンス粒子が付いた薄膜、ポリマーマトリックスに存在する光ルミネセンス粒子、または、その他の光ルミネセンス材料でよい。
【００４８】
本発明のナノ複合材料は好ましくは、光ルミネセンス粒子を封じ込めるポリマーマトリックスを備えている。光ルミネセンス粒子を封じ込めるポリマーマトリックスは、湿ってないのが好ましい。意図した核酸結合ではない核酸の吸収が起きないようにである。
【００４９】
しかしながら、表面は、制御された核酸のグラフトのため、選択的に改質されてもよく、単位面積当たりの分子密度が調整できる。結合の深さは、好ましくは、隣り合う鎖とのもつれを避けるのに十分である程度に、そして、溶液内の速いハイブリダイセーションに十分なだけ鎖に運動性を持たせるのに十分である程度に浅い。好ましくは、その深さは、核酸の層が一本鎖から二本鎖になると核酸の層の複素屈折率に大きな変化がみられるのに十分な程度に深いとよい。ポリスチレンはこれらの基準を満たす。
【００５０】
本発明のデバイスを作る好ましい作製方法には、ナノ複合材料作製、セルフアライメント作製、ナノ粒子・ナノアレイ作製、ポリマーブロブ／ナノ粒子作製がある。
【００５１】
ナノ複合材料の作製方法の例は以下の通りである。図４Ａに示すように、ナノ複合材料膜を硬い基板（石英やガラス等）の上に置く。図４Ｂに示されるように、なめらかなナノ複合材料膜を置くには、その場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）３ステップを使う。適切な金属塩とのイオン交換によって表面が改質される。次に、イオンは続いて埋め込まれ、反射する媒体にさらされて光ルミネセンス粒子を形成する。粒子が埋め込まれる間に、ポリマーの表面は再生される。その結果の構造は図４Ｂに示される。図５は、図４Ｂに対応し、かつ、本発明による、ナノ複合材料の構造の原子間力顕微鏡写真である。表面は、１×１μｍをタッピングモードで調べた。トポグラフィ（コントラストは高い）とダンピング（コントラストは局部的に硬い）のである。３タイプのサンプルを比較すると、粒子が形成され、バルクにおいてイオンの拡散なしにスルホン化が起きるときに比べ、埋め込まれた粒子は小さいことが明らかにわかる。ダンピング‐マップにおいて、埋め込まれたサンプルのほうがコントラストが弱いということは、粒子が内側に拡散し表面は全てポリスチレンであることを示す。
【００５２】
図４に戻る。図４Ｂに示された再生された表面（ポリスチレンの表面等）は、次に、選択的に改質される。改質のプロセスは、（ｉ）選択的（ｉｉ）機能表面の密度が調整可能（ｉｉｉ）ＤＮＡの３’または５’末端をグラフトする機能をもつ、というプロセスであると好ましい。シンプルなプラズマ表面改質やスタンダードなウェット表面改質は同業者に知られているが、どちらも、本発明の表面の処理に使うことができる。
【００５３】
図４Ｃと４Ｄを参照すると、機能化したエリアにｓｓＤＮＡ溶液を置くとＤＮＡグラフトが起きる。図６に見られるように、異なるｓｓＤＮＡの水滴を置くとセルフアライメントが起きる。なぜなら機能化した極性のエリアが非極性のエリアに囲まれるからである。図６Ａと６Ｂは本発明による選択的に改質されたポリスチレン表面の光学顕微鏡写真である。完全に改質できるよう、処理は９０秒間行った。サンプルを水に浸し、風で過剰な水をとばすと、水滴が形成された。スケールインディケイターは１ｍｍである。
【００５４】
セルフアライメント特性はデバイス作製のコストを抑えるために重要である。例えば、２５×２５ｍｍの基板上に１ｍｍの周期で１００×１００μｍのフィーチャができれば、６００をこえる結合が同時に作られる。このような形成は、マイクロエレクトロニクス製造に公の、既存のディスペンシングシステムやマイクロピペッティングによって形成される。前者が特に好ましい。なぜなら、１００秒未満で６００の形成ができ、信頼性があるからである。図４Ｄは、結果として得られた、ｓｓＤＮＡ−１とｓｓＤＮＡ−２という２つの異なるタイプのｓｓＤＮＡの部分をもつ表面を示している。
【００５５】
図４はこのように、本発明による、その場ナノ複合材料形成を示す。まず、非常になめらかなポリスチレン膜を基板上に置く。そして、膜は３ステップを経て光ルミネセンス粒子を生成し、ＺｎＳ：Ｍｎ粒子を生成する。表面は再生され、表面にポリスチレンが生成される。膜は同様の表面改質にさらされ、５’または３’末端にそれぞれ結合する、酸性あるいは塩基性の部分をもつ表面が機能化される。
【００５６】
図２Ａに見られるように、基板１の上に、オプションとして金電極４が与えられる。電極４の形成後、ポリマーと光ルミネセンス粒子を含むナノ複合材料が基板１と電極４の上に形成される。ポリマーと光ルミネセンス粒子の溶液が使われてもよい。光ルミネセンス粒子の例としては、紫外線（約２６５ｎｍの波長）にさらされたとき、マンガンをドープした硫化亜鉛（ＺｎＳ：Ｍｎ）の可視光線（緑等）を出す粒子が言及されてもよい。
【００５７】
光学活性な層２としてナノ複合材料が使われる例において、ナノ複合材料は基板上に形成される。図１を参照すると、ｓｓＤＮＡ３はナノ複合材料にグラフトされる。ナノ複合材料表面が改質され、ｓｓＤＮＡの選択的グラフトがその上でできると、好ましい。選択的な改質をすると、ｓｓＤＮＡの大きな結合のチップを作製でき、これは、シンプルなマイクロピペットディスペンシングとともに使用できる。
【００５８】
グラフト前の選択的表面改質の後、ｓｓＤＮＡ３の層は、機能化していない有機化合物等の適切な結合のリンカーによってグラフトされ、片方の末端は（表面が改質した）ポリスチレン表面と反応し、もう片方の末端はｓｓＤＮＡの３’または５’末端に結合する。このような有機化合物の例は、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．（セントルイス、ミズーリ州）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（ユージーン、オレゴン州）から入手可能である。
【００５９】
好ましくは、機能化のグループは選択性を達成するため高い極性である。ポリマー表面の分離した領域を機能化することにより、ｓｓＤＮＡはこれらの領域に限り“局部的に”グラフトが可能である。好ましくは、これらの領域は、改質された異なる表面領域の異なるｓｓＤＮＡ配列をマイクロピペットするのに便利なように、約１００×１００ミクロンである。このように、様々な配列の既知のｓｓＤＮＡを基板１の上に配列することができる。機能化された表面は極性が高く、ポリマー（ポリスチレン等）は非極性なので、ＤＮＡ溶液は表面張力により機能化した領域の上でセルフアライメントする。
【００６０】
光学活性なポリマーの支持体にグラフトするｓｓＤＮＡ３は、既知である。好ましい実施例において、ｓｓＤＮＡ３は主としてｓｓＤＮＡの単層を含む。既知の、グラフトしたｓｓＤＮＡ３の層は、サンプル内の未知のｓｓＤＮＡとハイブリダイゼーションする等、サンプル内の分子と結合ができる。出力される可視光線の量は、ＤＮＡの層が一本鎖から二本鎖になるとＤＮＡの層の反射率の変化とともに、短調に増加する。ｓｓＤＮＡからｄｓＤＮＡになると複素屈折率が変化するとともに、反射率も短調に増加する。
【００６１】
図１を参照すると、完成した構造は２つの活性層からなる。グラフトしたｓｓＤＮＡ３である上の層が、光ルミネセンス粒子からなる光学活性な層２であるナノ複合材料の上にある。基板１と他の構造の特性は、反射モードやトランスミションモード等、エンドユーザのプローブ方法による。
【００６２】
本発明の他の例において、図１のデバイスの光学活性な層２は、ナノ複合材料ではなく、光ルミネセンスポリマーである。そのようなデバイスは、ｓｓＤＮＡの単層がポリマー薄膜にグラフトした、２層構造であってもよい。ポリマー薄膜は、紫外線領域、好ましくは２６５ｎｍ波長付近、の放射によって励起されたとき、蛍光発光する光学活性なものでもよい。例えば、膜は、ポリスチレンでもよい。意図するエンドユーズのプローブの応用に応じて、膜は、適切な基板上に配置されてもよい。デバイスが紫外線（〜２６５ｎｍの波長）にさらされるとき、光活性なポリマー膜が光を出し、デバイスは、上述のように、光学活性な層２がナノ複合材料であるデバイスが使われる。
【００６３】
図７は、本発明のデバイスにおいて使用したときの、様々な条件でのポリスチレンからの典型的な蛍光発光のスペクトルを示している。低強度の暗曲線はｓｓＤＮＡの単層で覆われたポリスチレンのルミネセンススペクトルである。ｓｓＤＮＡがｄｓＤＮＡになると、シグナルは強くなる。ピークの強さは高くなり、ピークの位置は赤方偏移する。ｓｓＤＮＡがｄｓＤＮＡになる前と後の蛍光発光の強さの違いはコントラストといえる。図７に示される典型的なコントラストは、顕著であり、ｓｓＤＮＡがｄｓＤＮＡに変わったといえる。出力された光の強さの変化（つまりコントラスト）は、様々な方法で記録できる。例えば（ｉ）ＣＣＤカメラを介した共焦点顕微鏡および／または、（ｉｉ）ファイバーオプティクス方法等である。ファイバーオプティクス集積光学によりアプローチすると、溶液内でのハイブリダイゼーションの間、オンライン測定が可能である。
【００６４】
光ルミネセンスポリマーを含むデバイスの作製は、以下の通りである。表面改質方法は、ポリマー表面でｓｓＤＮＡを選択的にグラフトするために使われてもよい。特に、選択的に改質すれば、シンプルなマイロピペットディスペンシングを使って、ｓｓＤＮＡの大きな結合をもつチップの作製ができる。図２Ａを参照すると、構造は２つの活性層からなる。グラフトしたｓｓＤＮＡである上の層が、本実施例では蛍光ポリマーの層である光学活性な材料の層の上にある。基板と他の構造の特性は、プローブ方法による。限定ではないが、典型的な２つのプローブ方法がある。（ｉ）反射モード。３番目の層として反射率の高い金があり、デバイスの上側の光ルミネセンス材料により作られる可視光線を屈折する。（ｉｉ）トランスミションモード（デバイスの本来の特性である）。金の層は含まれず、可視の光ルミネセンス光がサンプルの逆側で検出できる。
【００６５】
光ルミネセンスポリマーは、蛍光ポリマー、またはポリマーと光ルミネセンス色素の混合を含んでよい。上の層のｓｓＤＮＡは既知の配列であり、機能化していない有機化合物等の適切な結合のリンカーを使い、グラフトされ、片方の末端は（表面が改質した）ポリスチレン表面と反応し、もう片方の末端はｓｓＤＮＡの３’または５’末端に結合する。
【００６６】
好ましくは、機能化のグループは選択性を達成するため高い極性である。ポリスチレンポリマーの分離した領域を機能化することにより、ｓｓＤＮＡはこれらの領域に限り局部的にグラフトが可能である。好ましくは、これらの領域は、異なる領域の異なるｓｓＤＮＡ配列をマイクロピペットするのに便利なように、約１００×１００ミクロンである。このように、様々な配列のｓｓＤＮＡをポリスチレン基板の上に配列することができる。機能化された表面は極性が高く、ポリスチレンは非極性なので、ＤＮＡ溶液の水滴は表面張力により機能化した領域の上でセルフアライメントする。図６Ａと６Ｂは本発明の表面を改質したポリスチレン膜を示している。膜を水に浸したあとは、改質した領域のみが湿っているな特徴をもつ。
【００６７】
好ましくは、層２としては湿っていないポリマーがよく、そうすればＤＮＡ吸収が不可能である。しかしながら、表面は、制御されたｓｓＤＮＡのグラフトのため、選択的に改質されてもよく、単位面積当たりの分子密度が調整できる。たとえ水滴が大きすぎても、水滴は選択的に改質された領域にとどまる。結合の深さは、好ましくは、隣り合う鎖とのもつれを避けるのに十分である程度に、そして、溶液内の速いハイブリダイセーションに十分なだけ鎖に運動性を持たせるのに十分である程度に浅い。好ましくは、その深さは、ＤＮＡの層によって大きな吸収がされるのに十分な程度に深いとよい。これらの基準を満たすポリマーの一例は、ポリスチレンである。図６Ａと６Ｂはポリスチレンの選択的改質を示し、さらされた領域のみ湿っており一本鎖核酸の鎖がグラフトするのに適している。
【００６８】
本発明によるＤＮＡチップは自己組織化技術を使って作製できる。これは、ＤＮＡチップ作製の伝統的な方法で使われたリソグラフィーに比べ費用がかからない。自己組織化は伝統的なリソグラフィーに基づくＤＮＡチップ作製方法に比べ著しく低価格である。ｓｓＤＮＡの自己組織化の特性、特に、機能化した極性のエリアが非極性のエリアに囲まれる、ことが利用される。信頼できる比較的早い作製がなされ、１分当たり多くの配列が可能である。
【００６９】
本発明のデバイスを作るには、ナノ粒子をブロック共重合体の鋳型に装飾するというのもある。少なくとも２つの鎖タイプをもつブロック共重合体は、基板の上に置かれる。液体または固体形成のプロセスどちらによってでもよい。ブロック共重合体膜は、熱処理され、ナノ相を、分離した相のマイノリティポリマーへと分離する。分離した相の構造は、ブロック共重合体の構成に応じて、ナノスケールの直径をもつナノ球体や円柱、または、他の（より）複雑な形でもよい。膜の重要な特性は、５〜５００ｎｍのスケールで特徴のある大きさの、分離した相の領域をもつ構造であることである。
【００７０】
次に、ブロック共重合体は、表面処理される。表面をエッチングして分離した相をさらし、同じプロセスにおいて、分離した相の表面を活性化する。しかしながら、エッチングされた“マトリックス”ポリマーは活性化されない。続いて、構造は、ブロック共重合体を破壊しない溶剤内の、無機または有機金属塩の前駆体溶液にさらされる。塩は活性化した表面と反応し、分離した相のさらされた表面上に、選択的な配列を形成する。
【００７１】
次に、置かれた塩は、反応性ガスまたは活性溶液のどちらかと反応し、ナノ粒子が、特に分離した相の領域に限られて形成される。サンプルを、オプションとしてナノ粒子合成ステップの前または後で、選択的にアニールしてもよい。その結果の構造は、ナノ粒子をもつポリマーブロブである。
【００７２】
図１４は、本発明のチップを作るプロセスの流れの例の概略図である。約１０〜１０００ｎｍの大きさのポリマー“ブロブ”６は、基板１の上に作られる。ブロブはランダムでも周期的な配置でもよい（図１４Ａ参照）。続いて、一本鎖核酸分子３ａが（グラフト等により）各ブロブ６に結合する。ブロブの大きさと核酸配列３ａの塩基の数に応じて、ブロブ６当たりの核酸配列３ａの数は、約１〜１０の範囲に渡る。ブロブの直径が５０ｎｍ未満で核酸粒子が８０を超える塩基を持っている場合、１ブロブ当たりの核酸粒子の数は１である。
【００７３】
図１５Ａ乃至１５Ｇは、本発明の核酸チップをつくる方法の例である。図１５Ａが示すように、まず、基板１の上にブロック共重合体８を置く。ブロックの８Ｂの一つジエンポリマーであり、ジエンポリマーはオゾンや酸素プラズマ等の酸化プロセスによってエッチングされてもよい。ポリマーの他の部分である８Ａは、オゾン耐性のポリマーである。ポリマーの８Ｂは多くを占める相であり、ポリマーの８Ａ（球で示されている）は小さな相である。８Ａは分離して球体または球体に近い粒子を形成している。好ましくは、ブロック共重合体８は、単分散され、通常の規則的な格子に自己組織化する層を持っている。例えば、ポリマーの小さい相８Ａはポリスチレン（ＰＳ）またはポリ（メタクチル酸メタル）（ＰＭＭＡ）で、大きい相８Ｂはポリイソプレンまたははポリブタジエンでもよい。
【００７４】
図１５Ｂにおいて、ブロック共重合体薄膜８はスピンキャストされ、アニールされて、ミクロ相分離の球の単層を形成する。そしてマトリックスはオゾンまたはプラズマにエッチングされて、分離した球体８ａが形成される。続いて、球体８ａは、ポリマーのガラス転移温度より上でアニールされて、ポリマー“ブロブ”８８（図１５Ｃ参照）を形成する。次のステップで、基板１の表面１ａは、陰イオン基により改質されて（図１５Ｄ参照）、改質されたブロブ８８ａが作られる。この改質に使われるグループは、亜鉛、カドミウム、鉛または水銀塩の水溶液にさらされると塩を形成する、強い陰イオンでもよい。アニールすると（図１５Ｅ参照）、アニールされたブロブ８８ｂを形成し、硫化水素にさらされ、ＩＩ‐ＶＩカルコゲナイドナノ粒子９がブロブ８８ｃ内に形成される（図１５Ｆ参照）。最も高い光ルミネセンスを提供するために、典型的なナノ粒子はドープされてもよい。例えばＺｎＳ：ＭｎまたはＺｎＳ：Ａｇ等である。前者は、光ルミネセンスの強さが最も高く、紫外線領域の核酸の最高の吸収に近い、２６５ｎｍあたりの強さである。
【００７５】
次のステップで、ブロブ表面はウエット、プラズマまたはコロナによって再び改質されて、核酸の鎖の３’または５’末端と反応できる部分を形成する。例えば、水プラズマによってヒドロキシル基が形成されると、リン酸の末端が反応して共有結合を形成する。このように、核酸の鎖はポリマーブロブ表面でグラフトされる。核酸の大きさに応じて、１ブロブ当たり１または複数の鎖がグラフトされる。５０塩基を越える長い鎖の場合、鎖が横に長いために１ブロブ当たり１つの鎖のみがグラフトされるかもしれない（図１５Ｇの拡大図である図１６Ａ参照）。図１５Ｇと図１６Ａは、最終的な構造を示し、ブロブ８８ｄ内のナノ粒子９と一本鎖核酸３ａのグラフトである。このような表面が一本鎖核酸破片の混合物にさらされると、基板上でグラフトされた一本鎖核酸プローブは、化学的なピンセットのように働き、ハイブリダイゼーションのための相補的な一本鎖核酸を抜く。その結果の基板上の二本鎖核酸３３は図１６Ｂに示されている。ナノ粒子９は通常２〜３０ｎｍの範囲の直径である。ブロブ８８ｄは通常、直径は約１０〜１００ｎｍで、ピッチは約１０〜１００ｎｍである。
【００７６】
図１６Ａ乃至１６Ｂのようなデバイスの、読み取りの方法は以下のようである。適合を示すハイブリダイズされた部分の読み取りは、図１７Ａ乃至１７Ｃにおいて説明される。核酸なしのチップを紫外線（励起光またはプローブ光）にさらすと、光ルミネセンスナノ粒子は可視光線であるＩ_０を放射する（図１７Ａ参照）。その可視光線は、あらゆる方向に平等である。プローブ光（つまり紫外線）の干渉を避けるため、ルミネセンスの強さＩ_０は通常の方向で記録される。一本鎖核酸３ａをもつ核酸チップがさらされると、強さはＩ_０からＩ_ｉに変わる。なぜなら、一本鎖核酸の結合により上層の光学的特性（吸収、反射または散乱）が変化するので、ナノ粒子に入射する光が変化するからである（図１７Ｂ参照）。一本鎖核酸がハイブリダイズして二本鎖核酸３３を形成すると、強さはさらに変化し、Ｉ_ｆとなる（図１７Ｃ参照）。図１７Ｂから１７Ｃへの変化は、一本鎖から二本鎖になるときにＤＮＡの複素屈折率が変化することによる。このように、ナノ粒子からの光ルミネセンス光の量は、図１７に示された３つの場合に応じて変化する。コントラストＩ_ｉ‐Ｉ_０は、単位面積当たりの一本鎖核酸分子の数に比例する。ハイブリダイゼーション可能な場所の較正が提供される。コントラストＩ_ｆ−Ｉ_０＝ΔＩは、二本鎖にハイブリダイズされた一本鎖核酸の数に比例する。
【００７７】
上述した作製方法は、例であって限定ではない。例えば、ｓｓＤＮＡについて記述した部分に他の核酸を応用してもよい。
【００７８】
上述した作製方法または他の適した方法を使って、ピクセル５の配列をもつ図１３に示すようなバイオチップをつくることができる。好ましい実施例において、本発明は、１０^４ピクセル（サイト）の場合に光ルミネセンスの測定のためのＤＮＡチップを提供する。同じピクセルを１００回、異なる場所で繰り返すことができるので、繰り返して測定でき、統計的な結果を出せる。例えば、図１６Ａに示した構造の１０^４μｍサイズのプローブが作製できる。各基板は異なる一本鎖核酸プローブをもってもよい。入射する紫外線や出力される可視光線は、同業者に知られている典型的な集積光学方法によって基板に結合できる。例えば、光ファイバが使われてもよい。信号雑音比を改善するために、入射光を改質し、出力信号を同じ周波数で固定してもよい。このような統合的アプローチによって、効果的に、オンラインセンサを作ることができ、各ファイバまたはファイバの束は、他のファイバの束と異なるタイプの一本鎖核酸をもつ。この方法で、いくつかの一本鎖核酸を、多重遺伝子のプローブ等、混合物の中で同時にプローブしてもよい。
【００７９】
本発明のバイオチップの作製に“デジタル”アプローチを使ってもよく、プローブの位置を、１０〜５０ｎｍのスケールの周期で等間隔に配列してもよい。分離して等間隔に並べると、核酸を高い感度と正確さで数えることができ、“アナログ”方法の場合に隣接する断片からの信号の重複によって起こり得るノイズ／エラーを、低くすることができる。従来のバイオチップ技術と比べて、集中的方法と製品が１０^３‐１０^４小さい大きさのサンプルで使うことができる。また、配列の作製は、高価なリソグラフィーによる技術ではなく、比較的安価で、かなり並列な自己組織化アプローチに基づいてもよい。
【００８０】
本発明を特に核酸に関連して説明してきた。蛋白質は他の蛋白質と反応すると、または構造を変えると、蛋白質の複素屈折率も紫外線の範囲で著しく変化するので、センサや分析デバイスを、核酸について上述したように、抗原や蛋白質をプローブするように作製することができる。このように、抗原抗体センサが提供できる。このようなデバイスにおいて、所望の抗体が一本鎖核酸に置き換わることができる。標識付けが必要ないので、このようなデバイスは、空中または液中の、小さいレベルの抗原や蛋白質を検出する高い感度のセンサであり得る。分析とデバイス作製の本質は、上述した一本鎖核酸の場合と同じである。
【００８１】
限定ではないが、本発明の例を以下に示す。
【００８２】
（実施例１）
シリコン（Ｓｉ）表面の上にポリスチレン（ＰＳ）／ポリブタジエン（ＰＢ）のブロック共重合体膜を置いて、高度に規則正しく分離したＰＳ球の相を作る。図８参照。その構造を、水蒸気を含んだプラズマにさらし、ブタジエンをエッチングしポリスチレンを改質する。図９は、さらす時間に対するエッチングの量を示した（ポリブタジエンの）典型的なエッチング曲線を示している。表面改質は確かに選択的であることを確かめるため、純ポリマーのＰＳとＰＢを同様の処理にさらした。図１０の、プラズマにさらす時間に対する水の濡れ角度は、明らかに、ＰＳは改質され、高い極性を持った（つまり、濡れた）が、ＰＢには特筆すべき改質はみられなかったことを示している。特に、図１０は、水の接触角が、処理時間が長くなると、ＰＳでは小さくなるが、ＰＢは大きいままであることを示している。活性化した表面は亜鉛塩溶液に浸し、硫化水素にさらして硫化亜鉛を作る。図１１は典型的な電界放射走査型電子顕微鏡による写真（ＳＥＭ）を示しており、ここで、ＰＢマトリックスに比べＰＳ球は明るい。ＰＢの明るさは、マトリックス内の原子量の低い材料（炭素や水素）に比べ、原子番号の高い亜鉛の存在による。図１１に、ブロック共重合体の上の硫化亜鉛ナノ粒子が示されており、特に、分離したＰＳの島は、マトリックスに比べ球形で明るく、これは、硫化亜鉛はＰＳにのみ限られていることを意味している。ＰＳ球がランダムに配列されるのはＰＢの過度のエッチングによる。図１２の結果のサンプルの光ルミネセンス（ＰＬ）スペクトルは、硫化亜鉛粒子からの光ルミネセンスを示しており、４２０ｎｍまでの典型的な出力のピークが１００ｎｍを超えて強く青方偏移しており、これは、硫化亜鉛のナノ粒子の存在を示している。強い青方偏移は、量子閉じ込め効果を意味しており、公称寸法＜３ｎｍの大きさの硫化亜鉛粒子であることを示す。
【００８３】
（実施例２）
自己組織化したブロック共重合体の単層と異方性エッチングを用いて、ナノ粒子で覆ったポリマーブロブでｓｓＤＮＡ断片（ｘ）をグラフトすることによって、構造は作られる。ブロブ（ポリスチレン（ＰＳ）で作られた）は、（シリコン）基板の上に等間隔に配列される。ブロブの間隔と大きさは１０−２０ｎｍの範囲である（図１４Ａ参照）。半導体ナノ粒子の直接バンドギャップを、ポリマーにその場埋め込みし、確かに通常に単分散された大きさで置き、プロセスを容易にする。ルミネセンス励起は最大〜２６０ｎｍまで（ＤＮＡの最大の吸収に近い）に調整される。ｓｓＤＮＡがグラフトされると、可視光線のルミネセンス光はＩ_０からＩ_ｉに弱まる。このように、違いΔＩ＝Ｉ_ｆ−Ｉ_ｉの測定によって、ｘグラフトをもつプローブ箇所がｓｓＤＮＡ混合物にさらされると、ｙ断片の量が量的に計算できる。ΔＩと基板に結合したｙの数に関する較正定数は、ｘ箇所の数がわかるので、正確に決定される。計測可能なコントラスト、つまりΔＩ〜１０％の変化、を達成するために、最小ｓｓＤＮＡの大きさは５０塩基配列である。２０ｎｍピッチ配列の上の、ｓｓＤＮＡの５０塩基配列には、ブロブ当たり１つの鎖のみが可能である。これはガウス鎖が横に長いためである。全配列の大きさが１０^４μｍ^２あれば、２５％の量子効果と３０°の検出器許容角をもつナノ粒子の単層の、Ｉ_０、Ｉ_ｉおよびＩ_ｆの計測に十分である。このように、アレイ当たり２．５×１０^７ｓｓＤＮＡ（または〜１０フェムトグラム）を計測する感度は可能である。異なるｓｓＤＮＡグラフトのいくつかの配列の集団を作り、各配列を直径１００μｍの光ファイバと繋げることによって、いくつかの断片の平行分析が達成できる。
【００８４】
本発明を好ましい実施例について上に説明してきたが、本発明が特許請求の範囲の各請求項の真意および範囲を逸脱することなく変形を加えて実施できることは当業者には理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法を示すフローチャートである。
【図２Ａ】本発明のデバイスの断面図である。
【図２Ｂ】図２Ａの部分拡大図であり、本発明の結合してない一本鎖核酸材料を示す。
【図２Ｃ】図２Ａの部分拡大図であり、本発明の結合した核酸材料を示している。
【図３Ａ】本発明の検出を示す断面図である。
【図３Ｂ】本発明の検出を示す断面図である。
【図３Ｃ】本発明の検出を示す断面図である。
【図４】Ａは本発明のナノ複合材料その場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）形成を備えるデバイス作製を示し、Ｂは本発明のナノ複合材料その場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）形成を備えるデバイス作製を示し、Ｃは本発明のナノ複合材料その場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）形成を備えるデバイス作製を示し、Ｄは本発明のナノ複合材料その場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）形成を備えるデバイス作製を示している。
【図５】本発明のナノ複合材料の構造の原子間力顕微鏡写真を示している。
【図６】ＡおよびＢは本発明の選択的に改質されたポリスチレン表面の光学顕微鏡写真を示している。
【図７】本発明の光ルミネセンスポリマーを含む実施例で使われるポリスチレンからの蛍光発光のスペクトルを示している。
【図８】本発明の例示的なシリコン表面上のポリスチレン／ポリブタジエンブロック共重合体球の単層を示している。
【図９】本発明の例示的なブロック共重合体のさらす時間に対する、ポリブタジエンのエッチングのグラフである。
【図１０】本発明の例示的な材料の、水の接触角における表面処理の効果のグラフである。
【図１１】本発明のブロック共重合体をベースとした例示的な材料上の硫化亜鉛ナノ粒子の電界放射顕微鏡写真である。
【図１２】本発明の硫化亜鉛を含む材料の光ルミネセンススペクトルを示している。
【図１３】本発明のバイオチップの上面図を示している。
【図１４Ａ】本発明のポリマーブロブ（ｂｌｏｂ）／ナノ粒子作製の実施例を示す断面図である。
【図１４Ｂ】本発明のポリマーブロブ（ｂｌｏｂ）／ナノ粒子作製の実施例を示す断面図である。
【図１４Ｃ】本発明のポリマーブロブ（ｂｌｏｂ）／ナノ粒子作製の実施例を示す断面図である。
【図１５】Ａ−Ｇは本発明のナノ粒子配列を作る例示的プロセスの流れを示している。
【図１６】Ａは使用前の本発明のナノ粒子／ポリマーブロブバイオチップの例示的構造を示し、Ｂは一本鎖核酸が相補的塩基配列とハイブリダイズして二本鎖核酸を作ったあとの図１６Ａの構造を示している。
【図１７】Ａは図１６Ａおよび１６Ｂのデバイスの、本発明による読み取り方法を示している。そこでは、紫外線はある角度でサンプルに入射し、ナノ粒子からのルミネセンス可視光線が記録される。Ｂは図１６Ａおよび１６Ｂのデバイスの、本発明による読み取り方法を示している。そこでは、紫外線はある角度でサンプルに入射し、ナノ粒子からのルミネセンス可視光線が記録される。Ｃは図１６Ａおよび１６Ｂのデバイスの、本発明による読み取り方法を示している。そこでは、紫外線はある角度でサンプルに入射し、ナノ粒子からのルミネセンス可視光線が記録される。
【符号の説明】
１００　　　既知の一本鎖核酸のみの測定／観測
２００　　　サンプルにさらされた既知の一本鎖核酸の測定／観測
２１０　　　変化なしを測定（＝サンプル内で既知の一本鎖核酸といずれのＢＰとの結合もなし）
２２０　　　変化を測定／観測（＝サンプル内で既知の一本鎖核酸と結合）

Claims (50)

1. 分子の結合を検出する標識付けなしの方法であって、
   Ａ一本鎖核酸配列を含む第１の層と、光ルミネセンス材料を含む第２の層とを含むセンサを準備するステップと、
   Ｂ前記一本鎖核酸配列が生物サンプル内で関心のある材料と結合するのに十分な時間にわたり前記センサを前記生物サンプルにさらすステップと、
   Ｃ前記センサを光にさらし、前記センサからの光ルミネセンスを測定するステップと
   を含む方法。
2. 前記一本鎖核酸を、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡからなる群から選んだ請求項１記載の標識付けなしの方法。
3. 前記第２の層を、芳香族ポリマー、ドープした、またはドープしてない金属酸化物、硫化物、セレン化物、ヒ化物、テルル化物、および、窒化物と燐化物のナノ複合材料からなる群から選んだ請求項１記載の標識付けなしの方法。
4. 前記第２の層がマトリックス材料を備え、前記光ルミネセンス材料が前記マトリックス材料と関連づけられている、請求項１記載の標識付けなしの方法。
5. 前記光ルミネセンス材料が前記マトリックス材料に埋め込まれている、請求項４記載の方法。
6. 前記第２の層がポリスチレンを含む、請求項１記載の標識付けなしの方法。
7. 前記第２の層がポリマーマトリックス内に光ルミネセンス粒子を含む、請求項１記載の標識付けなしの方法。
8. 前記光ルミネセンス粒子が、第ＩＩ群および第ＶＩ群からなる群から選ばれたドープされた、または、ドープされていない化合物である、請求項７記載の標識付けなしの方法。
9. ドープされた、または、ドープされていない硫化亜鉛を含む、請求項８記載の標識付けなしの方法。
10. 前記第２の層がナノ複合材料を含む、請求項１記載の標識付けなしの方法。
11. 前記測定ステップが、２００−７００ｎｍの範囲の波長の紫外線が前記第１の層にあてられたとき、前記第２の層からの光ルミネセンス光を感知することを含む、請求項１記載の標識付けなしの方法。
12. あてられる紫外線の波長の範囲が２６０‐２６５ｎｍである、請求項１１記載の標識付けなしの方法。
13. 前記第１の層がｓｓＤＮＡ の単層を含む、請求項１記載の標識付けなしの方法。
14. 前記第２の層が薄膜または支持体を含む、請求項１記載の標識付けなしの方法。
15. 前記第２の層がポリマーを含む、請求項１記載の標識付けなしの方法。
16. 核酸配列が５塩基対から２００塩基対の間である、請求項１記載の標識付けなしの方法。
17. 前記配列が約２５塩基対である、請求項１６記載の標識付けなしの方法。
18. 前記第２の層が２００−７００ｎｍの波長の光に励起されると蛍光発光する、請求項１記載の標識付けなしの方法。
19. センサが前記第２の層にグラフトされた前記第１の層として、ｓｓＤＮＡを含む、請求項１記載の標識付けなしの方法。
20. 前記第１の層の異なる部分に異なる核酸配列を含む不連続の第１の層を提供することを含む、請求項１記載の標識付けなしの方法。
21. 前記第１の層が前記第２の層の第１の側に位置し、前記測定するステップが前記第２の層の第２の側からの光ルミネセンスを測定する、請求項１記載の方法。
22. 前記第２の側が前記第２の層上の前記第１の層の反対側である、請求項２１記載の方法。
23. 前記第１の層が前記第２の層の第１の側に位置し、前記測定するステップが前記第２の層の前記第１の側から反射する光ルミネセンスを測定する、請求項１記載の方法。
24. 光源と、
    核酸の層と光ルミネセンスの層とをもつセンサと、
    光ルミネセンス検出器と
    を含む、分子の結合を標識付けなしで分析する装置。
25. 前記光源が紫外光線源である、請求項２４記載の装置。
26. 前記光源が赤外光線源である、請求項２４記載の装置。
27. 前記光源が可視光線源である、請求項２４記載の装置。
28. 前記検出器が赤外線から紫外線の範囲の光の検出器である、請求項２４記載の装置。
29. 前記光源が可視光線源である、請求項２８記載の装置。
30. 前記紫外光線源が２６０−２６５ｎｍの範囲の紫外線を提供する、請求項２５記載の装置。
31. 光ルミネセンス材料で一本鎖核酸配列に接触することを含む、標識付けなしのセンサを作る方法。
32. 基板上に光ルミネセンス材料を設け表面を形成し、次に金属塩とのイオン交換によってその表面を改質し、イオンを埋め込み、イオンを埋め込んだ材料を反射媒体にさらして光ルミネセンス粒子を作ることを含む請求項３１記載の方法。
33. 一本鎖核酸配列を含む第１の層と、光ルミネセンス材料を含む第２の層とを含む標識付けなしのセンサ。
34. 一本鎖核酸をＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡからなる群から選んだ請求項３３記載のセンサ。
35. 前記第２の層を芳香族ポリマー、金属酸化物、硫化物、ナノ複合材料からなる群から選んだ請求項３３記載のセンサ。
36. 前記第２の層がポリスチレンを含む請求項３３記載のセンサ。
37. 前記第２の層が硫化亜鉛を含む請求項３３記載のセンサ。
38. 前記第２の層がナノ複合材料を含む請求項３３記載のセンサ。
39. 前記核酸配列が約２５塩基対である請求項３３記載のセンサ。
40. 前記第１の層がｓｓＤＮＡの単層を含む請求項３３記載のセンサ。
41. 前記第２の層が紫外線の範囲の光に励起されると蛍光発光する材料からなる請求項３３記載のセンサ。
42. 抗原の結合を検出する標識付けなしの方法であって、
    Ａ抗体を含む第１の層と、光ルミネセンス材料を含む第２の層と、を備えるセンサを準備ステップと、
    Ｂ前記抗体が生物サンプル内で関心のある抗原と結合するのに十分な時間にわたり前記センサを前記生物サンプルにさらすステップと、
    Ｃ前記センサからの光ルミネセンスを測定するステップと
    を含む方法。
43. ２００−７００ｎｍの範囲の波長の紫外線が前記第１の層にあてられたとき、前記第２の層から反射する光の光ルミネセンスを測定することを含む、請求項４２記載の標識付けなしの方法。
44. あてられる紫外線の波長の範囲が２６０−２６５ｎｍである請求項４３記載の標識付けなしの方法。
45. 紫外線に励起されると前記第２の層が蛍光発光する請求項４２記載の標識付けなしの方法。
46. 前記第１の層が不連続であり異なる抗体を含む請求項４２記載の標識付けなしの方法。
47. 光源と、
    抗体を含む第１の層と第２の光ルミネセンスの層とをもつセンサと、
    光検出器と
    を含む抗体の結合を標識付けなしで分析する装置
48. 抗体を含む第１の層と、光ルミネセンス材料を含む第２の層とを含む標識付けなしのセンサ。
49. 前記第１の層が不連続であり異なる抗体を含む請求項４８記載のセンサ。
50. 互いに異なる既知の抗体を含む請求項４９記載のセンサ。

Images