JP2009522406A

JP2009522406A - 蛍光染料

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Publication number: JP2009522406A
Application number: JP2008548601A
Authority: JP
Inventors: スーザンエムガスパー; ミンシャンヘ; ファンライ; トーマスエムレスリー; ヘレンサムソン
Original assignee: Corning Inc
Current assignee: Corning Inc
Priority date: 2005-12-30
Filing date: 2006-12-19
Publication date: 2009-06-11
Also published as: US7781187B2; EP1973973A2; US20070154980A1; WO2007078926A3; WO2007078926A2

Abstract

共役π電子架橋と電子受容部分とによって結合される電子供与部分の生物学的アッセイにおいて、標的物質を検出するために有用な蛍光染料。前記π電子架橋は、少なくとも１つの炭素環又は複素環構造を含有する。電子受容部分は、カルボン酸、カルボン酸の塩、又は、化学式（I）を有し、Ｘ_８は、Ｈ、ＣＨ_３及び（ＣＨ_２）_ｎ６−Ｚ_２からなる群から選択され、Ｚ_２は一価のアニオンであり、ｎ_６は１から１０の正数であり、Ｑ_３はＯ又はＳである。
【化１】

Description

本発明は広くは蛍光染料に関し、より詳細には生物学的検出法における標的物質の検出及び定量化に有用である蛍光染料に関する。

蛍光標識は生体分子の検出するための重要な技術である。例えば、抗体は蛍光染料を用いて標識されることが可能である。標識後、続いて、特定の標的分子への抗体の結合は、蛍光シグナルにおける変化に基づき、蛍光シグナルにおける変化が増加であるか又は減少であるかが監視される。蛍光におけるこの変化は分光計（スペクトロメーター）、免疫蛍光装置、フローサイトメーター（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）、蛍光顕微鏡、又は他の検出機器を用いて検出することができる。同じような方法で、ＤＮＡ配列は、前記ＤＮＡが蛍光染料で標識されている相補的ＤＮＡ配列を用いてハイブリダイズされた後、蛍光検出装置を使って検出することができる

蛍光染料は標的物質を検出及び定量化するために色及び光を使うことができ、反応を詳細に調べ、分析を行う。一般に、大きなストークスシフトを有する蛍光染料（すなわち、蛍光励起と発光波長との間の差異）、低分子量及び優れた安定性は、より迅速でより感度の高い及びより選択的な方法使用することを可能にする。

市販の蛍光染料は多くの欠点を有する。例えば、いくつかの蛍光染料は小さすぎる量子収率を有し、従って、少量の標的物質と関連する発光における小さな変化を検出するのに必要とされる感度を欠如している。他の蛍光染料はストークスシフトを有しており、前記ストークスシフトは小さすぎて励起光の十分な検出なしに発光を検出することができない。蛍光染料の励起又は発光スペクトルが低ＳＮ比をもたらす標的物質の自己蛍光と重なり合う場合、標的物質は検出することができない。さらに、いくつかの蛍光染料は安定しておらず、保存期間が短く、その結果、蛍光染料はすぐに色あせ非蛍光性になる。さらに他の蛍光染料は励起スペクトルを有しており、前記励起スペクトルは蛍光染料を一般的なレーザー及びアークランプなどの波長制限光源（ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ−ｌｉｍｉｔｅｄｌｉｇｈｔ）によって励起することができない。前記の欠点に加えて、多くの市販の蛍光染料は水性の媒体中において不溶性であるという点において更なる欠点を有する。従って、蛍光染料は、基質が標識化する前に、例えば、Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ（ＤＭＦ）などのように水溶性媒体中で有機溶媒に溶けなければならなく、これらの有機溶媒は高感度の基質に悪影響を及ぼすことがあり得る。蛍光染料の溶解度は溶液中において蛍光染料同士が相互作用する度合に影響を及ぼし、蛍光染料が基質に接合する場合、直接に、光吸収及び発光特性に影響を及ぼす。蛍光染料による細胞物質の非特異的な染色の度合（これは、蛍光測定中、ＳＮ比における雑音を増加させる）もまた染料の疎水性の機能であり、蛍光染料に付加された官能基の極性の機能である。最後に、多くの蛍光染料は、合成することが困難であり、購入するにも価格が高く、高コストな検出方法（例えば、ＤＮＡ、抗原、モノクローナル抗体についての生物学的検定法、及び当業者に周知である他の検出）の原因となる。

ＤＮＡ塩基は、紫外スペクトル中、２６０ｎｍにおいて吸光度を示すとはいえ、この方法によるＤＮＡの定量化は低感度（高減衰係数）のため大量の材料を必要とする。ＤＮＡ単独の吸光度検出に必要な十分な材料を入手することは多くの場合かなり困難であり、多くの費用がかかる。医薬品産業及びバイオテクノロジー産業はより小さいスケール（小型）及びハイスループット（高生産性）のアッセイを好む傾向が続いているので、核酸検出及び定量化のより高感度な方法・手段が必要とされている。蛍光に基づいたアッセイは高選択性及び高感度であるが故に魅力的であり、従って、少量の材料を用いた検出を可能にする。

シアニン染料（ＤＮＡ結合すると蛍光強度における変化を示す）は生物学的応用にとって産業上有益なものである。シアニン染料は核酸検出のために開発されてきた。核酸検出は広ダイナミックレンジ全体に渡って、非常に感度が高い。典型的なシアニン染料はピコグリーン（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ^ＴＭ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ社の商標）であり、ピコグリーンはμプレートリーダー上で２５０ｐｇ／ｍＬの２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）及びダイナミックレンジ約３オーダーの大きさに対する高感度を有する。ピコグリーン（商標ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ^ＴＭ）は、一方、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）と比較すると二本鎖ＤＮＡについては特異的ではなく、同一モル濃度の一本鎖ＤＮＡの存在下二本鎖ＤＮＡを定量することができる。さらに、ピコグリーンは自身の蛍光寿命、高度且つ煩雑な実験に基づいて二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡを識別することができる。このように、市販のシアニン染料は一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡとを識別することができるが、シアニン染料は高コスト及び小さいストークスシフト（一般的に２０ｎｍより小さい）のために完全に十分ではない。小さいストークスシフトはアッセイ中においてノイズの全体を覆うエミッション信号を読み取ることを困難にさせる。小さいストークスシフトの欠点を補うために、狭い波長のレーザー励振源及び多重発光高解像度単色光分光器を使う必要があり、最終的に機器の費用の増加をもたらす。

現在、市販の染料が有する前記の問題を受けて、蛍光染料は、比較的、安価な出発物質から容易に合成されることができ、大きいストークスシフトを示し、且つ低分子量を有することが望ましい。これらの特性は励起波長に対して染料発光波長のよりクリーンな検出（ｃｌｅａｎｅｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）を可能にし、よって、より高価な器具を使用する必要性がなくなる。一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）と比較して、一本鎖ＤＮＡに対する選択性よりも二本鎖（ｄｓＤＮＡ）に対する選択性の方が高い蛍光染料が望まれている。二本鎖ＤＮＡに対する選択性がたかいということは、未反応混合物（すなわちＰＣＲ生成物混合物）中において二本鎖ＤＮＡを定量化するとき重要である特性を有しているということである。次の特性を有する蛍光染料が望ましい。
・標的物質が結合する複数付着部位を有すること。
・複数付着部位が蛍光染料を表面に付着する結合能力を有すること。
・乾燥状態（ｄｒｙｓｔａｔｅ）（溶媒を必要とせず）において蛍光性を有していること。
・長寿命を有していること。
特定の用途に基づいて操作されることができる水性媒体において可溶な蛍光染料は特に有利である。

本発明の一つの実施例は化学式Iを有する蛍光染料に関し：

式中：
・Ｄ_２は電子供与部分から成る群から選択される；
・Ｂ_１及びＢ_２は同一でも又は異なっていてもよく、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、Ｃｌ及びＦから成る群から選択される；
・Ａ_２は以下の化学式を有する電子受容部分であり：

式中：
・Ｘ_８はＨ、ＣＨ_３、および（ＣＨ_２）_ｎ６−Ｚ_２ ⁻から成る群から選択され、Ｚ^２−は一価のアニオンであり、Ｚ_２ ⁻が存在するとき、Ｚ_１ ⁻は存在しない；ｎ_６は１から１０の正数である；
・Ｑ_３はＯ又はＳである；
・Ｚ_１ ⁻は一価のアニオンであり、Ｚ_１ ⁻が存在するとき（ＣＨ_２）_ｎ６−Ｚ_２ ⁻は存在しない；
・ｎ_２は１から２の正数である。

本発明の他の実施例は、化学式IVを有する蛍光染料に関する：

式中：
・Ｄ_１は電子供与部分である；
・Ｘ_１及びＸ_２は同一でも又は異なっていてもよく、Ｈ、ＣＨ_３、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ、Ｓｅ、Ｆ、Ｃｌ、及びＣＨ_２から成る群から選択され、ＸがＨ、Ｆ、又はＣｌであるならば、Ｒ_１及びＲ_２は存在しない；又は、
・ＸがＦ又はＣｌでないとき、
・Ｒ_１及びＲ_２は同一でも又は異なっていてもよく、Ｈ、ＣＨ_３、及びＣＨ_２−Ｑから成る群から選択され、ＱはＯＨ、ＳＨ、及びＮＨから成る群から選択され、
・Ｒ_１及びＲ_２は、少なくとも一つの環原子を有する炭素環構造又は複素環構造を形成する。前記少なくとも1つの環原子はＯ、Ｎ及びＳから成る群から選択される；
・ｎ_１は１から２の正数である；
・Ａ_１はカルボン酸及びカルボン酸の塩から成る群から選択された電子受容部分である。

本発明の他の実施例は、サンプル中において標的物質を検出するための分析デバイスに関する。前記分析デバイスは、少なくとも１つの反応領域を有する。前記反応領域は特定の標的物質に接するとき、蛍光する染料を用いて共有結合で標識される。反応領域はサンプルと接触するように配置されている。前記分析デバイスは、蛍光が存在するか又は存在しないかを検出するために前記反応領域に近傍に、少なくとも１つの検出器を有する。

本発明の他の実施例は化学式Iの蛍光染料を合成する方法に関する：

前記方法は、ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｅに過剰のｉｏｄｏｍｅｔｈａｎｅ（ヨードメタン）を加えるステップと；
・ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｅ塩を分離するステップと；
・ｍｅｔｈａｎｏｌ中にｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｅを形成するためにｍｅｔｈａｎｏｌ中における前記ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｅ塩を溶解するステップと；
・ｍｅｔｈａｎｏｌ中で置換したｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ及びｐｉｐｅｒｉｄｉｎをｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｅ溶液に加えるステップと；
・反応生成物を分離し、溶液から固体を再結晶化するステップを含む；
化学式I中、
・Ｄ_２は電子供与部分から成る群から選択される；
・Ｂ_１及びＢ_２は同一でも又は異なっていてもよく、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、Ｃｌ、及びＦから成る群から選択される；
・Ａ_２は以下に示す化学式を有する電子受容部分である：

式中：
・Ｘ_８はＨ、ＣＨ_３及び（ＣＨ_２）_ｎ６ ⁻Ｚ_２ ⁻から成る群から選択され、Ｚ_２ ⁻は一価のアニオンであり、Ｚ_２ ⁻が存在する場合、Ｚ_１ ⁻は存在しない；ｎ_６は１から１０の正数である；
・Ｑ_３はＯ又はＳである；
・Ｚ₁ ⁻は一価のアニオンであり、Ｚ_１ ⁻が存在する場合、（ＣＨ_２）_ｎ６ ⁻Ｚ_２ ⁻は存在しない；
・ｎ_２は１から２の正数である。

本発明の蛍光染料の共通点は電子受容部分に対して共役π電子架橋によって結合される電子供与部分である。前記π電子架橋は少なくとも一つの炭素環構造又は複素環構造を有する。前記電子受容部分は、カルボン酸、カルボン酸の塩、又は以下に示す化学式を有する：

式中：
・Ｘ_８はＨ、ＣＨ_３及び（ＣＨ_２）_ｎ６ ⁻Ｚ_２ ⁻から成る群から選択され、式中、Ｚ_２ ⁻は一価のアニオンであり、Ｚ_２ ⁻が存在する場合、Ｚ_１ ⁻は存在しない；ｎ_６は１から１０の正数である；
・Ｑ_３はＯ又はＳである。

本発明の蛍光染料は、その各々が前記の一般的な構造を有し、電子供与部分及び電子受容部分の性質・特徴に依存してＤＮＡとの相互作用により発光強度における増加又は減少を示すように説明されている。ＤＮＡと相互作用するとき、ほとんど市販の染料は陽性反応又は発光シグナルの増加を示すけれども、陰性反応又は発光シグナルの減少を示す生物学的アッセイの実施例が存在する；例えばＩＱ^Ｒ（ＰｉｅｒｃｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社の登録商標）キナーゼアッセイプラットフォームがある。この一般的な構造を有する前記蛍光染料は、一本鎖ＤＮＡと比較して二本鎖ＤＮＡに対する選択を示すために説明されている。本発明の染料はＤＮＡ定量化についてほとんどの市販の染料が有するストークスシフトより大きいストークスシフトを有する；このような蛍光染料はより互換性があり、且つ、高性能な機器を必要とせず、より安価であり感度を犠牲にすることなく器具を使用することができる。

本発明の他の特徴及び利点は、下記に示す詳細な記述におい記載されている。本発明の前記、他の特徴及び利点の一部は当業者には下記の詳細な説明から容易に明らかであり、添付図面と明細書及び特許請求の範囲中に記載されているように、本発明を実施することにより認識される。

前記の一般的な説明と以下の詳細な説明はともに本発明の例示にすぎなく、特許請求の範囲に記載されているように本発明の本質及び特徴を理解するための要約又はフレームワーク（枠組み）が示すものであることが理解されるべきである。

図面は本発明のさらなる理解を与えるために添付されており、本明細書に組み込まれ、本明細書の一部の構成要素とする。記述とともに、本発明の一つ以上の実施例を示している図面は原理及び本発明の実施を説明するのに役立つ。

本明細書で用いられている
・電子供与部分（ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｄｏｎａｔｉｎｇｍｏｉｅｔｙ）という表現は電子供与体（ｅｌｅｃｔｒｏｎｄｏｎａｔｏｒ）又は電子供与体（ｅｌｅｃｔｒｏｎｄｏｎｏｒ）と同義に用いられ、電子密度に寄与するサブスチチュートと呼び又はさらにＨ、Ｆ、又はＣｌを含むことができる；
・電子受容部分（ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ａｃｃｅｐｔｉｎｇｍｏｉｅｔｙ）という表現は、電子受容体（ｅｌｅｃｔｒｏｎａｃｃｅｐｔｏｒ）又は電子求引性（ｅｌｅｃｔｒｏｎｗｉｔｈｄｒａｗｉｎｇ）と同義に用いられ、ある程度密度（量）の電子を引き寄せるサブスチチュートと呼ぶ；
・助色団（ａｕｘｏｃｈｒｏｍｅ）という用語は、発色団に結合したとき波長のみならず吸収の強度も変化させる非結合電子を有する飽和した基と呼ぶ；
・“サブスチチュート”という用語は、分子中で他の原子又は他の基と置き換わる原子又は基と呼ぶ。
・本発明は、本発明の例示であることを意図する下記実施例によってさらに明確にされ得る。

本発明の一つの実施例は化学式Iを有する蛍光染料に関する：

式中：
・Ｄ_２は電子供与部分から成る群から選択される；
・Ｂ_１及びＢ_２は同一でも又は異なっていてもよく、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、Ｃｌ、及びＦから成る群から選択される；
・Ａ_２は以下に示す化学式を有する電子受容部分である：

式中：
・Ｘ_８は、Ｈ、ＣＨ_３、及び（ＣＨ_２）_ｎ６ ⁻Ｚ_２ ⁻から成る群から選択され、Ｚ_２ ⁻は一価のアニオンであり、Ｚ_２ ⁻が存在するときＺ_１ ⁻は存在しない；ｎ_６は１から１０の正数である；
・Ｑ_３はＯ又はＳである；
・Ｚ_１ ⁻は一価のアニオンであり、Ｚ_１が存在するとき（ＣＨ_２）_ｎ６ ⁻Ｚ_２ ⁻は存在しない；
・ｎ_２は１から２の正数である。

本発明の他の実施例は化学式IIを有する蛍光染料に関する：

式中：
・Ｘ_３がＨ、ＣＨ_３、ＯＨ、ＳＨ、Ｆ又はＣｌのときＲ_３は存在しない、Ｘ_３は、Ｈ、ＣＨ_３、ＯＨ、ＳＨ、−ＮＨ−、−Ｓｅ−、−Ｏ−、−Ｓ−、Ｆ、Ｃｌ、及びＣＨ_２から成る群から選択される；
・Ｘ_３がＨ、ＣＨ_３、ＯＨ、ＳＨ、Ｆ又はＣｌでないとき：
・Ｒ_３はＨ、ＣＨ_３、及び（ＣＨ_２）_ｎ４−Ｘ_６はＯＨ、ＳＨ、及びＮＨ_２から成る群から選択され、ｎ_４は１から１０の正数である；
・Ｑ_３はＯ又はＳである；
・Ｂ_１及びＢ_２は同一でも又は異なっていてもよく、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、Ｃｌ、及びＦから成る群から選択される；
・Ｘ_８はＨ、ＣＨ_３、及び（ＣＨ_２）_ｎ６−Ｚ_２ ⁻から成る群から選択され、式中、Ｚ_２ ⁻は一価のアニオンであり、なお、Ｚ_２ ⁻が存在するとき、Ｚ_１ ⁻は存在しない；ｎ_６は１から１０の正数である；
・Ｑ_３はＯ又はＳである；
・Ｚ_１ ⁻は一価のアニオンであり、なお、Ｚ_１ ⁻が存在するとき、（ＣＨ_２）_ｎ６−Ｚ_２ ⁻は存在しない。

化学式IIを有する一般的な蛍光染料は、次の通りであるがそれだけには限定されない：

本発明の他の実施例は化学式IIIを有する蛍光染料に関する：

式中：
・ｔは１から８の正数である；
・Ｘ_４及びＸ_５は同一でも又は異なっていてもよく、Ｏ、Ｓ、Ｎ、ＮＨ、ＮＨ_２及びＳｅから成る群から選択される；
・ｎ_３は１から３の正数である；
・Ｂ_１及びＢ_２は同一でも又は異なっていてもよく、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、Ｃｌ、及びＦから成る群から選択される；
・Ｑ_３はＯ又はＳである；
・Ｚ_１ ⁻は一価のアニオンであり、Ｚ_１ ⁻が存在するとき、（ＣＨ_２）_ｎ６−Ｚ_２ ⁻は存在しない；
Ｘ_８は、Ｈ、ＣＨ_３、及び（ＣＨ_２）_ｎ６−Ｚ_２ ⁻から成る群から選択され、式中、Ｚ_２ ⁻は一価のアニオンであり、Ｚ_２ ⁻が存在するとき、Ｚ_１ ⁻は存在しない；ｎ_６は１から１０の正数である。

化学式IIIを有する一般的な蛍光染料は以下の通りであるが、それだけには限らない。：

化学式I、化学式II、及び化学式IIIにおいて、Ｑ_３の識別は、より高い蛍光発光を有する本発明のｂｅｎｚｔｉａｚｏｌｅ染料（Ｑ_３＝Ｓ）のために蛍光量子収率に影響を与えることが分かった。しかし一方、示された一般的な蛍光染料は、Ｚ_１ ⁻＝Ｉ⁻を有し、任意の生物学的に適合した対イオン（すなわち、安定しており合成する際入手し易い）は使用することができる。対イオンは、例えば、ＯＨ、ＳＨ、ＨＣＯ_３、ＨＳＯ_４、Ｈ_２ＰＯ_４、ＰＦ_６、Ｆ、ＣＮＯ、ＳＣＮ、ｔｅｔｒａｐｈｅｎｙｌｂｏｒａｔｅ，ＢＨ_４、Ｃｌ、Ｂｒ、ＢＦ_４、Ｉ_３、ＮＯ_３、ＳＯ_３、ＢｒＯ、ＢｒＯ_２、ＢｒＯ_３、ＢｒＯ_４、ＩＯ、ＩＯ_２、ＩＯ_３、ＩＯ_４、ＣｌＯ、ＣｌＯ_２、ＣｌＯ_３、及びＣｌＯ_４である。好ましくはＺ₂ ⁻はＯ、Ｓ、ＣＯ_２，ＰＯ_３、ＰＦ_６、Ｆ、ＳＯ_３及びＮＯ_２から成る群から選択される。

化学式I、化学式II、及び化学式IIIにおいてＢ_１及びＢ_２は助色団として機能することができ、蛍光染料の電子密度を変化することによって、蛍光染料の蛍光応答を強める。

本発明の一般的な蛍光染料は、表１（ＧＡ、９５、ＦＩ及びＨＥ）に記載されているように、容易に入手できる出発原料から合成される。最初に、過剰のヨードメタン（ｉｏｄｏｍｅｔｈａｎｅ）がメチルベンズチアゾール（ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｅ）（６７ｍｍｏｌ）に加えられる。反応混合物は２４時間還流される。その後、メチルベンゾチアゾリウム塩（ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｕｍｓａｌｔ）は過剰のヨードメタン（ｉｏｄｏｍｅｔｈａｎｅ）の蒸発によって青白いクリームパウダーとして分離される。次に、精製されていない塩はｍｅｔｈａｎｏｌ（１０ｍＬ）に溶解され、それに対して３．４ｍｍｏｌの適切な助色団サブスチチュートベンズアルデヒド及び一滴のピぺリジンが加えられた。一般に好まれる助色団サブスチチュートベンズアルデヒド（ｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ）は蛍光染料の最終特性を決定することができ、特に、選択された助色団は染料の色及び溶解度を決定することができる。次に、その結果生じた混合物は、２４時間還流される。冷却により形成される固体は分離され望ましい生成物を生成するためにメタノール／水から再結晶化される。単量体染料合成及び一般的な助色団サブスチチュートベンズアルデヒド（ｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ）の様々な例が表１に示されている。

二量体シアニン染料ＨＥ−ＨＥは、前記に記載したように４，４’−［１，２−ｅｔｈａｎｅｄｉｙｌｂｉｓ（ｏｘｙ−２，１−ｅｔｈａｎｅｅｄｉｌｙｌｏｘｙ）］ｂｉｓ−ｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅを使って合成される。前記アルデヒドは市販で入手できず次の通りに合成される：４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ（５４ｍｍｏｌ）は乾燥アセトン（１００ｍＬ）に溶解され、炭酸カリウム（２７０ｍｍｏｌ）を用いて１時間攪拌される。１，２−Ｂｉｓ（２−ｉｏｄｏｅｔｈｏｘｙ）ｅｔｈａｎ（１０ｇ）は反応物に一滴ずつ滴下され（ｄｒｏｐｗｉｓｅ）及び混合物は２４時間還流により加熱される。冷却した混合物は水に注入され酢酸エチルを用いて抽出される。結合した有機層は無水硫酸マグネシウム上で乾燥され、粘性のある黄色のオイルを得るために濃縮される。粗生成物は溶離液としてヘキサン／酢酸エチルを用いてカラムクロマトグラフィによって精製される。アルデヒドはクリーム色の固体として得られる。

緩衝剤中の一般的な蛍光染料の蛍光はＦｌｕｏｒｏｌｏｇ−３^(R)（Ｓｐｅx Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社の登録商標）スペクトロメーターによって調べられる。典型的・代表的な励起スペクトル及び発光スペクトルは図１に示されている。本発明の蛍光染料は大きいストークスシフトを有している；励起及び発光最大値は互いに１００ｎｍ近く及び又は１００ｎｍより大きく離れている。ピーク波長はＴＯＴＯ−１^ＴＭ及びＹＯ−ＰＲＯ−３^ＴＭ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ社の商標）の二つの市販の蛍光染料と共に表２に一覧にされている。ＴＯＴＯ−１^ＴＭ及びＹＯ−ＰＲＯ−３^ＴＭのストークスシフトは、本発明の染料と比較して小さい。

＊ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ社カタログから得た市販染料のデータ

図２は染料発光に対する一本鎖ＤＮＡ及び二本鎖ＤＮＡの影響を示している。この影響は、染料ＦＩ及びＨＥ−ＨＥに関して最も顕著である。本明細書に記載されているすべての染料は、一本鎖ＤＮＡを添加することによって変化する発光強度よりも二本鎖ＤＮＡを添加することによって変化する発光強度の変化の方が大きいことを示している。ある場合（ＧＡ、９５）は、前記変化は陽性であり、他の場合では前記変化は陰性である（ＨＥ、ＨＥ−ＨＥ，ＦＩ）。

１×ＰＣＲバッファ（緩衝剤）中において１×１０^−５Ｍである本発明の蛍光染料及びＴＯＴＯ−１^ＴＭの発光強度は、蛍光分光計によって、ＤＮＡが存在しない場合（ｆｒｅｅｄｙｅｅｍｉｓｓｉｏｎ）と等モルの二本鎖ＤＮＡ又は一本鎖ＤＮＡ（２０ｍｅｒ）の存在する場合が比較された。フリーダイエミッション（ｆｒｅｅｄｙｅｅｍｉｓｓｉｏｎ）と対する二本鎖ＤＮＡ又は一本鎖ＤＮＡの発光強度が表３に一覧にされている。

^＊市販の染料

この例において、染料ＦＩは一本鎖ＤＮＡの存在下ではほとんど発光強度の変化を示さないが、二本鎖ＤＮＡの存在下では２８．７倍の変化を示している。ＨＥ−ＨＥは二本鎖ＤＮＡの存在下では１３．５倍の変化を示している。市販の蛍光染料であるＴＯＴＯ−１^ＴＭは、二本鎖ＤＮＡとの相互作用にすると（比はより小さい。なぜならＴＯＴＯ−１^ＴＭはＤＮＡと結合していくと増加するからである）非常に大きい変化を示し、一本鎖ＤＮＡと相互作用するときはほとんど変化しない。ＴＯＴＯ−１^ＴＭは二本鎖ＤＮＡに対しては高い感度を示すけれども、ＴＯＴＯ−１^ＴＭは小さいストークスシフトを有し、小さいストークスシフトは発光強度の検出のために高度な機器を必要とする。このデータは研究用のスペクトロメーターから得られていることを念頭に置くことが必要である；それ程、高度ではないプレートリーダーから得られたデータは相違している部分が有り得る；その点において、ＴＯＴＯ−１^ＴＭの二本鎖ＤＮＡに対する感度の利点は、それ程、高度ではないプレートリーダーにおけるＳＮ比に対しては実現されない（得られない）ことである。本発明の蛍光染料は大きなストークスシフトを有し発光強度を検出するためにそれ程、高度な機器でなくても使用することができる。

核酸の高速大量処理スクリーニング（ハイスループットスクリーニング）のために、前記染料はマイクロウェルアッセイにおいて使用することができる。原則としてプレートリーダーは、蛍光スペクトロメーターによく似た蛍光強度を測定するけれども、サンプル形式（ウェルとキュベット）及び使用する光学機器のために独特であるいくつかの特徴を持つ。これらの理由のために、本発明の蛍光染料の検出感度及び検出範囲はマイクロプレートリーダーにおいて測定・決定される。最適な励起波長及び発光波長において、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ社より入手した３つの先端を行く市販の蛍光染料に対して、本発明の蛍光染料はバッファと染料のみでマイクロプレートが読み込んだ変化率が表４に示されている。バックグラウンド信号は、２つのサンプルにおいてバッファと染料のみで読みとられた。１００μｌ／ｗｅｌｌの体積に対して市販の染料のバックグラウンドは７６−１１５％の変化を示し、一方、これらの値は、ＨＥ−ＨＥ及び９５に対しては著しく低く、本発明の蛍光染料は２つのサンプルに対して変化を低く維持することができ、より重要なことには、さらに低いサンプル体積のときには、蛍光染料及びサンプルの改良された物質利用を可能にする。大きくなったストークスシフトを有する蛍光染料の必要性は、この例において明らかである。生物学的アッセイにおける標的物質の検出のためには蛍光の変化がシステムにおけるノイズと区別される必要があり、前記システム内で染料を加えたバッファはノイズの原因となる。

＊市販の染料

表５に示されている蛍光染料は感度（最低検出限界）及びダイナミックレンジを決定するために二本鎖ＤＮＡを用いて滴定された。９６ウェルポリスチレンコーニングコースター（コーニング社の登録商標）マイクロウェルプレートは様々な濃度の二本鎖ＤＮＡと混合された１００μＬ／ｗｅｌｌの染料が流し込まれ、混合物を均一化させるために、２時間室温でインキュベートされた。染料蛍光は、次に、スぺクトラマックス（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ）（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ社の登録商標）で計測された。相対蛍光強度（ＲＦＵ）はｐｇ／μＬにおけるＤＮＡ濃度と対照してプロットされた。各々の染料についての実験パラメーター及び実験結果は表５に示されている。蛍光染料ＨＥ−ＨＥは市販の染料ＴＯＴＯ−１^ＴＭよりも高い感度として現れ、より大きいダイナミックレンジを示す。本発明の蛍光染料、９５は、感度の点から見ると、市販のＴＯＴＯ−１^ＴＭにほぼ同じだがより大きいダイナミックレンジを有する。

＊市販の染料

図３は、プレートリーダーアッセイにおける、市販蛍光染料ＴＯＴＯ−１^ＴＭに対する本発明の蛍光染料、ＨＥ−ＨＥ及び９５の一本鎖ＤＮＡ／二本鎖ＤＮＡの選択について図示している。二本鎖ＤＮＡについてのＴＯＴＯ−１^ＴＭの優れた選択性は蛍光光度計データと一致する。９５は二本鎖ＤＮＡに対して好適であり、一方で、ＨＥ−ＨＥは一本鎖ＤＮＡより二本鎖ＤＮＡに対して感度がほんの少し高いだけである。開示された染料の結合形態についてより研究・検討することによって、二本鎖ＤＮＡ検出について最適化された群の構成要素を設計及び合成することが可能であろう。

式中：
・Ｄ_１は電子供与体である。
・Ｘ_１及びＸ_２は同一でも又は異なっていてもよく、Ｈ、ＣＨ_３、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ、Ｓｅ、Ｆ、Ｃｌ、及びＣＨ_２から成る群から選択され、ただし、Ｘが、Ｈ、Ｆ、又はＣｌ及びＣＨ_２であるならば、Ｒ_１及びＲ_２は存在しない；
・ＸがＦ又はＣｌでないとき：
・Ｒ_１又はＲ_２は同一でも又は異なっていてもよく、Ｈ、ＣＨ_３、及びＣＨ_２−Ｑから成る群から選択され、Ｑは、ＯＨ、ＳＨ、及びＮＨから成る群から選択され、
・Ｒ_１又はＲ_２はＯ、Ｎ、又はＳから成る群から選択された少なくとも１つの環原子を有する炭素環構造又は複素環構造を形成する；
・ｎ_１は１から２の正数である；
・Ａ_２はカルボン酸及びカルボン酸の塩から成る群から選択された電子受容部分である。
・好ましくは、Ｄ_１は以下に示す化学式から成る群から選択される。

式中：
・Ｑ_１及びＱ_２は同一でもよく又は異なっていてもよく、ＣＨ_２、Ｏ、Ｓ、及びＮＨから成る群から選択される：

式中：
・Ｘ_１１は、Ｏ、Ｓ、及びＮから成る群から選択される；
・Ｒ_５及びＲ_６は同一でも又は異なっていてもよく、Ｈ、ＣＨ_３、及び（ＣＨ_２）_ｎ５−Ｘ_７から成る群から選択され、Ｘ_７はＯＨ、ＳＨ、及びＮＨ_２から成る群から選択され、ｎ_５は１から１０の正数である；
・Ｘ_１１がＯ又はＳのとき、Ｒ_５及びＲ_６のどちらか一方しか存在せず、他方は存在しない。
・好ましくは、Ａ_１は以下に示す化学式から成る群から選択される：

式中：
・Ｍは一価のカチオンである；

式中；
Ｌは金属である。

化学式IVを有する蛍光染料は以下の一般的な図式に従って合成することができる：

実施例
実施例１
２−ｂｒｏｍｏｔｈｉｏｐｈｅｎｅのアミノ化についての一般的な合成

２−Ｂｒｏｍｏｔｈｉｏｐｈｅｎｅ（１６．３ｇ，０．１ｍｏｌ）、２−（ｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈａｎｏｌ（１００ｍｌ）、Ｃｕｍｅｔａｌ（０．３２ｇ）、ＣｕＩ（０．８５ｇ）、Ｋ_３ＰＯ_４（４２．４ｇ）は、磁性を帯びたスターラ―バー、濃縮装置が取り付けられ隔壁で密封されたフラスコに加えられた。反応混合物は窒素ポジションプレッシャー下、７２時間、８０℃において攪拌された。反応物が室温まで冷却された後、６００ｍｌの水が加えられ、混合物はエチルエーテル（３^＊２００ｍｌ）で抽出された。結合した有機層は、次に塩水で洗浄され、硫酸マグネシウム上で乾燥された。溶媒は真空内で取り除かれ、残留物は、ヘキサン／酢酸エチル（１：１）で溶出されたシリカゲル上においてフラッシュクロマトグラフィによって精製された。生成物は液体として得られた。２−ｂｒｏｍｏｔｈｉｏｐｈｅｎｅのアミノ化の実施例は表７に示されている。

実施例２
２−ｂｒｏｍｏｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏｐｈｅｎｅの一般的合成
三臭化リン（Ｔｒｉｂｒｏｍｉｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ）（ＰＢｒ_３、５４．２ｇ、０．２ｍｏｌ）は、エチルエーテル（３００ｍＬ）中で、２−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｔｈｉｐｈｅｎｅ（５０．０ｇ、０．４４ｍｏｌ）に０℃において滴下された（ｄｒｏｐｗｉｓｅ）。前記混合物は室温でひと晩攪拌され飽和した炭酸水素ナトリウム溶液（４００ｍＬ）に注がれた。有機層は分離され、炭酸水素ナトリウム溶液（２×１００ｍＬ）及び水（１００ｍＬ）で洗浄された。有機物は、硫酸マグネシウム上で乾燥された。溶媒の蒸発後、標的合成物が得られ、更に生成することなく直ちに使用された。収率は７２．０グラム、９２．８％であった。
実施例３
２−ｔｈｉｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｔｒｉｂｕｔｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅの一般的合成
２−ｂｒｏｍｏｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏｐｈｅｎｅ（７２ｇ、０．４１ｍｏｌ）は、トルエン（４００ｍＬ）に溶解された。前記溶液に対して、ｔｒｉｂｕｔｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ（８２ｇ、０．４１ｍｏｌ）が加えられた。前記混合物は、９０℃でひと晩加熱された。前記混合物は室温まで冷却され、固体は濾過された。前記固体はエチルエーテル（２００ｍＬ）によって洗浄され、１４２．３グラム（収率９２．３％）が生じた。
実施例４
４−［Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌｅｔｈｅｎｙｌ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅの一般的合成
２−ｔｈｉｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｔｒｉｂｕｔｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ（２０．９ｇ、０．０５５ｍｏｌ）及び４−Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌａｌｄｅｈｙｄｅ（７．５ｇ、０．０５ｍｏｌ）はＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）（１００ｍＬ）に溶解された。前記混合物に対して、Ｓｏｄｉｕｍｅｔｈｏｘｙ（ＮａＯＣ_２Ｈ_５：ナトリウムエトキシド）（エタノール、６５ｍＬ中に１．０Ｍ溶液）は滴下された（ｄｒｏｐｗｉｓｅ）。前記混合物は９０℃でひと晩加熱され水（５００ｍＬ）に注がれた。固体は濾過によって集められた。固体は水で洗浄されエタノール（１００ｍＬ）から再結晶され、１０．５ｇの結晶が得られ、収率は９１．３％であった。
実施例５
４−｛［Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ａｍｉｎｏ］−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅ−ｔｈｉｅｎ−５｝−ｆｏｒｍａｔｅｌｉｔｈｉｕｍの一般的合成
４−［Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌｅｔｈｅｎｙｌ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ（４．５８ｇ、０．０２ｍｏｌ）は、乾燥ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）（５０ｍＬ）に溶解され、−７８℃に冷却された。前記溶液に対して、ｂｕｔｙｌｌｉｔｈｉｕｍ（ヘキサン中において８．０ｍＬ、０．０２ｍｏｌ、２．５Ｍ）滴下された（ｄｒｏｐｗｉｓｅ）。黄色い溶液は急速に色がグリーンに変化した。溶液はゆっくりと−２０℃まで温められ（このプロセスの間、この溶液の色が黄色に戻ったなら、ＢｕＬｉをもう少し加える）次に、−７８℃まで冷却された。二酸化炭素（ＣＯ_２）ガスは、次に６時間溶液を通過して発泡された。ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）は真空で蒸発された。残留物は集められ水によって洗浄された。最終生成物はエタノールから再結晶することによって精製され、２．６５グラムを生じ、収率は４７．５％であった。

実施例６
ＰｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍｓＳａｌｔの一般的合成

ＮａＩ（１５．０ｇ、０．１ｍｏｌ）、Ｈ_２Ｏ（７．８０ｍｌ）及びＨＯＡｃ（２２．２ｍｌ）は、ｔｏｌｕｅｎｅ（１５０ｍｌ）中で、Ｎ，Ｎ−ｄｉａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎａｍｉｎｅ（０．１ｍｏｌ）、Ｐｈ_３Ｐ（２６．２ｇ、０．１ｍｏｌ）及びｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ（３．０ｇ、０．０３ｍｏｌ）の溶液に加えられた。結果として得られた混合物は２４時間還流された。Ｈ_２Ｏ（２００ｍｌ）が混合物に加えられ、抽出はＣＨ_２Ｃｌ_２を用いて行われ、有機層はＮａＨＣＯ_３で洗浄され、次に、Ｈ_２Ｏで洗浄され、その次に、ＭｇＳＯ_４上で乾燥された。次に、溶媒は蒸発された。残留物はエタノールから再結晶することによって精製された。ＰｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍｓＳａｌｔの実施例が表６に示されている。

化学式IVを有する典型的な蛍光染料の例としては以下のものがあるが、これらに限定されない：

蛍光染料及び他の市販の染料、そのピーク励起及び発光波長は極めて近接していることとは異なり、ＭＨ染料は約２００ｎｍピーク間を有する。

本発明の蛍光染料は、より優れた安定性又はより長い保存期限を示す。つまり、前記染料の蛍光発光の機能性は数か月間透明容器において室温で保管される場合、保たれる。本発明の蛍光染料は、電子供与部分又は電子受容部分が望ましく拘束された表面上で反応基と反応できるという条件で、任意の以下の表面、例えば、ガラス、ポリマー、金属又は任意の組合せで拘束されることができる。米国特許出願Ｎｏ．２００４／００４３５０８Ａ１は、その全開示内容は本明細書にすべて組み込まれたものとし、そこに開示されている表面は、本発明の蛍光染料を繋ぐために適した反応基を提供する。結果として生じる繋がれた表面は、蛍光染料で標識されるようになる。蛍光染料は前記表面に共有結合し、あらかじめパッケージされた蛍光染料で標識された分析装置を提供する機会を提供している。分析デバイスは、単一表面から反応領域としては次のようなものが挙げられる。単一表面では、蛍光染料が分析のためにサンプルを導入する注入口を含む高性能なデバイスに、標的物質を含んでいるかどうか分らないが、共有結合で結合している。反応領域と流体連結している流体では、蛍光染料は蛍光が存在するか又は存在しないかを評価できる反応領域に極めて接近して、検出器を有する反応領域に共有結合で結合している。適切な反応領域は下記によって実証されている：顕微鏡スライド、マイクロアレイ、フラスコ、キャピラリーチューブ、マイクロビーズ、ナノビーズ、マイクロウェルプレート、マイクロ流体導管、及びマイクロ流体リザーバー。分析デバイスは、さらに抽出物質のための反応領域と流体連結している流体に出口をさらに含んでもよい。注入口及び排出口は同じスペースを占め又は同じ構造であり得る。例えば、フラスコである。すなわち注入口及び排出口は互いに隔てられており又は異なる構造であり得る。例えば、フロースルーマイクロフルディックデバイスである。分析デバイスは複数の注入口、反応領域、検出器、及び出口を含むことができる。表面は繋ぐために必要とされる反応基を与えるために覆われることもある。例えば、ＧＡＰＳ^ＴＭ又はＵｌｔｒａＧＡＰＳ^ＴＭ（コーニング社の商標）スライドのような被膜された顕微鏡スライドは適切な表面を与えることができる。適切な表面はまたＥｐｉｃ^ＴＭ（コーニング社の商標）システムマイクロプレートによって提供され得る。表面は、薄膜であってもよく又は表面は他の構造を有する薄膜の組合せ、例えば、これらに限定されないが、一つ又は複数の薄膜を有するフラスコを含有することもある。蛍光染料は、当該技術分野において一般に用いられているがマイクロビーズ及びナノビーズの表面に蛍光染料が取り付けることによって生物学的アッセイにおいて標的物質用のフィルターとして使われることもある。表面は個々の用途について必要な環境・条件・構成を提供するために任意の形又は任意のサイズを取り得る。前記連結能力は、これらに限定されるわけではないが、ＰＣＲプレート又はマイクロプレートなどのような被膜された表面を通じて直接のＤＮＡの定量化を可能にする。表面に連結された本発明の蛍光染料はＤＮＡ生成が起こる処理、例えば、ＰＣＲを行うことによりＤＮＡが生成するプロセスによって、ＤＮＡの結合が起こると蛍光シグナルにおいて変化が生じる。この手法の利点のいくつかは、「表面上」の読み取りに対して感度が高く、その結果さらなる蛍光染料の追加を必要とせず、且つ、生じたＰＣＲ生成物は染料除去ステップを施さずに次の使用時に使うことができる。

本発明の蛍光染料は前記において説明したように、一本鎖ＤＮＡに対してより、二本鎖ＤＮＡに対してより感度が高い。生物学的アッセイの全体的な誘電定数に追加しながら、一本鎖ＤＮＡは蛍光染料に対してバッファを生じ、生物学的アッセイの全体的な誘電定数に加わります。二本鎖ＤＮＡは親水性及び疎水性の領域を有しており、前記領域は誘電状況を変化させ、従って、染料の蛍光発光に影響する。誘電状況変化に対するこの感度のために、本発明の蛍光染料は９６ウェルマイクロプレートにおいて最低検出限界（あるケースにおいては、約１０ｎｇ／ｗｅｌｌ）を有する。これらの染料は、誘電状況における変化に基づいて電子再組織化を通じて変化し、染料の蛍光が導入される。これら染料分子は、構造上、ほぼ平面である。平面構造は、電子供与部分と電子受容部分との間で共役したπ‐電子架橋を通じて維持される。これは、多くの市販の染料が分子再配向に基づいて変化し、電子再組織化に基づいては変化しないという点において、市販の蛍光染料とは異なる。

本発明の蛍光染料の溶解度は用途によって操作される（変えられる）。蛍光染料の親水性及び疎水性は電子供与部分及び電子受容部分の長さ及びサブスチチュートに基づいて変化する場合もある。典型的には、より長い構造はより低い親水性をもたらす傾向がある。溶解度は、本発明に開示されている様々な構造と関連する電子供与部分又は電子受容部分における官能基以外の官能基を変えることにより影響を受けることもある。従って、蛍光染料の溶解度は用途における特定の要件を満たすように調整することができる。

さまざまな改良及び変形が本発明の精神と範囲から逸脱することなく、本発明に対してなしえることは当業者であれば明らかであろう。すなわち、本発明は、ここに添付した特許請求の範囲及びそれらの均等の範囲において与えられる本発明の改良及び変形をカバーすることを包含している。

本発明は、添付の図面と一緒に読まれるとき、下記の詳細な説明により最大限に理解される。
バッファ中における特定の染料の励起スペクトル及び発光スペクトルを示す図である。ＨＥ−ＨＥ発光に対する一本鎖ＤＮＡ及び二本鎖ＤＮＡの効果を示す図である。プレートリーダーアッセイにおける一本鎖ＤＮＡ及び／二本鎖ＤＮＡに関する染料の性能を示す三つの図である。ＭＨ１、ＭＨ２、ＭＨ３染料のストークスシフトを示した図である。

Claims

化学式Iを有する蛍光染料であって：

式中：
・Ｄ_２は電子供与部分から成る群から選択される；
・Ｂ_１及びＢ_２は同一でも又は異なっていても良く、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、Ｃｌ、及びＦからなる群から選択される；
・Ａ_２は以下の化学式を有する電子受容部分である：

式中：
・Ｘ_８はＨ、ＣＨ_３、及び（ＣＨ_２）_ｎ６−Ｚ_２ ⁻からなる群から選択され、Ｚ_２ ⁻は一価のアニオンであり、さらにＺ_２ ⁻が存在するならば、Ｚ_１ ⁻は存在しない；ｎ_６は１から１０の正数である；
・Ｑ_３はＯ又はＳである；
・Ｚ_１ ⁻は一価のアニオンであり、Ｚ_１ ⁻が存在するならば、（ＣＨ_２）_ｎ６−Ｚ_２ ⁻は存在しない；
・ｎ_２は１から２の正数であることを特徴とする蛍光染料。
Ｚ_１ ⁻は、ＯＨ、ＳＨ、ＨＣＯ_３、ＨＳＯ_３、ＨＳＯ_４、Ｈ_２ＰＯ_４、Ｈ_２ＰＯ_４、ＰＦ_６、Ｆ、ＣＮＯ、ＳＣＮ、ｔｅｔｒａｐｈｅｎｙｌｂｏｒａｔｅ、ＢＨ_４、Ｃｌ、Ｉ、Ｂｒ、ＢＦ_４、Ｉ_３、ＮＯ_３、ＳＯ_３、ＢｒＯ、ＢｒＯ_２、ＢｒＯ_３、ＢｒＯ_４、ＩＯ、ＩＯ_２、ＩＯ_３、ＩＯ_４、ＣｌＯ、ＣｌＯ_２、ＣｌＯ_３、及びＣｌＯ_４からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の蛍光染料。
Ｚ₂ ⁻は、Ｏ、Ｓ、ＣＯ_２、ＰＯ_３、ＰＦ_６、Ｆ、ＳＯ_３、及びＮＯ_２から成る群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の蛍光染料。
化学式IIを有する請求項１に記載の蛍光染料。

式中：
・Ｘ_３はＨ、ＣＨ_３、ＯＨ，ＳＨ、−ＮＨ−、−Ｓｅ−、−Ｏ−、−Ｓ−、Ｆ、Ｃｌ、及びＣＨ_２から成る群から選択され、Ｘ_３がＨ、ＣＨ_３、ＯＨ、ＳＨ、Ｆ又はＣｌであるならば、Ｒ_３は存在しない。
・Ｘ_３がＨ、ＣＨ_３、ＯＨ、ＳＨ、Ｆ又はＣｌではないとき：
・Ｒ_３はＨ、ＣＨ_３、及び（ＣＨ_２）_ｎ４−Ｘ_６から成る群から選択され、Ｘ_６はＯＨ、ＳＨ及びＮＨ_２から成る群から選択され、ｎ_４は１から１０の正数である；
・Ｑ_３はＯ又はＳである；
・Ｂ_１及びＢ_２は同一でも異なっていてもよく、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、Ｃｌ、及びＦから成る群から選択される；
・Ｘ_８はＨ、ＣＨ_３、及び（ＣＨ_２）_ｎ６−Ｚ_２ ⁻から成る群から選択され、Ｚ_２ ⁻は一価のアニオンであり、Ｚ_２ ⁻が存在するならば、Ｚ_１ ⁻は存在しない；ｎ_６は１から１０の正数である。
・Ｑ_３はＯ又はＳである；
・Ｚ_１ ⁻は一価のアニオンであり、Ｚ_１ ⁻が存在するならば、（ＣＨ_２）_ｎ６−Ｚ_２ ⁻は存在しない。
化学式IIIを有する請求項１に記載の蛍光染料であって：

式中：
・ｔは１から８の正数である；
・Ｘ_４及びＸ_５は同一でも又は異なっていてもよく、Ｏ，Ｓ、Ｎ、ＮＨ、ＮＨ_２及びＳｅから成る群から選択される；
・ｎ_３は１から３の正数である；
・Ｂ_１及びＢ_２は同一でも又は異なっていてもよく、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、Ｃｌ、及びＦから成る群から選択される；
・Ｑ_３はＯ又はＳである：
・Ｚ_１ ⁻は一価のアニオンであり、Ｚ_１ ⁻が存在するならば、（ＣＨ_２）_ｎ６−Ｚ_２ ⁻は存在しない；
・Ｘ_８はＨ、ＣＨ_３及び（ＣＨ_２）_ｎ６−Ｚ_２ ⁻から成る群から選択され、Ｚ_２ ⁻は一価のアニオンであり、Ｚ_２ ⁻が存在するならば、Ｚ_１ ⁻は存在しない；ｎ_６は１から１０の正数である。
化学式IVを有する蛍光染料であって：

式中：
・Ｄ_１は電子供与部分である；
・Ｘ_１及びＸ_２は同一でも異なっていてもよく、Ｈ、ＣＨ_３、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ、Ｓｅ、Ｆ、Ｃｌ、及びＣＨ_２から成る群から選択され、ＸがＨ、Ｆ、又はＣｌであるならばＲ_１及びＲ_２は存在しない；
・ＸがＦ又はＣｌではないとき：
・Ｒ_１及びＲ_２は同一でも又は異なっていてもよく、Ｈ、ＣＨ_３、及びＣＨ_２−Ｑから成る群から選択され、ＱはＯＨ、ＳＨ、及びＮＨから成る群から選択され、又は、
・Ｒ_１及びＲ_２はＯ、Ｎ、及びＳから成る群から選択される少なくとも１つの環原子を有する炭素環構造又は複素環構造を形成する；
・ｎ_１は１から２の正数である；
・Ａ_１はカルボン酸及びカルボン酸の塩から成る群から選択された電子受容部分であることを特徴とする蛍光染料。
Ｄ_１は以下に示す化学式から成る群から選択される：

式中：
・Ｑ_１及びＱ_２は同一でも又は異なっていてもよく、ＣＨ_２，Ｏ，Ｓ及びＮＨから成る群から選択される。

式中：
・Ｘ_１１はＯ、Ｓ、及びＮから成る群から選択される；
・Ｒ_５及びＲ_６は同一でもよく異なっていてもよく、Ｈ、ＣＨ_３、及び（ＣＨ_２）_ｎ５−Ｘ_７から成る群から選択され、式中、Ｘ_７はＯＨ、ＳＨ、及びＮＨ_２から成る群から選択される。ｎ_５は１から１０の正数である；
・Ｘ_１１がＯ又はＳのとき、Ｒ_５及びＲ_６のうちの一方しか存在せず、他方は存在しないということを特徴とする請求項６に記載の蛍光染料。
Ａ_１は以下に示す化学式から成る群から選択される：

式中：
・Ｍは一価のカチオンである；

式中：
・Ｌは金属であることを特徴とする請求項６に記載の蛍光染料。
標的物質と請求項１に記載の蛍光染料を接触させるステップと蛍光染料を励起するステップと蛍光を検出するステップとを含む生物学的アッセイにおける標的物質の検出方法。
標的物質と請求項６に記載の蛍光染料を接触させるステップと蛍光染料を励起するステップと蛍光を検出するステップとを含む生物学的アッセイにおける標的物質の検出方法。
請求項１に記載の蛍光染料及び溶媒を含むことを特徴とする組成物
請求項６に記載の蛍光染料及び溶媒を含むことを特徴とする組成物
化学式Iの蛍光染料を合成する方法であって：

前記方法は：
過剰のヨードメタン（ｉｏｄｏｍｅｔｈａｎｅ）をメチルベンズチアゾール（ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｅ）に加えるステップと；
・メチルベンズチアゾール（ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｅ）塩を分離するステップと；
・メタノール中にメチルベンズチアゾール溶液を形成するためにメタノール中にメチルベンズチアゾール塩を溶解するステップと
・メタノール中で置換したベンズアルデヒド及びピペリジンをメチルベンズチアゾール溶液に加えるステップと
・溶液から反応生成物を分離し、溶液から固体を再結晶するステップを含み；
化学式I中において；
・Ｄ_２は電子供与部分から成る群から選択される；
・Ｂ_１及びＢ_２は同一でも又は異なっていてもよく、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、Ｃｌ、及びＦから成る群から選択される。
・Ａ_２は以下に示す化学式を有する電子受容部分である：

式中：
・Ｘ_８はＨ、ＣＨ_３、及び（ＣＨ_２）_ｎ６ ⁻Ｚ_２ ⁻から成る群から選択され、Ｚ_２ ⁻は一価のアニオンであり、Ｚ_２ ⁻が存在するならば、Ｚ₁ ⁻は存在しない；ｎ_６は１から１０の正数である：
・Ｑ_３はＯ又はＳである；
・Ｚ₁ ⁻は一価のアニオンであり、Ｚ₁ ⁻が存在するならば、（ＣＨ_２）_ｎ６ ⁻Ｚ_２ ⁻は存在しない；ｎ_６は１から１０の正数である；
・Ｑ_３は、Ｏ又はＳである；
・Ｚ₁ ⁻は一価のアニオンであり、Ｚ₁ ⁻が存在するならば、（ＣＨ_２）_ｎ６ ⁻Ｚ_２ ⁻は存在しない；
・ｎ_２は１から２の正数であることを特徴とする化学式Iの蛍光染料合成方法。
少なくとも1つの反応領域と少なくとも1つの検出器を含む分析デバイスであって、
前記反応領域は、特定の標的物質と接触するとき蛍光を発する染料を用いて共有結合で標識され、前記反応領域はサンプルと接触するために配置されており、前記検出器は蛍光が存在するか又は存在しないのかを検出するために前記反応領域に極めて近接して設けられることを特徴とする分析デバイス。
前記少なくとも１つの反応領域が、化学式Iを有する前記蛍光染料を用いて共有結合で標識されていることを特徴とする請求項１４に記載の分析デバイス。
前記少なくとも１つの反応領域は、化学式IVを有する前記蛍光染料を用いて共有結合で標識されていることを特徴とする請求項１４に記載の分析デバイス。
前記少なくとも１つの反応領域が蛍光染料を用いて共有結合で標識されたガラス表面を含むことを特徴とする請求項１４に記載の分析デバイス。
前記少なくとも１つの反応領域が蛍光染料を用いて共有結合で標識されたポリマー表面を含むことを特徴とする請求項１４に記載の分析デバイス。
前記少なくとも１つの反応領域は、蛍光染料を用いて共有結合で標識された金属表面を包含することを特徴とする請求項１４に記載の分析デバイス。
直列に配列された複数の反応領域をさらに含むことを特徴とする請求項１４に記載の分析デバイス。
平行な複数の反応領域をさらに含むことを特徴とする請求項１４に記載の分析デバイス。
前記少なくとも１つの反応領域は、顕微鏡のスライド、マイクロアレイ、フラスコ、キャピラリーチューブ、マイクロビーズ、ナノビーズ、マイクロウェルプレート、マイクロ流体の流路、及びマイクロ流体のリザーバーから成る群から選択されることを特徴とする請求項１４に記載の分析デバイス。