JP4194794B2 - 生化学反応体の検出方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、バイオチップを用いた生化学検体の検出方法の改良に係り、基板に配列されたプローブＤＮＡに例えば解放末端側が基板側に向くようにループ構造を取らせることで、目的ＲＮＡがある場合にハイブリダイゼーションが起こり、前記ループ構造が解消されて伸びることから、ハイブリダイズした目的の複合体（生化学反応体）を任意の標識で修飾することが可能となり、ハイブリダイゼーション並びに標識による修飾自体の精度が本来的に高く、高精度の生化学検体の検出が実現できる生化学反応体の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子検出の基本原理は、ＤＮＡが相補的な二重螺旋構造を形成することを利用するものである。Ａ（アデニン）とＴ（チミン）、Ｃ（シトシン）とＧ（グアニン）が対をなすことから、例えば、ＡＧＧＴＴＡＣのＤＮＡ配列を持つ遺伝子を検出するには、プローブとしてＴＣＣＡＡＴＧの配列を持つＤＮＡを作成し、サンプリング検体遺伝子中に目的遺伝子が存在すると、ＤＮＡハイブリダイゼーションによって、プローブＤＮＡの配列にＡＧＧＴＴＡＣの配列が結合して二重螺旋構造を取るため、これを検出することで目的ＤＮＡを容易に選別できることになる。
【０００３】
二重螺旋構造のＤＮＡを検出する方法として、検体ＤＮＡ（サンプリング遺伝子ＤＮＡ）に蛍光標識で修飾を施しておき、プローブＤＮＡと前記のＤＮＡハイブリダイゼーション操作を行い、二重螺旋構造を呈したＤＮＡ、すなわち蛍光シグナルを発するものを検出する、蛍光法が知られている。
【０００４】
蛍光標識としては、蛍光色素そのものの他、蛍光色素により直接染色された染色体、糖蛋白や糖脂質から切り出された糖鎖体を修飾したイオン性蛍光物質、あるいはタンパク質、核酸、酵素、細胞等を蛍光色素でタグ化するなど、種々方法並びに物質で蛍光を発する標識が提案されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上述のＤＮＡを初めとして検出対象となる生化学検体には、ＲＮＡ及び核酸類似構造物などの多種多様の構造物が想定される。これらの生化学検体を効率よく検出するには、プローブとして機能する所要の塩基配列を有するＤＮＡやＲＮＡ構造物を所要のガラス基板などの基板上に配列してチップ化し、かかるバイオチップを基本単位として目的検体を含む生化学検体とのハイブリダイゼーションを施し、当該ハイブリダイゼーションを完了した目的の複合体（生化学反応体）を確実に検出する必要がある。
【０００６】
検体側に蛍光標識を施す蛍光法を用い、前記バイオチップにハイブリダイゼーションを行いハイブリダイズしたＤＮＡを検出する方法では、蛍光標識による修飾操作が煩雑であること、また、施術者の技量によって前記ハイブリダイゼーション並びに標識による修飾効率が異なること、さらに種々条件で蛍光色素の光消失が発生すること、未反応吸着物によるバックグラウンドノイズの上昇で検出精度が低下すること等の問題が指摘されている。
【０００７】
この発明は、前記バイオチップを用いた生化学検体の検出方法の問題に鑑み、検出工程を再現性よく簡素化でき、測定者に過度の技量を要求することがなく、ハイブリダイゼーション並びに標識による修飾工程におけるそれぞれの施術並びに効率の精度を高め、最終的に目的検体の検出精度の向上が可能となる生化学反応体の検出方法の提供を目的としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、バイオチップを用いた生化学検体の検出精度の向上を目的に、ガラスなどの基板にプローブが多数配列されたバイオチップにおいて、プローブへ生化学検体をハイブリダイゼーションさせる方法、プローブへの蛍光標識などの標識による修飾方法について詳細に検討したところ、
１）ハイブリダイゼーションを完了して二重螺旋構造を形成したプローブを標識で修飾すると、ハイブリダイズしていないプローブへも修飾が行われて標識による検出が不能となるため、従来、予め検体側に標識による修飾を施しておき、ハイブリダイズした後に検体側の標識を検出することで目的検体を検出するが、条件設定の違いや施術者の技量などによりハイブリダイゼーション時に非特異的な吸着が生じて検出精度が変動低下すること、
２）生化学検体がＲＮＡ及び核酸類似構造物である場合、合成ＤＮＡ構造物と比較してプローブとの結合力が強く、かつ基板に多数のプローブＤＮＡが配列されているため、目的物以外との吸着やハイブリダイズの可能性が高くノイズが増大して目的生化学検体の検出精度が低下すること、
等の問題があることを知見し、これらを解消するには、かかるプローブが多数配列されるバイオチップにおいて、根本的に検出精度を向上させ得る新たな基本構造を与えなければならないことに着目した。
【０００９】
そこで発明者らは、基板にプローブが多数配列されたバイオチップにおいて、検出精度を向上させ得る新たな基本構造、すなわち基板上のプローブが目的の生化学検体とのみハイブリダイズできる構成を目的に種々検討し、ハイブリダイズしたプローブのみを標識で修飾することで基本的に検出精度を高めることが可能であることに着目し、またあえて容易にはハイブリダイズできないようにして目的の生化学検体とのみハイブリダイズするように構成して本来的な検出精度を高めておくことに着目し、検出精度を高めることが可能となるプローブ自体の構成について鋭意検討した。
【００１０】
その結果、発明者らは、ハイブリダイズしたプローブのみが他のハイブリダイズしていないプローブより外側へ伸びていると、その先端にのみ標識が修飾可能であること、またプローブの生化学検体と相補的に結合する主要部位が配列するプローブ内に潜り込んでいると容易にはハイブリダイズできないが、選択的にかつ確実に目的の生化学検体とのみハイブリダイズ可能であることに着目し、検出精度を高めるためにバイオチップに立体的な構造を与えることができる構成について検討したところ、基板表面に固定されない解放端側又はその標識による修飾を可能にした部位が基板上や表面近傍の基板側に位置するように、または生化学検体と相補的に結合する主要部位が基板側に位置するように、基板に配列するプローブにループ構造を採用することで、基本的に検出精度を高めることが可能であることを知見した。
【００１１】
また、発明者らは、かかるループ構造を有するプローブを基板に配列したバイオチップの構成は、生化学検体の検出操作において、前述の如く先に標識で修飾した生化学検体を用いてハイブリダイゼーションするのではなく、従来とは逆に生化学検体とのハイブリダイゼーションを行った後、ハイブリダイズしたプローブにのみ、かつその先端などの所要の箇所を標識で修飾することが可能となり、ハイブリダイゼーション時並びに標識による修飾時と、各工程での精度が向上して目的検体の検出精度が著しく向上するとともに、基本的に検出精度の向上のために各工程で施術者の技量を要求しないため、生化学検体の検出操作が比較的容易になることを知見した。
【００１２】
さらに、発明者らは、この発明によるバイオチップの構成は、ハイブリダイズしたプローブや検体にのみ選択的に標識による修飾が可能であることから、標識には従来の蛍光標識、蛍光色素を初め、Ｓｉを含む金属粒子、セラミックス粒子、化学発色体など任意の粒子を採用できること、また最初に設けた標識を目標にさらに別の標識で修飾でき、多重標識を形成できること、従って用いた標識の種類に応じて種々の標識の検出方法を採用でき、前記多重標識の場合は標識自体の大きさを目視可能な大きさや形態にすることが可能になり、生化学検体の性状に応じて最適な標識や検出方法を採用できることを知見し、この発明を完成した。
【００１３】
請求項１に記載の発明は、基板表面にプローブＤＮＡを配列する工程、ループ構造を形成しているプローブＤＮＡに生化学検体をハイブリダイゼーションする工程、ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後に２本鎖を形成したプローブＤＮＡを標識で修飾する工程、及び、前記標識を検出・識別する工程を有し、
ハイブリダイゼーションの実行前において、基板表面に配列されたプローブＤＮＡの解放端は、第２の標識で修飾可能な第１の標識で修飾されていると共に基板上又はその近傍の基板側に位置し、基板とループとの隙間の寸法が第２の標識の寸法より狭く構成されており、
ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後の修飾操作を第２の標識を用いて行い、２本鎖を形成してループ構造が解消されたプローブＤＮＡの解放端の第１の標識を第２の標識で選択的に修飾し、当該第２の標識を検出・識別することを特徴とする生化学反応体の検出方法である。
【００１４】
請求項２に記載の発明は、第２の標識が、金属微粒子（Ｓｉを含む）、セラミックス微粒子、蛍光標識、蛍光色素、色素、化学発色体のいずれかである請求項１に記載の生化学 反応体の検出方法である。
【００１５】
請求項３に記載の発明は、金属微粒子が、Ａｕ、Ａｌ、Ｔｉ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｍｏ、Ｓｉのいずれかである請求項２に記載の生化学反応体の検出方法である。
【００１６】
請求項４に記載の発明は、セラミックス微粒子が、ＳｉＯ ₂ 、ＴｉＯ ₂ 、ＺｒＯ ₂ 、Ａｌ ₂ Ｏ ₃ 、ＭｇＯのいずれかである請求項２に記載の生化学反応体の検出方法である。
【００１７】
請求項５に記載の発明は、第２の標識を検出・識別する方法が、光散乱法、ＳＰＲ分光法、化学発色法、蛍光検知法、イメージング処理法、目視法のいずれかである請求項１から請求項４のいずれかに記載の生化学反応体の検出方法である。
【００１８】
請求項６に記載の発明は、第２の標識を検出・識別する方法が目視法であり、第２の標識が、金属粒子（Ｓｉを含む）、セラミックス粒子、色素、染色体、糖鎖体、タンパク質、核酸、酵素、細胞のいずれかであり、第２の標識の粒径が５００ｎｍ以上である請求項１に記載の生化学反応体の検出方法である。
【００１９】
【発明の実施の形態】
この発明において、生化学検体はＲＮＡ及び核酸類似構造物でＤＮＡを除くものであり、例えば、核酸類似構造物としては、核酸のリボースあるいはリン酸ジエステル部位を修飾した分子やリボース−リン酸骨格をアミド結合に置き換えたペプチド核酸（ＰＮＡ）等がある。
【００２０】
この発明において、プローブＤＮＡにループ構造を与えるには、その製造過程中又は製造後にループ構造を形成していて基板に配列されるか、基板に配列する際にループ構造を形成するか、基板に配列後にループ構造を形成するように構成するか、いずれの構成、形成方法も採用できる。
【００２１】
例えば、プローブＤＮＡの所要の二箇所に相補的な二重鎖を形成可能な対をなす塩基の配列、一例として図ではＡとＴの箇所を予め形成しておき、図１Ａに示すごとく、基板１にプローブＤＮＡ１０を配列した際の固定端１１側近くにある塩基配列と解放端１２側近くにある塩基配列とで結合部１３が形成されてループ１４を生成することで、プローブＤＮＡ１０の解放端１２が基板１上あるいは基板１上面近傍に位置するように構成することができる。
【００２２】
また、図１Ｂに示す例は、基板１に配列したプローブＤＮＡ１０が、図１Ａと同様にプローブＤＮＡ１０の固定端１１側近くにある塩基の配列と解放端側近くにある塩基の配列とで結合部１３が形成されてループ１４を生成することで、標識３による修飾を可能にした部位、図では解放先端に設けたビオチン基２が基板１上あるいは基板１上面近傍に位置するように構成してある。
【００２３】
プローブＤＮＡにループ構造を形成するための前記した対をなす塩基の配列を設ける箇所を適宜設定することで、結合部１３箇所が先端側、中央あるいは固定端側と種々形態のループ構造を形成し得る。図２に示す例は、プローブＤＮＡ２０の解放端２２側の塩基と対をなす塩基配列をプローブＤＮＡ２０の中央部側に配置してある。
【００２４】
図２Ａに示す例は、対をなす塩基の配列をプローブＤＮＡ２０の中央部側に配置して、生化学検体と相補的に結合する主要部位２５が図１のプローブＤＮＡ１０構成例と比較してより基板１側へ向くようにループ２４を形成してある。
【００２５】
また、図２Ｂに示す例は、図２Ａと同様構成で標識による修飾を可能にした解放端２２に設けたビオチン基２が基板１上方に位置しており、図１Ｂに示す例と同様に標識３による修飾を可能にしたビオチン基２部分が、基板１との距離にかかわらず、プローブＤＮＡ２０の解放端２２側と対をなす塩基の配列部分、中央の結合部２３とループ２４部分にそして固定端２１と中央の結合部２３との間の脚２６部とで囲まれる形態であり、基板１とループ２４の隙間ｘが標識３の寸法より狭いと、解放端２２及びビオチン基２は基板１上でどのような向きであっても容易には標識３で修飾され難くなる。
【００２６】
この発明において、プローブＤＮＡには前述の如く、生化学検体と相補的に結合する主要部位がループ内に配列されるように、ループを形成する結合部、すなわちプローブＤＮＡの任意の二箇所に対をなす塩基の配列を適宜設けることが可能であり、前記ループを形成する結合部の位置やループの形状、あるいはプローブ解放端の向き等はいずれの構成も採用できることは上記の説明から明らかである。
【００２７】
例えば図３に示すごとく、ビオチン基２を設けた解放端２２がより基板１に近接するように結合部２３より解放端２２の間がより長い構成、図４に示すごとく、図３と同様構成で結合部２３より解放端２２の間がさらに長くかつビオチン基２が結合部２３側を向いている構成、さらに図５に示すごとく、図２Ｂに示す例と同様構成で、ループ２４部分がより基板１に近接するよう長くした構成等が採用できる。
【００２８】
さらに、図２の構成は、上述したように図１に比較して結合部２３をプローブＤＮＡ２０の中央に位置させるために脚２６を設けているが、ここは特に結合部２３の対をなす塩基の配列やループ２４部分の生化学検体と相補的に結合する主要部位２５とは無縁であるから、必ずしも塩基等の配列である必要はなく、公知の核酸類似構造物としたり、前記の基板１とループ構造の隙間ｘの設定のために他の分子構造体と置換したり、種々構成を採用できる。
【００２９】
また、この発明において、プローブＤＮＡには、複数の第２の標識による修飾を可能にした第１の標識で修飾された部位が基板上又はその近傍の基板側に位置するようループ構造を有する構成が採用でき、基板とループの隙間は第２の標識の外径より狭く、第２の標識がここを通過して第１の標識に容易に近接することができない程度の隙間となるように、前記の結合部を設ける箇所が適宜設定されるとよい。
【００３０】
プローブＤＮＡにおいて、目的の生化学検体と所要のハイブリダイゼーションが可能であり、かつ上述のごとく種々目的のループ構造を形成することが可能であれば、短鎖、長鎖を問わずいずれの塩基配列の構成であっても採用できる。また、この発明において、塩基数は特に限定しないが、比較的長鎖の構成を有するものが望ましく、例えば本来的に標識が修飾し難い塩基数が５０あるいは６０以上のものが検出精度の向上や検出時のノイズの低減に望ましく、さらに塩基数が１００を超えたり、１０００程度の場合であってもこの発明を適用できる。
【００３１】
この発明において、ループを形成する結合部として、プローブＤＮＡの任意の二箇所に対をなす塩基の配列を設ける例を説明したが、塩基の配列以外の例えば分子間結合が可能なもの、標識による修飾に用いた手段など、プローブＤＮＡ内に配置・配列可能であり、かつペアリングしてループを形成することが可能であれば、いずれの分子、構造物であっても利用できる。また、かかる結合部における結合力を、採用する塩基、分子種やその配置や長さにより適宜選定することも可能で、ハイブリダイゼーションや標識による修飾時における温度条件や他の分子構造物（検体など）との結合力等を考慮して、当該結合部における結合力をを選定できる。
【００３２】
この発明において、バイオチップを形成するための基板には、ガラス基板、樹脂基板、シリコン基板等の硬質材料の他、メンブラン（例えばニトロセルロースなど）等の材料も採用可能で、また積層基板などプローブＤＮＡの配列が実施可能な基板であればいずれの材質、構成の基板も採用できる。また、必要に応じて基板に貴金属薄膜など種々の薄膜を成膜する場合は、その表面粗度はできるだけ平坦なものが好ましい。
【００３３】
かかる薄膜を成膜する場合、基板の洗浄、乾燥方法としては、半導体ウエーハや各種デバイスを製造する際に採用される、各種溶剤による洗浄、純水中の超音波洗浄、各種酸溶液による洗浄、ブロー乾燥、スピン乾燥など公知の基板の洗浄、乾燥方法を適宜選択、組合せて採用できる。
【００３４】
入手や取扱いの良好なガラス基板としては、公知のホウケイ酸ガラス等が利用でき、厚みは厚いほうが取り扱いやすいが、バイオチップとしては目的に応じていずれの厚みのものも利用できる。
【００３５】
また、プローブＤＮＡの配列を容易にするため、基板上に金、白金、銀などの貴金属薄膜を設けることができる。成膜方法としては膜厚みを一定に制御するため、スパッタリング、イオンプレーティング、ＣＶＤ等の公知の気相成長による方法が好ましい。なお、基板と薄膜との密着性を向上させるために下地層を適宜成膜することができる。例えば、ガラス基板、石英基板にＣｒ層を設けたり、シラン化合物によって表面改質するなどの手段を採用できる。
【００３６】
この発明において、基板上あるいは所要薄膜表面にプローブＤＮＡを配列する工程は、特に限定されるものでなく、公知のいずれの方法も採用でき、例えば薄膜上を酸や純水で洗浄後、プローブＤＮＡと緩衝液を用いて飽和水蒸気雰囲気中で配列させることができる。
【００３７】
緩衝液としては、例えばＫＨ₂ＰＯ₄とＫ₂ＨＰＯ₄を配合して所要ｐＨにした溶液が採用できる。他には、ＰＢＳや、ＮａＣｌとＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ＮａＣｌとＴｒｉｓ−ＨＣｌとＥＤＴＡを用いるなど、所要ｐＨにするため公知の薬液を選定配合した溶液等も採用できる。
【００３８】
以下にこの発明による生化学反応体の検出方法を詳述する。まず、基本工程を説明すると、
・ 基板表面にプローブＤＮＡを配列する工程、
・ ループ構造を形成しているプローブＤＮＡに生化学検体をハイブリダイゼーションする工程、
・ ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後に２本鎖を形成したプローブＤＮＡ又は生化学検体あるいはその両方を標識で修飾する工程、
・ 前記標識を検出・識別する工程、を有する。
【００３９】
基板表面にプローブＤＮＡを配列する工程は、前述した基板の構成、プローブＤＮＡの構成、プローブＤＮＡの配列方法において、明らかにしたとおりである。
【００４０】
ループ構造を形成しているプローブＤＮＡに生化学検体をハイブリダイゼーションする工程は、特に限定されるものでなく、公知のいずれの方法も採用でき、例えば基板の洗浄後に生化学検体と緩衝溶液を用いてハイブリダイゼーションさせることができる。前記の緩衝溶液としては、例えばＮａＣｌとＴｒｉｓ−ＨＣｌを配合して所要ｐＨに保持した溶液が採用できる。
【００４１】
ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後に２本鎖を形成したプローブＤＮＡ又は生化学検体あるいはその両方を標識で修飾する工程は、文字どおり２本鎖を形成したところのプローブＤＮＡか生化学検体、あるいはそれぞれに所要の標識で修飾するもので、２本鎖を形成して複合体となっている両者の結合部に選択的に入り込むようなインターカレーターを標識とするものではない。
【００４２】
この発明において、前記標識には、Ｓｉを含む金属粒子、セラミックス粒子、蛍光標識、蛍光色素、色素、化学発色体、あるいは生化学検体の検出に利用されている染色体、糖鎖体、タンパク質、核酸、酵素、細胞など、プローブＤＮＡ又は検体ＲＮＡに修飾できるもの、さらに前記の各種標識で再修飾できればいずれのものも利用できる。
【００４３】
金属粒子標識は、Ｓｉを含み、Ａｕ、Ａｌ、Ｔｉ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｍｏなどの各種金属の微粒子を用いるもので、特に微粒子の形状や粒径寸法や均一性は任意に適宜選択できる。特に必須条件ではないが、プローブＤＮＡや検体のＲＮＡなどの所要部位を修飾可能とすること、微粒子表面に成膜可能なことなどから、５μｍ以下、さらに１μｍ以下が好ましく、数ｎｍ〜数百ｎｍの範囲で所定粒径が均一でかつ工業安定的に得られる微粒子が好ましい。
【００４４】
セラミックス粒子標識には、球形や固有の結晶体など、公知のいずれの形態も採用できるが、微粒子表面には成膜可能なことなどから、５μｍ以下、さらに１μｍ以下が好ましく、検出方法に応じて数ｎｍ〜数百ｎｍの範囲で所定粒径が均一でかつ工業安定的に得られるＳｉＯ₂、ＴｉＯ₂、ＺｒＯ₂、Ａｌ₂Ｏ₃、ＭｇＯなどのセラミックス微粒子が好ましい。
【００４５】
蛍光標識には、公知のいずれの形態も採用でき、市販されている蛍光色素によりタグ化された染色体、糖鎖体、タンパク質、核酸、酵素、細胞、微粒子等を標識自体の性質を利用したり後述のごとく抗原−抗体反応を利用して修飾することが可能である。また、この発明では蛍光自体は必須でないため、蛍光標識等に利用されている染色体、糖鎖体、タンパク質、核酸、酵素、細胞をそのまま利用することも可能である。また、蛍光でない色素も標識として利用できる。
【００４６】
この発明において化学発色体は、発色反応に関与するものを標識として修飾するもので、酵素法等の化学的発色をさせる方法に用いる物質をいい、例えばビオチン誘導体で修飾した箇所を用意することで容易に実施できる。
【００４７】
この発明において、上述の各種標識でプローブＤＮＡを修飾する方法としては、例えば金属微粒子等の粒子自体の性質を利用したり、公知の蛍光標識で修飾する方法などのように抗原−抗体反応を利用して修飾するなど、公知のいずれの方法も採用できる。また、中性のコロイダル液のごとく、微粒子を均一分散させた溶液の形態を利用することで修飾が容易になる。
【００４８】
また、プローブＤＮＡの末端をビオチンで修飾しておき、ストレプトアビジンをコートした金属やセラミックス等の微粒子をビオチン−アビジンの高い結合能力を利用して標識となすことができる。さらに、プローブＤＮＡの末端にＩｇＧや抗プロテイン物質を付加することで、タンパクをコートした前記微粒子等で抗原−抗体反応を利用して修飾することが可能である。
【００４９】
さらに、生化学検体を前記各種の標識で修飾することが可能であり、修飾方法は、当該検体の所要箇所を適宜標識化できればよく、上述の公知のいずれの方法も採用でき、特に末端を修飾するには上述の方法などいずれの方法も採用できる。
【００５０】
この発明において、上述の各種標識を検出・識別する工程は、用いた標識に応じて適宜選定できることが特徴であり、光散乱法、ＳＰＲ分光法、化学発色法、蛍光検知法、イメージング処理法、目視法などを採用することができる。例えば、金属微粒子標識を検出する方法としては、ＳＰＲ分光法、光散乱法、磁気検出法、顕微鏡観察法、微分干渉顕微鏡を用いた顕微鏡画像解析装置などが利用できる。
【００５１】
光散乱法は、金属粒子やセラミックス微粒子標識において、微粒子が反射する光で特定波長光を発したり、レーザー光による散乱光の検知を可能にするもので、一般的な構成例を説明すると、例えばこの発明による金薄膜を設けた検出チップ基板をプリズム上に載置し、Ｈｅ−Ｎｅレーザー光をプリズムの一方側より基板裏面に入射してプリズムの他方側へこれを全反射させるように条件設定することで、検出チップ基板を上面から観察するＣＣＤカメラ側に散乱光を検出することができる。
【００５２】
また、セラミックス微粒子自体が有する可視光下での特定色を検出したり、特定粒径のセラミックス微粒子に対して特定波長の光を照射して特定色を発光させてこれを検出するなど、前記セラミックス微粒子の種類やその粒径や性状等、条件に応じて公知の検出方法や装置を適宜選定するとよい。
【００５３】
ＳＰＲ分光法は、貴金属薄膜表面おける屈折率変化を検出するもので、例えばガラス基板上に金薄膜を形成し、金薄膜上にプローブＤＮＡを固定化し、プローブＤＮＡが検体中の目的ＲＮＡとのハイブリダイゼーションにより二本鎖を形成すると、金薄膜上の屈折率が変化するためにＳＰＲ角（反射率が最小となる入射角度）がシフトするが、ＳＰＲ角のシフトはハイブリダイゼ一ションした目的ＲＮＡの量と対応するために、ＳＰＲ測定によってＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションの定量的な解析が可能となる。
【００５４】
具体的に説明すると、基板の貴金属薄膜表面にプローブＤＮＡを配列してバイオチップを作製し、ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後のプローブを貴金属コロイドや金属粒子等の標識で修飾するもので、末端を標識への接着部位で修飾したプローブは、ループ（ヘアピン）構造を取る場合は標識が全く接着できないこと、このループ構造を取るプローブはその立体的構造により選択的に目的検体とハイブリダイズすることで基本的な検出精度が向上し、また、目的検体とのハイブリダイゼーション反応によってＤＮＡ鎖が伸びた状態になり、ハイブリダイズされたプローブＤＮＡに選択的に標識による修飾が行われることで、前述のＳＰＲ角のシフトを増幅でき、高精度の検出が可能になる。
【００５５】
この発明において、ハイブリダイゼーション後に２本鎖を形成したプローブ−生化学反応体（複合体）をＳＰＲ分光法にて検出する工程は、液中あるいは大気中のいずれも可能である。ＳＰＲ法の測定システムとしては、公知のいずれの構成も採用可能である。例えば実施例では、光源としＨｅ−Ｎｅレーザー（波長６３２．８ｎｍ）を用い、偏光子によってｐ−偏光としプリズムを介して全反射条件で貴金属薄膜基板に照射し、基板からの反射光をフォトダイオードにより検出し、得られた信号は、光チョッパー、ロックインアンプを用いて外部ノイズを取り除き増幅を行うことができる。なお基板は、屈折率整合剤を介してプリズム上に付着させ回転ステージ上に固定し、この回転ステージを回転させて入射角の変化を得ることができ、また、その際、フォトダイオードも基板を固定した回転ステージと同調させ回転、移動させることができる。
【００５６】
化学発色法は、免疫組織染色方法が応用できる。これは予め４つの結合部位をもつアビジンと複数箇所でビオチン化されたペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を適当な割合で混合し、多数のＨＲＰを含み一部にアビジンのビオチン結合部位を残す複合体（ＡＢＣ）を形成させて、この複合体（ＡＢＣ）と予め組織中の標的抗原と結合したビオチン化抗体とを反応させて標的抗原を検出するもので、例えばプローブにビオチンで修飾した箇所を用意することで容易に適用できる。また、ＡＰＲ法など公知の免疫組織染色方法も応用できる。
【００５７】
蛍光検知法は、種々の蛍光色素自体を所要部位に着設したり、又は蛍光色素によりタグ化された染色体、糖鎖体、タンパク質、核酸、酵素、細胞、微粒子等を標識自体の性質を利用したり前述のごとく抗原−抗体反応を利用して修飾した物を検出するが、顕微鏡とＣＣＤカメラを組み合せた蛍光イメージング検出システム、共焦点顕微鏡システム等、また種々の光学装置やイメージング装置を併用した検出方法が提案されており、前記蛍光標識の種類やその蛍光自体の性状等、条件に応じて公知の検出方法や装置を適宜選定するとよい。また、蛍光でない色素も同様に検知できる。
【００５８】
要するに顕微鏡観察法は、公知の蛍光や散乱光の検出システムとして、顕微鏡とＣＣＤカメラを組み合せたイメージング検出システム、共焦点顕微鏡システム、金属顕微鏡等、また種々の光学装置やイメージング装置を併用した検出方法が提案されているが、これらをそのまま利用することが可能である。
【００５９】
イメージング処理法は、カメラ又は顕微鏡にてスキャニングした画像をディスプレイで目視で確認できるように拡大、鮮鋭化、着色化等、各種の公知の画像処理を施したり、あるいはコントラストや特定形状、寸法の粒子をソフトウェアー的に検出するために公知の画像処理を施すなどの方法である。
【００６０】
目視法は、この発明のバイオチップがハイブリダイゼーションしたプローブＤＮＡと目的検体のみを粒子標識で修飾できることから可能になるものであり、詳述した各種の標識粒子の集合体を目視にて観察し、目的検体の有無を検出するものである。
【００６１】
この発明において、標識は上述のごとく独自の色や形を有しており、これらは集合して目視可能になるもので、検出に際しての第１の標識と第２の標識がそれぞれプローブ又は検体に設けられる場合はこれらを目視することになる。また、第１の標識をターゲットにして第２の標識で修飾する場合は、第１の標識と第２の標識の両方を目視することになるが、第１の標識が目視できないような場合は第２の標識のみを目視することになる。
【００６２】
また、上述の第１の標識で修飾してさらにそれを目標として第２の標識で修飾する２段階修飾、あるいは先に修飾した標識にさらに修飾を繰り返す多段修飾を行って、目視可能な標識粒子の集合体となすことが可能である。
【００６３】
この発明において、２本鎖を形成したプローブＤＮＡ及び生化学検体とループ構造を取っている他プローブＤＮＡとを高さの違いで検出・識別する方法には、標識による修飾の有無にかかわらず、例えば半導体ウェーハやデバイスの表面性状や形状、表層部を評価するために採用されている公知の各種計測評価方法並びにその装置を適宜利用することが可能である。
【００６４】
例えば、電子線計測評価手法として、電子顕微鏡を用いた視野法、電子回折法など、Ｘ線計測評価手法として、Ｘ線回折法、Ｘ線トポグラフ、表面回折法、Ｘ線干渉法など、電界磁界計測評価手法として、走査型トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）、走査トンネル分光（ＳＴＳ）、ＳＴＭファミリーのＡＦＭなど、光学的計測評価手法として、光伝導法、光学顕微鏡法などがある。さらに、Ｘ線顕微鏡観察法、レーザー顕微鏡観察法も利用できる。雰囲気も上記の評価方法により異なるが、真空中、大気中又は所要溶液中のいずれでも評価できる。
【００６５】
また、基板に前記手法の検査対象であるシリコンウェーハを用いたり、標識の種類や性質を利用して前記手法の検出対象や信号発生源等にすることもできる。また、前記の各種評価方法において、得られた信号、画像や回折像をさらに画像処理化して３次元画像化する公知の手法や装置を併用して、ハイブリダイゼーション後の２本鎖を形成したプローブＤＮＡとループ構造を取っている他プローブＤＮＡとの高さの違いを検出、識別することができる。
【００６６】
以上詳述したこの発明によるバイオチップを用いた生化学反応体の検出方法において、１）ループ構造を形成しているプローブＤＮＡを予め標識で修飾した生化学検体をハイブリダイゼーションする工程、２）ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後に２本鎖を形成したプローブＤＮＡ又は生化学検体あるいはその両方を標識で修飾する工程、３）前記標識を検出・識別する工程を採用することも可能である。
【００６７】
又、同様に生化学反応体の検出方法において、１）前記のループ構造を形成しているプローブＤＮＡを予め標識で修飾した生化学検体をハイブリダイゼーションする工程、前記標識を検出・識別する工程を採用することも可能である。
【００６８】
【実施例】
実施例１
検出目標には、キャンピロバクター・ジェミニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ）Ｏ−１９血清型ｇｙｒＢ遺伝子変異部周辺の８５６ｂｐより、イン・ビトロ（ｉｎ Ｖｉｔｒｏ）ＲＮＡ合成法により作製し、精製した約８００塩基のＲＮＡを用いた。
【００６９】
プローブＤＮＡには、前記ＲＮＡの中央部で相補的に結合する中央６０塩基のＤＮＡを作製した。又、比較のために前記ＲＮＡと末端部で相補的に結合する末端３０塩基、中央部で相補的に結合する中央３０塩基の２種類のＤＮＡとしてプローブＤＮＡを作製した。なお、３０塩基のものは同一鎖内でループを形成しないように、本願発明の６０塩基のものは同一鎖内でループを形成するように構成した。
【００７０】
ガラス基板をアセトン、メタノール、超純水中で超音波洗浄した後、１０％フッ酸で表面を２０秒間エッチングを行ない、さらに、アセトン、メタノール、超純水中で超音波洗浄した後、窒素ガスで乾燥させた。その後、スパッタ装置（ＵＬＶＡＣ）を用いガラス基板にまず約１ｎｍ厚みのＣｒ層を設け、さらに約５０ｎｍ厚みのＡｕ層を設けた。
【００７１】
前記基板を濃硫酸中１〜２時間浸漬後、超純水で洗浄した後、前記３種のプローブＤＮＡ、の３'端側をＳＨ（チオール）基で、５'端側をビオチン基で修飾したプローブＤＮＡ−Ｄ−ＢＦＲ溶液（ＫＨ₂ＰＯ₄、Ｋ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ ７．０）を基板上に滴下し、飽和水蒸気中に約１５時間放置し、プローブＤＮＡをガラス基板の金薄膜上に付着させて検出用バイオチップとなした。
【００７２】
ハイブリダイゼーションは、Ｒ−ＢＦＲ溶液（ＮａＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ７．４）とＨ−ＢＦＲ溶液（ＮａＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．４）で洗浄後に、乾燥せずに検体ＲＮＡのＨ−ＢＦＲ溶液を所要濃度となるように滴下し、約１６〜２４時間放置して実施した。
【００７３】
前記チップ上のこの発明のスポットと比較のスポットの３種に対して、前記ＲＮＡ鎖を用いてハイブリダイゼーションを実施した後、アビジンをコートした蛍光微粒子でプローブに対して修飾した。その後、蛍光倒立顕微鏡とＣＣＤカメラを用いてハイブリダイゼーションの検出、すなわち蛍光の検出を実施した。
【００７４】
また、３種のスポット（プローブ）に対して、前記ハイブリダイゼーションを実施することなく、アビジンをコートした蛍光微粒子で蛍光標識による修飾処理を行い、その後蛍光の検出を実施した。
【００７５】
塩基数３０のプローブＤＮＡにおいては、ループ構造を有していないため、目的ＲＮＡとのハイブリダイゼーション前後でいずれも蛍光発光が観測され、ハイブリダイゼーションの有無にかかわらず蛍光標識による修飾が可能であること、すなわち目的ＲＮＡの検出が困難であることを確認した。
【００７６】
一方、塩基数６０のプローブＤＮＡにおいては、目的ＲＮＡとのハイブリダイゼーション前では蛍光標識による修飾が全くできず、ハイブリダイゼーション後では目的ＲＮＡとのハイブリダイゼーションが行われたプローブからのみ強い蛍光を観測することができ、塩基数６０のプローブはループ構造を有しており、ハイブリダイズしたプローブにのみ、その先端を標識で修飾することが可能であり、目的ＲＮＡの検出が容易であることが確認できた。
【００７７】
実施例２
検出目標には、基本的に実施例１と同じ約８００塩基のＲＮＡを用いた。また、プローブＤＮＡには実施例１と同じ構成のものを用いて、実施例１と同様のガラス基板に同様条件で配列してバイオチップを作製した。
【００７８】
ここで標識による修飾方法として採用した金コロイド修飾方法は、上記のバイオチップをハイブリダイゼーション後にＲ−ＢＦＲ溶液で洗浄し、窒素ガスでおだやかに乾燥させ、表面にアビジンをコートした金コロイド（粒径１０ｎｍ、ＳＩＧＭＡ製）を滴下し１〜３時間、飽和水蒸気中で放置することで、ビオチンとアビジンの特異的結合を利用して修飾した。
【００７９】
また、金属微粒子修飾は、プローブの５'端側とビオチン−アビジン結合させるため、予めアビジンコートした平均粒径が１μｍ程度のＦｅ微粒子を用いて、ｐＨ ７．４のコロイダル液となして実施した。
【００８０】
前記の長いＲＮＡ鎖を用いて実施例１と同様にハイブリダイゼーションを実施した後、金コロイド修飾又は金属微粒子修飾を行い、その後ＳＰＲ測定を行った。また比較のため、同時に目的ＲＮＡを有しないＨ−ＢＦＲ溶液をプローブＤＮＡと反応させた後、標識による修飾処理をしてからＳＰＲ測定を行った。なお、ＳＰＲ測定は、バイオチップをＲ−ＢＦＲ溶液で洗浄後に窒素ガスで穏かに乾燥し、その後速やかにＳＰＲ測定を行なった。ＳＰＲ測定はイメージングシステムを用いて行った。
【００８１】
その結果、目的ＲＮＡとハイブリダイゼーションしたプローブＤＮＡのみに選択的に金コロイド修飾及び金属微粒子修飾が可能であり、従って、ＳＰＲ角度シフト増幅が可能で、ハイブリダイゼーションの検出が可能であることを確認した。さらに、前記金コロイド修飾と同様方法でストレプトアビジンで修飾した場合も同様に目的ＲＮＡとハイブリダイゼーションしたプローブＤＮＡのみに選択的に修飾が可能であった。
【００８２】
さらに、比較のため、前記ハイブリダイゼーションを実施することなく、アビジンをコートしたＦｅ微粒子標識による修飾処理を行った。しかし、目的ＲＮＡとのハイブリダイゼーション前ではＦｅ微粒子標識による修飾が全くできず、ハイブリダイゼーション後ではＦｅ微粒子標識による修飾が行われ、ハイブリダイゼーション前後で明らかな差が見られた。
【００８３】
また、上記のハイブリダイゼーションを実施する際に、目的ＲＮＡがある場合と、ない場合を設定して、Ｆｅ微粒子コロイダル修飾を行い、その後、微分干渉顕微鏡にて観察を行った。目的ＲＮＡがある場合には、Ｆｅ微粒子が多数観察されたが、目的ＲＮＡがない場合には、Ｆｅ微粒子はほとんど観察されなかった。なお、前記バイオチップのいずれの場合も、表面に粒状感のあるなしで明確に目的ＲＮＡの存在を目視で区別することができた。
【００８４】
実施例３
実施例２において、プローブＤＮＡの修飾に、前述の金又はＦｅ微粒子に換えて、ビオチン基で修飾したプローブの５'端側とシリカ粒子とをビオチン−アビジン結合させるため、予めアビジンコートしたシリカ粒子を用いて、ｐＨ ７．４のコロイダルシリカとなして実施した。コロイダルシリカとしては粒径が１００ｎｍ〜８００ｎｍの種々粒径のものを用いた。
【００８５】
ハイブリダイゼーションの検出は、検出チップをプリズム上に載置し、Ｈｅ−Ｎｅレーザー光をプリズムの一方側より基板裏面に入射してプリズムの他方側へこれを全反射させて、検出チップ上面から観察するＣＣＤカメラで散乱光強度を検出する方法で実施した。
【００８６】
また、比較のため、前記ハイブリダイゼーションを実施することなく、アビジンをコートしたシリカ微粒子標識による修飾処理を行った。その結果、目的ＲＮＡとのハイブリダイゼーション前では、シリカ微粒子標識による修飾が全く実施できず、散乱光を観測することができなかったが、ハイブリダイゼーション後では目的ＲＮＡとのハイブリダイゼーションが行われたプローブＤＮＡからのみ強い散乱光を観測することができた。また、いずれの粒径のシリカ粒子の場合も同様に目的ＲＮＡの検出が可能であった。
【００８７】
実施例４
実施例２において、プローブＤＮＡの修飾に、前述の金又はＦｅ微粒子コロイダル修飾に換えて、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体を用いるＡＢＣ法による化学発色（酵素）法を実施した。すなわち、前記複合体を滴下して室温で１ｈｒ放置した。その後、ＴＢＳ−Ｔ（Ｔｗｅｅｎ２０添加Ｔｒｉｓ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）で洗浄し、テトラメチルベンジン溶液を滴下し、５〜１５ｍｉｎ、室温で放置した。
【００８８】
その後、超純水にて洗浄し、窒素ガスにて乾燥させた。その結果、目的ＲＮＡがある場合は発色したが、目的ＲＮＡがない場合は発色せず、明確に目視にて識別することができた。
【００８９】
又、同じバイオチップを用い、上記のＡＢＣ法に換えてアビジンをコートした色素を滴下し、室温〜３７℃、飽和水蒸気中で１〜２時間の修飾を行った。その後、ＴＢＳで洗浄し、窒素ガスにて乾燥させたところ、目的ＲＮＡがある場合は着色したが、目的ＲＮＡがない場合は着色せず、明確に目視にて目的ＲＮＡを検出できた。
【００９０】
上記実施例において、実施例２と同等のバイオチップを用い、ハイブリダイゼーション後アビジンをコートした色素を滴下し、室温〜３７℃、飽和水蒸気中で１〜２時間の修飾を行った。その後、ＴＢＳで洗浄し、さらに、予め染色されたタンパクをビオチンで修飾した第２の標識を、上記条件と同様に滴下して、修飾処理した。その後ＴＢＳで洗浄し、乾燥させたところ、目的ＲＮＡがある場合は上記の色素のみに比較して強く着色し、また目的ＲＮＡがない場合は着色せず、明確に目視にて目的ＲＮＡを確認することができた。
【００９１】
実施例５
実施例３のコロイダルシリカとしては粒径が１００ｎｍの粒径のものを用い、ハイブリダイゼーションを検出する方法として、ＳＴＭ、ＳＴＳ、ＡＦＭの３種を実施した。目的ＲＮＡとのハイブリダイゼーション前ではシリカ微粒子標識による修飾が全く実施できず、ハイブリダイゼーション後ではシリカ微粒子標識による修飾が行われたことから、ハイブリダイゼーション前後で１１０ｎｍ〜３００ｎｍの段差を確認した。なお、ハイブリダイゼーション後に標識による修飾を行わない場合は、目的ＲＮＡとハイブリダイズせずにループ構造をとっているプローブＤＮＡとハイブリダイズして２重鎖を形成したプローブＤＮＡとで１５ｎｍ〜３００ｎｍの段差を確認した。又、いずれの検出方法でも画像処理化することで、バイオチップ表面に段差があるかないかを簡単に確認できた。
【００９２】
また、実施例２の平均粒径が１μｍ程度のＦｅ微粒子のコロイダル修飾において、ハイブリダイゼーションを検出する方法として、走査反射電子顕微鏡による観察を実施したところ、目的ＲＮＡがある場合とない場合で１０００ｎｍ〜１０５０ｎｍの段差を確認した。
【００９３】
【発明の効果】
この発明によるループ構造を有するプローブＤＮＡを基板に配列したバイオチップの構成は、生化学検体の検出操作において、従来とは逆に生化学検体とのハイブリダイゼーションを行った後に、標識による修飾を行い、ハイブリダイズしたプローブにのみ、かつ所要の箇所を標識で修飾することが可能となり、ハイブリダイゼーション時並びに標識による修飾時と、各工程での精度が向上して目的検体の検出精度が著しく向上する。
【００９４】
一般に、生体内現象を捉えるためには、ＤＮＡではなく、ｍ−ＲＮＡの発現量を調べる必要があるとされるが、上述のようにループ構造を利用したこの発明のプローブはバックグラウンドノイズが低く高感度のため、ｍ−ＲＮＡの動向をｃ−ＤＮＡを作製することなく、直接検出可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ａ，Ｂはこの発明によるプローブＤＮＡのループ構造を示す説明図である。
【図２】 Ａ，Ｂはこの発明によるプローブＤＮＡのループ構造を示す説明図である。
【図３】 この発明によるプローブＤＮＡの他のループ構造を示す説明図である。
【図４】 この発明によるプローブＤＮＡの他のループ構造を示す説明図である。
【図５】 この発明によるプローブＤＮＡの他のループ構造を示す説明図である。
【符号の説明】
１ 基板
２ ビオチン基
３ 標識
１０，２０ プローブＤＮＡ
１１，２１ 固定端
１２，２２ 解放端
１３，２３ 結合部
１４，２４ ループ
１５，２５ 主要部位
２６ 脚
ｘ 隙間

Claims (6)

1. 基板表面にプローブＤＮＡを配列する工程、ループ構造を形成しているプローブＤＮＡに生化学検体をハイブリダイゼーションする工程、ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後に２本鎖を形成したプローブＤＮＡを標識で修飾する工程、及び、前記標識を検出・識別する工程を有し、
   ハイブリダイゼーションの実行前において、基板表面に配列されたプローブＤＮＡの解放端は、第２の標識で修飾可能な第１の標識で修飾されていると共に基板上又はその近傍の基板側に位置し、基板とループとの隙間の寸法が第２の標識の寸法より狭く構成されており、
   ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後の修飾操作を第２の標識を用いて行い、２本鎖を形成してループ構造が解消されたプローブＤＮＡの解放端の第１の標識を第２の標識で選択的に修飾し、当該第２の標識を検出・識別することを特徴とする生化学反応体の検出方法。
2. 第２の標識が、金属微粒子（Ｓｉを含む）、セラミックス微粒子、蛍光標識、蛍光色素、色素、化学発色体のいずれかである請求項１に記載の生化学反応体の検出方法。
3. 金属微粒子が、Ａｕ、Ａｌ、Ｔｉ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｍｏ、Ｓｉのいずれかである請求項２に記載の生化学反応体の検出方法。
4. セラミックス微粒子が、ＳｉＯ₂、ＴｉＯ₂、ＺｒＯ₂、Ａｌ₂Ｏ₃、ＭｇＯのいずれかである請求項２に記載の生化学反応体の検出方法。
5. 第２の標識を検出・識別する方法が、光散乱法、ＳＰＲ分光法、化学発色法、蛍光検知法、イメージング処理法、目視法のいずれかである請求項１から請求項４のいずれかに記載の生化学反応体の検出方法。
6. 第２の標識を検出・識別する方法が目視法であり、第２の標識が、金属粒子（Ｓｉを含む）、セラミックス粒子、色素、染色体、糖鎖体、タンパク質、核酸、酵素、細胞のいずれかであり、第２の標識の粒径が５００ｎｍ以上である請求項１に記載の生化学反応体の検出方法。

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