CN113293197A - 一种检测疾病核酸标志物的spr-sers双模传感器、其制备方法及其应用 - Google Patents

一种检测疾病核酸标志物的spr-sers双模传感器、其制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测疾病核酸标志物的SPR‑SERS双模传感器、其制备方法及其应用。该SPR‑SERS双模传感器通过提取暗场显微图像中暗场颜色的积分光密度来实现SPR传感模式，并通过获取ROX分子和4‑巯基苯甲酸(4‑MBA)分子的SERS特征峰的强度比值来实现比率型SERS传感模式。对于miRNA‑652检测，第一试剂、第二试剂和第三试剂中的核酸单链C、H1和H2为针对miRNA‑652设计的核苷酸序列不同的DNA链。本发明公开的SPR‑SERS双模传感器制备简单、检测灵敏度高、可靠性好，SPR传感模式和SERS传感模式对于血清中核酸检测的检出限均可达到飞摩尔每升量级，可实现在复杂生物样品中检测疾病相关的核酸标志物。

Description

一种检测疾病核酸标志物的SPR-SERS双模传感器、其制备方 法及其应用
技术领域
本发明属于生物检测和光谱学检测领域，具体涉及一种用于胃癌核酸标志物miRNA-652检测的SPR-SERS双模传感器及其制备方法与应用。
背景技术
痕量核酸的准确检测对于疾病早期相关生物标志物的可靠分析至关重要，在疾病诊断、治疗和发病机制中起着重要作用。然而，由于核酸序列的某些细微变化而引起的遗传变异会产生显著的生物学效应。因此，发展超灵敏和可靠的方法来检测与低丰度疾病有关的生物标志物至关重要，并正成为一种不可阻挡的趋势。传统的分析方法如Northern印迹杂交、微阵列技术、实时定量聚合酶链式反应(PCR)等被广泛应用于核酸检测。除了这些传统方法外，各种光电生物传感器还通过与不同的纳米材料耦合或信号放大策略结合，用于核酸检测。由于疾病早期核酸标志物丰度低，样本成分复杂，单一模式检测易出现漏诊或诊断错误。因此，发展多种传感模式结合的检测策略以提高核酸测定的灵敏度和特异性是非常必要的。
近年来，表面等离子体共振(SPR)、表面增强拉曼散射(SERS)等基于等离子体的传感技术因其能够以微量、低成本、易操作等优势提供高灵敏、无标记的检测而受到广泛的研究关注。迄今为止，在单一模式检测的基础上，已有许多工作通过设计优越的等离子体纳米结构或提高生物分子修饰的纳米界面的生物活性以获得更高的灵敏度。然而，随着灵敏度的提高，传感器的可靠性可能被牺牲，因为异常的灵敏度很容易受到来自污染或复杂样品中其他分析物的背景光谱信号的影响。随着产生假阳性或假阴性信号的机会增加，这一问题不仅危及检测目标分析物的真实灵敏度，而且在实际应用中也产生了问题。提高高灵敏传感器可靠性的一个最优策略是发展两位一体(SPR-SERS双模)传感器，即用多个传感器检测同一目标分析物，期望同时协调各自的优点，弥补彼此的不足，实现准确可靠的检测。然而，由于SERS增强主要依赖于局域表面等离激元(LSPs)的激发，而SPR是基于传播表面等离激元(SPPs)，SERS和SPR的传感原理截然不同，将SPR和SERS检测策略(SPR-SERS)结合起来应用于等离子体传感器的研究很少。因此，开发SPR-SERS双模传感器是一个非常有挑战性的工作。而相较于制备大规模均匀的纳米阵列，基于胶体纳米粒子的传感策略有望使SPR-SERS双模传感器的制备和应用更加便捷。发明人于2020.06.12申请的CN202010539833.0，“SERS-SPR双模传感器及其制备方法和应用”，双模传感器包含检测芯片和DNA探针，检测芯片为表面修饰有四面体DNA的银纳米孔-纳米棒阵列基片。本发明将检测芯片依次与待检测液体样品、DNA探针溶液混合，通过互补配对形成“检测芯片-目标DNA-DNA探针”复合物，之后依次进行透射光谱测试、SERS测试，通过透射光谱特征谷的波长变化、SERS光谱及其特征信号强度值实现对于血清中核酸的高灵敏、特异性的双模传感检测，SERS传感模式和SPR传感模式的检测限分别达到了亚飞摩尔每升量级和亚皮摩尔每升量级，可实现在血清等复杂环境中检测核酸标志物。本发明是对该申请的技术改进。
发明内容
发明目的：为了克服现有单一检测模式易出现漏诊或诊断错误的不足，以及为了解决之前公开的专利文件所存在的需要核酸扩增的问题的问题，本发明提出了一种基于胶体金纳米颗粒(AuNPs)的SPR-SERS双模传感器，并设计了专门用于检测胃癌核酸标志物miRNA-652的催化发夹自组装(CHA)诱导的AuNP网络化传感器。对于miRNA-652检测，第一试剂、第二试剂和第三试剂中的核酸单链C、H1和H2为针对miRNA-652设计的核苷酸序列不同的DNA链。SPR传感模式和SERS传感模式对于血清中核酸检测的检出限均可达到飞摩尔每升量级，可实现在复杂生物样品中检测疾病相关的核酸标志物。
本发明还要解决的技术问题是提供了一种SPR-SERS双模传感器的制备方法，制备方法简单。
本发明最后要解决的技术问题是提供了一种SPR-SERS双模传感器的用于检测胃癌核酸标志物miRNA-652的检测方法。该SPR-SERS双模传感器通过提取暗场显微图像中暗场颜色的积分光密度来实现SPR传感模式，并通过获取ROX分子和4-巯基苯甲酸(4-MBA)分子的SERS特征峰的强度比值来实现比率型SERS传感模式。具有优异的检测灵敏度、特异性，能够实现可靠的高灵敏核酸检测。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种检测疾病核酸标志物的SPR-SERS双模传感器，所述SPR-SERS双模传感器包括第一试剂、第二试剂和第三试剂；
所述第一试剂为检测探针Probe 1，所述检测探针Probe 1为表面修饰捕获单链C的金纳米颗粒；
所述捕获单链C碱基序列如SEQ ID NO：2所示；
所述第二试剂为修饰有染料分子的发夹型DNA单链H2；所述发夹型DNA单链H2的碱基序列如SEQ ID NO：4所示。
所述第三试剂为检测探针Probe 2；所述检测探针Probe 2为表面修饰有能识别目标核酸的发夹型DNA单链H1和内标拉曼分子4-MBA的金纳米颗粒。
所述发夹型DNA单链H1的碱基序列如SEQ ID NO：3所示；
所述金纳米颗粒(AuNP)粒径为15～100nm。较佳地，该粒径为15nm。
一种检测疾病核酸标志物的SPR-SERS双模传感器的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、第一试剂的制备：
(1)离心清洗AuNPs并使用超纯水重分散(9000rpm，15min)；AuNPs粒径为15～100nm。较佳地，粒径为15nm。
合成第一试剂的过程中，金纳米颗粒(AuNP)的量为100μL 2.3nM，捕获单链C是10μL 10μM，经离心提纯后定容到10μL即得。
(2)将10μL 100μM的捕获单链C与10μL 100mM的TCEP溶液混合置于25℃恒温混匀仪中过夜反应以还原巯基之间形成的二硫键。
(3)将捕获单链C与AuNPs混合并共培养，捕获单链C通过巯基与金形成共价键修饰在AuNPs表面；之后以30分钟为间隔分4次将10μL 2M NaCl溶液缓慢添加到上述混合物中，摇匀过夜得到混合液；最后提纯去除上清液，得到终产物AuNP-C检测探针Probe 1即为第一试剂。
步骤二、第二试剂的制备：
根据发夹型DNA单链H1设计并合成修饰有染料分子的发夹型DNA单链H2即为第二试剂，通常为了使得发夹型DNA单链H2能一直保留发夹型结构，会在进一步实验时将发夹型DNA单链H2置于混匀仪中95℃退火5min以使其始终保持发夹型结构。
步骤三、第三试剂的制备：
与第一试剂的制备过程相似。简而言之，将发夹型DNA单链H1预先置于混匀仪中95℃退火5min以使其保持发夹型结构，然后与AuNPs混合并共培养过夜；而后，以30分钟为间隔分4次将10μL 2M NaCl溶液缓慢添加到上述混合物中，摇匀过夜得到混合液；随后，加入5μL 100μM的内标拉曼分子4-MBA共培养3h；最后，提纯去除上清液，得到最终产物AuNP-H1@4-MBA检测探针Probe 2即为第三试剂。
合成第三试剂的过程中，金纳米颗粒(AuNP)的量为100μL 2.3nM，发夹型DNA单链H1是10μL 10μM，内标拉曼分子4-MBA是5μL 100μM，经离心提纯后定容到10μL即得。
其中，所述步骤一至步骤三中的捕获单链C、发夹型DNA单链H1和H2的浓度相同，浓度均为1～10μM。
步骤四、SPR-SERS双模传感器的制备：
在疾病核酸标志物miRNA(T)存在下，第三试剂上的H1被miRNA触发打开，形成T-H1双链。借助第二试剂，即染料分子ROX标记的发夹型DNA单链H2，触发T-H1双链发生催化发夹自组装(CHA)反应，在检测探针Probe 2(Probe 2-CHA)表面形成多个ROX标记的H1-H2双链，同时伴随miRNA-652的释放，供循环使用。在上述溶液中同时加入第一试剂和第二试剂后，第一试剂上的捕获单链C与H1-H2双链的粘性末端杂交，形成Probe 1-Probe 2网络结构。Probe 1-Probe 2网络结构的形成导致了DFM图的颜色变化和SERS信号增强。在这种情况下，通过暗场显微镜可以观察到Probe 1-Probe 2网络结构在ITO玻璃上散射黄光或红光的DFM图。同时，SERS检测可以通过检测Probe 1-Probe 2网络结构中丰富的纳米间隙(即热点)显著增强的ROX和4-MBA的SERS信号来实现。相反，在没有疾病核酸标志物miRNA的情况下，第一试剂和第三试剂的混合物不能形成AuNP网络聚集体。由于AuNPs粒径较小(直径约为15nm)，单个第一试剂和第三试剂在ITO玻璃上的散射光在暗场显微镜下难以观察到，没有明显SERS活性热点的相对孤立的AuNPs表现出很微弱的拉曼信号。
所述第一试剂浓度为1～100nM，较佳地，所述第一试剂浓度为2.3nM。
所述第三试剂浓度为1～100nM，较佳地，所述第一试剂浓度为2.3nM。
上述SPR-SERS双模传感器的用来检测胃癌核酸标志物miRNA-652的应用，包括以下步骤：
1)在10％浓度的正常人血清中加入胃癌核酸标志物miRNA-652，得到样品溶液；
2)将第一试剂、第二试剂和第三试剂与含有不同浓度的目标miRNA-652的样品溶液共培养；
3)将步骤2)处理得到的混合样品溶液离心清洗多次后进行暗场显微图像采集、SERS测试，得到不同浓度目标miRNA-652的暗场颜色及其积分光密度、SERS光谱及ROX与4-MBA特征峰的SERS强度比值，以目标miRNA-652浓度的对数为横坐标，分别以积分光密度、ROX与4-MBA特征峰的SERS强度比值为纵坐标，分别做出SPR传感、SERS传感的工作曲线，根据工作曲线计算传感器的SPR传感检出限和SERS传感检出限。
所述步骤2)SPR传感模式检测目标miRNA-652浓度范围为100fM～10nM，SERS传感模式检测目标miRNA-652浓度范围为10fM～10nM。
其中，所述步骤1)目标miRNA-652核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。第一试剂、第二试剂和第三试剂中的C、H1和H2为针对miRNA-652设计的核苷酸序列不同的DNA链。
本发明的检测原理(以miRNA-652为例)：通过Au-S共价键将捕获单链C固定在AuNPs表面制备第一试剂AuNP-C探针(Probe 1)；将发夹型DNA单链H1和4-MBA依次固定在AuNP表面制备第三试剂AuNP-H1@4-MBA探针(Probe 2)。在目标miRNA-652(T)存在下，第三试剂上的H1被miRNA-652触发打开，形成T-H1双链。借助第二试剂，即染料分子ROX标记的发夹型DNA单链H2，触发T-H1双链发生催化发夹自组装(CHA)反应，在检测探针Probe 2(Probe2-CHA)表面形成多个ROX标记的H1-H2双链，同时伴随miRNA-652的释放，供循环使用。在上述溶液中同时加入第一试剂和第二试剂后，第一试剂上的捕获单链C与H1-H2双链的粘性末端杂交，形成Probe 1-Probe 2网络结构。Probe 1-Probe 2网络结构的形成导致了DFM图的颜色变化和SERS信号增强。在这种情况下，通过暗场显微镜可以观察到Probe 1-Probe 2网络结构在ITO玻璃上散射黄光或红光的DFM图。同时，SERS检测可以通过检测Probe1-Probe2网络结构中丰富的纳米间隙(即热点)显著增强的ROX和4-MBA的SERS信号来实现。相反，在没有miRNA-652的情况下，第一试剂和第三试剂的混合物不能形成AuNP网络聚集体。由于AuNPs粒径较小(直径约为15nm)，单个第一试剂和第三试剂在ITO玻璃上的散射光在暗场显微镜下难以观察到，没有明显SERS活性热点的相对孤立的AuNPs表现出很微弱的拉曼信号。
相对于现有技术，本发明具备以下优势：
(1)本发明所制备的SPR-SERS(表面等离子体共振光谱-表面增强拉曼光谱)双模传感器，制备工艺简单，采用催化发夹自组装(CHA)诱导的AuNP网络化传感策略用于胃癌核酸标志物miRNA-652的检测，检测灵敏度高、特异性好、可靠性强，在疾病早期相关生物标志物检测等领域具有广阔的应用前景。
(2)本发明通过提取暗场显微图像中暗场颜色的积分光密度来实现SPR传感模式，并通过获取染料分子ROX和内标拉曼分子4-MBA特征峰的SERS强度比值来实现SERS传感模式，实现了对于胃癌核酸标志物miRNA-652的高灵敏、可靠检测。
附图说明
图1是本发明所涉及的SPR-SERS双模传感器构建及传感原理图。
图2是实施例1中涉及的DNA杂交过程的凝胶电泳表征。
图3是实施例1中涉及的SPR和比率型SERS传感的可行性验证；(a-h)SPR传感：(a)和(e)是AuNPs的DFM和SEM图，(b)和(f)是检测探针Probe 2的DFM和SEM图，(c)和(g)是空白样品的DFM和SEM图，(d)和(h)是目标miRNA-652诱导形成的Probe 1-Probe 2网络结构的DFM和SEM图；(i)比率型SERS纳米探针的示意图；(j)由ROX与4-MBA不同摩尔比制备的SERS纳米探针得到的SERS光谱；(k)ROX与4-MBA特征峰的SERS强度比值(IR＝I1500/I1580)。
图4是实施例2中SPR-SERS双模传感器用于血清样品检测时SPR模式的检测工作曲线；(a-g)不同浓度10％人血清中miRNA-652检测的DFM图，即0(空白)、100fM、1pM、10pM、100pM、1nM和10nM；(h)DFM图中提取的暗场颜色积分光密度(n＝5)和SPR检测的线性校准曲线。
图5是实施例2中SPR-SERS双模传感器用于血清样品检测时SERS模式的检测工作曲线；不同浓度(0(空白)、10fM、100fM、1pM、10pM、100pM、1nM、10nM)的miRNA-652在10％人血清中的SERS光谱；ROX与4-MBA特征峰的SERS强度比值(IR＝I1500/I1580)和SERS检测的线性校准曲线。
图6是实施例3中SPR-SERS双模传感器特异性。
图7是实施例4中SERS检测均一性。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的内容并不限于所举的实施例。
本发明所使用的7种DNA碱基序列片段均为人工合成得到，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。SM，TM中加粗部分为错配碱基。
1、实施例中的待检测的目标miRNA-652的核酸碱基序列为：
目标miRNA-652(T)：5’-AAT GGC GCC ACT AGG GTT GTG T-3’
2、实施例中捕获单链C、发夹型DNA单链H1和H2碱基序列为：
C：5’-SH-(CH2)6-TTT TTA ACA CAAACA TC-3’
H1：5’-ACA CAA CCC TAG TGG CGC CAT TGA TGT TTG TGT GAA TGG CGC CAC TAGGGT TTT T-(CH2)6-SH-3’
H2：5’-ROX-GCC ATT CAC ACA AAC ATC AAT GGC GCC ACT AGG GTT GTG TCG CCATTG ATG TTT GTG TT-ROX-3’
3、针对目标miRNA-652碱基序列的特异性实验对应的单碱基错配序列(SM)，三碱基错配序列(TM)，完全错配(UM)碱基序列为：
单碱基错配序列(SM)：5’-AAT GGC GCC ACT AGG GTT GAG T-3’
三碱基错配序列(TM)：5’-AAA GGC GCC ACA AGG GTT GAG T-3’
完全错配(UM)：5’-TAG CTT ATC AGA CTG ATG TTG A-3’
实施例1 SPR-SERS双模传感器的制备
1、第一试剂的制备
(1)、将发夹型DNA单链H1和H2分别置于混匀仪中95℃退火5min以使其分别始终保持发夹型结构；
(2)、将10μL 100μM的捕获单链C、10μL 100μM的发夹型DNA单链H1分别与10μL，100mM的TCEP溶液(二硫键还原剂)混合置于25℃恒温混匀仪中过夜反应以还原巯基之间形成的二硫键；
(3)、将100μL 2.3nM AuNPs和10μL 10μM的捕获单链C混合在0.5×TBE溶液中，并于25℃温度下300rpm培育过夜得到混合液1；
(4)、向步骤(3)得到的混合液1进行加盐老化：以30分钟为间隔分4次将10μL2MNaCl溶液缓慢添加到上述混合物1中，最终NaCl浓度为0.3M，然后在25℃300rpm的条件下摇晃过夜得到混合液2；
(5)将步骤(4)得到的混合液2通过离心(9000rpm，15min)3次去除未连接到AuNP上的少量DNA，离心后抽取上清液，而后用PBS缓冲液定容为10μL，即为第一试剂。
第二试剂：根据序列合成修饰有染料分子的发夹型DNA单链H2，其浓度可以为1～10μM。
2、第三试剂的制备
(1)将100μL 2.3nM AuNPs和10μL 10μM的发夹型DNA单链H1混合在0.5×TBE溶液中，并于25℃温度下300rpm培育过夜得到混合液3；
(2)向步骤(1)得到的混合液3进行加盐老化：以30分钟为间隔分4次将10μL2MNaCl溶液缓慢添加到上述混合物3中，最终NaCl浓度为0.3M，然后在25℃300rpm的条件下摇晃过夜得到混合液4；
(3)向步骤(2)得到的混合液4加入5μL 100μM的内标拉曼分子4-MBA共培养3h得到混合液5；
(4)将步骤(3)得到的混合液5通过离心(9000rpm，15min)3次去除未连接到AuNP上的少量DNA与拉曼分子4-MBA，离心后抽取上清液，而后用PBS缓冲液定容为10μL，即为第三试剂。
3、SPR-SERS双模传感器的制备为检测miRNA-652，分别取10μL第一试剂、10μL第三试剂、5μL 10μM第二试剂混匀于45μL PBS缓冲液中，加入5μL一定浓度(SPR传感模式检测目标miRNA-652浓度范围为100fM～10nM，SERS传感模式检测目标miRNA-652浓度范围为10fM～10nM)的miRNA-652。以不添加miRNA-652的混合物作为空白对照。在25℃混匀仪中摇晃3h后，离心洗涤3次，最后产物再分散于40μL PBS缓冲液中，进行SPR-SERS双模检测。用10％聚丙烯酰胺凝胶电泳表征催化发夹自组装(CHA)的可行性及CHA产物与捕获单链C的进一步杂交。如图2所示，泳道1至4分别表示T、H1、H2和C。H1和H2的混合物呈现两条亮带(泳道9)，与H1和H2的位置一致。在miRNA-652(T)存在时，第5泳道中T、H1和H2的混合物显示出一条新的CHA产物条带，同时还可以观察到一条较浅的T条带，这表明成功地进行了目标触发的CHA反应。随着T浓度的降低(从1μM降至100nM)，CHA产物条带逐渐变浅(泳道6-7)，说明CHA反应的成功进行。在第8泳道中，引入捕获单链C后，出现一个缓慢移动的条带，即CHA产物与C杂交，且H2+C(泳道10)、H1+C(泳道11)、T+C(泳道12)和H2+T(泳道13)相对于泳道1-4所示的条带位置变化不大。
图3显示了AuNPs、第三试剂、空白样品以及1μM miRNA-652诱导形成的Probe1-Probe 2网络结构的DFM和SEM图。由于AuNPs的尺寸较小(直径15nm)(图3e)，在暗场显微镜下观察不到AuNPs在ITO玻璃上的散射光(图3a)。经过H1和4-MBA修饰后，第三试剂的散射光(图3b)和分布(图3f)与AuNPs相比变化不大。空白样品的DFM图(即第一试剂、第二试剂和第三试剂的混合物)显示很少的黄色亮斑(图3c)，相应的SEM图(图3g)显示出极少量的AuNP聚集体。miRNA-652特异性检测的DFM图(图3d)，即Probe 1-Probe 2网状结构显示出大量黄色亮斑，表明基于目标触发CHA诱导AuNP网络聚集的传感策略的SPR检测可以成功执行。
为了制备最佳配比的SERS探针，在制备第三试剂的步骤中，通过改变4-MBA的加入量，研究了不同ROX与4-MBA的摩尔比(1∶0.01、1∶0.1、1∶1、1∶10)。图3i给出了将ROX标记的发夹型DNA单链H1和4-MBA分子固定在AuNP上制备的比率型SERS纳米探针(第三试剂)的示意图。图3j显示了不同ROX与4-MBA摩尔比制备的第三试剂的SERS响应。可以清晰地观察到1500cm-1处ROX和1580cm-1处4-MBA两个分离的特征峰的强度比(IR＝I1500/I1580)随着ROX相对浓度的增加而逐渐增大(图3k)，说明第三试剂可以有效输出比率型SERS信号。并且，选择ROX与4-MBA的最佳摩尔比为1∶1可以将合适的信号强度清晰地呈现出来。
实施例2SPR-SERS双模传感器的工作曲线及检出限
将目标miRNA-652用10％正常人血清稀释到不同浓度0(空白)、10fM、100fM、1pM、10pM、100pM、1nM和10nM。分别取10μL第一试剂、10μL第三试剂、5μL10μM第二试剂混匀于45μL PBS缓冲液中，加入5μL不同浓度的miRNA-652，在25℃混匀仪中摇晃3h后，离心洗涤3次，最后产物再分散于40μL PBS缓冲液中，进行SPR-SERS双模检测。SPR检测采用暗场显微镜(DFM)，将检测miRNA-652后的20μL终产物直接滴加在干净的氧化铟锡(ITO)玻璃(25×5mm)中央，25℃吸附1min后用N2流吹干，滴加PBS缓冲液于ITO玻璃上并进行DFM图的拍摄。拍摄完成后用Image Pro Plus软件进行图像分析，提取暗场颜色的积分光密度。此外，在7.5cm×2.5cm的硅基底上将4×10阵列孔(直径4mm)的聚二甲基硅氧烷(PDMS)薄膜图形化，然后滴入20μL终产物。用清水冲洗小孔，风干后进行SERS检测。通过计算ROX与4-MBA特征峰的SERS强度比值(IR＝I1500/I1580)实现SERS分析，即比率型SERS传感。对目标miRNA-652浓度和相应暗场颜色的积分光密度、SERS光谱及其ROX与4-MBA特征峰的SERS强度比值分别作出SPR-SERS双模传感器的工作曲线，并分别计算传感器对目标miRNA-652的传感线性范围和检测下限。
图4a～g为检测不同目标miRNA-652浓度的DFM图，图4h为基于积分光密度的SPR强度与miRNA-652浓度对数呈线性关系，得到工作曲线：ISPR＝57640×Log CT+825229(R2＝0.984)，通过计算检出限为42.5fM。同样，图5a显示了检测不同目标miRNA-652浓度的SERS光谱，图5b显示ROX与4-MBA特征峰的SERS强度比值与miRNA-652浓度在10fM～10nM范围内呈良好的线性关系，即得到工作曲线：ISERS＝0.48×Log CT+7.70(R2＝0.989)，通过计算检出限为2.91fM。
实施例3 SPR-SERS双模传感器的特异性
用PBS缓冲液将目标miRNA-652稀释到1pM，用PBS缓冲液将完全错配序列(UM)、三碱基错配序列(TM)和单碱基错配序列(SM)均稀释到100pM。取10μL第一试剂、10μL第三试剂、5μL 10μM第二试剂混匀于45μL PBS缓冲液中，分别加入5μL 1pM miRNA-652、100pM完全错配序列(UM)、100pM三碱基错配序列(TM)、100pM单碱基错配序列(SM)和空白样品组(PBS缓冲液)，在25℃混匀仪中摇晃3h后，离心洗涤后进行SPR-SERS双模检测。得到目标miRNA-652、完全错配序列(UM)、三碱基错配序列(TM)、单碱基错配序列(SM)和空白样品组(PBS缓冲液)分别对应的暗场颜色的积分光密度、SERS光谱及其ROX与4-MBA特征峰的SERS强度比值。图6总结了基于积分光密度的SPR强度和ROX与4-MBA特征峰的SERS强度比值，错配样品的传感信号与空白样品相似，远低于目标miRNA-652的检测信号，表明SPR-SERS双模传感器对miRNA-652检测具有良好的特异性。
实施例4 SPR-SERS双模传感器的均一性
取检测10nM目标miRNA-652时的50个随机点，记录其ROX与4-MBA特征峰的SERS强度比，用来表征该检测策略的均一性，如图7所示，相对标准偏差(RSD)为12.0％，说明所提出的SPR-SERS双模传感器具有很好的均一性。
实施例5 SPR-SERS双模传感器的回收率实验
用10％正常人血清将目标miRNA-652稀释为3个不同浓度的溶液(30fM、7pM和3nM)，分别对检测这三个浓度的终产物进行SPR-SERS双模检测，进行回收率表征实验，实验结果如表1，证实该本发明SPR-SERS双模传感器具有良好的精确度。
表1 10％正常人血清中目标miRNA-652检测的回收率结果
Figure BDA0003053650800000101
Figure BDA0003053650800000111
序列表
<110> 南京邮电大学
<120> 一种检测疾病核酸标志物的SPR-SERS双模传感器、其制备方法及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aatggcgcca ctagggttgt gt 22
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tttttaacac aaacatc 17
<210> 3
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acacaaccct agtggcgcca ttgatgtttg tgtgaatggc gccactaggg ttttt 55
<210> 4
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gccattcaca caaacatcaa tggcgccact agggttgtgt cgccattgat gtttgtgtt 59
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aatggcgcca ctagggttga gt 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaaggcgcca caagggttga gt 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tagcttatca gactgatgtt ga 22

Claims (7)

1.一种检测疾病核酸标志物的SPR-SERS双模传感器，其特征在于，所述双模传感器包括第一试剂、第二试剂和第三试剂；
所述第一试剂为检测探针Probe 1，所述检测探针Probe 1为表面修饰捕获单链C的金纳米颗粒；
所述第二试剂为修饰有染料分子的发夹型DNA单链H2；
所述第三试剂为检测探针Probe 2；所述检测探针Probe 2为表面修饰有能识别目标核酸的发夹型DNA单链H1和内标拉曼分子4-MBA的金纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的检测疾病核酸标志物的SPR-SERS双模传感器，其特征在于，
所述捕获单链C碱基序列如SEQ ID NO：2所示：5’-SH-(CH2)6-TTT TTA ACA CAA ACATC-3’
所述发夹型DNA单链H1的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，5’-ACA CAA CCC TAG TGG CGCCAT TGA TGT TTG TGT GAA TGG CGC CAC TAG GGT TTT T-(CH2)6-SH-3’
所述发夹型DNA单链H2的碱基序列如SEQ ID NO：4所示；5’-ROX-GCC ATT CAC ACA AACATC AAT GGC GCC ACT AGG GTT GTG TCG CCA TTG ATG TTT GTG TT-ROX-3’
所述金纳米颗粒(AuNP)粒径为15～100nm。
3.根据权利要求1所述的检测疾病核酸标志物的SPR-SERS双模传感器，其特征在于，
目标miRNA-652的核酸碱基序列为：5’-AAT GGC GCC ACT AGG GTT GTG T-3’
针对目标miRNA-652碱基序列的特异性实验对应的单碱基错配序列(SM)，三碱基错配序列(TM)，完全错配(UM)碱基序列为：
单碱基错配序列(SM)：5’-AAT GGC GCC ACT AGG GTT GAG T-3’
三碱基错配序列(TM)：5’-AAA GGC GCC ACA AGG GTT GAG T-3’
完全错配(UM)：5’-TAG CTT ATC AGA CTG ATG TTG A-3’。
4.权利要求1所述的检测疾病核酸标志物的SPR-SERS双模传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：
1)第一试剂的制备：
首先离心清洗AuNPs并使用超纯水重分散；
其次，将捕获单链C与TCEP溶液混合置于恒温混匀仪中过夜反应以还原巯基之间形成的二硫键；
随后将捕获单链C与AuNPs混合并共培养，捕获单链C通过巯基与金形成共价键修饰在AuNPs表面；
之后加盐老化，提纯去除上清液，得到终产物AuNP-C检测探针Probe 1，即为第一试剂；
2)第二试剂的制备：根据发夹型DNA单链H1设计并合成修饰有染料分子的发夹型DNA单链H2，即为第二试剂；
3)第三试剂的制备：首先，将发夹型DNA单链H1与TCEP溶液混合置于恒温混匀仪中过夜反应以还原巯基之间形成的二硫键；其次，将发夹型DNA单链H1与AuNPs混合并共培养过夜，然后加盐老化；随后，加入内标拉曼分子4-MBA共培养；最后，提纯去除上清液，得到最终产物AuNP-H1@4-MBA检测探针Probe 2，即为第三试剂；
4)SPR-SERS双模传感器的制备：
在检测疾病核酸标志物存在下，第三试剂上的H1被该核酸标志物触发打开，形成T-H1双链；
借助第二试剂，即染料分子标记的发夹型DNA单链H2，触发T-H1双链发生催化发夹自组装反应，在检测探针Probe 2表面形成多个染料分子标记的H1-H2双链，同时伴随疾病核酸标志物的释放，供循环使用；
在上述溶液中同时加入第一试剂和第二试剂后，第一试剂上的捕获单链C与H1-H2双链的粘性末端杂交，形成Probe 1-Probe 2网络结构，Probe 1-Probe 2网络结构的形成导致了DFM图的颜色变化和SERS信号增强；通过暗场显微镜可以观察到Probe 1-Probe 2网络结构在ITO玻璃上散射黄光或红光的DFM图；同时，SERS检测可以通过检测Probe 1-Probe 2网络结构中丰富的纳米间隙显著增强的染料分子ROX和内标拉曼分子4-MBA的SERS信号来实现。
5.根据权利要求4所述的检测疾病核酸标志物的SPR-SERS双模传感器的制备方法，其特征在于，步骤1)-3)，所述捕获单链C、发夹型DNA单链H1和H2的浓度相同，浓度均为1～10μM。
6.权利要求1所述的检测疾病核酸标志物的SPR-SERS双模传感器用于检测胃癌核酸标志物miRNA-652的应用，其特征在于，
1)在10％浓度的正常人血清中加入胃癌核酸标志物miRNA-652，得到样品溶液，备用；
2)将第一试剂、第二试剂和第三试剂与含有不同浓度的目标miRNA-652的样品溶液共培养；
3)将步骤2)处理得到的混合样品离心清洗多次后进行暗场显微图像采集、SERS测试，得到不同浓度目标miRNA-652的暗场颜色及其积分光密度、SERS光谱及ROX与4-MBA特征峰的SERS强度比值，以目标miRNA-652浓度的对数为横坐标，分别以积分光密度、ROX与4-MBA特征峰的SERS强度比值为纵坐标，分别做出SPR传感、SERS传感的工作曲线，根据工作曲线计算传感器的SPR传感检出限和SERS传感检出限。
7.根据权利要求6所述的检测疾病核酸标志物的SPR-SERS双模传感器用于检测胃癌核酸标志物miRNA-652的应用，其特征在于，所述步骤2)中共培养条件为在25～37℃，300rpm的恒温混匀仪中培养1～3h。
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