CN114317686A - 一种基于CRISPR/Cas13a系统的SERS检测试剂盒、其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于CRISPR/Cas13a系统的SERS检测试剂盒、其制备方法与应用。该试剂盒包括检测体系和SERS检测芯片，检测体系包括Cas13a蛋白、crRNA、尿嘧啶修饰的发夹型识别单链和三个发夹型DNA单链，SERS检测芯片为表面修饰有DNA单链的银纳米棒阵列基片。将Cas13a蛋白、crRNA、尿嘧啶修饰的发夹型识别单链、三个发夹型DNA单链与待检测RNA样品混合，并滴加在SERS检测芯片表面，借助级联的CRISPR/Cas13a系统的信号放大和发夹型DNA单链产生的枝状杂交链式反应信号策略及检测芯片的SERS增强性能，通过测试芯片上染料分子ROX的拉曼信号，实现RNA的快速（60分钟内）、高灵敏度（2.62 aM）和高特异性（识别单碱基突变）检测。

Description

一种基于CRISPR/Cas13a系统的SERS检测试剂盒、其制备方法 与应用

技术领域

本发明属于功能纳米材料和生物检测领域，具体涉及一种基于CRISPR/Cas13a系统的表面增强拉曼散射(SERS)检测试剂盒、其制备方法与应用。

背景技术

分子诊断技术，特别是在肿瘤、传染病和遗传病等领域，已经成为疾病鉴定、评估、预防以及治疗方面的强有力工具。对生物样品中极微量的核酸标志物进行高灵敏和特异性检测是一项巨大的挑战。为了满足可靠且高灵敏检测的需求，一个可行的解决方案是对极微量的待检测核酸进行扩增。近年来，实时聚合酶链式反应(RT-PCR)被认为是一种典型的核酸扩增策略，它通过目标核酸在聚合酶作用下的连续复制实现了高灵敏检测。此外，核酸等温扩增技术，诸如环介导等温扩增技术(LAMP)和重组酶聚合酶扩增(RPA)，被称为是可以替代传统PCR的核酸检测技术。然而，这些基于核酸扩增的检测技术受限于精确的引物设计、精细的热控制及复杂的操作等要求，使得检测成本高、耗时长，且容易受到污染造成假阳性。因此，发展无需核酸扩增的检测技术具有重要意义。

目前，无酶信号放大策略由于其简单、稳健、高效的检测，且无需核酸扩增即可产生明显的信号放大而受到广泛关注。然而，几乎所有的无酶信号放大策略都不如常规 PCR具有一般10⁷～10⁸扩增倍数的灵敏性，由于其有限的信号放大能力和自发杂交产生的非特异性问题，极大限制了其在液体活检和病原体检测方面的应用。而最近发现的簇状规则间隔短回文重复(CRISPR)和CRISPR相关(Cas)蛋白系统为构建新型核酸检测体系提供了可能性。已经有研究证实了CRISPR/Cas13a系统可特异性识别目标RNA，随后激活Cas13a的RNA酶切活性，非特异性地切割特定的核酸探针。此外，这种RNA 酶切效率高效，每识别一个目标RNA至少有10⁴次周转量，导致信号放大4个数量级。此外，基于高灵敏的表面增强拉曼散射(SERS)技术开发传感策略，可以获得更灵敏的检测能力，有望取代传统基于荧光的检测方法而具有广阔的应用前景。

因此，开发一种基于CRISPR/Cas13a系统的表面增强拉曼散射(SERS)检测试剂盒用于检测RNA及其简便的制备及应用技术，可实现快速、便捷、特异性、高灵敏核酸检测，对于生物样本中极低丰度的RNA快速、可靠检测具有重要意义和应用价值。

公开号为CN111270012B的授权专利涉及一种用于检测新型冠状病毒(2019-nCoV)的CRISPR核酸检测试剂盒，包括用于检测新型冠状病毒的CRISPR-Cas13a系统，实现对于新型冠状病毒核酸的高灵敏、高特异、便捷检测。本申请主题也是涉及“检测疾病相关核酸标志物”，基于判例法，本发明不属于专利法25条不授予专利权的内容。

发明内容

发明目的：针对当前核酸分子尤其是疾病相关核酸标志物的快速灵敏测定的重大需求，以及传统基于核酸扩增检测技术在灵敏度、特异性、重现性和时效性等方面的不足，本发明公开了一种基于CRISPR/Cas13a系统的表面增强拉曼散射(SERS)检测试剂盒、其制备方法与应用。该检测试剂盒制备及应用简单，可在60分钟内实现阿摩尔每升量级的高灵敏检测，能够在复杂环境高特异性的检测目标RNA并能够区分核酸分子单碱基差异，具有优异的特异性、均一性和重现性，具备检测核酸分子的强大能力，在核酸分子检测领域具有重要的应用前景。

该SERS检测试剂盒包括CRISPR/Cas13a系统(检测体系)、枝状杂交链式反应(bHCR)体系和SERS检测芯片三部分：

其中CRISPR/Cas13a系统包括Cas13a蛋白、crRNA和尿嘧啶修饰的发夹型识别单链RP。

枝状杂交链式反应(bHCR)体系包括修饰有染料分子ROX的发夹型DNA单链 H1和发夹型DNA单链H2和H3。

SERS检测芯片为表面修饰有捕获单链C的银纳米棒阵列基片。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种基于CRISPR/Cas13a系统的表面增强拉曼散射(SERS)检测试剂盒，包括：CRISPR/Cas13a系统、枝状杂交链式反应(bHCR)体系和SERS检测芯片三部分。

其中CRISPR/Cas13a系统包括Cas13a蛋白、crRNA和尿嘧啶修饰的发夹型识别单链RP；

枝状杂交链式反应(bHCR)体系包括修饰有染料分子ROX的发夹型DNA单链 H1，发夹型DNA单链H2和H3；

SERS检测芯片为表面修饰有捕获单链C的银纳米棒阵列基片。

在一些实施方式中，以检测胃癌微小核酸标志物miRNA-106a为例，

所述miRNA-106a碱基序列如SEQ ID NO：1所示：

miRNA-106a：5’-AAA AGU GCU UAC AGU GCA GGU AG-3’

所述crRNA碱基序列如SEQ ID NO：2所示：

crRNA：5’-GAC CAC CCC AAA AAU GAA GGG GAC UAA AAC CUA CCU GCA CUG UAAGCA CUU UU-3’

所述尿嘧啶修饰的发夹型识别单链RP的碱基序列如SEQ ID NO：3所示：

RP：5’-ACT ACC ATG ATC/rU//rU//rU//rU//rU//rU/GTT AGA TCT CCA GTT ATCATG GTA GTT GGA-3’

所述发夹型DNA单链H1的碱基序列如SEQ ID NO：4所示：

H1：5’-ROX-TCC AGT TAT CAT GTT AAG CGA TGA TAA CTG GAG ATC TAA C -3’

所述发夹型DNA单链H2的碱基序列如SEQ ID NO：5所示：

H2：5’-CGC TTA ACA TGA TAA CTG GAG TTA GAT CTC CAG TTA TCA TTG CGG TGACAC GGC AGT TAG A-3’

所述发夹型DNA单链H3的碱基序列如SEQ ID NO：6所示：

H3：5’-TCT AAC TGC CGT GTC ACC GCA GTT AGA TCT CCA GTT ATC AT-3’

所述捕获单链C的碱基序列如SEQ ID NO：7所示：

C：5’-SH-(CH₂)₆-TTT TTT TTT TTC CAA CTA CC-3’

在一些实施方式中，所述捕获单链C的浓度为0.5～2μM，所述Cas13a蛋白与crRNA的浓度为0.1～1μM，所述尿嘧啶修饰的发夹型识别单链RP的浓度为1～10μM，所述的发夹型DNA单链H1、H2和H3的浓度为5～20μM。

上述一种基于CRISPR/Cas13a系统的SERS检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1)CRISPR/Cas13a系统的制备：包括Cas13a蛋白、crRNA和尿嘧啶修饰的发夹型识别单链RP的制备；

2)枝状杂交链式反应(bHCR)体系的制备：包括修饰有染料分子ROX的发夹型 DNA单链H1，发夹型DNA单链H2和H3的制备；

3)SERS检测芯片制备：

(1)制备银纳米棒阵列并用DEPC处理水多次冲洗；

所述银纳米棒阵列采用真空电子束蒸发镀膜技术制备，具体方法按文献(C.Y.Song, J.L.Abell,Y.P.He,S.H.Murph,Y.P.Cui,Y.P.Zhao.Gold-modified silvernanorod arrays: growth dynamics and improved SERS properties.Journal ofMaterials Chemistry,2012, 22(3):1150-1159.)中报到的方法制备，并在其表面用PDMS膜制备阵列型小孔，在一些实施方式中为4×10阵列，孔径4mm，深度1mm。

(2)将银纳米棒阵列和20μL 0.5～2μM(较佳是20μL 1μM)捕获单链C溶液共培养，捕获单链C通过巯基与银形成共价键而固定在银纳米棒阵列表面；

培养条件：25～37℃，60～80％湿度环境中静置3～5小时；

(3)使用反应缓冲液(10mM Tris-HCl，50mM KCl，1.5mM MgCl₂，pH 8.3)清洗基片后，将20μL 1～100μM(较佳是20μL 10μM)6-巯基己醇(MCH)滴加至上述基片表面置于37℃恒温混匀仪中反应20分钟；

(4)依次用反应缓冲液和DEPC(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理水多次清洗基片，得到SERS检测芯片。

RP上述一种基于CRISPR/Cas13a系统的SERS检测试剂盒用于检测RNA的应用，步骤如下：

1)在10％浓度的正常人血清中加入目标RNA，配制含有不同浓度RNA的血清样品；

2)将Cas13a蛋白、crRNA、尿嘧啶修饰的发夹型识别单链RP、发夹型DNA单链 H1、H2和H3和含有不同浓度的目标RNA的样品溶液混合，滴加至SERS检测芯片表面共培养；

培养条件：25～37℃，60～80％湿度环境中静置0.5～3小时；

3)用DEPC处理水(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)清洗检测芯片多次后进行SERS测试，得到不同浓度目标RNA对应的SERS光谱及其特征信号强度值，以目标RNA浓度的对数为横坐标，以SERS特征峰强度值为纵坐标，得到SERS检测试剂盒的工作曲线，根据工作曲线计算SERS检测试剂盒检测目标RNA的检测限；

4)将待检测样品与Cas13a蛋白、crRNA、尿嘧啶修饰的发夹型识别单链RP、发夹型DNA单链H1、H2和H3混合后滴加至SERS检测芯片表面共培养(共培养条件为在25～37℃，300rpm的恒温混匀仪中培养60分钟)，用DEPC处理水清洗检测芯片多次后进行SERS测试，得到SERS光谱及其特征信号强度值，根据工作曲线计算得到待检测样品中目标RNA的浓度。

其中，所述步骤2)和4)中共培养条件为在25～37℃，300rpm的恒温混匀仪中培养60分钟。

本发明的检测原理(以检测胃癌微小核酸标志物miRNA-106a为例，见图1所示)：

一种基于CRISPR/Cas13a系统的表面增强拉曼散射(SERS)检测试剂盒，包括CRISPR/Cas13a系统、枝状杂交链式反应(bHCR)体系和SERS检测芯片三部分。在目标miRNA-106a存在的情况下，miRNA-106a通过与Cas13a/crRNA复合物中的crRNA 杂交进而结合，从而激活Cas13a的RNA酶切活性，切割尿嘧啶修饰的发夹型识别单链 RP，进而释放出多个包含30个核苷酸的RT片段。随后，在RT的触发下，修饰有ROX 分子的发夹型DNA单链H1的3’端与RT杂交并打开茎环结构，H1的5’端进而与H2 的5’端杂交而打开H2，打开的H2的3’端又可以与溶液中H1的3’端杂交，发生H1和 H2的杂交链式反应(HCR)。以此同时，H1和H2杂交链上悬挂的H2的3’端又可以与 H3的5’端杂交并打开H3，打开后的H3再次结合溶液中的H1触发H1和H2的杂交链式反应(HCR)。据此，在目标miRNA-106a和单链RP存在的情况下，三个发夹型DNA 单链H1、H2和H3可依次被触发进行枝状杂交链式反应(bHCR)，形成含有大量染料分子ROX的枝状HCR产物。这些枝状HCR产物通过触发端的RT片段与SERS检测芯片表面的捕获单链C杂交而被捕获在SERS检测芯片上。在拉曼检测时，激光照射下固定在银纳米棒阵列上的枝状HCR产物因包含大量的染料分子ROX，并受到SERS活性的银纳米棒阵列的表面增强作用，输出显著增强的ROX分子拉曼光谱，因此根据ROX 的拉曼信号可以对miRNA-106a进行定性且定量的高灵敏和特异性检测。该技术结合了 CRISPR/Cas13a系统的高特异性和信号放大功能，以及枝状杂交链式反应(bHCR)体系的信号放大性能，构建了级联的双重信号放大体系用于SERS检测RNA。

有益效果：本发明公开了一种基于CRISPR/Cas13a系统的表面增强拉曼散射(SERS) 检测试剂盒，与传统核酸检测PCR技术相比，本发明公开的试剂盒基于高灵敏的SERS 技术，结合了CRISPR/Cas13a系统的高特异性和信号放大功能，以及枝状杂交链式反应 (bHCR)体系的信号放大性能，基于级联的双重信号放大体系用于高灵敏、高特异性检测RNA。试剂盒制备及应用简单，可在60分钟内实现阿摩尔每升量级的高灵敏检测，能够在复杂环境高特异性的检测目标RNA并能够区分核酸分子单碱基差异，具有优异的特异性、均一性和重现性，具备检测核酸分子的强大能力，在核酸分子检测领域具有重要的应用前景。

附图说明

图1是基于CRISPR/Cas13a系统的表面增强拉曼散射(SERS)检测试剂盒制备及工作原理图；

图2是实施例1中基于CRISPR/Cas13a系统检测miRNA-106a作用机制的SERS验证实验：图2A是基于CRISPR/Cas13a系统检测miRNA-106a作用机制的SERS光谱图；图2B是图2A中各谱线在1503cm^-1拉曼位移处所对应的SERS峰强度；

图3是实施例1SERS检测芯片表面6-巯基己醇(MCH)封闭时间优化实验：图3A 是SERS检测芯片表面6-巯基己醇(MCH)封闭不同时间的SERS光谱图；图3B是图 2A中各谱线在1503cm^-1拉曼位移处所对应的SERS峰强度；

图4是实施例1SERS检测试剂盒检测miRNA-106a的检测时间优化实验：图4A 是SERS检测试剂盒检测miRNA-106a在不同检测时间对应的SERS光谱图；图4B是图4A中各谱线在1503cm^-1拉曼位移处所对应的SERS峰强度；

图5是实施例1SERS检测试剂盒检测不同浓度miRNA-106a的工作曲线：图5A 是SERS检测试剂盒检测不同浓度miRNA-106a对应的SERS光谱图；图5B是图5A中各谱线在1503cm^-1拉曼位移处所对应的SERS峰强度；

图6是实施例1SERS检测试剂盒检测miRNA-106a的特异性表征：图6A是SERS 检测试剂盒检测miRNA-106a、5’-SM RNA(miRNA-106a在5’端单碱基突变)、m-SM RNA(miRNA-106a在序列中间单碱基突变)、3’-SM RNA(miRNA-106a在3’端单碱基突变)、miRNA-21、miRNA-155、miRNA-21和miRNA-155混合样品及miRNA-21、 miRNA-155和miRNA-106a混合样品的SERS光谱图；图6B是图6A中各谱线在1503 cm^-1拉曼位移处所对应的SERS峰强度；

图7是实施例1 SERS检测试剂盒检测miRNA-106a的均一性表征；

图8是实施例1 SERS检测试剂盒检测miRNA-106a的重现性表征。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的内容并不限于所举的实施例。

本发明所使用的DNA/RNA碱基序列片段均为人工合成得到，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1、以下实施例中目标检测RNA为miRNA-106a，其碱基序列为：

miRNA-106a：5’-AAA AGU GCU UAC AGU GCA GGU AG-3’

2、以下实施例中crRNA、尿嘧啶修饰的发夹型识别单链RP(该序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，属于DNA序列，中间修饰的RNA碱基U是设置的酶切位点)、发夹型DNA单链H1、H2和H3及捕获单链C的碱基序列为：

crRNA：5’-GAC CAC CCC AAA AAU GAA GGG GAC UAA AAC CUA CCU GCA CUG UAAGCA CUU UU-3’

RP：5’-ACT ACC ATG ATC/rU//rU//rU//rU//rU//rU/GTT AGA TCT CCA GTT ATCATG GTA GTT GGA-3’

H1：5’-ROX-TCC AGT TAT CAT GTT AAG CGA TGA TAA CTG GAG ATC TAA C -3’

H2：5’-CGC TTA ACA TGA TAA CTG GAG TTA GAT CTC CAG TTA TCA TTG CGG TGACAC GGC AGT TAG A-3’

H3：5’-TCT AAC TGC CGT GTC ACC GCA GTT AGA TCT CCA GTT ATC AT-3’

C：5’-SH-(CH₂)₆-TTT TTT TTT TTC CAA CTA CC-3’

3、针对胃癌微小核酸标志物miRNA-106a检测的特异性实验对应的分别位于5’末端、中间位点和3’末端的单碱基突变RNA(5’-SM、m-SM和3’-SM)与其它miRNA (miRNA-21和miRNA-155)的碱基序列为：

5’-SM RNA：5’-UAA AGU GCU UAC AGU GCA GGU AG-3’

m-SM RNA：5’-AAA AGU GCU UAG AGU GCA GGU AG-3’

3’-SM RNA：5’-AAA AGU GCU UAC AGU GCA GGU AC-3’

miRNA-21：5’-UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A-3’

miRNA-155：5’-UUA AUG CUA AUC GUG AUA GGG GU-3’

4、以下实施例中银纳米棒阵列采用真空电子束蒸发镀膜技术制备，具体方法按文献(C.Y.Song,J.L.Abell,Y.P.He,S.H.Murph,Y.P.Cui,Y.P.Zhao.Gold-modified silvernanorod arrays:growth dynamics and improved SERS properties.Journal ofMaterials Chemistry,2012,22(3):1150-1159.)中报到的方法制备，并在其表面用PDMS膜制备4×10 阵列型小孔，孔径4mm，深度1mm。

实施例1一种基于CRISPR/Cas13a系统的表面增强拉曼散射(SERS)检测试剂盒的制备

一、CRISPR/Cas13a系统的制备：包括Cas13a蛋白、crRNA和尿嘧啶修饰的发夹型识别单链RP的制备。

二、枝状杂交链式反应(bHCR)体系的制备：包括修饰有染料分子ROX的发夹型 DNA单链H1，发夹型DNA单链H2和H3的制备。

三、SERS检测芯片制备及反应条件考察

1、SERS检测芯片制备：

(1)制备银纳米棒阵列并用DEPC处理水多次冲洗；

(2)将银纳米棒阵列和20μL 1μM捕获单链C溶液共培养，捕获单链C通过巯基与银形成共价键而固定在银纳米棒阵列表面；

培养条件：25～37℃，60～80％湿度环境中静置3～5小时；

(3)使用反应缓冲液(10mM Tris-HCl，50mM KCl，1.5mM MgCl₂，pH 8.3)清洗基片后，将20μL 10μM 6-巯基己醇(MCH)滴加至上述基片表面置于37℃恒温混匀仪中反应20分钟；

(4)依次用反应缓冲液和DEPC处理水多次清洗基片，得到SERS检测芯片。

2、SERS检测芯片表面6-巯基己醇(MCH)封闭时间优化实验

在SERS检测芯片制备的过程中，将银纳米棒阵列与20μL 1μM捕获单链C溶液共培养3小时，使用反应缓冲液清洗基片后，将20μL 10μM 6-巯基己醇(MCH)滴加至上述银纳米棒阵列表面置于37℃恒温混匀仪中分别反应0、10、20、30、40和60分钟，使用反应缓冲液和DEPC处理水多次清洗基片，得到SERS检测芯片，并分别用于检测0(空白样品)和10pMmiRNA-106a，测试得到SERS光谱，参见图3。可见，随着MCH封闭时间的延长，用于空白样品检测的背景信号降低，但10pM miRNA-106a 检测的SERS强度也明显下降。因此，为了有效降低背景并保持较强的检测信号，选择封闭时间为20min作为封闭芯片的最佳条件。

四、SERS检测试剂盒的制备

1、为构建试剂盒检测微小核酸miRNA-106a的工作曲线，分别取2μL 0.25μMCas13a蛋白,2μL 0.25μM crRNA,2μL 2.5μM RP,2μL 10μM H1,2μL 10μM H2,2μL 5 μM H3和2μL miRNA-106a(浓度范围10aM～1nM)混匀于20μL反应缓冲液中。不添加miRNA-106a的混合溶液作为空白样品。将上述含有不同浓度miRNA-106a的混合溶液和空白样品分别滴加至SERS检测芯片表面，在37℃300rpm恒温混匀仪中培养60 分钟后，依次使用反应缓冲液和DEPC处理水清洗小孔。自然风干后在SERS检测芯片上进行SERS测试，得到不同浓度miRNA-106a及空白样品的SERS光谱及其特征信号强度值。

2、基于CRISPR/Cas13a系统检测目标miRNA-106a作用机制的SERS验证实验

配置缺失某一试剂(如miRNA-106a、crRNA或RP)的不完全混合溶液，以及含有所有试剂其中miRNA-106a浓度分别为10aM、10fM、10pM的完全混合溶液，将溶液分别滴加到SERS检测芯片，置于37℃300rpm恒温混匀仪中共培养，使用反应缓冲液和DEPC处理水清洗小孔后进行SERS检测，得到SERS光谱图，参见图2。可见，不完全检测体系测得的SERS强度与背景信号类似。相比之下，Cas13a/crRNA复合物、 miRNA-106a和尿嘧啶修饰的发夹型识别单链RP的存在可以有效激活Cas13a蛋白切割 RP，导致释放的RT片段触发枝状杂交链式反应(bHCR)，获得显著增强的SERS信号，并且SERS信号可随着目标miRNA-106a浓度的增加而逐渐增强。

3、SERS检测试剂盒检测miRNA-106a的检测时间优化实验

在上述制备的SERS检测芯片上加入2μL 0.25μM Cas13a蛋白,2μL 0.25μM crRNA,2μL 2.5μM RP,2μL 10μM H1,2μL 10μM H2,2μL 5μM H3和2μL 10pM的 miRNA-106a混合于20μL反应缓冲液中，置于37℃300rpm恒温混匀仪中分别反应5、 10、20、30、40、60、90、120和180分钟后，使用反应缓冲液和DEPC处理水清洗小孔并进行SERS检测，测试得到SERS光谱图，参见图4。可见，在MCH最佳封闭时间的条件下，通过测试培养了5～180min不同时段后检测芯片的SERS信号，观察到在 0～60min内，SERS强度逐渐增强，并在共培养60min时SERS信号达到最大饱和值，表明60min是SERS检测试剂盒检测miRNA-106a的最佳检测时间。

4、SERS检测试剂盒检测miRNA-106a的工作曲线及检测限

将目标miRNA-106a加入到10％血清中，配置不同浓度(10aM、100aM、1fM、 10fM、100fM、1pM、10pM、100pM和1nM)miRNA-106a检测样品。不添加 miRNA-106a的样品作为空白样本。将2μL 0.25μM Cas13a蛋白,2μL 0.25μM crRNA,2 μL 2.5μM RP,2μL 10μM H1,2μL10μM H2,2μL 5μM H3与2μL含有不同浓度 miRNA-106a的血清样品分别混合于20μL反应缓冲液中，将混合溶液滴加在上述制备的SERS检测芯片上，置于37℃300rpm恒温混匀仪中反应60分钟后，使用反应缓冲液和DEPC处理水清洗小孔，自然风干后在SERS检测芯片上进行SERS检测(拉曼测试条件：扫描时间1s，激光功率1％，物镜放大倍率20x，累计次数1次，激发光波长 633nm)，得到SERS光谱及其特征信号强度值，以目标miRNA-106a浓度的对数为横坐标，以SERS探针的特征峰强度值为纵坐标做出工作曲线，根据工作曲线计算SERS 检测试剂盒检测miRNA-106a的检测限(计算依据：样品在1503cm^-1的检测SERS信号值≥空白样品在1503cm^-1的检测信号值加上3倍的误差值)。图5A是检测含有不同浓度miRNA-106a血清样品检测所得的SERS光谱，图5B是其各谱线在1503cm^-1处所对应的SERS峰强度。对于检测miRNA-106a，得到工作曲线为I₁₅₀₃＝376×LogC_miRNA-106a +6851(R²＝0.994)，通过计算得到的检测限为2.62aM。

5、SERS检测试剂盒检测miRNA-106a的特异性表征

将miRNA-106a分别稀释到100fM和10pM，将5’末端(5’-SM)、中间位点(m-SM) 和3’末端(3’-SM)的单碱基突变RNA以及完全错配的miRNA-21和miRNA-155样品稀释到10pM，配置10pM的miRNA-21和miRNA-155混合样品及10pM的miRNA-21、 miRNA-155和miRNA-106a混合样品，并将没有RNA的反应缓冲液用作空白样品。在 2μL 0.25μM Cas13a蛋白,2μL 0.25μM crRNA,2μL 2.5μM RP,2μL 10μM H1,2μL 10 μM H2,2μL 5μM H3中分别加入2μL上述各种样品(包括100fM和10pM miRNA-106a， 10pM 5’-SM RNA、m-SM RNA、3’-SM RNA、miRNA-21、miRNA-155、miRNA-21和 miRNA-155混合样品及miRNA-21、miRNA-155和miRNA-106a混合样品)于20μL反应缓冲液中，再将混合溶液滴加在上述制备的SERS检测芯片上，置于37℃300rpm恒温混匀仪中反应60分钟后，使用反应缓冲液和DEPC处理水清洗小孔。自然风干后对 SERS检测芯片进行SERS测试，得到SERS光谱及其特征峰强度值。图6A是检测不同生物分子样品的SERS光谱，图6B是其谱线在1503cm^-1处所对应的SERS峰强度。所制备的SERS检测试剂盒可以较好的区分目标样品与其他miRNA，并且可将目标样品与单碱基突变RNA区分开来，这表明SERS检测试剂盒具有良好的特异性。

6、SERS检测芯片均一性验证

在上述制备的SERS检测芯片上加入2μL 0.25μM Cas13a蛋白,2μL 0.25μM crRNA,2μL 2.5μM RP,2μL 10μM H1,2μL 10μM H2,2μL 5μM H3和2μL 10pM miRNA-106a于20μL反应缓冲液中，置于37℃300rpm恒温混匀仪中反应60分钟后，使用反应缓冲液和DEPC处理水清洗小孔，自然风干后对芯片进行SERS检测，记录检测芯片上50个随机点的SERS信号来分析SERS检测芯片的均一性。图7是记录的50 个随机点在1503cm^-1处所对应的SERS峰强度。对应于miRNA-106a检测的50个随机点的SERS峰强度的相对标准偏差(RSD)很小(RSD＝9.63％)，表明所提出的SERS 检测试剂盒检测miRNA-106a具有良好的均一性。

7、SERS检测芯片重现性

在上述实施例1制备的5组SERS检测芯片上分别加入2μL 0.25μM Cas13a蛋白,2 μL 0.25μM crRNA,2μL 2.5μM RP,2μL 10μM H1,2μL 10μM H2,2μL 5μM H3和2μL 10pMmiRNA-106a于20μL反应缓冲液中，置于37℃300rpm恒温混匀仪中反应60分钟后，使用反应缓冲液和DEPC处理水清洗小孔并进行SERS检测。对于每组SERS检测芯片，采集在不同区域的10个随机点，并获得平均SERS光谱。图8是记录的5组 SERS检测芯片检测10pM miRNA-106a的SERS峰强度。检测结果显示5组检测芯片的SERS峰强度的相对标准偏差(RSD)很小(RSD＝4.37％)，说明本发明的SERS试剂盒具有良好的检测重现性。

序列表

<110> 南京邮电大学

<120> 一种基于CRISPR/Cas13a系统的SERS检测试剂盒、其制备方法与应用

<141> 2021-12-23

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> RNA

<213> miRNA-106a (Artificial Sequence)

<400> 1

aaaagugcuu acagugcagg uag 23

<210> 2

<211> 53

<212> RNA

<213> crRNA (Artificial Sequence)

<400> 2

gaccacccca aaaaugaagg ggacuaaaac cuaccugcac uguaagcacu uuu 53

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> H1 (Artificial Sequence)

<400> 4

tccagttatc atgttaagcg atgataactg gagatctaac 40

<210> 5

<211> 61

<212> DNA

<213> H2 (Artificial Sequence)

<400> 5

cgcttaacat gataactgga gttagatctc cagttatcat tgcggtgaca cggcagttag 60

a 61

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> H3 (Artificial Sequence)

<400> 6

tctaactgcc gtgtcaccgc agttagatct ccagttatca t 41

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> C (Artificial Sequence)

<400> 7

tttttttttt tccaactacc 20

<210> 8

<211> 23

<212> RNA

<213> 5’-SM RNA (Artificial Sequence)

<400> 8

uaaagugcuu acagugcagg uag 23

<210> 9

<211> 23

<212> RNA

<213> m-SM RNA (Artificial Sequence)

<400> 9

aaaagugcuu agagugcagg uag 23

<210> 10

<211> 23

<212> RNA

<213> 3’-SM RNA (Artificial Sequence)

<400> 10

aaaagugcuu acagugcagg uac 23

<210> 11

<211> 22

<212> RNA

<213> miRNA-21 (Artificial Sequence)

<400> 11

uagcuuauca gacugauguu ga 22

<210> 12

<211> 23

<212> RNA

<213> miRNA-155 (Artificial Sequence)

<400> 12

uuaaugcuaa ucgugauagg ggu 23

Claims (10)

1.一种基于CRISPR/Cas13a系统的SERS检测试剂盒，其特征在于，包括CRISPR/Cas13a系统、枝状杂交链式反应体系和SERS检测芯片三部分；

所述CRISPR/Cas13a系统包括Cas13a蛋白、crRNA和尿嘧啶修饰的发夹型识别单链RP；

所述枝状杂交链式反应体系包括修饰有染料分子ROX的发夹型DNA单链H1，发夹型DNA单链H2和H3；

所述SERS检测芯片为表面修饰有捕获单链C的银纳米棒阵列基片。

2.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR/Cas13a系统的SERS检测试剂盒，其特征在于：

所述crRNA碱基序列如SEQ ID NO：2所示：

crRNA：5’-GAC CAC CCC AAA AAU GAA GGG GAC UAA AAC CUA CCU GCA CUG UAA GCACUU UU-3’

所述尿嘧啶修饰的发夹型识别单链RP的碱基序列如SEQ ID NO：3所示：

RP：5’-ACT ACC ATG ATC/rU//rU//rU//rU//rU//rU/GTT AGA TCT CCA GTT ATC ATGGTA GTT GGA-3’

所述发夹型DNA单链H1的碱基序列如SEQ ID NO：4所示：

H1：5’-ROX-TCC AGT TAT CAT GTT AAG CGA TGA TAA CTG GAG ATC TAA C-3’

所述发夹型DNA单链H2的碱基序列如SEQ ID NO：5所示：

H2：5’-CGC TTA ACA TGA TAA CTG GAG TTA GAT CTC CAG TTA TCA TTG CGG TGA CACGGC AGT TAG A-3’

所述发夹型DNA单链H3的碱基序列如SEQ ID NO：6所示：

H3：5’-TCT AAC TGC CGT GTC ACC GCA GTT AGA TCT CCA GTT ATC AT-3’

所述捕获单链C的碱基序列如SEQ ID NO：7所示：

C：5’-SH-(CH₂)₆-TTT TTT TTT TTC CAA CTA CC-3’。

3.权利要求1～2任一项所述的一种基于CRISPR/Cas13a系统的SERS检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(一)CRISPR/Cas13a系统的制备：包括Cas13a蛋白、crRNA和尿嘧啶修饰的发夹型识别单链RP的制备；

所述Cas13a蛋白与crRNA的浓度为0.1～1μM，所述尿嘧啶修饰的发夹型识别单链RP的浓度为1～10μM；

(二)枝状杂交链式反应体系的制备：包括修饰有染料分子ROX的发夹型DNA单链H1，发夹型DNA单链H2和H3的制备；

所述的发夹型DNA单链H1、H2和H3的浓度为5～20μM；

(三)SERS检测芯片制备：

(1)制备银纳米棒阵列并用DEPC处理水多次冲洗；

(2)将银纳米棒阵列和20μL 0.5～2μM捕获单链C溶液共培养，捕获单链C通过巯基与银形成共价键而固定在银纳米棒阵列表面；

培养条件：25～37℃，60～80％湿度环境中静置3～5小时；

(3)使用反应缓冲液清洗基片后，将20μL 1～100μM 6-巯基己醇滴加至上述基片表面置于37℃恒温混匀仪中反应20分钟；

(4)依次用反应缓冲液和DEPC处理水多次清洗基片，得到SERS检测芯片。

4.根据权利要求3所述的一种基于CRISPR/Cas13a系统的SERS检测试剂盒的制备方法，其特征在于：反应缓冲液是10mM Tris-HCl，50mM KCl，1.5mM MgCl₂，pH8.3。

5.权利要求1～2任一项所述的一种基于CRISPR/Cas13a系统的SERS检测试剂盒用于非疾病诊断目的的检测血清中微小核酸microRNA的应用。

6.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤如下：

1)向10％浓度的血清中加入microRNA目标检测物，配制含有不同浓度microRNA的血清样品；

2)将Cas13a蛋白、crRNA、尿嘧啶修饰的发夹型识别单链RP、发夹型DNA单链H1、H2和H3和含有不同浓度microRNA的样品溶液混合，滴加混合溶液至SERS检测芯片表面共培养；

培养条件：25～37℃，60-80％湿度环境中静置0.5～3小时；

3)用DEPC处理水清洗检测芯片多次后进行SERS测试，得到不同浓度microRNA对应的SERS光谱及其特征信号强度值，以microRNA浓度的对数为横坐标，以SERS特征峰强度值为纵坐标，得到SERS检测试剂盒的工作曲线，根据工作曲线计算SERS检测试剂盒检测microRNA的检测限；

4)将待检测样品与Cas13a蛋白、crRNA、尿嘧啶修饰的发夹型识别单链RP、发夹型DNA单链H1、H2和H3混合后滴加至SERS检测芯片表面共培养，用DEPC处理水清洗检测芯片多次后进行SERS测试，得到SERS光谱及其特征信号强度值，根据工作曲线计算得到待检测样品中microRNA的浓度。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤2)和4)中共培养条件为在25～37℃，300rpm的恒温混匀仪中培养60分钟。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，SERS检测芯片检测microRNA的线性范围为：10aM-1nM，检测限达到阿摩尔每升量级。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的血清中微小核酸microRNA是肿瘤目标微小核酸标志物microRNA。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤目标微小核酸标志物microRNA是胃癌目标微小核酸标志物microRNA-106a。

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