CN111812075A - Sers-spr双模传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开用于核酸检测的SERS‑SPR双模传感器，双模传感器包含检测芯片和DNA探针，检测芯片为表面修饰有四面体DNA的银纳米孔‑纳米棒阵列基片。本发明还公开SERS‑SPR双模传感器的制备方法及检测方法。本发明将检测芯片依次与待检测液体样品、DNA探针溶液混合，通过互补配对形成“检测芯片‑目标DNA‑DNA探针”复合物，之后依次进行透射光谱测试、SERS测试，通过透射光谱特征谷的波长变化、SERS光谱及其特征信号强度值实现对于血清中核酸的高灵敏、特异性的双模传感检测，SERS传感模式和SPR传感模式的检测限分别达到了亚飞摩尔每升量级和亚皮摩尔每升量级，可实现在血清等复杂环境中检测核酸标志物。

Description

SERS-SPR双模传感器及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于功能纳米材料和生物检测领域，具体涉及一种用于核酸检测的SERS-SPR双模传感器及其制备方法和应用。

背景技术

随着分子生物学、医学领域的不断发展，以及对于癌症产生机制的进一步研究，人们逐渐认识到癌症的发生是由遗传物质的改变所引发的疾病，即对应的细胞会分泌癌症标志物，包括核酸(如microRNA)、蛋白质、激素等，其在血液中的存在或是含量将会反映癌症的状态。但在病变早期，癌症标志物的含量很低，常规临床检测技术因其灵敏度的限制，在标志物的检测过程中容易出现漏检的现象；此外癌症标志物检测的样本一般是血液或组织，通常成分复杂，测试结果易受干扰，常常会出现“假阳性”或“假阴性”现象，严重影响检测的可靠性。因此，面对实际疾病诊断中“快、准、早”的要求，针对癌症早期检测这一关键性问题，如何构建一种超灵敏检测体系，同时具备优异的特异性、敏感性，成为了早期癌症诊断领域急需解决的问题。此外，已有的单一模式检测，所能提供的生物特征信息相对单一、有限，对于疾病的判断和分析无法提供充分依据，通常需要分别经由多种独立传感模式分别测试，以获得更为丰富的生物特征信息。多次测试需要更大的样品量，同时在不同传感器及仪器上转移测试，复杂并费时的操作容易导致生物样品失活，且很难做到对于样品的多模式共定位联合精准检测。因此，不同传感器所获取的信息很难保证来源于同一检测区域或目标，致使检测结果欠缺一致性和可靠性，容易造成疾病诊断不准确、甚至错误。同时，由于不同检测模式具有各自特有的优点，但无法兼顾多方面特点。因此，开发多模式传感器，能够解决单一模式检测的不足，提高重大疾病诊疗准确性和便捷性。

金属结构独特的等离子体性质，导致表面等离子体共振(SPR)。折射率传感是一种重要的等离子体应用，提供了一种准确、无标记的分析方法。这项技术的基础是通过在纳米结构表面取代本体材料或诱导分子相互作用来监测金属纳米结构周围折射率改变时共振峰的波长或角度偏移。金属纳米结构独特的局域等离子体性质，会导致纳米结构具有表面增强拉曼散射(SERS)性能。SERS光谱技术因其出色的检测灵敏度、非侵入检测等优势而在生物医学检测领域得到广泛关注。SERS技术在生物分析与标志物的传感检测领域具有独特优势：①超灵敏性：SERS的增强因子高达10¹³-10¹⁵，已实现单分子检测水平；②样品需求量少；③高选择性：表面选择定则和共振增强的选择性使得SERS可以在极其复杂的体系中仅仅增强目标分子或基团，可最大限度减小复杂样品的背景干扰；④检测条件温和：SERS技术具有非破坏性，且不会自猝灭和光漂白。

因此，将SPR和SERS两种等离子体传感模式结合在一个传感器中，有望同时协同各自的优势，弥补彼此的不足，实现两种模式联合，达到准确可靠的检测。但是SERS和SPR的传感原理是非常不同的：SERS依赖于在具有非传播电磁波的金属纳米结构周围产生强局域电场；而SPR是基于入射电磁波与金属与介质界面上传播的电磁波的耦合。因此，开发SPR/SERS双模传感器是一个很大的挑战。

发明内容

发明目的：现有的检测技术单一，而且往往在检测灵敏性、特异性方面差强人意，并且检测得到了样品生物特征信息较为单一，无法更为全面反映样品特征而出现漏诊、误诊等情况。本发明提出了一种用于核酸检测的SERS-SPR双模传感器，能够有效解决目前大多数检测手段存在的灵敏性、特异性不足的问题。本发明的双模传感器其具有优异的检测灵敏度、特异性，能够实现可靠的高灵敏核酸检测。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种SERS-SPR双模传感器的制备方法。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种SERS-SPR双模传感器的应用。

本发明最后要解决的技术问题是提供了一种SERS-SPR双模光谱传感器的检测方法。本发明将检测芯片依次与待检测液体样品、DNA探针溶液混合，通过互补配对形成“检测芯片-目标DNA-DNA探针”复合物，之后依次进行透射光谱测试、SERS测试，通过透射光谱谷值变化、SERS信号强度实现对于血清中核酸的高灵敏、特异性的双模传感检测，SERS传感模式和SPR传感模式的检测限分别达到了fM、pM，可实现在血清等复杂环境中检测核酸标志物。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了用于核酸检测的SERS-SPR双模传感器，所述双模传感器包含检测芯片和DNA探针，所述检测芯片为表面修饰四面体DNA的银纳米孔-纳米棒阵列基片。

其中，所述四面体DNA具有三维立体结构，该四面体DNA由A(第一条单链)、B(第二条单链)、C(第三条单链)、D(第四条单链)四条DNA单链自组装而成，其中A、B两条DNA单链均在5’端修饰巯基，DNA单链C链在3’端修饰巯基，DNA单链D链的5’端延伸出能与目标DNA互补配对的碱基序列。四面体DNA底面三个端角有巯基，四面体DNA顶角有延伸出的能与目标DNA互补配对的碱基序列(DNA单链的5’端)。该序列能够识别并捕获待检测液中的目标DNA，目标DNA与四面体DNA中D单链从5’端开始杂交，进而将原先与D链杂交的C链5’端部分碱基序列释放出来，四面体结构被打开，释放出的C链5’端能与DNA串联体中S1的3’端序列互补杂交。

其中，所述DNA探针为DNA单链S1与DNA单链S2重复杂交形成的DNA串联体，单链S1和S2的3’端、5’端均修饰了染料分子，DNA单链S1与DNA单链S2的部分序列碱基互补，能杂交并形成DNA串联体。

其中，所述染料分子为本领域常规的标记染料，包括但不限于ROX等染料。

其中，DNA单链S1、DNA单链S2均为修饰有染料分子的DNA单链，DNA单链S2的3’端部分碱基序列能够与DNA单链S1的5’端部分碱基序列互补杂交，DNA单链S2的5’端的部分碱基序列能与DNA单链S1的3’端部分碱基序列互补杂交，由此可以形成DNA单链S1和DNA单链S2交替杂交排列的S1-S2串联体。其中DNA单链S1的部分碱基序列能够与四面体DNA捕获目标DNA后释放出的C链5’端部分碱基序列互补杂交。也即意味着，只有当待测样品中存在目标DNA时，检测芯片上的四面体DNA会特异性识别并捕获目标DNA，互补杂交后打开四面体并释放一条碱基序列用于特异性捕获DNA串联体并固定在检测芯片表面，进而输出DNA串联体对应的SPR和SERS检测信号；当不存在目标DNA时，四面体DNA的结构得到保持，因而DNA串联体不会被捕获并固定在检测芯片表面，且探测不到DNA串联体对应的检测信号。

本发明内容还包括所述的用于核酸检测的SERS-SPR双模传感器的制备方法，包括以下步骤：

1)检测芯片的制备：

(a)制备银纳米孔-纳米棒阵列基片，并用缓冲液多次清洗；

(b)将四条DNA单链等物质的量混合，经退火处理后，组装形成四面体DNA；

(c)将银纳米孔-纳米棒阵列基片与四面体DNA溶液共培养，四面体DNA通过其中一个面上三个端角的巯基与银通过共价键修饰在银纳米孔-纳米棒阵列基片表面，经多次缓冲液冲洗后得到检测芯片。

2)DNA探针的制备：DNA单链S1、S2等物质的量混合，经退火处理后，组装形成DNA串联体，作为DNA探针。

其中，所述步骤(b)的四面体DNA的制备方法为：将四条DNA单链等物质的量混合，经退火处理(即加热至95℃并保持5min，再自然冷却至室温)，得到四面体DNA。

其中，所述步骤(c)四面体DNA与银纳米孔-纳米棒阵列基片共培养的培养条件为在25℃共培养3小时以上。

其中，所述步骤2)DNA探针的制备方法为：将等摩尔量的DNA单链S1和S2混合于TM缓冲液得到混合溶液，将混合溶液退火处理(即加热至95℃维持5min，再自然冷却至室温)，然后将混合溶液置于25℃恒温摇床中振荡3h，最终形成DNA串联体，作为DNA探针。

其中，所述步骤(b)四条DNA单链的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～4所示。

其中，所述步骤2)DNA单链S1和S2的核苷酸序列如SEQ ID NO：5～6所示。

本发明内容还包括所述的用于核酸检测的SERS-SPR双模传感器在核酸检测中的应用。

本发明内容还包括所述的用于核酸检测的SERS-SPR双模传感器的检测方法，所述检测方法包括：

S1)将检测芯片分别与含有不同浓度目标DNA的样品溶液共培养；

S2)将步骤S1)处理后的检测芯片多次清洗，之后分别与DNA探针溶液共培养；

S3)将步骤S2)处理后的检测芯片经多次清洗后进行偏振透射光谱测试(入射线偏振光的电场方向设置成与芯片上银纳米棒的取向方向夹角为90°)、SERS测试，检测得到不同浓度样品对应的偏振透射光谱、SERS光谱，以目标DNA浓度的对数为横坐标，分别以偏振透射光谱的特征谷的波长变化值、SERS特征峰强度值为纵坐标，分别做出SPR传感、SERS传感的工作曲线。根据工作曲线计算传感器的SPR传感检测限和SERS传感检测限。

其中，所述步骤S1)目标DNA核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。

其中，所述步骤S1)目标DNA浓度范围为1fM～10nM。

有益效果：相对于现有技术，本发明具备以下优势：

1、本发明所制备的SERS-SPR双模传感器可用于核酸的高灵敏传感检测。SERS-SPR双模传感器是以修饰有四面体DNA的银纳米孔-纳米棒阵列基片为检测芯片，并以DNA串联体作为DNA探针。

2、本发明所采用的银纳米孔-纳米棒阵列基片具有大面积均一、银纳米孔阵列排列、纳米棒生长在纳米孔外等结构特征，显示出优异的各向异性超传输(EOT)光学特性和强局部表面等离子体共振增强效应，表现出良好的折射率变化响应能力和SERS增强性能。

3、本发明所制备的SERS-SPR双模传感器表面修饰有四面体DNA实现生物功能化，相比于常规使用的单链DNA，四面体DNA具有良好的结构刚性和稳定性，能够通过四面体尺寸的调控实现修饰有四面体DNA在纳米界面表面分布的密度，具有优异的空间定位能力；同时，四面体DNA在纳米界面具有较好的取向性，避免了单链在界面上的倒伏和缠绕等不足，因而提高了生物功能化的界面对于目标DNA的捕获能力和效率，提高检测灵敏度和特异性；此外，四面体DNA修饰纳米界面后能够高效封闭界面上的吸附位点，能够有效降低界面对血清中杂质分子的非特异性吸附，提高检测的特异性；本发明所制备的四面体DNA与已有报道的四面体DNA有显著不同，本发明所制备的四面体DNA在检测到目标DNA后结构会打开，进而释放出一条DNA单链用于结合DNA串联体，这种设计相比于常规四面体DNA(直接与目标DNA杂交而无结构变化)的结合方式因与目标DNA间有更多数量的碱基互补杂交，以及打开后释放的单链能提供更多碱基与DNA串联体互补杂交，因而具有更高的杂交效率，进而灵敏度更好。所采用的DNA探针为单链组装形成的DNA串联体，能够携带大量信号分子，可以有效增大SERS光谱及其特征信号强度值，DNA串联体具有较大的分子结构，具有更大的光折射率，能引起传感器更为显著的SPR特征信号的波长移动，因此可以提高传感灵敏度。此外，SERS由于具有极高的灵敏度，因而非常容易被背景(污染)分子或在检测介质中存在的其他分析物中所产生得高背景光谱信号干扰，增加了产生假阳性或假阴性信号的机会。而SERS-SPR双模传感器不仅保持了SERS传感器的高灵敏度，并且利用SPR传感器能够检测相同的目标分析物，可以提高检测的鲁棒性和检测的精度。本发明制备的SERS-SPR双模传感器可实现在血清等复杂环境中低丰度核酸的高灵敏、特异性检测，SPR传感模式下对血清中目标DNA的检测限达到0.51pM(亚皮摩尔每升量级)，SERS传感模式下对血清中目标DNA的检测限达到0.77fM(亚飞摩尔每升量级)。

4、该双模传感器同时具有SERS性能和介质折射率变化响应能力。本发明能够实现一次微量取样测试，实现原位SPR和SERS双模式共定位联合检测，通过两种模式功能的协同，有效避免不同传感器多批次加样检测容易导致的样品采集量大，转移分别检测导致的样品污染失活，以及单一模式检测结果欠缺一致性和可靠性而容易造成疾病诊断不准确、甚至错误等问题，实现双模检测的互查复验，达成高灵敏、高特异性准确检测目标。

综上，本发明公开的SERS-SPR双模传感器结合了SPR的无标记测定和SERS的高灵敏性分析的特点，在传感检测中表现出可靠而灵敏的检测性能。在检测血液中与疾病相关的核酸生物标志物方面具有巨大应用市场，并为开发用于早期疾病诊断的可靠传感器提供了制备方法与思路。

附图说明

图1是实施例1所得银纳米孔-纳米棒阵列基片的制备流程图；

图2是实施例1所制得的银纳米孔-纳米棒阵列基片的扫描电镜图，图中右上角插图是放大图，底部是截面图；

图3是实施例2表征得到银纳米孔-纳米棒阵列基片对不同折射率溶剂的透射光谱，其中(a)、(c)和(e)图分别是非偏振光、0度偏振光和90度偏振光入射时的检测得到透射光谱，(b)、(d)和(f)图是不同入射光下基片在各种折射率溶液中测得的透射光谱上各个峰、谷的波长与溶液折射率关系图，并计算其折射率响应灵敏度；

图4是实施例4在非偏振光、0度偏振光和90度偏振光入射下测试缓冲液中不同浓度目标DNA时所测得的透射光谱数据，(a)、(c)和(e)图分别是非偏振光、0度偏振光和90度偏振光入射归一化透射光谱，(b)、(d)和(f)图是分别对应于(a)、(c)和(e)图中透射光谱中V₂波长变化值的统计图；

图5是本发明所涉及的SERS-SPR双模传感器构建及传感原理图；

图6是实施例3中涉及的DNA形成及杂交过程的凝胶电泳表征；(a)图是四面体DNA形成、四面体DNA与目标DNA杂交示意图(左)和电泳图(右)。(b)图是DNA串联体形成以及DNA串联体与捕获链C1的杂交示意图(左)和电泳图(右)；

图7是实施例5中SERS-SPR双模传感器特异性。(a)图是检测目标DNA的偏振透射光谱；(b)图是检测与目标DNA单碱基错配和完全错配核酸序列得到的偏振透射光谱；(c)图是检测目标DNA、单碱基错配和完全错配核酸序列得到的SERS光谱，(d)图是对(a，b)图中透射光谱V₂波长变化值的统计和(c)图中SERS光谱1500cm^-1处峰值强度值的统计图；

图8是实施例6中SERS-SPR双模传感器用于血清样品检测时SERS模式和SPR模式的检测工作曲线；(a)图是SERS-SPR双模传感器检测不同浓度目标DNA得到的偏振透射光谱；(b)图是对(a)图中特征信号波长变化量的统计图；(c)图是SERS-SPR双模传感器检测不同浓度目标DNA得到的SERS光谱；(d)图是(c)图中SERS光谱1500cm^-1处峰值强度的统计图；

图9是实施例7中SERS检测均一性。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的内容并不限于所举的实施例。

本发明所使用的DNA碱基序列片段均为人工合成得到，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1、实施例中的待检测的目标DNA的核酸碱基序列为：

目标DNA(T)：5’-TTC AGA CTT AGG AAT GTA CCT AGA-3’

2、实施例中特殊设计的四条DNA片段碱基序列如表1所示，对应于四面体DNA制备所需的四条DNA单链：

表1

3、实施例中的用于组装DNA串联体的两条DNA单链的序列如下

DNA-S1(S1)：5’-ROX-ACT TTG TTC AGA CTT AGA CAT TCC TAA GTC TGA A-ROX-3’

DNA-S2(S2)：5’-ROX-CTA AGT CTG AAC AAA GTT TCA GAC TTA GGA ATG T-ROX-3’

4、针对目标DNA碱基序列的特异性实验对应的单碱基错配序列(SM)、完全错配(UM)碱基序列为：

单碱基错配序列(SM)：5’-TTC AGA CTT AGG AAT GTA CCG AGA-3’

完全错配(UM)：5′-CGT GAT GAG GGA TTG TAG AGT TCG-3

5、四面体DNA在与目标DNA互补后会延伸出一条DNA单链，该单链序列属于D链的一部分，可与S1部分序列发生碱基互补杂交，从而将所形成的DNA串联体与四面体绑定，进而固定在芯片表面。该单链序列记作Capture DNA(C1)，碱基序列为：

Capture DNA(C1)5’-TTC AGA CTT AGG AAT GT-3’。

实施例1银纳米孔-纳米棒阵列基片的制备

1、采用纳米球刻蚀(NSL)、活性离子刻蚀(RIE)和物理蒸发沉积技术制备了银纳米孔-纳米棒阵列。图1显示了银纳米孔-纳米棒阵列的制备过程。第一步，通过空气-水界面法，将500nm聚苯乙烯(PS)微球以单层方式密堆积的方式组装在干净的玻璃或硅片上，形成微球模板，玻璃片或硅片的尺寸均为0.9×2.5em。

2、第二步，利用O₂等离子体对基片表面的PS微球进行刻蚀，以降低基片表面微球的直径。在刻蚀过程采用的是Trion Technology Phantom III RIE/ICP系统进行操作，压力为40mTorr，氧气流量为10sccm，ICP功率为25W，射频功率为10W，持续时间为350s。

3、使用定制的电子束沉积系统在基片表面物理沉积。首先将表面带有PS微球模板的基片放置在沉积室中，并使基片的法线反向平行于沉积入射方向。然后在高真空条件下(＜3×10^-6Torr)，以0.2nm/s的速度在基片表面沉积厚度为10nm的Ti层，然后以0.3nm/s的速度沉积厚度为70nm的Ag膜。膜厚度和沉积速率通过石英晶体微量天平(QCM)进行监控。用透明胶带除去基片上的PS微球，用甲苯冲洗基片表面以除去残留的PS微球，再经过数次彻底的水洗后，便获得了银纳米孔阵列，如图2a所示。

4、最后，将上述基片再次置入沉积室，并进行斜角沉积(OAD)以在银纳米孔阵列上沉积银纳米棒阵列。将基片法线相对于入射方向旋转至86°，以0.3nm/s的速率沉积厚度为250nm的(QCM示数)银纳米棒，最终获得银纳米孔-纳米棒阵列基片，如图2b所示。

实施例2银纳米孔-纳米棒阵列基片折射率响应性能的表征

将实施例1所制备的银纳米孔-纳米棒阵列基片(结构如图2所示)分别浸泡在不同折射率溶剂中：甲醇(n＝1.328)、丙酮(n＝1.359)、1-己醇(n＝1.418)、氯仿(n＝1.446)和甲苯(n＝1.496)，之后分别测试银纳米孔-纳米棒阵列基片的偏振和非偏振透射光谱。在非偏振、0度偏振和90度偏振光照射下，银纳米孔-纳米棒阵列基片的透射光谱表现出折射率依赖性，如图3所示。此外透射光谱的光谱轮廓和峰谷变化均表现出明显的偏振相关性。根据不同峰谷变化对于不同折射率溶剂的响应程度，分别统计峰和谷对同折射率溶剂的响应程度，并根据它们的线性拟合计算了不同峰、谷的折射率灵敏度，如图3所示。并且从图3中发现，在比较非偏振(图3a，b)、0度偏振(图3c，d)和90度偏振光(图3e，f)照射下对应的光谱结果，标记为V₂的波长变化值均表现出良好的折射率依赖性、线性关系和折射率灵敏度，因此将谷V₂的波长变化用于SPR模式的传感检测。

实施例3 SERS-SPR双模传感器的制备

1、四面体DNA探针的制备。如图5所示，通过A、B、C、D四条单链的碱基互补杂交自组装形成四面体DNA。将等摩尔量(1μM)的四条DNA单链混合于300μL TM缓冲液(20mM Tris-HCl、50mM MgCl2，pH 8.0)中混合，经退火处理(即加热至95℃维持5min，再自然冷却至室温)，形成四面体DNA，最终溶液中四面体DNA的浓度为1μM。用10％聚丙烯酰胺凝胶电泳表征四面体DNA的形成，图6a为对应于四面体DNA形成过程的电泳胶图，相比于一条(泳道1)、两条(泳道2)和三条DNA链(泳道3)的组合，四条DNA链混合自组装形成的四面体DNA在泳道4中移动得最慢，表明四面体DNA成功形成，而且产率高。此外所形成的四面体DNA能够与目标DNA(T)发生高效的碱基互补杂交，所形成的复合物的条带相比四面体DNA移动得更慢(泳道5)。

2、将300μL四面体DNA通过TM缓冲液稀释至3mL四面体DNA溶液，然后将实施例1制备的带有银纳米孔-纳米棒阵列的基片与上述四面体DNA溶液在25℃的水浴锅中共培养3小时以上。四面体DNA通过底部的三个巯基，以Ag-S共价键的形式固定在银纳米孔-纳米棒阵列上。用TM缓冲液多次清洗基片，获得表面修饰四面体DNA的银纳米孔-纳米棒阵列检测芯片。

3、DNA串联体通过DNA单链S1和S2的自组装形成。将等摩尔量的DNA单链S1和S2混合于160μL TM缓冲液，DNA单链S1、S2的最终浓度均为3.75μM。将上述混合溶液退火处理(即加热至95℃维持5min，再自然冷却至室温)，然后将混合溶液置于25℃恒温摇床中振荡3h，最终形成DNA串联体，作为DNA探针。然后用TM缓冲液将DNA串联体稀释至3mL，并在4℃下保存以备用。用10％聚丙烯酰胺凝胶电泳表征DNA的形成，图6b为对应于DNA串联体形成的电泳胶图，相比于单链S1(泳道2)、单链S2(泳道3)，S1和S2混合自组装形成的DNA串联体在泳道4中移动得最慢，表明DNA串联体的成功形成，而且产率高。从图6b中可以看出，相比S1(泳道2)、C1(泳道1)，S1与C1(泳道6)之间能够发生碱基互补杂交，新条带证实四面体DNA上用于特异性捕获DNA串联体的碱基序列(C1)能够与S1发生互补杂交(泳道6)，进而能够与DNA串联体发生碱基互补杂交(泳道5)。

实施例4 SERS-SPR双模传感器SPR传感模式的选择

1、将目标DNA用TM缓冲液稀释到不同浓度1fM，10fM，100fM，1pM，10pM，100pM，1nM，10nM。将实施例3制备的表面修饰有四面体DNA的银纳米孔-纳米棒阵列检测芯片与不同浓度的目标DNA溶液置于25℃恒温摇床中共培养3h，随后用TM缓冲液清洗检测芯片，即SERS-SPR检测芯片。将每个SERS-SPR检测芯片分别和3mL DNA串联体溶液在25℃下共培养3h，然后用TM缓冲液清洗得到SERS-SPR双模传感器。将SERS-SPR双模传感器放入装有TM缓冲液的石英比色皿中，测试记录传感器的透射光谱。对目标DNA浓度和相应偏振透射光谱中V₂的波长变化作出SERS-SPR双模传感器的工作曲线，并分别计算传感器对这种目标DNA的线性范围和检测下限。之后比较非偏振光、0度偏振光、90度偏振光下的检测性能，选择最优的方式用于之后血清样品的检测。

图4a为非偏振光下，不同目标DNA浓度下所得的归一化后的透射光谱图，图4b为(a)图中不同目标DNA浓度下V₂的波长变化。图4c为0度偏振光下，不同目标DNA浓度下所得的归一化后的透射光谱图，图4d为(c)图中不同目标DNA浓度下V₂的波长变化。图4e为90度偏振光下，不同目标DNA浓度下所得的归一化后的透射光谱，图4f为(e)图中不同目标DNA浓度下V₂的波长变化。(透射光谱测试条件：扫描范围为300nm到1400nm，狭缝宽为5nm。通过在样品测试光路、参比光路分别放置一个偏振片，搭建偏振透射光谱的测试光路)通过对V₂波长变化值与目标DNA浓度对数关系的拟合，得到非偏振光、0度偏振光、90度偏振光下对应的工作曲线，比较三者发现，90度偏振光下对应的V₂波长变化响应最好，其对应的工作曲线为Δλ＝1.963×log C_T+26.34(R²＝0.980)，检测下限为0.18pM。之后将90度偏振光下的透射光谱中V₂波长变化用作血清样品的传感检测。

实施例5 SERS-SPR双模传感器的特异性

用TM缓冲液将目标DNA稀释到100pM，用TM缓冲液将单碱基错配序列(SM)、完全错配序列(UM)均稀释到1nM。将实施例3制备的表面修饰有四面体DNA的银纳米孔-纳米棒阵列检测芯片分别和100pM目标DNA、1nM单碱基错配DNA(SM)、1nM完全错配DNA溶液(UM)和空白对照组(TM缓冲液)，在25℃恒温摇床中共培养3h，随后用TM缓冲液清洗检测芯片，即SERS-SPR检测芯片。将SERS-SPR检测芯片分别和3mL DNA串联体溶液在25℃下共培养3h，然后用TM缓冲液清洗得到SERS-SPR双模传感器。将得到SERS-SPR双模传感器放入装有TM缓冲液的石英比色皿中，测试并记录偏振透射光谱。随后将芯片取出进行SERS测试，得到SERS光谱及其特征信号强度值(拉曼测试条件：扫描时间1s，激光功率1％，物镜放大倍率20x，累计次数1次，激发光波长633nm)。得到目标DNA、单碱基错配DNA(SM)、完全错配DNA(UM)、空白对照组(TM缓冲液)分别对应的偏振透射光谱中V₂波长变化值、SERS光谱及其特征信号强度值。提取图7a中归一化后的偏振透射光谱中V₂波长变化量得到图7b，此外提取图7c中1500cm^-1处SERS峰信号强度，最终得到SERS-SPR双模传感器的特异性表征实验的结果(图7d)。对于目标DNA(T)、单碱基错配序列(SM)、完全错配序列(UM)，对应于目标DNA的偏振透射光谱V₂波长变化最为显著、SERS光谱及其特征信号强度值最高，说明该检测策略具有很好的特异性。

实施例6 SERS-SPR双模传感器工作曲线及检测限

将目标DNA用10％正常人血清(购买自Biosharp)稀释到不同浓度1fM，10fM，100fM，1pM，10pM，100pM，1nM，10nM。将表面修饰有四面体DNA的银纳米孔-纳米棒阵列检测芯片和不同浓度的目标DNA溶液置于25℃恒温摇床中共培养3h，随后用TM缓冲液清洗检测芯片，即SERS-SPR检测芯片。将每个SERS-SPR检测芯片分别与实施例3制备的3mLDNA串联体溶液在25℃下共培养3h，然后用TM缓冲液清洗得到SERS-SPR双模传感器。将SERS-SPR双模传感器放入装有TM缓冲液的石英比色皿中，测试并记录传感器的偏振透射光谱。之后将检测芯片取出进行SERS测试，得到SERS光谱及其特征信号强度值。对目标DNA浓度和相应偏振透射光谱中V₂波长变化、SERS光谱及其特征信号强度值分别作出SERS-SPR双模传感器的工作曲线，并分别计算传感器对目标DNA的传感线性范围和检测下限。

图8a为不同目标DNA浓度检测所得的归一化后的偏振透射光谱图，图8b为其各谱线在V₂处所对应的的波长变化。通过对波长变化值与目标DNA浓度对数关系的拟合，得到工作曲线：Δλ＝2.22×log C_T+27.78(R²＝0.95)，通过计算检测限为0.51pM。图8c为不同T浓度下所得的归一化后的SERS光谱图，图8d为其各谱线在1500cm^-1处所对应的SERS峰强度。通过对SERS强度与目标DNA浓度对数关系的拟合，得到工作曲线：I＝699.11×log C_T+11197.24(R²＝0.98)，通过计算检测限为0.77fM。

实施例7 SERS-SPR双模传感器均一性

取检测1nM目标DNA时的50个随机点，记录其1500cm^-1处SERS峰强度，用来表征该检测策略的均一性，如图9所示，相对标准偏差(RSD)为4.36％，说明所提出的SERS-SPR双模传感器具有很好的均一性。

实施例8 SERS-SPR双模传感器回收率

用10％正常人血清将目标DNA稀释为3个不同浓度的溶液(7pM、30pM和3nM)，分别对这三个浓度的T溶液进行SERS-SPR双模检测，进行回收率表征实验，实验结果如表2。

表2 10％正常人血清中目标DNA的检测回收率表征结果

从表2中可以看出1、2和3样品中目标DNA的检出浓度与配制值接近，SPR传感对应的回收率在98.37％～113.5％之间，SERS传感对应的回收率在94.43％～107.0％之间，样品检出准确度高。

序列表

<110> 南京邮电大学

<120> SERS-SPR双模传感器及其制备方法和应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 55

<212> DNA

<213> A(Artificial Sequence)

<400> 1

tatcaccagg cagttgacag tgtagcaagc tgtaatagat gcgagggtcc aatac 55

<210> 2

<211> 55

<212> DNA

<213> B(Artificial Sequence)

<400> 2

tcaactgcct ggtgataaaa cgacactacg tgggaatcta ctatggcggc tcttc 55

<210> 3

<211> 55

<212> DNA

<213> C(Artificial Sequence)

<400> 3

ttcagactta ggaatgtgct tcccacgtag tgtcgtttgt attggaccct cgcat 55

<210> 4

<211> 62

<212> DNA

<213> D(Artificial Sequence)

<400> 4

tctaggtaca ttcctaagtc tgaaacatta cagcttgcta cacgagaaga gccgccatag 60

ta 62

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 目标 DNA (Artificial Sequence)

<400> 5

ttcagactta ggaatgtacc taga 24

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> DNA-S1 (Artificial Sequence)

<400> 6

actttgttca gacttagaca ttcctaagtc tgaa 34

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> DNA-S2(Artificial Sequence)

<400> 7

ctaagtctga acaaagtttc agacttagga atgt 34

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 单碱基错配序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttcagactta ggaatgtacc gaga 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 完全错配 (Artificial Sequence)

<400> 9

cgtgatgagg gattgtagag ttcg 24

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> Capture DNA (Artificial Sequence)

<400> 10

ttcagactta ggaatgt 17

Claims (10)

1.用于核酸检测的SERS-SPR双模传感器，其特征在于，所述双模传感器包含检测芯片和DNA探针，所述检测芯片为表面修饰四面体DNA的银纳米孔-纳米棒阵列基片。

2.根据权利要求1所述的用于核酸检测的SERS-SPR双模传感器，其特征在于，所述四面体DNA具有三维立体结构，该四面体DNA由四条DNA单链自组装而成，其中第一、第二条DNA单链均在5’端修饰巯基，第三条DNA单链在3’端修饰巯基，第四条DNA单链5’端延伸出能与目标DNA互补配对的碱基序列。

3.根据权利要求1所述的用于核酸检测的SERS-SPR双模传感器，其特征在于，所述DNA探针为DNA单链S1与DNA单链S2重复杂交形成的DNA串联体，单链S1和单链S2的序列3’端、5’端均修饰有染料分子，单链S1与单链S2的部分序列互补配对，杂交形成DNA串联体。

4.权利要求1~3任一项所述的用于核酸检测的SERS-SPR双模传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）检测芯片的制备：首先制备银纳米孔-纳米棒阵列基片；接着将四条DNA单链等物质的量混合，组装形成三维立体结构的四面体DNA；随后将银纳米孔-纳米棒阵列基片和四面体DNA溶液共培养，四面体DNA通过三个巯基与银形成共价键修饰在银纳米孔-纳米棒阵列基片表面；最后用缓冲液多次清洗基片，得到检测芯片；

2）DNA探针的制备：将DNA单链S1、S2等物质的量混合，经退火处理，组装形成DNA串联体，作为DNA探针。

5.根据权利要求4所述的用于核酸检测的SERS-SPR双模传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤1）四面体DNA的制备方法为：将四条DNA单链等物质的量混合，经退火处理得到四面体DNA。

6.根据权利要求4所述的用于核酸检测的SERS-SPR双模传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤1）四面体DNA与银纳米孔-纳米棒阵列基片共培养的培养条件为25℃共培养3小时以上。

7.根据权利要求4所述的用于核酸检测的SERS-SPR双模传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤2）DNA探针的制备方法为：将等摩尔量的单链DNA S1和S2混合于TM缓冲液得到混合溶液，将混合溶液退火处理之后，将混合溶液置于25°C恒温摇床中振荡3 h，形成DNA串联体，作为DNA探针。

8.权利要求1~3任一项所述的用于核酸检测的SERS-SPR双模传感器在核酸检测中的应用。

9.权利要求1~3任一项所述的用于核酸检测的SERS-SPR双模传感器的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：

S1）将检测芯片分别与含有不同浓度的目标DNA的样品溶液共培养；

S2）将步骤S1）共培养后的检测芯片多次清洗后分别与DNA探针溶液共培养；

S3）将步骤S2）处理得到的检测芯片清洗多次后依次进行偏振透射光谱测试、SERS测试，得到不同浓度目标DNA检测对应的偏振透射光谱、SERS光谱及其特征信号强度值，以目标DNA浓度的对数为横坐标，分别以偏振透射光谱的特征谷的波长变化值、SERS特征峰强度值为纵坐标，分别做出SPR传感、SERS传感的工作曲线，根据工作曲线计算传感器的SPR传感检测限和SERS传感检测限，根据工作曲线计算得出待测样品中目标DNA的浓度。

10.根据权利要求9所述的用于核酸检测的SERS-SPR双模传感器的检测方法，其特征在于，所述步骤S1）的目标DNA浓度范围为1fM~10 nM。

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