JP4233807B2 - 生化学反応体の検出方法とバイオチップ - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、バイオチップを用いた生化学検体の検出方法の改良に係り、基板に配列されたプローブ核酸に例えば解放末端側が基板側に向くようにループ構造を取らせることで、目的ＤＮＡやＲＮＡがある場合にのみハイブリダイゼーションが起こり、前記ループ構造が解消されて伸びることから、ハイブリダイズした目的の複合体（生化学反応体）のみを任意の標識で修飾することが可能となり、ハイブリダイゼーション並びに標識による修飾自体の精度が本来的に高く、これを電気的、電気磁気的、電気光学的あるいは電気磁気光学的な変化として高精度な生化学検体の検出が実現できる生化学反応体の検出方法とバイオチップに関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子検出の基本原理は、ＤＮＡが相補的な二重螺旋構造を形成することを利用するものである。Ａ（アデニン）とＴ（チミン）、Ｃ（シトシン）とＧ（グアニン）が対をなすことから、例えば、ＡＧＧＴＴＡＣ（５'→３'）のＤＮＡ配列を持つ遺伝子を検出するには、プローブとしてＴＣＣＡＡＴＧ（３'→５'）の配列を持つＤＮＡを作成し、サンプリング検体遺伝子中に目的遺伝子が存在すると、ＤＮＡハイブリダイゼーションによって、プローブＤＮＡの配列にＡＧＧＴＴＡＣの配列が結合して二重螺旋構造を取るため、これを検出することで目的ＤＮＡを容易に選別できることになる。
【０００３】
二重螺旋構造のＤＮＡを検出する方法として、検体ＤＮＡ（サンプリング遺伝子ＤＮＡ）に蛍光標識で修飾を施しておき、プローブＤＮＡと前記のＤＮＡハイブリダイゼーション操作を行い、二重螺旋構造を呈したＤＮＡ、すなわち蛍光シグナルを発するものを検出する、蛍光法が知られている。
【０００４】
蛍光標識としては、蛍光色素そのものの他、蛍光色素により直接染色された染色体、糖蛋白や糖脂質から切り出された糖鎖体を修飾したイオン性蛍光物質、あるいはタンパク質、核酸、酵素、細胞等を蛍光色素でタグ化するなど、種々方法並びに物質で蛍光を発する標識が提案されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上述のＤＮＡを初めとして検出対象となる生化学検体には、ＲＮＡ及び核酸類似構造物などの多種多様の構造物が想定される。これらの生化学検体を効率よく検出するには、プローブとして機能する所要の塩基配列を有するＤＮＡやＲＮＡ構造体、ＰＮＡ構造体を所要のガラス基板などの基板上に配列してチップ化し、かかるバイオチップを基本単位として生化学検体とのハイブリダイゼーション操作を施し、当該ハイブリダイゼーションを完了した目的のプローブと生化学検体との複合体（生化学反応体）を確実に検出する必要がある。
【０００６】
検体側に蛍光標識を施す蛍光法を用い、前記バイオチップにハイブリダイゼーションを行いハイブリダイズしたＤＮＡを検出する方法では、蛍光標識による修飾操作が煩雑であること、また、施術者の技量によって前記ハイブリダイゼーション並びに標識による修飾効率が異なること、さらに種々条件で蛍光色素の光消失が発生すること、未反応吸着物によるバックグラウンドノイズの上昇で検出精度が低下すること等の問題が指摘されている。
【０００７】
この発明は、前記バイオチップを用いた生化学検体の検出方法の問題に鑑み、検出工程を再現性よく簡素化でき、測定者に過度の技量を要求することがなく、ハイブリダイゼーション並びに標識による修飾工程におけるそれぞれの施術並びに効率の精度を高め、最終的に目的検体の検出精度の向上が可能となる生化学反応体の検出方法とバイオチップの提供を目的としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、バイオチップを用いた生化学検体の検出精度の向上を目的に、ガラスなどの基板にプローブが多数配列されたバイオチップにおいて、プローブへ生化学検体をハイブリダイゼーションさせる方法、プローブへの蛍光標識などの標識による修飾方法について詳細に検討したところ、
１）ハイブリダイゼーションを完了して二重螺旋構造を形成したプローブを標識で修飾すると、ハイブリダイズしていないプローブへも修飾が行われて標識による検出が不能となるため、従来、予め検体側に標識による修飾を施しておき、ハイブリダイズした後に検体側の標識を検出することで目的検体を検出するが、条件設定の違いや施術者の技量などによりハイブリダイゼーション時に非特異的な吸着が生じて検出精度が変動低下すること、
２）プローブがＲＮＡ及び核酸類似構造物である場合、プローブがＤＮＡ構造物である時と比較して生化学検体との結合力が強く、かつ基板に多数のプローブが配列されているため、目的物以外との吸着やハイブリダイゼーションの可能性が高くノイズが増大して目的生化学検体の検出精度が低下すること、
等の問題があることを知見し、これらを解消するには、かかるプローブが多数配列されるバイオチップにおいて、根本的に検出精度を向上させ得る新たな基本構造を与えなければならないことに着目した。
【０００９】
そこで発明者らは、基板にプローブが多数配列されたバイオチップにおいて、検出精度を向上させ得る新たな基本構造、すなわち基板上のプローブが目的の生化学検体とのみハイブリダイズできる構成を目的に種々検討し、ハイブリダイズした生化学反応体のみを標識で修飾することで基本的に検出精度を高めることが可能であることに着目し、またあえて容易にはハイブリダイズできないようにし、目的の生化学検体とのみハイブリダイズするように構成して本来的な検出精度を高めておくことに着目し、検出精度を高めることが可能となるプローブ自体の構造やその構成について鋭意検討した。
【００１０】
その結果、発明者らは、ハイブリダイズしたプローブのみが他のハイブリダイズしていないプローブより外側へ伸びていると、その先端にのみ標識が修飾可能であること、またプローブの生化学検体と相補的に結合する主要部位が配列するプローブ内に潜り込んでいると容易にはハイブリダイズできないが、選択的にかつ確実に目的の生化学検体とのみハイブリダイズ可能であることに着目し、これらを実現し検出精度を高めるためにバイオチップに立体的な構造を与えることができる構成について検討したところ、基板表面に固定されない解放端側又はその標識による修飾可能にした部位が基板側に位置するように、あるいは生化学検体と相補的に結合する主要部位が基板上や表面近傍の基板側に位置するように、基板に配列するプローブにループ構造を採用することで、上述の選択的なハイブリダイズが実現でき基本的に検出精度を高めることが可能であることを知見した。
【００１１】
また、発明者らは、かかるループ構造を有するプローブを基板に配列したバイオチップの構成は、生化学検体の検出操作において、前述の如く先に標識で修飾した生化学検体を用いてハイブリダイゼーションするのではなく、従来とは逆に生化学検体とのハイブリダイゼーションを行った後、ハイブリダイズしたプローブ、すなわちループ構造を解消してハイブリダイズしているプローブにのみ、その先端などの所要の箇所を標識で修飾することが可能となり、ハイブリダイゼーション時並びに標識による修飾時と、各工程での精度が向上して目的検体の検出精度が著しく向上するとともに、基本的に検出精度の向上のために各工程で施術者の技量を要求しないため、生化学検体の検出操作が比較的容易になることを知見した。
【００１２】
また、発明者らは、この発明によるバイオチップの構成は、ハイブリダイズしたプローブや検体にのみ選択的に標識による修飾が可能であることから、標識には従来の蛍光標識、蛍光色素を初め、Ｓｉを含む金属粒子、磁性体粒子、セラミックス粒子、化学発色体など任意の粒子を採用できること、また最初に設けた標識を目標にさらに別の標識を修飾でき、多重標識を形成できること、従って用いた標識の種類に応じて種々の標識の検出方法、すなわちハイブリダイズした生化学反応体に設けられる標識の有無を電気的、磁気的、光学的な変化のうち少なくとも１つを検出・識別する方法が採用でき、また、検出する生化学検体の性状に応じて最適な標識や検出方法を採用できることを知見し、この発明を完成した。
【００１３】
さらに、発明者らは、このループ構造を与えたプローブを予め標識で修飾し、ハイブリダイゼーション操作前に前記の電気的、磁気的、光学的あるいはそれらを組み合せた計測を行うことにより、バイオチップの電極上に配列させているプローブの状態、すなわち各種操作などを行う前の各電極上のプローブの状態を定量的に把握しておくことが可能となり、ハイブリダイゼーション操作後、さらには２本鎖を形成したプローブ核酸又は生化学検体あるいはその両方を標識で修飾した後に、当該標識を目標に検知して２本鎖を形成した複合体の有無の評価をするに際し、予め各電極上のプローブの状態を定量的に把握できることから、対比や評価をより精度の高いものとすることができること、また、予めプローブを修飾する標識とハイブリダイゼーション操作後に修飾する標識を別異の種類とするか、同種であっても寸法や色などの形態を変えて標識の検出方法を換えたり複数手段を採用することで、プローブの状態（電極上のプローブ量）による検出結果の補正をより高精度で行うことも可能であることを知見し、この発明を完成した。
【００１４】
【００１５】
この発明は、基板又はその類似物表面に設けられた１又は２以上の電極上に配列されループ構造を形成したプローブ核酸かあるいは前記構成に加え予め標識で修飾したプローブ核酸を有するバイオチップを用い、該チップのプローブ核酸に生化学検体をハイブリダイゼーションする工程、ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後に２本鎖を形成したプローブ核酸又は生化学検体あるいはその両方を標識で修飾する工程、２本鎖を形成したプローブ核酸と生化学検体との複合体を該バイオチップの表面における電気的、磁気的、光学的な変化の少なくとも１つにより検出・識別する工程を有する生化学反応体の検出方法である。
【００１６】
【００１７】
また、この発明は、基板又はその類似物表面に設けられた１又は２以上の電極上に配列されループ構造を形成したプローブ核酸かあるいは前記構成に加え予め標識で修飾したプローブ核酸を有するバイオチップを用い、該チップのプローブ核酸を予め標識で修飾した生化学検体をハイブリダイゼーションする工程、ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後に２本鎖を形成したプローブ核酸又は生化学検体あるいはその両方を標識で修飾する工程、２本鎖を形成したプローブ核酸と生化学検体との複合体を該バイオチップの表面における電気的、磁気的、光学的な変化の少なくとも１つにより検出・識別する工程を有する生化学反応体の検出方法である。
【００１８】
また、この発明は、上述の生化学反応体の検出方法において、
・ 検出・識別する工程で、ハイブリダイゼーション操作前にバイオチップ表面の電気的、磁気的、光学的な変化の少なくとも１つを捉える測定を行い得られた測定結果を基準として、各工程後のバイオチップのそれら測定結果と比較する方法、
・ 検出・識別する工程で、ハイブリダイゼーション操作の前後あるいはさらに標識修飾操作の前後における該バイオチップの表面における電気的、磁気的、光学的な変化の少なくとも１つを捉える測定を行いこれらを比較する方法、
・ 検出・識別する工程で、ハイブリダイゼーション操作前に複数の電極を有するバイオチップ表面の電気的、磁気的、光学的な変化の少なくとも１つを捉える測定を行い各電極上のプローブ核酸の量比を予め求めて各工程後の測定値に対する補正基準として用いる方法、
・ プローブ核酸又は生化学検体を標識で修飾する方法が、予め修飾されていた第１の標識を目標として第２の標識で修飾する２段階あるいは３段階以上の多段修飾である方法、
・ プローブ核酸又は生化学検体あるいはその両方を標識で修飾する方法が、先に第１の標識で修飾してさらにそれを目標として第２の標識で修飾する２段階あるいは３段階以上の多段修飾である方法、
・ 標識が、金属微粒子（Ｓｉを含む）、磁性体粒子、セラミックス微粒子、蛍光標識、蛍光色素、色素、化学発色体のいずれかである方法、
・ バイオチップの表面における電気的な変化として検出・識別する方法が、バイオチップ又は電極における電流値又は電圧値あるいは抵抗値の変化、バイオチップ表面の静電容量変化のうち少なくとも１つを検出・識別する方法、
・ バイオチップの表面における電気的、磁気的な変化として検出・識別する方法が、バイオチップ又は電極における電流値又は電圧値あるいは抵抗値の変化、バイオチップ表面の静電容量変化のうち少なくとも１つを検出・識別するとともに、２本鎖を形成した複合体からの信号、例えば磁性を磁気的に検知・識別する方法、
・ バイオチップの表面における電気的、光学的な変化として検出・識別する方法が、バイオチップ又は電極における電流値又は電圧値あるいは抵抗値の変化、バイオチップ表面の静電容量変化のうち少なくとも１つを検出・識別するとともに、２本鎖を形成した複合体からの信号、例えば光等を光学的に検知・識別する方法、
・ バイオチップの表面における電気的、磁気的、光学的な変化として検出・識別する方法が、バイオチップ又は電極における電流値又は電圧値あるいは抵抗値の変化、バイオチップ表面の静電容量変化のうち少なくとも１つを検出・識別するとともに、２本鎖を形成した複合体自体又は複合体のプローブ核酸又は生化学検体あるいはその両方に修飾された標識、あるいは複合体と前記標識からの信号を磁気的に検知・識別し、かつ２本鎖を形成した複合体からの信号を光学的に検知・識別する方法、を併せて提案する。
【００１９】
さらに、この発明は、表面に少なくとも１つの電極が形成された基板又はその類似物からなり、前記電極面上に一方端を固定して配列されたプローブ核酸を有し、かつ各プローブ核酸がループ構造を有し、配列したプローブ核酸は、
１）生化学検体と相補的に結合する主要部位が該基板等側に位置するようループ構造を有する、
２）その電極表面に固定されない解放端側又はその標識を修飾可能にした部位が該基板等側に位置するようループ構造を有する、
３）第２の標識で修飾可能な第１の標識で修飾された部位が該基板等側に位置するようループ構造を有する、又は、
４）予め修飾された標識が該基板等側に位置するようループ構造を有する、
バイオチップを併せて提案する。
【００２０】
また、上記構成のバイオチップにおいて、
標識が、金属微粒子（Ｓｉを含む）、磁性体粒子、セラミックス微粒子、蛍光標識、蛍光色素、色素、化学発色体のいずれかである構成、
基板又はその類似物材料がガラス又は半導体シリコンである構成、
基板又はその類似物を別途用意する電気的回路基板に組み込み可能とした構成、
を併せて提案する。
【００２１】
【発明の実施の形態】
この発明において、生化学検体はＤＮＡとＲＮＡ及び核酸類似構造物をいい、核酸類似構造物は、文字どおりの核酸に類似した構造物であり、例えば核酸のリボースあるいはリン酸ジエステル部位を修飾した分子やリボース−リン酸骨格をアミド結合に置き換えたペプチド核酸（ＰＮＡ）等がある。
【００２２】
この発明において、プローブ核酸は、ＤＮＡとＲＮＡ及び核酸類似構造物をいい、例えば、核酸類似構造物としては、上記と同様である。
【００２３】
この発明において、プローブＤＮＡやＲＮＡにループ構造を与えるには、その製造過程中又は製造後にループ構造を形成していて基板に配列されるか、基板に配列する際にループ構造を形成するか、基板に配列後にループ構造を形成するように構成するか、いずれの構成、形成方法も採用できる。
【００２４】
例えば、プローブＤＮＡの所要の二箇所に相補的な二重鎖を形成可能な対をなす塩基の配列、一例として図ではＡとＴの箇所を予め形成しておき、図１Ａに示すごとく、基板１にプローブＤＮＡ１０を配列した際の固定端１１側近くにある塩基配列と解放端１２側近くにある塩基配列とで結合部１３が形成されてループ１４を形成することで、プローブＤＮＡ１０の解放端１２が基板１上あるいは基板１上面近傍に位置するように構成することができる。
【００２５】
また、図１Ｂに示す例は、基板１に配列したプローブＤＮＡ１０が、図１Ａと同様にプローブＤＮＡ１０の固定端１１側近くにある塩基の配列と解放端側近くにある塩基の配列とで結合部１３が形成されてループ１４を形成することで、標識３による修飾を可能にした部位、図では解放先端に設けたビオチン基２が基板１上あるいは基板１上面近傍に位置するように構成してある。
【００２６】
プローブ核酸にループ構造を形成するための前記した対をなす塩基の配列を設ける箇所を適宜設定することで、結合部１３箇所が先端側、中央あるいは固定端側と種々形態のループ構造を形成し得る。例えば図２に示す例は、プローブＲＮＡ２０の解放端２２側の塩基と対をなす塩基配列をプローブＲＮＡ２０の中央部側に配置してある。
【００２７】
図２Ａに示す例は、対をなす塩基の配列をプローブＲＮＡ２０の中央部側に配置して、生化学検体と相補的に結合する主要部位２５が図１のプローブＤＮＡ１０構成例と比較してより基板１側へ向くようにループ２４を形成してある。
【００２８】
また、図２Ｂに示す例は、図２Ａと同様構成で標識による修飾を可能にした解放端２２に設けたビオチン基２が基板１上方に位置しており、図１Ｂに示す例と同様に標識３による修飾を可能にしたビオチン基２部分が、基板１との距離にかかわらず、プローブＲＮＡ２０の解放端２２側と対をなす塩基の配列部分、すなわち中央の結合部２３とループ２４部分にそして固定端２１と中央の結合部２３との間の脚２６部とで囲まれる形態であり、基板１とループ２４の隙間ｘが標識３の寸法と同程度あるいはより狭いと、解放端２２及びビオチン基２は基板１上でどのような向きであっても容易には標識３で修飾され難くなる。
【００２９】
この発明において、プローブ核酸には前述の如く、生化学検体と相補的に結合する主要部位がループ内に配列されるように、ループを形成する結合部、例えばプローブ核酸の任意の二箇所に対をなす塩基の配列等の結合可能な分子等の結合部を適宜設けることが可能であり、前記ループを形成する結合部の位置やループの形状、あるいはプローブ解放端の向き等はいずれの構成も採用できることは上記の説明から明らかである。
【００３０】
例えば図３に示すごとく、ビオチン基２を設けた解放端２２がより基板１に近接するように結合部２３より解放端２２の間がより長い構成、図４に示すごとく、図３と同様構成で結合部２３より解放端２２の間がさらに長くかつビオチン基２が結合部２３側を向いている構成、さらに図５に示すごとく、図２Ｂに示す例と同様構成で、ループ２４部分がより基板１に近接するよう長くした構成等が採用できる。
【００３１】
さらに、図２の構成は、上述したように図１に比較して結合部２３をプローブＲＮＡ２０の中央に位置させるために脚２６を設けているが、ここは特に結合部２３の対をなす塩基の配列やループ２４部分の生化学検体と相補的に結合する主要部位２５とは無縁であるから、必ずしも塩基等の配列である必要はなく、公知の核酸類似構造物としたり、前記の基板１とループ構造の隙間ｘの設定のために他の分子と置換したり、種々構成を採用できる。さらに、脚２６の先に結合部２３を形成してループ２４部を形成しているが、例えばこの脚２６をＹ字型に構成してそれぞれ結合部２３とループ２４部を設けて、一つの固定端２１、脚２６部から２つのループを有するプローブＲＮＡ２０を形成することも可能である。
【００３２】
また、この発明において、プローブ核酸には、複数の第２の標識による修飾を可能にした第１の標識で修飾された部位が基板上又はその近傍の基板側に位置するようループ構造を有する構成が採用でき、基板とループの隙間は第２の標識の外径と同程度あるいはより狭く、第２の標識がここを通過して第１の標識に容易に近接することができない程度の隙間となるように、前記の結合部を設ける箇所を適宜設定するとよい。
【００３３】
プローブ核酸において、目的の生化学検体と所要のハイブリダイゼーションが可能であり、かつ上述のごとく種々構成のループ構造を形成することが可能であれば、短鎖、長鎖を問わずいずれの塩基配列の構成であっても採用できる。また、この発明において、塩基数は特に限定しないが、比較的長鎖の構成を有するものが望ましく、例えば本来的に標識が修飾し難い塩基数が５０あるいは６０以上のものが検出精度の向上や検出時のノイズの低減に望ましく、さらに塩基数が１００を超えたり、１０００程度の場合であってもこの発明を適用できる。
【００３４】
この発明において、ループを形成する結合部として、プローブ核酸の任意の二箇所に対をなす塩基の配列を設ける例を説明したが、塩基の配列以外の例えば分子間結合が可能なもの、標識による修飾に用いた手段など、プローブ核酸内に配置・配列可能であり、かつペアリングしてループを形成することが可能であれば、いずれの分子、構造物であっても利用できる。
【００３５】
また、かかる結合部における結合力を、採用する塩基、分子種やその配置や長さにより適宜選定することも可能で、ハイブリダイゼーションや標識による修飾時における温度条件や他の分子構造物（検体など）との結合力等を考慮して、当該結合部における結合力を選定できる。
【００３６】
従って、この発明によるプローブ核酸は、所要の電極上に配列されてかつ前述のループ構造を有した構成であり、所定のハイブリダイゼーションの操作において、目的の生化学検体とのみ２本鎖を形成することが可能となる。また、２本鎖を形成することにより、このループが解消されるため、２本鎖を形成したプローブのみを標識で修飾することが可能となる。
【００３７】
この発明において、バイオチップを形成するための基板又はその類似物には、純然たる板の基板の他、エッチングなどで溝や凹部などを形成して所要の凹部又は凸部を使用する基板構成や、基板などにピン等の突起物を形成した構成、棒や立方体などの表面等を利用する形態、構成など、それらの表面の所要箇所に電極を形成でき、プローブの配列やハイブリダイゼーションが可能であれば、採用する標識などの検出・識別方法等に応じて、種々の形態を採用することが可能である。
【００３８】
この発明において、基板としては、ガラス基板、樹脂基板、シリコン基板等の硬質材料の他、メンブラン（例えばニトロセルロースなど）等の材料も採用可能で、また積層基板などプローブ核酸の配列が実施可能な基板であればいずれの材質、構成の基板も採用できる。また、基板に電極など種々の薄膜を成膜する場合は、その表面粗度はできるだけ平坦なものが好ましい。
【００３９】
入手や取扱いの良好なガラス基板としては、公知のホウケイ酸ガラス等が利用でき、厚みは厚いほうが取り扱いやすいが、バイオチップとしては目的に応じていずれの厚みのものも利用できる。
【００４０】
かかる電極膜を成膜する場合、基板又はその類似物の洗浄、乾燥方法としては、半導体ウエーハや各種デバイスを製造する際に採用される、各種溶剤による洗浄、純水中の超音波洗浄、各種酸溶液による洗浄、純水洗浄、ブロー乾燥、スピン乾燥など公知の基板等の洗浄、乾燥方法を適宜選択、組合せて採用できる。
【００４１】
電極材料は、基板などの所要表面に形成でき、かつ電極膜上にプローブ核酸の配列が可能であれば、公知の電極材料のいずれも採用可能であり、また、電極でありかつプローブ核酸の配列を容易にすることが可能な金、白金、銀などの貴金属電極膜を設けることも好ましい。
【００４２】
成膜方法としては、特に限定されないが、前述した所要形態の基板などの製作に採用されるエッチング、成膜などの半導体デバイスの製造プロセスで採用される方法を採用することが好ましく、例えば所要パターンで電極とそのリード部を形成し、また膜厚みを一定に制御するため、スパッタリング、イオンプレーティング、ＣＶＤ等の公知の気相成長による方法が好ましい。
【００４３】
なお、採用した基板等の材質に応じて、電極膜との密着性を向上させるために下地層を適宜成膜することができる。例えば、ガラス基板、石英基板にＣｒ層を設けたり、シラン化合物によって表面改質するなどの手段を採用できる。
【００４４】
この発明において、基板等の所要電極表面にプローブ核酸を配列する工程は、特に限定されるものでなく、公知のいずれの方法も採用でき、例えば電極膜上を酸や純水で洗浄後、プローブ核酸と緩衝液を用いて飽和水蒸気雰囲気中で配列させることができる。
【００４５】
緩衝液としては、例えばＫＨ2ＰＯ4とＫ2ＨＰＯ4を配合して所要ｐＨにした溶液が採用できる。他には、ＰＢＳや、ＮａＣｌとＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ＮａＣｌとＴｒｉｓ−ＨＣｌとＥＤＴＡを用いるなど、所要ｐＨにするため公知の薬液を選定配合した溶液等も採用できる。
【００４６】
以下にこの発明による生化学反応体の検出方法を詳述する。まず、基本工程を説明すると、
・ 基板等の表面にプローブ核酸を配列する工程、
・ ループ構造を形成しているプローブ核酸に生化学検体をハイブリダイゼーションする工程、
・ ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後に２本鎖を形成したプローブ核酸又は生化学検体あるいはその両方を標識で修飾する工程、
・ 前記標識を検出・識別する工程、を有する。
【００４７】
基板表面にプローブ核酸を配列する工程は、前述した基板の構成、プローブ核酸の構成、その配列方法において、明らかにしたとおりである。また、当該プローブにループ構造を与えるには、その製造過程中又は製造後にループ構造を形成していて基板に配列されるか、基板に配列する際にループ構造を形成するか、基板に配列後にループ構造を形成するように構成するか、いずれの構成、形成方法も採用できる。
【００４８】
ループ構造を形成しているプローブ核酸に生化学検体をハイブリダイゼーションする工程は、特に限定されるものでなく、公知のいずれの方法も採用でき、例えば基板の洗浄後に生化学検体と緩衝溶液を用いてハイブリダイゼーションさせることができる。前記の緩衝溶液としては、例えばＮａＣｌとＴｒｉｓ−ＨＣｌとＥＤＴＡを配合して所要ｐＨに保持した溶液が採用できる。
【００４９】
ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後に２本鎖を形成したプローブ核酸又は生化学検体あるいはその両方を標識で修飾する工程は、文字どおり２本鎖を形成したところのプローブ核酸か生化学検体、あるいはそれぞれに所要の標識を修飾するもので、２本鎖を形成して複合体となっている両者の結合部に選択的に入り込むようなインターカレーターを特に標識とする必要はない。しかし、インターカレーターを採用したり、前記標識と共に用いたりすることも可能である。
【００５０】
この発明において、前記標識には、Ｓｉを含む金属粒子、磁性体粒子、セラミックス粒子、蛍光標識、蛍光色素、色素、化学発色体、あるいは生化学検体の検出に利用されている染色体、糖鎖体、タンパク質、核酸、酵素、細胞など、プローブ核酸又は生化学検体に修飾できるもの、さらに前記の各種標識で再修飾できればいずれのものも利用できる。
【００５１】
また、かかる標識は、電気的特性として必ずしも導電性である必要はなく、この発明のバイオチップとしては、当該標識の有無で電流、電圧、抵抗、静電容量等の電気的な変化を生じることで検出可能であり、さらには電気的な変化とともに当該標識の有無で磁気的な変化を生じ得る標識を用いたり、あるいは当該標識の有無で電気的変化と光学的変化を共に生じ得る標識を用いるなど、前記標識にはいずれの構成も採用可能である。
【００５２】
金属粒子標識は、Ｓｉを含み、Ａｕ、Ａｌ、Ｔｉ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｍｏなどの各種金属の微粒子を用いるもので、特に微粒子の形状や粒径寸法や均一性は任意に適宜選択できる。特に必須条件ではないが、プローブや検体の所要部位を修飾可能とすること、微粒子表面に成膜可能なことなどから、５μｍ以下、さらに１μｍ以下が好ましく、数ｎｍ〜数百ｎｍの範囲で所定粒径が均一でかつ工業安定的に得られる微粒子が好ましい。
【００５３】
磁性体粒子標識には、磁性粉、酸化鉄顔料、磁性流体等の用途で一般的な酸化鉄系微粒子の他、磁性トナーや磁性インクとして利用されている炭素系微粒子、前記金属粒子や後述のセラミックス粒子のなかにも種々の磁性材がありこれらも利用できる。また、磁気記録媒体用磁性粉には、酸化鉄系等の酸化物、合金などのメタル系等種々組成や複合体粒子が提案されており、これらは数ｎｍ〜数百ｎｍの範囲で所定粒径や形状が均一でかつ工業安定的に得られることから好ましい。さらに、磁性インキ・磁性トナーとして利用される着色磁性粉体は、核となる磁性粉体の材質、大きさや形状、また表面膜の材料、厚さ、成膜数などの組み合わせによって、種々の磁性や色調を呈するため、磁気的検出と光学的検出を同時に実施できる。
【００５４】
セラミックス粒子標識には、球形や固有の結晶体など、公知のいずれの形態も採用できるが、微粒子表面に成膜可能なことなどから、５μｍ以下、さらに１μｍ以下が好ましく、検出方法に応じて数ｎｍ〜数百ｎｍの範囲で所定粒径が均一でかつ工業安定的に得られるＳｉＯ2、ＴｉＯ2、ＺｒＯ2、Ａｌ2Ｏ3、ＭｇＯなどのセラミックス微粒子が好ましい。
【００５５】
蛍光標識には、公知のいずれの形態も採用でき、市販されている蛍光色素によりタグ化された染色体、糖鎖体、タンパク質、核酸、酵素、細胞、微粒子等を標識自体の性質を利用したり後述のごとく抗原−抗体反応を利用して修飾することが可能である。また、この発明では蛍光自体は必須でないため、蛍光標識等に利用されている染色体、糖鎖体、タンパク質、核酸、酵素、細胞をそのまま利用することも可能である。また、蛍光でない色素も標識として利用できる。
【００５６】
この発明において化学発色体は、発色反応に関与するものを標識として修飾するもので、酵素法等の化学的発色をさせる方法に用いる物質をいい、例えばビオチン誘導体で修飾した箇所を用意することで容易に実施できる。
【００５７】
この発明において、上述の各種標識でプローブ核酸を修飾する方法としては、例えば金属微粒子等の粒子自体の性質を利用したり、公知の蛍光標識で修飾する方法などのように抗原−抗体反応を利用して修飾するなど、公知のいずれの方法も採用できる。また、中性のコロイダル液のごとく、微粒子を均一分散させた溶液の形態を利用することで修飾が容易になる。
【００５８】
また、プローブ核酸の末端をビオチンで修飾しておき、ストレプトアビジンをコートした金属やセラミックス等の微粒子をビオチン−アビジンの高い結合能力を利用して標識となすことができる。さらに、プローブ核酸の末端にＩｇＧや抗プロテイン物質を付加することで、タンパクをコートした前記微粒子等で抗原−抗体反応を利用して修飾することが可能である。
【００５９】
さらに、生化学検体を前記各種の標識で修飾することも可能であり、修飾方法は、当該検体の所要箇所を適宜標識化できればよく、上述の公知のいずれの方法も採用でき、特に末端を修飾するには上述の方法などいずれの方法も採用できる。
【００６０】
この発明において、ハイブリダイゼーション後に２本鎖を形成したプローブ核酸と生化学検体との複合体を、バイオチップの基板等の表面における電気的変化として検出・識別する方法は、例えば、該基板等表面に流した電流値又は電圧値あるいは抵抗値の変化、該基板等表面の静電容量変化のうち少なくとも１つを検出し、ハイブリダイゼーション前後の当該変化で前記複合体を識別することができる。
【００６１】
具体的には、バイオチップが複数の検出用スポット（ステージ）に区分けされ、各スポットに所要数の電極を有した構成で、各スポットにはそれぞれ異なるプローブ核酸がループを形成して各電極上に多数配列されている場合、まず、ハイブリダイゼーション前のドライ時又は所要バッファー液に浸漬するなどのウエット時に、基板等又は各電極に交流、直流あるいはパルス性の所要の電流を流し（電圧を印加し）、その際の所要電極間の電流Ｉ値又は電圧Ｖ値あるいは抵抗Ｒ値、静電容量Ｃ値を測定しておく。
【００６２】
次に、所要の生化学検体とのハイブリダイゼーションを行い、その後直ちに、あるいは洗浄後所要のバッファー液中で、または洗浄工程、乾燥後に再度所要電流を流し（電圧を印加し）、前記と同様の測定を行いその間の変化を観察、解析することで、各プローブ用電極上にあるハイブリダイゼーションにより２本鎖を形成したプローブ核酸と生化学検体との複合体の生成の有無を検知できる。
【００６３】
また、各電極上にあるプローブ核酸と生化学検体との複合体生成の有無を検出するため、バイオチップの基板等表面に起こる電気的な変化として捉える対象として、電流Ｉ、電圧Ｖ、抵抗Ｒ、静電容量Ｃのいずれかあるいはそれらを組み合せた測定用電気回路や電気素子回路を当該バイオチップ上に形成しておき、前記プローブ用電極と接続する構成なども採用可能である。
【００６４】
また、プローブ用電極上でのプローブ核酸と生化学検体との複合体生成の有無を検知するのに、補足対象の電流Ｉ、電圧Ｖ、抵抗Ｒ、静電容量Ｃ等を検知できる他のプローブ電極やセンサーを、バイオチップ表面に近接させて当該表面をスキャニングし、ハイブリダイゼーション前後の所要電極間に印加している電流Ｉ値又は電圧Ｖ値あるいは抵抗Ｒ値、静電容量Ｃ値の少なくとも１つの変化を捉えることで、ハイブリダイゼーションに伴う複合体の生成の有無を検知できる。
【００６５】
この発明において、ハイブリダイゼーション後に２本鎖を形成したプローブ核酸と生化学検体との複合体で、プローブ核酸又は生化学検体あるいはその両方を予めあるいはハイブリダイゼーション後に標識で修飾された該複合体を、バイオチップの基板等の表面における電気的、磁気的、光学的あるいは電気磁気的、電気光学的、電気磁気光学的な変化として検出・識別する方法は、前述のごとく複合体の形成に伴う電気的な変化を検知することを含むことはもちろんであるが、主に選定使用した標識の物理的な性状に起因して発生する所要電極間の電流Ｉ値又は電圧Ｖ値あるいは抵抗Ｒ値、静電容量Ｃ値の少なくとも１つの変化として当該複合体の有無を捉えることができる。
【００６６】
ここで電気磁気的変化とは、上記のプローブ核酸又は生化学検体あるいはその両方、あるいはさらに修飾した標識による電気的変化を捉えるとともに、複合体自体並びにそのプローブ核酸又は生化学検体あるいは両方に設けられた標識が有する磁性などを磁気的な検知手段で検知することを意味する。従って、該標識が有する磁性などを磁気的な検知手段で検知することはもちろんのこと、所要の電極間に電圧を印加したりあるいはバイオチップに磁場を印加して、前記複合体又は標識あるいは両者が有するに至った電気的特性又は磁気的特性あるいはその両方の変化を磁気的な検出手段で検知することも意味する。
【００６７】
例えば、標識に磁気記録媒体用の磁性微粒子を用いて磁気ヘッドを検出用プローブとして所要の磁場を印加した後の磁気的変化を検知することはもちろん、標識に金属粒子やセラミックス粒子などを用いて、電圧又は磁場あるいはその両方を印加後に所要電極間の電流Ｉ値又は電圧Ｖ値あるいは抵抗Ｒ値、静電容量Ｃ値の変化としてこれを検知することも意味し、電気的な変化と磁気的な変化を個別にあるいは同時に検出することも可能である。
【００６８】
また、電気光学的変化とは、上記のプローブ核酸又は生化学検体あるいはその両方、あるいはさらに修飾した標識による電気的変化を捉えるとともに、複合体自体並びにそのプローブ核酸又は生化学検体あるいはその両方に設けられた標識からの信号を光学的な検知手段で検知することを意味する。従って、該標識が有する光学的特性を光学的な検知手段で検知することはもちろんのこと、所要の電極間に電圧を印加あるいはバイオチップに磁場を印加して、前記複合体又は標識あるいは両者が有するに至った電気的特性あるいは光学的特性の変化を同様に光学的な検出手段で検知することも意味する。
【００６９】
例えば、標識に金属粒子やセラミックス微粒子を用いて、ＣＣＤを検出用プローブとして所要の電圧または磁場を印加あるいは特定波長の光を照射した後、あるいはこれら全ての操作後に標識から発せられる信号の変化を検知することはもちろん、電圧又は磁場を印加あるいはレーザー光の照射、さらにはこれらの操作全てを施した後に所要電極間の電流Ｉ値又は電圧Ｖ値あるいは抵抗Ｒ値、静電容量Ｃ値の変化としてこれを検知することも意味し、電気的な変化と光学的な変化を個別にあるいは同時に検出することも可能である。
【００７０】
さらに、上述の電気磁気的変化と電気光学的変化を組み合せた、電気磁気的光学的変化として捉えることが可能であることは明らかであり、例えば磁性を有しかつ特定波長で発光する磁性微粒子が開発されており、これを用いると上述の工程等を適宜選定して組み合せることで、複合体及び複合体のプローブ核酸又は生化学検体あるいはその両方に設けられた標識からの信号を電気的、磁気的及び光学的な変化として容易に捉えることができる。
【００７１】
また、バイオチップの基板では前述の電気的な検出を行い、同時に基板表面に近接して光学的に各種標識を検出・識別する手段を併用することも可能である。例えば光散乱法、ＳＰＲ分光法、化学発色法、蛍光検知法、顕微鏡法、イメージング処理法、目視法などを採用することができる。
【００７２】
光散乱法は、金属粒子やセラミックス微粒子標識において、微粒子が反射する光で特定波長光を発したり、レーザー光による散乱光の検知を可能にするもので、一般的な構成例を説明すると、例えばこの発明による金薄膜を設けた検出チップ基板をプリズム上に載置し、Ｈｅ−Ｎｅレーザー光をプリズムの一方側より基板裏面に入射してプリズムの他方側へこれを全反射させるように条件設定することで、検出チップ基板を上面から観察するＣＣＤカメラ側に散乱光を検出することができる。
【００７３】
また、セラミックス微粒子自体が有する可視光下での特定色を検出したり、特定粒径のセラミックス微粒子に対して特定波長の光を照射して特定色を発光させてこれを検出するなど、前記セラミックス微粒子の種類やその粒径や性状等、条件に応じて公知の検出方法や装置を適宜選定することも可能である。
【００７４】
ＳＰＲ分光法は、貴金属薄膜表面における屈折率変化を検出するもので、例えばガラス基板上に金電極を形成し、金薄膜電極上にプローブ核酸を固定化し、プローブ核酸が検体中の目的ＲＮＡなどの核酸類とのハイブリダイゼーションにより二本鎖を形成すると、金薄膜電極上の屈折率が変化するためにＳＰＲ角（反射率が最小となる入射角度）がシフトするが、ＳＰＲ角のシフトはハイブリダイゼ一ションした目的検体の量と対応するために、ＳＰＲ測定によって目的検体の定量的な解析が可能となる。
【００７５】
またＳＰＲ分光法において、標識による修飾によって前記信号の増幅が可能である。具体的に説明すると、基板の貴金属薄膜表面にプローブ核酸を配列してバイオチップを作製し、ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後のプローブを貴金属コロイドや金属粒子等の標識で修飾すると、末端を標識への接着部位で修飾したプローブは、ループ（ヘアピン）構造を取る場合は標識が全く接着できないことは前述したとおりであり、このループ構造を取るプローブはその立体的構造により選択的に目的検体とハイブリダイズすることで基本的な検出精度が向上する。
【００７６】
また、目的検体とのハイブリダイゼーション反応によってプローブ核酸のループが解消された状態になり、ハイブリダイズされたプローブ核酸に選択的に標識による修飾が行われることで、前述のＳＰＲ角のシフトを増幅でき、高精度の検出が可能になる。さらに、ハイブリダイゼーション後に２本鎖を形成した目的検体をＳＰＲ分光法にて検出する工程は、液中あるいは大気中のいずれも可能である。ＳＰＲ法の測定システムとしては、公知のいずれの構成も採用可能である。
【００７７】
化学発色法は、免疫組織染色方法が応用できる。これは予め４つの結合部位をもつアビジンと複数箇所でビオチン化されたペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を適当な割合で混合し、多数のＨＲＰを含み一部にアビジンのビオチン結合部位を残す複合体（ＡＢＣ）を形成させて、この複合体（ＡＢＣ）と予め組織中の標的抗原と結合したビオチン化抗体とを反応させて標的抗原を検出するもので、例えばプローブにビオチンで修飾した箇所を用意することで容易に適用できる。また、ＡＰＲ法など公知の免疫組織染色方法も応用できる。
【００７８】
蛍光検知法は、種々の蛍光色素自体をプローブ核酸又は標識の所要部位に着設したり、又は蛍光色素によりタグ化された染色体、糖鎖体、タンパク質、核酸、酵素、細胞、微粒子等を標識自体の性質を利用したり前述のごとく抗原−抗体反応を利用してプローブ核酸、生化学検体を修飾したものを検出するが、顕微鏡とＣＣＤカメラを組み合せた蛍光イメージング検出システム、共焦点顕微鏡システム等、また種々の光学装置やイメージング装置を併用した検出方法が提案されており、前記蛍光標識の種類やその蛍光自体の性状等、条件に応じて公知の検出方法や装置を適宜選定するとよい。また、蛍光でない色素も同様に検知できる。
【００７９】
顕微鏡観察法は、公知の蛍光や散乱光などの検出システムとして、顕微鏡とＣＣＤカメラを組み合せたイメージング検出システム、共焦点顕微鏡システム、金属顕微鏡等、また種々の光学装置やイメージング装置を併用した検出方法が提案されているが、これらをそのまま利用することが可能である。
【００８０】
イメージング処理法は、カメラ又は顕微鏡にてスキャニングした画像をディスプレイで目視で確認できるように拡大、鮮鋭化、着色化等、各種の公知の画像処理を施したり、あるいはコントラストや特定形状、寸法の粒子をソフトウェアー的に検出するために公知の画像処理を施すなどの方法である。
【００８１】
目視法は、この発明のバイオチップがハイブリダイゼーションにより２本鎖を形成したプローブ核酸と目的検体のみを粒子標識で修飾できることから可能になるものであり、詳述した各種の標識粒子の集合体を目視にて観察し、目的検体の有無を検出するものである。
【００８２】
この発明において、標識は上述のごとく独自の色や形を有しており、これらは集合して目視可能になるもので、検出に際しての第１の標識と第２の標識がそれぞれプローブ又は検体に設けられる場合はこれらを目視することになる。また、第１の標識をターゲットにして第２の標識で修飾する場合は、第１の標識と第２の標識の両方を目視することになるが、第１の標識が目視できないような場合は第２の標識のみを目視することになる。
【００８３】
また、上述の第１の標識で修飾してさらにそれを目標として第２の標識で修飾する２段階修飾、あるいは先に修飾した標識にさらに修飾を繰り返す多段修飾を行って、目視可能な標識粒子の集合体となすことが可能である。
【００８４】
この発明において、バイオチップ上のループ構造を形成して配列されているプローブ核酸を予め標識で修飾しておくことで、ハイブリダイゼーション操作などを行う前の各電極上のプローブの状態を定量的に把握することを可能とするが、このプローブを修飾する標識は、特に限定されることなく前述のいずれの標識でもよい。また、プローブ核酸が有しているループ構造のいずれの位置、例えば図示のループ部や脚部等の部位に設けられてもよく、さらにプローブ核酸の電極への配列と同時あるいは配列後に修飾するなど、バイオチップの作製工程のいずれの工程において修飾されてもよく、要するにハイブリダイゼーション操作前の状態にある当該バイオチップの各電極上に配列したプローブの状態を定量的に把握できればよい。
【００８５】
また、この発明においてより検出精度や定量性を向上させるために、例えば、バイオチップのプローブ核酸に予め修飾する標識とハイブリダイゼーション操作後の生化学検体に修飾する標識を、磁気的に検出可能な標識と光学的に検出可能な標識とするなど、別異の種類とすることが可能であり、これによりバイオチップの初期検知の際には磁気センサーを用いてプローブ核酸の量を把握し、ハイブリダイゼーション操作後は散乱光強度センサーを用いて生化学反応体を検出することができる。さらに、前記２種の標識にセラミックス粒子標識を用いた場合、例えば粒子外径を変えることで同じ散乱光強度を見るにも照射する光を複数種とすることで解析分解能を高めたり、プローブ核酸を修飾した標識又は生化学検体を修飾した標識などの目的標識のみを個別に検知することなどが可能となる。
【００８６】
さらに、予め標識で修飾したこの発明によるバイオチップは、上述の如く当該チップに配置した各電極上に固定化されたプローブ核酸の量比を前もって正確に把握することが可能で、各種の操作を行った後に行う前述の電気的、磁気的、光学的な各種手段で得られた各電極上の生化学検体からの測定信号に基づく対比や解析等の測定結果に対して、既知の各電極上のプローブ核酸の量比に応じて補正することで、生化学反応体の定量検出を極めて高精度に実施可能とする。
【００８７】
また、プローブに修飾する標識がハイブリダイゼーション操作後に修飾する標識等と明確に区別できるように標識の構成や寸法あるいは種類を適宜選定しておくことで、各電極上に配列したプローブの状態を定量的に把握するために、前述のようにハイブリダイゼーション操作前に所要の測定を実施することなく、ハイブリダイゼーション操作やその後に行う標識による修飾を完了した後、例えば電気的、磁気的、光学的な変化の１つ以上を測定することで各電極上のプローブを定量的に把握することが可能である。従って、例えばプローブ核酸のループ部や脚部等の部位を蛍光色素や微小な磁性体粒子で修飾して、２本鎖を形成した生化学反応体を比較的粒径の大きなセラミックス粒子で修飾するなどの場合、各種操作の完了後の一回の測定工程のみで各電極上のプローブの量比とともに、２本鎖を形成した生化学反応体の量比などの目的の検出、識別が可能となり、操作上の利便性が向上する。
【００８８】
この発明のバイオチップにおいて、各電極上のプローブ核酸の量比を求めるためにプローブ核酸を予め標識で修飾した例を以上に詳述したが、標識で修飾しない場合でも前述した電気的な変化を求める手段を用いてかかるプローブ核酸の量比を求めることが可能であることは言うまでもないこととである。プローブ核酸を予め標識で修飾しない場合、ハイブリダイゼーション操作前にかかる量比を電気的な変化を基に求めることも可能であり、またハイブリダイゼーションや修飾などの各種操作後にまとめて、電気的、磁気的、光学的な変化として測定してプローブ核酸の量比を求めることも可能である。
【００８９】
この発明において、バイオチップの形態は種々の構成を採用できることは前述したとおりであるが、以下に一構成例を説明する。ここではバイオチップに矩形のシリコン基板及びガラス基板を用い、これを図示しないキャリングケースに収納してハンドリングするが、ケースとしては通常の蓋つきの容器としてバイオチップを出し入れする構成と、例えば市販のＤＶＤ−ＲＡＭなどのキャリングケースの如く、検出のためのスキャニング装置に当該キャリングケースを挿入すると外装ケースから内蔵されたバイオチップのみを該装置内に露出させる構成を採用した。すなわち、ハンドリングを人手で行う場合、また機械による半自動化及び全自動化を行う場合を想定している。
【００９０】
図６Ａに示すバイオチップ３０は、キャリングケースより取り出して半自動化のための搬送アーム３２に保持させるが、ここではバイオチップ３０のリード端子３１ａ，３１ｂを搬送アーム３２のコ字型の保持部３３内の接続端子内に挿入させて通電可能にして保持する構成を採用している。図６Ｂに示す搬送アーム３２のコ字型の保持部３３の溝に保持されたバイオチップ３０は、このドライ状態で該アーム３２を通じて所要の電圧、電流を印加して該チップの各電極上に所要のプローブ核酸が配列された状態における、電流や抵抗値などの電気的な計測を行うことができる。
【００９１】
なお、リード端子３１ａ，３１ｂは詳細に図示しないが、ここでは基板表面に所要パターンのリード用膜を成膜してあり、リード端子３１ａは当該端子とは反対側のバイオチップ３０の半分の領域αにあるプローブを配列した複数の電極からリードしてあり、リード端子３１ｂは残り半分の領域βにあるプローブを配列した複数の電極からリードしてある。ここでバイオチップ３０の表面を領域α、領域βに分割するのは、ハイブリダイゼーション前後における所要の計測を確実に対比できるようにするためである。
【００９２】
すなわち、両方の領域に全く同じパターンで電極並びに所要の各種プローブ核酸が適宜配列されており、領域αは同部のみをバッファー液に浸漬して所要の生化学検体とのハイブリダイゼーションを実施し、あるいはさらに所要の標識による修飾を実施するが、領域βはハイブリダイゼーション、標識による修飾を実施せずにおき、前記ハイブリダイゼーションの完了後の領域αに洗浄、乾燥を施し、両方の領域がドライ状態で該アーム３２を通じて所要の電圧、電流を印加することで、ハイブリダイゼーション前の領域βとハイブリダイゼーション後の領域αの各状態における、電流や抵抗値などの電気的な計測を行うことができる。
【００９３】
また、図６Ｂに示すごとく、搬送アーム３２に保持したままスキャニング装置４０に挿入するが、装置内にはバイオチップ３０表面のプローブ核酸を載せた電極に対して、例えば上側から近接できる電極プローブ、ＣＣＤプローブ、磁気ヘッドなどの電気的、光学的、磁気的なプローブのいずれかを配置するか、あるいはこれらを組み合せて配置してあり、上記のごとく搬送アーム３２側からの通電による計測と併せて、ハイブリダイズ前後の電気的、光学的、磁気的な計測を実施することができる。こうしてハイブリダイズ前後の計測結果を比較することで、ハイブリダイゼーション後に２本鎖を形成したプローブ−生化学検体のとの複合体、すなわち生化学反応体の有無を容易に検出することができる。
【００９４】
上述の例では基板の一方主面を２分割するが、多数に分割したり、また両面を同様構成とするほか、スリットを設けて領域を分割したり、あるいは領域を分けることなく複数の短冊状板や棒材を用いることも可能であり、さらにハイブリダイゼーション時に前記領域β部分を蓋や容器部材などでシールしておく構成も採用できる。
【００９５】
なお、バイオチップの領域αに前記ハイブリダイゼーション操作を施す時に、先の例は領域βには何らの操作も施さないが、例えば同領域を生化学検体を含まない同種バッファー液に浸漬して同領域をネガティブコントロールとすることができ、これにより上述した操作において複合体の有無を容易に検出することができる。また、このバイオチップ３０を２枚使用することで、バッファー液に対して無操作領域、ネガティブコントロール領域、既知濃度の領域、そして検査のサンプル領域を設定することができる。
【００９６】
さらに、図７に示すバイオチップ５０は、板状のバイオチップ５０を３本のスリットで４分割してスティック状のチップ領域５１〜５４を作製し、各チップ領域５１〜５４には同じ電極パターンを成膜して、チップ５０の一方端にリード端子５５ａ〜５５ｄを設けてそれぞれチップ領域５１〜５４上に設けた電極群と接続する構成からなる。このバイオチップ５０に対して所要のプローブ核酸を所定の電極上に配置する操作を繰り返して各チップ領域５１〜５４上に同じ条件で同種の各プローブ核酸を配置する。次に、例えばチップ領域５１はバッファー液にも浸漬しない無操作領域、チップ領域５２は生化学検体を含まない同種バッファー液に浸漬するネガティブコントロール領域、チップ領域５３は既知濃度の生化学検体を含む同種バッファー液に浸漬する既知濃度の領域、そしてチップ領域５４は検査のサンプル領域として、同時に同条件の操作を可能にする。
【００９７】
なお、個別に同じ電極パターンを形成した複数のスティック状のバイオチップを用いることも可能であり、チップ表面の各電極に同時にプローブ核酸の配列を行った後、先の例と同様操作を行う他、例えば生化学検体の含有濃度がそれぞれ異なる複数種のハイブリダイゼーションを複数のバイオチップに施し、さらにこれらを所要の標識で修飾したものとしないものに分けた後、搬送アームにこれら複数のバイオチップを装着して前述の計測を実施することで、ハイブリダイゼーションをより正確に定量的に計測することが可能となる。
【００９８】
【実施例】
実施例１
検出目標を、キャンピロバクター・ジェミニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）Ｏ−１９血清型ｇｙｒＢ遺伝子変異部周辺の８５６ｂｐのＤＮＡとし、これとその中央部で相補的に結合する中央６０塩基のＲＮＡをプローブＲＮＡとして作製した。又、比較のために前記ＤＮＡと末端部で相補的に結合する末端３０塩基のＤＮＡ、中央部で相補的に結合する中央３０塩基のＤＮＡ、中央６０塩基のＤＮＡの３種類をプローブＤＮＡとして作製した。なお、３０塩基のものは同一鎖内でループを形成しないように、６０塩基のものは同一鎖内でループを形成するように構成した。
【００９９】
バイオチップ作製するための基板にガラス基板を用い、これをアセトン、メタノール、超純水中で超音波洗浄した後、１０％フッ酸で表面を２０秒間エッチングを行ない、さらに、アセトン、メタノール、超純水中で超音波洗浄した後、窒素ガスで乾燥させた。
【０１００】
その後、所要パターンでレジスト層を設けた後スパッタ装置（ＵＬＶＡＣ）を用いガラス基板にまず約１ｎｍ厚みのＣｒ層を設け、次いで約５０ｎｍ厚みのＡｕ層を設けた。次にレジスト層を除去して基板に所要パターンでＡｕ膜電極を配列しかつＡｕ膜線で結線した構成の電気回路を設けた。またさらに、プローブ核酸を配列する予定のＡｕ膜電極を除くＡｕ膜線等の回路パターン部分には絶縁マスク層を設けた。
【０１０１】
前記基板を濃硫酸中に１時間程度浸漬した後、超純水で洗浄した。その後、プローブＲＮＡ、ＤＮＡの３'端側をＳＨ（チオール）基で、５'端側をビオチン基で修飾したプローブＲＮＡ，ＤＮＡ−Ｄ−ＢＦＲ溶液（ＫＨ2ＰＯ4、Ｋ2ＨＰＯ4、ｐＨ ７．０）を基板上に滴下し、飽和水蒸気中に約１５時間放置し、プローブＲＮＡ、ＤＮＡをガラス基板のＡｕ膜電極上に付着させてこの発明によるバイオチップとなした。
【０１０２】
ハイブリダイゼーションは、Ｒ−ＢＦＲ溶液（ＮａＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ７．４）とＨ−ＢＦＲ溶液（ＮａＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．４）で洗浄後に、所要濃度からなる検体ＤＮＡのＨ−ＢＦＲ溶液を滴下し、約１６〜２４時間放置して実施した。
【０１０３】
この発明のプローブと比較のプローブの４種のスポットに対して、前記ＤＮＡ鎖を用いてハイブリダイゼーションを実施した後、アビジンをコートした蛍光微粒子をプローブに対して修飾した。その後、蛍光倒立顕微鏡とＣＣＤカメラを用いてハイブリダイゼーションの検出、すなわち蛍光の検出を実施した。
【０１０４】
また、同様の４種のプローブに対して、前記ハイブリダイゼーションを実施することなく、アビジンをコートした蛍光微粒子で蛍光標識による修飾処理を行い、その後蛍光の検出を実施した。
【０１０５】
塩基数３０のプローブＤＮＡにおいては、目的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションの有無にかかわらずいずれも蛍光発光が観測され、ループ構造を有していないため、常に蛍光標識による修飾が可能であること、すなわち目的ＤＮＡの検出が困難であることを確認した。
【０１０６】
一方、塩基数６０のプローブＤＮＡ及びプローブＲＮＡにおいては、目的ＤＮＡとのハイブリダイゼーション前では蛍光標識による修飾が全くできず、ハイブリダイゼーション後では二本鎖を形成したプローブからのみ強い蛍光を観測することができ、塩基数６０のプローブはループ構造を有しており、ハイブリダイズしたプローブにのみ、その先端を標識で修飾することが可能であり、目的ＤＮＡの検出が容易であることが確認できた。
【０１０７】
また、この発明のプローブＲＮＡの場合は、ＤＮＡ−ＲＮＡ結合の安定性がＤＮＡ−ＤＮＡ結合より強いため、比較の６０塩基のプローブＤＮＡに比較して検出感度がより高くなることを確認した。
【０１０８】
また、上述の蛍光標識による検出後に、バイオチップを洗浄して乾燥させた後、図６に示すごとく、搬送アームに装着して電極プローブを配置したスキャニング装置にセットして、電圧、電流、静電容量を測定した。この測定結果を、前記のハイブリダイゼーションと蛍光標識による修飾を行う前のドライ状態の場合、ハイブリダイゼーションなしで蛍光標識による修飾を行った場合の電圧、電流、静電容量の測定結果と対比し観察した。
【０１０９】
この発明と比較のスポットの対比において、ハイブリダイゼーションの有無、蛍光標識の有無による電気的変化が、先の蛍光標識による検出結果と一致することを確認し、ハイブリダイゼーションを電気的な変化として検出可能なバイオチップであることを確認した。前述の操作でハイブリダイズする際の目的ＤＮＡの量を種々換えた場合も実施した結果、目的ＤＮＡ量に相関した信号の変化が検出でき、定量的な検出が可能であることを確認した。
【０１１０】
さらに、上記のスキャニング装置に前述のＣＣＤカメラを用いた光学検出器を装着した構成となし、搬送アームに装着して電気的な計測とともに蛍光標識の光学的検知を同時に行うことで、ハイブリダイズしたプローブの定量的な検出がより正確に実施可能であることを確認した。
【０１１１】
実施例２
検出目標には、実施例１のＤＮＡに換えてＲＮＡを使用した。すなわち、ｇｙｒＢ遺伝子（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）より、イン・ビトロＲＮＡ合成法により作製し、精製した約８００塩基のＲＮＡを用いた。
【０１１２】
また、プローブＤＮＡには上記の合成ＲＮＡと中央で相補的に結合する６０塩基のＤＮＡを用いて、実施例１と同様のガラス基板に同様条件で配列してこの発明によるバイオチップを作製した。
【０１１３】
ここで標識による修飾方法として採用した金コロイド修飾方法は、上記のバイオチップをハイブリダイゼーション後にＲ−ＢＦＲ溶液で洗浄し、窒素ガスでおだやかに乾燥させ、アビジンをコートした金コロイド（粒径１０ｎｍ、ＳＩＧＭＡ製）を滴下し１〜３時間、飽和水蒸気中で放置することで、ビオチンとアビジンの特異的結合を利用して修飾した。
【０１１４】
また、金属微粒子修飾は、プローブの５'端側とビオチン−アビジン結合させるため、予めアビジンコートした平均粒径が１μｍ程度のＦｅ微粒子を用いて、ｐＨ ７．４のコロイダル液となして実施した。
【０１１５】
前記のＲＮＡ鎖を用いて実施例１と同様にハイブリダイゼーションを実施した後、金コロイド修飾又は金属微粒子修飾を行い、その後ＳＰＲ測定を行った。また比較のため、同時に目的ＲＮＡを有しないＨ−ＢＦＲ溶液をプローブＤＮＡと反応させた後、標識による修飾処理をしてからＳＰＲ測定を行った。なお、ＳＰＲ測定は、バイオチップをＲ−ＢＦＲ溶液で洗浄後に窒素ガスで穏かに乾燥し、その後速やかにＳＰＲ測定を行なった。ＳＰＲ測定はイメージングシステムを用いて行った。
【０１１６】
その結果、目的ＲＮＡとハイブリダイゼーションしたプローブＤＮＡのみに選択的に金コロイド修飾及び金属微粒子修飾が可能であり、従って、ＳＰＲ角度シフト増幅が可能で、ハイブリダイゼーションによる生化学反応体の検出が可能であることを確認した。さらに、前記金コロイド修飾と同様方法でストレプトアビジンで修飾した場合も同様に目的ＲＮＡとハイブリダイゼーションしたプローブＤＮＡのみに選択的に修飾することが可能であった。
【０１１７】
さらに、比較のため、前記ハイブリダイゼーションを実施することなく、アビジンをコートしたＦｅ微粒子標識による修飾処理を行った。しかし、目的ＲＮＡとのハイブリダイゼーション前ではＦｅ微粒子標識による修飾が全くできず、ハイブリダイゼーション後ではＦｅ微粒子標識による修飾が行われ、前記ＳＰＲ測定においてハイブリダイゼーション前後で明らかな差が見られた。
【０１１８】
また、上記のハイブリダイゼーションを実施する際に、目的ＲＮＡがある場合と、ない場合を設定して、Ｆｅ微粒子コロイダル修飾を行い、その後、微分干渉顕微鏡にて観察を行った。目的ＲＮＡがある場合には、Ｆｅ微粒子が多数観察されたが、目的ＲＮＡがない場合には、Ｆｅ微粒子はほとんど観察されなかった。なお、前記バイオチップのいずれの場合も、表面に粒状感のあるなしで明確に目的ＲＮＡの存在を目視で区別することができた。
【０１１９】
また、実施例１と同様に上述の金属粒子標識による検出後に、バイオチップを洗浄して乾燥させた後、図６に示すごとく、搬送アームに装着して電極プローブを配置したスキャニング装置にセットして、電圧、電流、静電容量を測定した。この測定結果を、前記のハイブリダイゼーションと金属粒子標識による修飾を行う前のドライ状態の場合、ハイブリダイゼーションなしで金属粒子標識による修飾を行った場合の電圧、電流、静電容量の測定結果と対比し観察した。
【０１２０】
前述の操作でハイブリダイズする際の目的ＲＮＡの量を種々換えた例を実施した結果、ハイブリダイゼーションの有無、金属粒子標識の有無による電気的変化の差異やその程度は、金属標識によるＳＰＲ検出と一致すること、すなわちＳＰＲ角のシフト量はハイブリダイゼ一ションした目的検体の量と対応するが、このＳＰＲ角のシフトと電気的測定の変化量が同傾向を示すことを確認し、ハイブリダイゼーションを定量的に電気的な変化として検出可能なバイオチップであることを確認した。
【０１２１】
実施例３
実施例２において、プローブＤＮＡの修飾に、前述の金又はＦｅ微粒子に換えて、ビオチン基で修飾したプローブの５'端側とシリカ粒子とをビオチン−アビジン結合させるため、予めアビジンコートしたシリカ粒子を用いて、ｐＨ ７．４のコロイダルシリカとなして実施した。コロイダルシリカとしては粒径が１００ｎｍ〜８００ｎｍの種々粒径のものを用いた。
【０１２２】
スキャニング装置におけるハイブリダイゼーションの検出機構には、検出チップをプリズム上に載置し、Ｈｅ−Ｎｅレーザー光をプリズムの一方側より基板裏面に入射してプリズムの他方側へこれを全反射させて、バイオチップの上面から観察するＣＣＤカメラで散乱光強度を検出する方法で実施した。
【０１２３】
また、比較のため、前記ハイブリダイゼーションを実施することなく、アビジンをコートしたシリカ微粒子標識による修飾処理を行った。その結果、目的ＲＮＡとのハイブリダイゼーション前では、シリカ微粒子標識による修飾が全く実施できず、散乱光を観測することができなかったが、ハイブリダイゼーション後では目的ＲＮＡとのハイブリダイゼーションが行われたプローブＤＮＡからのみ強い散乱光を観測することができた。また、いずれの粒径のシリカ粒子の場合も同様に目的ＲＮＡの検出が可能であった。
【０１２４】
次に、図７の表面領域を分割したバイオチップを実施例２のとおり作製し、チップ領域５１は検体を有しない実施例２と同種のバッファー液に浸漬しさらに上述のシリカ粒子標識による修飾を行い、チップ領域５２は既知の量の検体を有する該バッファー液を用いて実施例２と同様にハイブリダイゼーションを行い、チップ領域５３は既知の量の検体を有する該バッファー液を用いて実施例２と同様にハイブリダイゼーションを行いかつシリカ粒子標識による修飾を行い、チップ領域５４は実施例２と同様に検査対象のバッファー液を用いて目的ＲＮＡとのハイブリダイゼーションを行い、上述のシリカ粒子標識による修飾後に、各領域を洗浄して乾燥させた後、図６に示すごとく、搬送アームに装着して電極プローブとＣＣＤカメラを配置した前記スキャニング装置にセットして、散乱光強度の検出とともに電圧、電流、静電容量を測定した。
【０１２５】
前記測定の結果、予め測定したプローブＤＮＡを配列したままの状態の場合の測定結果とともに、ネガティブコントロールとして前記のハイブリダイゼーションとシリカ粒子標識による修飾を行った領域５１の場合、既知量の目的検体とハイブリダイゼーションを行った領域５２の場合、検査対象の目的検体とハイブリダイゼーションしてシリカ粒子標識による修飾を行った領域５３（既知量）及び領域５４（サンプル）の場合の４種の電圧、電流、静電容量を同時に測定するとともに、各領域の散乱光強度の検出結果も得られた。
【０１２６】
また、図７の各領域と同じ電極パターンを個別のスティック状基板にそれぞれ２か所を有する構成のバイオチップを作製し、先と同様の操作並びに目的ＲＮＡとのハイブリダイゼーションを行い、その後シリカ粒子標識による修飾後に、洗浄して乾燥させた後、前記スキャニング装置にセットして、散乱光強度の検出とともに電圧、電流、静電容量を測定した。この際、各チップは２領域を有するので前記操作を行った領域と該操作なしの領域となし、またハイブリダイゼーションには目的ＲＮＡの量を予め特定して種々の含有量となる５種のバッファー液を用意しておき、５枚のバイオチップに該バッファー液による５種のハイブリダイゼーションを実施した。
【０１２７】
これらの測定結果より、目的検体とのハイブリダイゼーションにより二本鎖を形成したプローブ、さらにシリカ粒子標識で修飾されたプローブが存在する場合の電圧、電流、静電容量の変化、散乱光強度の変化と目的ＲＮＡ濃度との間に一定の相関関係を見い出すことができ、先にハイブリダイゼーションを実施したバイオチップにおける測定結果と比較することにより定量的な測定が可能となることを確認した。
【０１２８】
実施例４
実施例１において、ガラス基板をシリコン基板とする以外は同様の構成のバイオチップを作製した。また実施例２において、プローブＤＮＡの修飾に、前述の金又はＦｅ微粒子コロイダル修飾に換えて、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体を用いるＡＢＣ法による化学発色（酵素）法を実施した。すなわち、前記複合体を滴下して室温で１ｈｒ放置した。その後、ＴＢＳ−Ｔ（Ｔｗｅｅｎ２０添加Ｔｒｉｓ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）で洗浄し、テトラメチルベンジン溶液を滴下し、５〜１５ｍｉｎ、室温で放置した。
【０１２９】
その後、超純水にて洗浄し、窒素ガスにて乾燥させた。その結果、目的ＲＮＡがある場合は発色したが、目的ＲＮＡがない場合は発色せず、明確に目視にて識別することができた。又、同じバイオチップを用い、上記のＡＢＣ法に換えてアビジンをコートした色素を滴下し、室温〜３７℃、飽和水蒸気中で１〜２時間の修飾を行った。その後、ＴＢＳで洗浄し、窒素ガスにて乾燥させたところ、目的ＲＮＡがある場合は着色したが、目的ＲＮＡがない場合は着色せず、明確に目視にて目的検体を検出できた。
【０１３０】
上記実施例において、実施例２と同等構成のバイオチップを用い、ハイブリダイゼーション後アビジンをコートした色素を滴下し、室温〜３７℃、飽和水蒸気中で１〜２時間の修飾を行った。その後、ＴＢＳで洗浄し、さらに、予め染色されたタンパクをビオチンで修飾した第２の標識を、上記条件と同様に滴下して、修飾処理した。その後ＴＢＳで洗浄し、乾燥させたところ、目的ＲＮＡがある場合は上記の色素のみに比較して強く着色し、また目的ＲＮＡがない場合は着色せず、明確に目視にて目的ＲＮＡを確認することができた。
【０１３１】
また、上述の化学発色標識及び色素標識による検出後に、図６に示すごとく、搬送アームに装着して電極プローブを配置したスキャニング装置にセットして、電圧、電流、静電容量を測定した。この測定結果を、前記のハイブリダイゼーションと標識による修飾を行う前のドライ状態の場合、ハイブリダイゼーションなしで標識による修飾を行った場合の電圧、電流、静電容量の測定結果と対比することにより、ハイブリダイゼーションを電気的な変化として補足でき、上述の目視による検出を補完することが可能となった。
【０１３２】
実施例５
実施例１と同様方法でバイオチップを作製した。目的検体には実施例１と同様のｇｙｒＢ遺伝子（８５６ｂｐ）を用いた。また、目的検体は粒径５０ｎｍのシリカ粒子で修飾しておき、バッファー液で既知の一定濃度となるようにして用いた。プローブは、前記ｇｙｒＢ遺伝子と相補的に結合する６０塩基のＤＮＡで、ループ構造を取る構成としかつ予め磁性材微粒子で修飾したものを用いた。
【０１３３】
バイオチップは、実施例１と同様方法にてガラス基板表面にａ〜ｆの電極部を設け、上記のプローブＤＮＡを実施例１と同様方法にて各電極に配列固定した。その後Ｒ−ＢＦＲ溶液で洗浄し、さらに窒素ガスでおだやかに乾燥させた。なお、プローブＤＮＡの配列には、電極面積とプローブＤＮＡを含むバッファー液濃度との関係を最適化して、各電極部で固定化される量ができるだけ均等になるようにした。
【０１３４】
得られたバイオチップを搬送アームに装着して磁気ヘッドプローブを配置したスキャニング装置にセットして、電極上の磁気を測定したところ表１の「磁気検出強度」の結果を得た。「磁気検出強度」は電極ａを基準として相対比で示す。
【０１３５】
次に、実施例１と同様方法にて、目的検体をバイオチップにハイブリダイゼーションして、Ｒ−ＢＦＲ溶液で洗浄し、さらに窒素ガスでおだやかに乾燥させた。ハイブリダイゼーション操作後のバイオチップに実施例３と同様方法にて散乱光強度の検出を施し、表１の「散乱光検出強度」の結果を得た。
【０１３６】
表１のハイブリダイゼーション操作後の各電極上における散乱光強度の測定結果を、ハイブリダイゼーション操作前の各電極上にあるプローブの状態を把握した表１の「磁気検出強度」の比、すなわちプローブ量比により補正したところ、表１の「補正後の検出強度」の結果を得た。すなわち、散乱光強度の検出値の偏差は、プローブ量比の補正により測定後の３７．４から補正後の６．０４へと著しく減少した。
【０１３７】
作製したバイオチップの各電極（スポット）上に配列したプローブに標識を施しておくことで、ハイブリダイゼーション操作前の各電極上のプローブの量比を測定することが可能であり、このプローブ量比を予め得ておくことで、ハイブリダイゼーション操作後の２本鎖を形成した目的検体量の測定値を正確に補正することが可能となり、生化学反応体の定量的な検出が極めて高い精度で実施できることを確認した。
【０１３８】
【表１】
【０１３９】
【発明の効果】
この発明によるループ構造を有するプローブ核酸を基板に配列したバイオチップの構成は、生化学検体の検出操作において、生化学検体とのハイブリダイゼーションを行った後に、標識による修飾を行い、ハイブリダイズしたプローブにのみ、かつ所要の箇所を標識で修飾することが可能となり、ハイブリダイゼーション時並びに標識による修飾時と、各工程での精度が向上して目的検体の検出精度が著しく向上する。
【０１４０】
一般に、生体内現象を捉えるためには、ＤＮＡではなく、ｍ−ＲＮＡの発現量を調べる必要があるとされるが、上述のようにループ構造を利用したこの発明のプローブはバックグラウンドノイズが低く高感度のため、また検体を標識で修飾しておく必要がないため、ｍ−ＲＮＡの動向をｃ−ＤＮＡを作製することなく、直接検出可能となる。
【０１４１】
またＤＮＡを検出する場合、プローブにＲＮＡを用いることで、ＤＮＡ−ＲＮＡ結合の安定性はＤＮＡ−ＤＮＡ結合より強いため、プローブにＤＮＡを用いた場合より、検出感度が高く、安定した検出精度を維持できる利点がある。
【０１４２】
この発明によるバイオチップは、目的とするプローブ核酸と生化学検体とのハイブリダイゼーション並びに標識による修飾自体の精度が本来的に高いという特徴に加え、実施例に示すようにこれを電気的、電気磁気的、電気光学的あるいは電気磁気光学的な変化として補足することが可能であり、高精度な生化学検体の検出、さらに定量的な検出が実現できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ａ，Ｂはこの発明によるプローブＤＮＡのループ構造を示す説明図である。
【図２】 Ａ，Ｂはこの発明によるプローブＲＮＡのループ構造を示す説明図である。
【図３】 この発明によるプローブＲＮＡの他のループ構造を示す説明図である。
【図４】 この発明によるプローブＲＮＡの他のループ構造を示す説明図である。
【図５】 この発明によるプローブＲＮＡの他のループ構造を示す説明図である。
【図６】 Ａはこの発明によるバイオチップと搬送アームの構成を示す斜視説明図であり、Ｂは搬送アームとスキャニング装置の構成を示す斜視説明図である。
【図７】 この発明によるバイオチップの他の構成を示す斜視説明図である。
【符号の説明】
１ 基板
２ ビオチン基
３ 標識
１０ プローブＤＮＡ
２０ プローブＲＮＡ
１１，２１ 固定端
１２，２２ 解放端
１３，２３ 結合部
１４，２４ ループ
１５，２５ 主要部位
２６ 脚
３０，５０ バイオチップ
３１ａ，３１ｂ，５５ａ，５５ｂ，５５ｃ，５５ｄ リード端子
３２ 搬送アーム
３３ 保持部
４０ スキャニング装置
α，β 領域
５１，５２，５３，５４ チップ領域
５６ スリット
ｘ 隙間
【発明の属する技術分野】
この発明は、バイオチップを用いた生化学検体の検出方法の改良に係り、基板に配列されたプローブ核酸に例えば解放末端側が基板側に向くようにループ構造を取らせることで、目的ＤＮＡやＲＮＡがある場合にのみハイブリダイゼーションが起こり、前記ループ構造が解消されて伸びることから、ハイブリダイズした目的の複合体（生化学反応体）のみを任意の標識で修飾することが可能となり、ハイブリダイゼーション並びに標識による修飾自体の精度が本来的に高く、これを電気的、電気磁気的、電気光学的あるいは電気磁気光学的な変化として高精度な生化学検体の検出が実現できる生化学反応体の検出方法とバイオチップに関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子検出の基本原理は、ＤＮＡが相補的な二重螺旋構造を形成することを利用するものである。Ａ（アデニン）とＴ（チミン）、Ｃ（シトシン）とＧ（グアニン）が対をなすことから、例えば、ＡＧＧＴＴＡＣ（５'→３'）のＤＮＡ配列を持つ遺伝子を検出するには、プローブとしてＴＣＣＡＡＴＧ（３'→５'）の配列を持つＤＮＡを作成し、サンプリング検体遺伝子中に目的遺伝子が存在すると、ＤＮＡハイブリダイゼーションによって、プローブＤＮＡの配列にＡＧＧＴＴＡＣの配列が結合して二重螺旋構造を取るため、これを検出することで目的ＤＮＡを容易に選別できることになる。
【０００３】
二重螺旋構造のＤＮＡを検出する方法として、検体ＤＮＡ（サンプリング遺伝子ＤＮＡ）に蛍光標識で修飾を施しておき、プローブＤＮＡと前記のＤＮＡハイブリダイゼーション操作を行い、二重螺旋構造を呈したＤＮＡ、すなわち蛍光シグナルを発するものを検出する、蛍光法が知られている。
【０００４】
蛍光標識としては、蛍光色素そのものの他、蛍光色素により直接染色された染色体、糖蛋白や糖脂質から切り出された糖鎖体を修飾したイオン性蛍光物質、あるいはタンパク質、核酸、酵素、細胞等を蛍光色素でタグ化するなど、種々方法並びに物質で蛍光を発する標識が提案されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上述のＤＮＡを初めとして検出対象となる生化学検体には、ＲＮＡ及び核酸類似構造物などの多種多様の構造物が想定される。これらの生化学検体を効率よく検出するには、プローブとして機能する所要の塩基配列を有するＤＮＡやＲＮＡ構造体、ＰＮＡ構造体を所要のガラス基板などの基板上に配列してチップ化し、かかるバイオチップを基本単位として生化学検体とのハイブリダイゼーション操作を施し、当該ハイブリダイゼーションを完了した目的のプローブと生化学検体との複合体（生化学反応体）を確実に検出する必要がある。
【０００６】
検体側に蛍光標識を施す蛍光法を用い、前記バイオチップにハイブリダイゼーションを行いハイブリダイズしたＤＮＡを検出する方法では、蛍光標識による修飾操作が煩雑であること、また、施術者の技量によって前記ハイブリダイゼーション並びに標識による修飾効率が異なること、さらに種々条件で蛍光色素の光消失が発生すること、未反応吸着物によるバックグラウンドノイズの上昇で検出精度が低下すること等の問題が指摘されている。
【０００７】
この発明は、前記バイオチップを用いた生化学検体の検出方法の問題に鑑み、検出工程を再現性よく簡素化でき、測定者に過度の技量を要求することがなく、ハイブリダイゼーション並びに標識による修飾工程におけるそれぞれの施術並びに効率の精度を高め、最終的に目的検体の検出精度の向上が可能となる生化学反応体の検出方法とバイオチップの提供を目的としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、バイオチップを用いた生化学検体の検出精度の向上を目的に、ガラスなどの基板にプローブが多数配列されたバイオチップにおいて、プローブへ生化学検体をハイブリダイゼーションさせる方法、プローブへの蛍光標識などの標識による修飾方法について詳細に検討したところ、
１）ハイブリダイゼーションを完了して二重螺旋構造を形成したプローブを標識で修飾すると、ハイブリダイズしていないプローブへも修飾が行われて標識による検出が不能となるため、従来、予め検体側に標識による修飾を施しておき、ハイブリダイズした後に検体側の標識を検出することで目的検体を検出するが、条件設定の違いや施術者の技量などによりハイブリダイゼーション時に非特異的な吸着が生じて検出精度が変動低下すること、
２）プローブがＲＮＡ及び核酸類似構造物である場合、プローブがＤＮＡ構造物である時と比較して生化学検体との結合力が強く、かつ基板に多数のプローブが配列されているため、目的物以外との吸着やハイブリダイゼーションの可能性が高くノイズが増大して目的生化学検体の検出精度が低下すること、
等の問題があることを知見し、これらを解消するには、かかるプローブが多数配列されるバイオチップにおいて、根本的に検出精度を向上させ得る新たな基本構造を与えなければならないことに着目した。
【０００９】
そこで発明者らは、基板にプローブが多数配列されたバイオチップにおいて、検出精度を向上させ得る新たな基本構造、すなわち基板上のプローブが目的の生化学検体とのみハイブリダイズできる構成を目的に種々検討し、ハイブリダイズした生化学反応体のみを標識で修飾することで基本的に検出精度を高めることが可能であることに着目し、またあえて容易にはハイブリダイズできないようにし、目的の生化学検体とのみハイブリダイズするように構成して本来的な検出精度を高めておくことに着目し、検出精度を高めることが可能となるプローブ自体の構造やその構成について鋭意検討した。
【００１０】
その結果、発明者らは、ハイブリダイズしたプローブのみが他のハイブリダイズしていないプローブより外側へ伸びていると、その先端にのみ標識が修飾可能であること、またプローブの生化学検体と相補的に結合する主要部位が配列するプローブ内に潜り込んでいると容易にはハイブリダイズできないが、選択的にかつ確実に目的の生化学検体とのみハイブリダイズ可能であることに着目し、これらを実現し検出精度を高めるためにバイオチップに立体的な構造を与えることができる構成について検討したところ、基板表面に固定されない解放端側又はその標識による修飾可能にした部位が基板側に位置するように、あるいは生化学検体と相補的に結合する主要部位が基板上や表面近傍の基板側に位置するように、基板に配列するプローブにループ構造を採用することで、上述の選択的なハイブリダイズが実現でき基本的に検出精度を高めることが可能であることを知見した。
【００１１】
また、発明者らは、かかるループ構造を有するプローブを基板に配列したバイオチップの構成は、生化学検体の検出操作において、前述の如く先に標識で修飾した生化学検体を用いてハイブリダイゼーションするのではなく、従来とは逆に生化学検体とのハイブリダイゼーションを行った後、ハイブリダイズしたプローブ、すなわちループ構造を解消してハイブリダイズしているプローブにのみ、その先端などの所要の箇所を標識で修飾することが可能となり、ハイブリダイゼーション時並びに標識による修飾時と、各工程での精度が向上して目的検体の検出精度が著しく向上するとともに、基本的に検出精度の向上のために各工程で施術者の技量を要求しないため、生化学検体の検出操作が比較的容易になることを知見した。
【００１２】
また、発明者らは、この発明によるバイオチップの構成は、ハイブリダイズしたプローブや検体にのみ選択的に標識による修飾が可能であることから、標識には従来の蛍光標識、蛍光色素を初め、Ｓｉを含む金属粒子、磁性体粒子、セラミックス粒子、化学発色体など任意の粒子を採用できること、また最初に設けた標識を目標にさらに別の標識を修飾でき、多重標識を形成できること、従って用いた標識の種類に応じて種々の標識の検出方法、すなわちハイブリダイズした生化学反応体に設けられる標識の有無を電気的、磁気的、光学的な変化のうち少なくとも１つを検出・識別する方法が採用でき、また、検出する生化学検体の性状に応じて最適な標識や検出方法を採用できることを知見し、この発明を完成した。
【００１３】
さらに、発明者らは、このループ構造を与えたプローブを予め標識で修飾し、ハイブリダイゼーション操作前に前記の電気的、磁気的、光学的あるいはそれらを組み合せた計測を行うことにより、バイオチップの電極上に配列させているプローブの状態、すなわち各種操作などを行う前の各電極上のプローブの状態を定量的に把握しておくことが可能となり、ハイブリダイゼーション操作後、さらには２本鎖を形成したプローブ核酸又は生化学検体あるいはその両方を標識で修飾した後に、当該標識を目標に検知して２本鎖を形成した複合体の有無の評価をするに際し、予め各電極上のプローブの状態を定量的に把握できることから、対比や評価をより精度の高いものとすることができること、また、予めプローブを修飾する標識とハイブリダイゼーション操作後に修飾する標識を別異の種類とするか、同種であっても寸法や色などの形態を変えて標識の検出方法を換えたり複数手段を採用することで、プローブの状態（電極上のプローブ量）による検出結果の補正をより高精度で行うことも可能であることを知見し、この発明を完成した。
【００１４】
【００１５】
この発明は、基板又はその類似物表面に設けられた１又は２以上の電極上に配列されループ構造を形成したプローブ核酸かあるいは前記構成に加え予め標識で修飾したプローブ核酸を有するバイオチップを用い、該チップのプローブ核酸に生化学検体をハイブリダイゼーションする工程、ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後に２本鎖を形成したプローブ核酸又は生化学検体あるいはその両方を標識で修飾する工程、２本鎖を形成したプローブ核酸と生化学検体との複合体を該バイオチップの表面における電気的、磁気的、光学的な変化の少なくとも１つにより検出・識別する工程を有する生化学反応体の検出方法である。
【００１６】
【００１７】
また、この発明は、基板又はその類似物表面に設けられた１又は２以上の電極上に配列されループ構造を形成したプローブ核酸かあるいは前記構成に加え予め標識で修飾したプローブ核酸を有するバイオチップを用い、該チップのプローブ核酸を予め標識で修飾した生化学検体をハイブリダイゼーションする工程、ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後に２本鎖を形成したプローブ核酸又は生化学検体あるいはその両方を標識で修飾する工程、２本鎖を形成したプローブ核酸と生化学検体との複合体を該バイオチップの表面における電気的、磁気的、光学的な変化の少なくとも１つにより検出・識別する工程を有する生化学反応体の検出方法である。
【００１８】
また、この発明は、上述の生化学反応体の検出方法において、
・ 検出・識別する工程で、ハイブリダイゼーション操作前にバイオチップ表面の電気的、磁気的、光学的な変化の少なくとも１つを捉える測定を行い得られた測定結果を基準として、各工程後のバイオチップのそれら測定結果と比較する方法、
・ 検出・識別する工程で、ハイブリダイゼーション操作の前後あるいはさらに標識修飾操作の前後における該バイオチップの表面における電気的、磁気的、光学的な変化の少なくとも１つを捉える測定を行いこれらを比較する方法、
・ 検出・識別する工程で、ハイブリダイゼーション操作前に複数の電極を有するバイオチップ表面の電気的、磁気的、光学的な変化の少なくとも１つを捉える測定を行い各電極上のプローブ核酸の量比を予め求めて各工程後の測定値に対する補正基準として用いる方法、
・ プローブ核酸又は生化学検体を標識で修飾する方法が、予め修飾されていた第１の標識を目標として第２の標識で修飾する２段階あるいは３段階以上の多段修飾である方法、
・ プローブ核酸又は生化学検体あるいはその両方を標識で修飾する方法が、先に第１の標識で修飾してさらにそれを目標として第２の標識で修飾する２段階あるいは３段階以上の多段修飾である方法、
・ 標識が、金属微粒子（Ｓｉを含む）、磁性体粒子、セラミックス微粒子、蛍光標識、蛍光色素、色素、化学発色体のいずれかである方法、
・ バイオチップの表面における電気的な変化として検出・識別する方法が、バイオチップ又は電極における電流値又は電圧値あるいは抵抗値の変化、バイオチップ表面の静電容量変化のうち少なくとも１つを検出・識別する方法、
・ バイオチップの表面における電気的、磁気的な変化として検出・識別する方法が、バイオチップ又は電極における電流値又は電圧値あるいは抵抗値の変化、バイオチップ表面の静電容量変化のうち少なくとも１つを検出・識別するとともに、２本鎖を形成した複合体からの信号、例えば磁性を磁気的に検知・識別する方法、
・ バイオチップの表面における電気的、光学的な変化として検出・識別する方法が、バイオチップ又は電極における電流値又は電圧値あるいは抵抗値の変化、バイオチップ表面の静電容量変化のうち少なくとも１つを検出・識別するとともに、２本鎖を形成した複合体からの信号、例えば光等を光学的に検知・識別する方法、
・ バイオチップの表面における電気的、磁気的、光学的な変化として検出・識別する方法が、バイオチップ又は電極における電流値又は電圧値あるいは抵抗値の変化、バイオチップ表面の静電容量変化のうち少なくとも１つを検出・識別するとともに、２本鎖を形成した複合体自体又は複合体のプローブ核酸又は生化学検体あるいはその両方に修飾された標識、あるいは複合体と前記標識からの信号を磁気的に検知・識別し、かつ２本鎖を形成した複合体からの信号を光学的に検知・識別する方法、を併せて提案する。
【００１９】
さらに、この発明は、表面に少なくとも１つの電極が形成された基板又はその類似物からなり、前記電極面上に一方端を固定して配列されたプローブ核酸を有し、かつ各プローブ核酸がループ構造を有し、配列したプローブ核酸は、
１）生化学検体と相補的に結合する主要部位が該基板等側に位置するようループ構造を有する、
２）その電極表面に固定されない解放端側又はその標識を修飾可能にした部位が該基板等側に位置するようループ構造を有する、
３）第２の標識で修飾可能な第１の標識で修飾された部位が該基板等側に位置するようループ構造を有する、又は、
４）予め修飾された標識が該基板等側に位置するようループ構造を有する、
バイオチップを併せて提案する。
【００２０】
また、上記構成のバイオチップにおいて、
標識が、金属微粒子（Ｓｉを含む）、磁性体粒子、セラミックス微粒子、蛍光標識、蛍光色素、色素、化学発色体のいずれかである構成、
基板又はその類似物材料がガラス又は半導体シリコンである構成、
基板又はその類似物を別途用意する電気的回路基板に組み込み可能とした構成、
を併せて提案する。
【００２１】
【発明の実施の形態】
この発明において、生化学検体はＤＮＡとＲＮＡ及び核酸類似構造物をいい、核酸類似構造物は、文字どおりの核酸に類似した構造物であり、例えば核酸のリボースあるいはリン酸ジエステル部位を修飾した分子やリボース−リン酸骨格をアミド結合に置き換えたペプチド核酸（ＰＮＡ）等がある。
【００２２】
この発明において、プローブ核酸は、ＤＮＡとＲＮＡ及び核酸類似構造物をいい、例えば、核酸類似構造物としては、上記と同様である。
【００２３】
この発明において、プローブＤＮＡやＲＮＡにループ構造を与えるには、その製造過程中又は製造後にループ構造を形成していて基板に配列されるか、基板に配列する際にループ構造を形成するか、基板に配列後にループ構造を形成するように構成するか、いずれの構成、形成方法も採用できる。
【００２４】
例えば、プローブＤＮＡの所要の二箇所に相補的な二重鎖を形成可能な対をなす塩基の配列、一例として図ではＡとＴの箇所を予め形成しておき、図１Ａに示すごとく、基板１にプローブＤＮＡ１０を配列した際の固定端１１側近くにある塩基配列と解放端１２側近くにある塩基配列とで結合部１３が形成されてループ１４を形成することで、プローブＤＮＡ１０の解放端１２が基板１上あるいは基板１上面近傍に位置するように構成することができる。
【００２５】
また、図１Ｂに示す例は、基板１に配列したプローブＤＮＡ１０が、図１Ａと同様にプローブＤＮＡ１０の固定端１１側近くにある塩基の配列と解放端側近くにある塩基の配列とで結合部１３が形成されてループ１４を形成することで、標識３による修飾を可能にした部位、図では解放先端に設けたビオチン基２が基板１上あるいは基板１上面近傍に位置するように構成してある。
【００２６】
プローブ核酸にループ構造を形成するための前記した対をなす塩基の配列を設ける箇所を適宜設定することで、結合部１３箇所が先端側、中央あるいは固定端側と種々形態のループ構造を形成し得る。例えば図２に示す例は、プローブＲＮＡ２０の解放端２２側の塩基と対をなす塩基配列をプローブＲＮＡ２０の中央部側に配置してある。
【００２７】
図２Ａに示す例は、対をなす塩基の配列をプローブＲＮＡ２０の中央部側に配置して、生化学検体と相補的に結合する主要部位２５が図１のプローブＤＮＡ１０構成例と比較してより基板１側へ向くようにループ２４を形成してある。
【００２８】
また、図２Ｂに示す例は、図２Ａと同様構成で標識による修飾を可能にした解放端２２に設けたビオチン基２が基板１上方に位置しており、図１Ｂに示す例と同様に標識３による修飾を可能にしたビオチン基２部分が、基板１との距離にかかわらず、プローブＲＮＡ２０の解放端２２側と対をなす塩基の配列部分、すなわち中央の結合部２３とループ２４部分にそして固定端２１と中央の結合部２３との間の脚２６部とで囲まれる形態であり、基板１とループ２４の隙間ｘが標識３の寸法と同程度あるいはより狭いと、解放端２２及びビオチン基２は基板１上でどのような向きであっても容易には標識３で修飾され難くなる。
【００２９】
この発明において、プローブ核酸には前述の如く、生化学検体と相補的に結合する主要部位がループ内に配列されるように、ループを形成する結合部、例えばプローブ核酸の任意の二箇所に対をなす塩基の配列等の結合可能な分子等の結合部を適宜設けることが可能であり、前記ループを形成する結合部の位置やループの形状、あるいはプローブ解放端の向き等はいずれの構成も採用できることは上記の説明から明らかである。
【００３０】
例えば図３に示すごとく、ビオチン基２を設けた解放端２２がより基板１に近接するように結合部２３より解放端２２の間がより長い構成、図４に示すごとく、図３と同様構成で結合部２３より解放端２２の間がさらに長くかつビオチン基２が結合部２３側を向いている構成、さらに図５に示すごとく、図２Ｂに示す例と同様構成で、ループ２４部分がより基板１に近接するよう長くした構成等が採用できる。
【００３１】
さらに、図２の構成は、上述したように図１に比較して結合部２３をプローブＲＮＡ２０の中央に位置させるために脚２６を設けているが、ここは特に結合部２３の対をなす塩基の配列やループ２４部分の生化学検体と相補的に結合する主要部位２５とは無縁であるから、必ずしも塩基等の配列である必要はなく、公知の核酸類似構造物としたり、前記の基板１とループ構造の隙間ｘの設定のために他の分子と置換したり、種々構成を採用できる。さらに、脚２６の先に結合部２３を形成してループ２４部を形成しているが、例えばこの脚２６をＹ字型に構成してそれぞれ結合部２３とループ２４部を設けて、一つの固定端２１、脚２６部から２つのループを有するプローブＲＮＡ２０を形成することも可能である。
【００３２】
また、この発明において、プローブ核酸には、複数の第２の標識による修飾を可能にした第１の標識で修飾された部位が基板上又はその近傍の基板側に位置するようループ構造を有する構成が採用でき、基板とループの隙間は第２の標識の外径と同程度あるいはより狭く、第２の標識がここを通過して第１の標識に容易に近接することができない程度の隙間となるように、前記の結合部を設ける箇所を適宜設定するとよい。
【００３３】
プローブ核酸において、目的の生化学検体と所要のハイブリダイゼーションが可能であり、かつ上述のごとく種々構成のループ構造を形成することが可能であれば、短鎖、長鎖を問わずいずれの塩基配列の構成であっても採用できる。また、この発明において、塩基数は特に限定しないが、比較的長鎖の構成を有するものが望ましく、例えば本来的に標識が修飾し難い塩基数が５０あるいは６０以上のものが検出精度の向上や検出時のノイズの低減に望ましく、さらに塩基数が１００を超えたり、１０００程度の場合であってもこの発明を適用できる。
【００３４】
この発明において、ループを形成する結合部として、プローブ核酸の任意の二箇所に対をなす塩基の配列を設ける例を説明したが、塩基の配列以外の例えば分子間結合が可能なもの、標識による修飾に用いた手段など、プローブ核酸内に配置・配列可能であり、かつペアリングしてループを形成することが可能であれば、いずれの分子、構造物であっても利用できる。
【００３５】
また、かかる結合部における結合力を、採用する塩基、分子種やその配置や長さにより適宜選定することも可能で、ハイブリダイゼーションや標識による修飾時における温度条件や他の分子構造物（検体など）との結合力等を考慮して、当該結合部における結合力を選定できる。
【００３６】
従って、この発明によるプローブ核酸は、所要の電極上に配列されてかつ前述のループ構造を有した構成であり、所定のハイブリダイゼーションの操作において、目的の生化学検体とのみ２本鎖を形成することが可能となる。また、２本鎖を形成することにより、このループが解消されるため、２本鎖を形成したプローブのみを標識で修飾することが可能となる。
【００３７】
この発明において、バイオチップを形成するための基板又はその類似物には、純然たる板の基板の他、エッチングなどで溝や凹部などを形成して所要の凹部又は凸部を使用する基板構成や、基板などにピン等の突起物を形成した構成、棒や立方体などの表面等を利用する形態、構成など、それらの表面の所要箇所に電極を形成でき、プローブの配列やハイブリダイゼーションが可能であれば、採用する標識などの検出・識別方法等に応じて、種々の形態を採用することが可能である。
【００３８】
この発明において、基板としては、ガラス基板、樹脂基板、シリコン基板等の硬質材料の他、メンブラン（例えばニトロセルロースなど）等の材料も採用可能で、また積層基板などプローブ核酸の配列が実施可能な基板であればいずれの材質、構成の基板も採用できる。また、基板に電極など種々の薄膜を成膜する場合は、その表面粗度はできるだけ平坦なものが好ましい。
【００３９】
入手や取扱いの良好なガラス基板としては、公知のホウケイ酸ガラス等が利用でき、厚みは厚いほうが取り扱いやすいが、バイオチップとしては目的に応じていずれの厚みのものも利用できる。
【００４０】
かかる電極膜を成膜する場合、基板又はその類似物の洗浄、乾燥方法としては、半導体ウエーハや各種デバイスを製造する際に採用される、各種溶剤による洗浄、純水中の超音波洗浄、各種酸溶液による洗浄、純水洗浄、ブロー乾燥、スピン乾燥など公知の基板等の洗浄、乾燥方法を適宜選択、組合せて採用できる。
【００４１】
電極材料は、基板などの所要表面に形成でき、かつ電極膜上にプローブ核酸の配列が可能であれば、公知の電極材料のいずれも採用可能であり、また、電極でありかつプローブ核酸の配列を容易にすることが可能な金、白金、銀などの貴金属電極膜を設けることも好ましい。
【００４２】
成膜方法としては、特に限定されないが、前述した所要形態の基板などの製作に採用されるエッチング、成膜などの半導体デバイスの製造プロセスで採用される方法を採用することが好ましく、例えば所要パターンで電極とそのリード部を形成し、また膜厚みを一定に制御するため、スパッタリング、イオンプレーティング、ＣＶＤ等の公知の気相成長による方法が好ましい。
【００４３】
なお、採用した基板等の材質に応じて、電極膜との密着性を向上させるために下地層を適宜成膜することができる。例えば、ガラス基板、石英基板にＣｒ層を設けたり、シラン化合物によって表面改質するなどの手段を採用できる。
【００４４】
この発明において、基板等の所要電極表面にプローブ核酸を配列する工程は、特に限定されるものでなく、公知のいずれの方法も採用でき、例えば電極膜上を酸や純水で洗浄後、プローブ核酸と緩衝液を用いて飽和水蒸気雰囲気中で配列させることができる。
【００４５】
緩衝液としては、例えばＫＨ2ＰＯ4とＫ2ＨＰＯ4を配合して所要ｐＨにした溶液が採用できる。他には、ＰＢＳや、ＮａＣｌとＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ＮａＣｌとＴｒｉｓ−ＨＣｌとＥＤＴＡを用いるなど、所要ｐＨにするため公知の薬液を選定配合した溶液等も採用できる。
【００４６】
以下にこの発明による生化学反応体の検出方法を詳述する。まず、基本工程を説明すると、
・ 基板等の表面にプローブ核酸を配列する工程、
・ ループ構造を形成しているプローブ核酸に生化学検体をハイブリダイゼーションする工程、
・ ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後に２本鎖を形成したプローブ核酸又は生化学検体あるいはその両方を標識で修飾する工程、
・ 前記標識を検出・識別する工程、を有する。
【００４７】
基板表面にプローブ核酸を配列する工程は、前述した基板の構成、プローブ核酸の構成、その配列方法において、明らかにしたとおりである。また、当該プローブにループ構造を与えるには、その製造過程中又は製造後にループ構造を形成していて基板に配列されるか、基板に配列する際にループ構造を形成するか、基板に配列後にループ構造を形成するように構成するか、いずれの構成、形成方法も採用できる。
【００４８】
ループ構造を形成しているプローブ核酸に生化学検体をハイブリダイゼーションする工程は、特に限定されるものでなく、公知のいずれの方法も採用でき、例えば基板の洗浄後に生化学検体と緩衝溶液を用いてハイブリダイゼーションさせることができる。前記の緩衝溶液としては、例えばＮａＣｌとＴｒｉｓ−ＨＣｌとＥＤＴＡを配合して所要ｐＨに保持した溶液が採用できる。
【００４９】
ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後に２本鎖を形成したプローブ核酸又は生化学検体あるいはその両方を標識で修飾する工程は、文字どおり２本鎖を形成したところのプローブ核酸か生化学検体、あるいはそれぞれに所要の標識を修飾するもので、２本鎖を形成して複合体となっている両者の結合部に選択的に入り込むようなインターカレーターを特に標識とする必要はない。しかし、インターカレーターを採用したり、前記標識と共に用いたりすることも可能である。
【００５０】
この発明において、前記標識には、Ｓｉを含む金属粒子、磁性体粒子、セラミックス粒子、蛍光標識、蛍光色素、色素、化学発色体、あるいは生化学検体の検出に利用されている染色体、糖鎖体、タンパク質、核酸、酵素、細胞など、プローブ核酸又は生化学検体に修飾できるもの、さらに前記の各種標識で再修飾できればいずれのものも利用できる。
【００５１】
また、かかる標識は、電気的特性として必ずしも導電性である必要はなく、この発明のバイオチップとしては、当該標識の有無で電流、電圧、抵抗、静電容量等の電気的な変化を生じることで検出可能であり、さらには電気的な変化とともに当該標識の有無で磁気的な変化を生じ得る標識を用いたり、あるいは当該標識の有無で電気的変化と光学的変化を共に生じ得る標識を用いるなど、前記標識にはいずれの構成も採用可能である。
【００５２】
金属粒子標識は、Ｓｉを含み、Ａｕ、Ａｌ、Ｔｉ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｍｏなどの各種金属の微粒子を用いるもので、特に微粒子の形状や粒径寸法や均一性は任意に適宜選択できる。特に必須条件ではないが、プローブや検体の所要部位を修飾可能とすること、微粒子表面に成膜可能なことなどから、５μｍ以下、さらに１μｍ以下が好ましく、数ｎｍ〜数百ｎｍの範囲で所定粒径が均一でかつ工業安定的に得られる微粒子が好ましい。
【００５３】
磁性体粒子標識には、磁性粉、酸化鉄顔料、磁性流体等の用途で一般的な酸化鉄系微粒子の他、磁性トナーや磁性インクとして利用されている炭素系微粒子、前記金属粒子や後述のセラミックス粒子のなかにも種々の磁性材がありこれらも利用できる。また、磁気記録媒体用磁性粉には、酸化鉄系等の酸化物、合金などのメタル系等種々組成や複合体粒子が提案されており、これらは数ｎｍ〜数百ｎｍの範囲で所定粒径や形状が均一でかつ工業安定的に得られることから好ましい。さらに、磁性インキ・磁性トナーとして利用される着色磁性粉体は、核となる磁性粉体の材質、大きさや形状、また表面膜の材料、厚さ、成膜数などの組み合わせによって、種々の磁性や色調を呈するため、磁気的検出と光学的検出を同時に実施できる。
【００５４】
セラミックス粒子標識には、球形や固有の結晶体など、公知のいずれの形態も採用できるが、微粒子表面に成膜可能なことなどから、５μｍ以下、さらに１μｍ以下が好ましく、検出方法に応じて数ｎｍ〜数百ｎｍの範囲で所定粒径が均一でかつ工業安定的に得られるＳｉＯ2、ＴｉＯ2、ＺｒＯ2、Ａｌ2Ｏ3、ＭｇＯなどのセラミックス微粒子が好ましい。
【００５５】
蛍光標識には、公知のいずれの形態も採用でき、市販されている蛍光色素によりタグ化された染色体、糖鎖体、タンパク質、核酸、酵素、細胞、微粒子等を標識自体の性質を利用したり後述のごとく抗原−抗体反応を利用して修飾することが可能である。また、この発明では蛍光自体は必須でないため、蛍光標識等に利用されている染色体、糖鎖体、タンパク質、核酸、酵素、細胞をそのまま利用することも可能である。また、蛍光でない色素も標識として利用できる。
【００５６】
この発明において化学発色体は、発色反応に関与するものを標識として修飾するもので、酵素法等の化学的発色をさせる方法に用いる物質をいい、例えばビオチン誘導体で修飾した箇所を用意することで容易に実施できる。
【００５７】
この発明において、上述の各種標識でプローブ核酸を修飾する方法としては、例えば金属微粒子等の粒子自体の性質を利用したり、公知の蛍光標識で修飾する方法などのように抗原−抗体反応を利用して修飾するなど、公知のいずれの方法も採用できる。また、中性のコロイダル液のごとく、微粒子を均一分散させた溶液の形態を利用することで修飾が容易になる。
【００５８】
また、プローブ核酸の末端をビオチンで修飾しておき、ストレプトアビジンをコートした金属やセラミックス等の微粒子をビオチン−アビジンの高い結合能力を利用して標識となすことができる。さらに、プローブ核酸の末端にＩｇＧや抗プロテイン物質を付加することで、タンパクをコートした前記微粒子等で抗原−抗体反応を利用して修飾することが可能である。
【００５９】
さらに、生化学検体を前記各種の標識で修飾することも可能であり、修飾方法は、当該検体の所要箇所を適宜標識化できればよく、上述の公知のいずれの方法も採用でき、特に末端を修飾するには上述の方法などいずれの方法も採用できる。
【００６０】
この発明において、ハイブリダイゼーション後に２本鎖を形成したプローブ核酸と生化学検体との複合体を、バイオチップの基板等の表面における電気的変化として検出・識別する方法は、例えば、該基板等表面に流した電流値又は電圧値あるいは抵抗値の変化、該基板等表面の静電容量変化のうち少なくとも１つを検出し、ハイブリダイゼーション前後の当該変化で前記複合体を識別することができる。
【００６１】
具体的には、バイオチップが複数の検出用スポット（ステージ）に区分けされ、各スポットに所要数の電極を有した構成で、各スポットにはそれぞれ異なるプローブ核酸がループを形成して各電極上に多数配列されている場合、まず、ハイブリダイゼーション前のドライ時又は所要バッファー液に浸漬するなどのウエット時に、基板等又は各電極に交流、直流あるいはパルス性の所要の電流を流し（電圧を印加し）、その際の所要電極間の電流Ｉ値又は電圧Ｖ値あるいは抵抗Ｒ値、静電容量Ｃ値を測定しておく。
【００６２】
次に、所要の生化学検体とのハイブリダイゼーションを行い、その後直ちに、あるいは洗浄後所要のバッファー液中で、または洗浄工程、乾燥後に再度所要電流を流し（電圧を印加し）、前記と同様の測定を行いその間の変化を観察、解析することで、各プローブ用電極上にあるハイブリダイゼーションにより２本鎖を形成したプローブ核酸と生化学検体との複合体の生成の有無を検知できる。
【００６３】
また、各電極上にあるプローブ核酸と生化学検体との複合体生成の有無を検出するため、バイオチップの基板等表面に起こる電気的な変化として捉える対象として、電流Ｉ、電圧Ｖ、抵抗Ｒ、静電容量Ｃのいずれかあるいはそれらを組み合せた測定用電気回路や電気素子回路を当該バイオチップ上に形成しておき、前記プローブ用電極と接続する構成なども採用可能である。
【００６４】
また、プローブ用電極上でのプローブ核酸と生化学検体との複合体生成の有無を検知するのに、補足対象の電流Ｉ、電圧Ｖ、抵抗Ｒ、静電容量Ｃ等を検知できる他のプローブ電極やセンサーを、バイオチップ表面に近接させて当該表面をスキャニングし、ハイブリダイゼーション前後の所要電極間に印加している電流Ｉ値又は電圧Ｖ値あるいは抵抗Ｒ値、静電容量Ｃ値の少なくとも１つの変化を捉えることで、ハイブリダイゼーションに伴う複合体の生成の有無を検知できる。
【００６５】
この発明において、ハイブリダイゼーション後に２本鎖を形成したプローブ核酸と生化学検体との複合体で、プローブ核酸又は生化学検体あるいはその両方を予めあるいはハイブリダイゼーション後に標識で修飾された該複合体を、バイオチップの基板等の表面における電気的、磁気的、光学的あるいは電気磁気的、電気光学的、電気磁気光学的な変化として検出・識別する方法は、前述のごとく複合体の形成に伴う電気的な変化を検知することを含むことはもちろんであるが、主に選定使用した標識の物理的な性状に起因して発生する所要電極間の電流Ｉ値又は電圧Ｖ値あるいは抵抗Ｒ値、静電容量Ｃ値の少なくとも１つの変化として当該複合体の有無を捉えることができる。
【００６６】
ここで電気磁気的変化とは、上記のプローブ核酸又は生化学検体あるいはその両方、あるいはさらに修飾した標識による電気的変化を捉えるとともに、複合体自体並びにそのプローブ核酸又は生化学検体あるいは両方に設けられた標識が有する磁性などを磁気的な検知手段で検知することを意味する。従って、該標識が有する磁性などを磁気的な検知手段で検知することはもちろんのこと、所要の電極間に電圧を印加したりあるいはバイオチップに磁場を印加して、前記複合体又は標識あるいは両者が有するに至った電気的特性又は磁気的特性あるいはその両方の変化を磁気的な検出手段で検知することも意味する。
【００６７】
例えば、標識に磁気記録媒体用の磁性微粒子を用いて磁気ヘッドを検出用プローブとして所要の磁場を印加した後の磁気的変化を検知することはもちろん、標識に金属粒子やセラミックス粒子などを用いて、電圧又は磁場あるいはその両方を印加後に所要電極間の電流Ｉ値又は電圧Ｖ値あるいは抵抗Ｒ値、静電容量Ｃ値の変化としてこれを検知することも意味し、電気的な変化と磁気的な変化を個別にあるいは同時に検出することも可能である。
【００６８】
また、電気光学的変化とは、上記のプローブ核酸又は生化学検体あるいはその両方、あるいはさらに修飾した標識による電気的変化を捉えるとともに、複合体自体並びにそのプローブ核酸又は生化学検体あるいはその両方に設けられた標識からの信号を光学的な検知手段で検知することを意味する。従って、該標識が有する光学的特性を光学的な検知手段で検知することはもちろんのこと、所要の電極間に電圧を印加あるいはバイオチップに磁場を印加して、前記複合体又は標識あるいは両者が有するに至った電気的特性あるいは光学的特性の変化を同様に光学的な検出手段で検知することも意味する。
【００６９】
例えば、標識に金属粒子やセラミックス微粒子を用いて、ＣＣＤを検出用プローブとして所要の電圧または磁場を印加あるいは特定波長の光を照射した後、あるいはこれら全ての操作後に標識から発せられる信号の変化を検知することはもちろん、電圧又は磁場を印加あるいはレーザー光の照射、さらにはこれらの操作全てを施した後に所要電極間の電流Ｉ値又は電圧Ｖ値あるいは抵抗Ｒ値、静電容量Ｃ値の変化としてこれを検知することも意味し、電気的な変化と光学的な変化を個別にあるいは同時に検出することも可能である。
【００７０】
さらに、上述の電気磁気的変化と電気光学的変化を組み合せた、電気磁気的光学的変化として捉えることが可能であることは明らかであり、例えば磁性を有しかつ特定波長で発光する磁性微粒子が開発されており、これを用いると上述の工程等を適宜選定して組み合せることで、複合体及び複合体のプローブ核酸又は生化学検体あるいはその両方に設けられた標識からの信号を電気的、磁気的及び光学的な変化として容易に捉えることができる。
【００７１】
また、バイオチップの基板では前述の電気的な検出を行い、同時に基板表面に近接して光学的に各種標識を検出・識別する手段を併用することも可能である。例えば光散乱法、ＳＰＲ分光法、化学発色法、蛍光検知法、顕微鏡法、イメージング処理法、目視法などを採用することができる。
【００７２】
光散乱法は、金属粒子やセラミックス微粒子標識において、微粒子が反射する光で特定波長光を発したり、レーザー光による散乱光の検知を可能にするもので、一般的な構成例を説明すると、例えばこの発明による金薄膜を設けた検出チップ基板をプリズム上に載置し、Ｈｅ−Ｎｅレーザー光をプリズムの一方側より基板裏面に入射してプリズムの他方側へこれを全反射させるように条件設定することで、検出チップ基板を上面から観察するＣＣＤカメラ側に散乱光を検出することができる。
【００７３】
また、セラミックス微粒子自体が有する可視光下での特定色を検出したり、特定粒径のセラミックス微粒子に対して特定波長の光を照射して特定色を発光させてこれを検出するなど、前記セラミックス微粒子の種類やその粒径や性状等、条件に応じて公知の検出方法や装置を適宜選定することも可能である。
【００７４】
ＳＰＲ分光法は、貴金属薄膜表面における屈折率変化を検出するもので、例えばガラス基板上に金電極を形成し、金薄膜電極上にプローブ核酸を固定化し、プローブ核酸が検体中の目的ＲＮＡなどの核酸類とのハイブリダイゼーションにより二本鎖を形成すると、金薄膜電極上の屈折率が変化するためにＳＰＲ角（反射率が最小となる入射角度）がシフトするが、ＳＰＲ角のシフトはハイブリダイゼ一ションした目的検体の量と対応するために、ＳＰＲ測定によって目的検体の定量的な解析が可能となる。
【００７５】
またＳＰＲ分光法において、標識による修飾によって前記信号の増幅が可能である。具体的に説明すると、基板の貴金属薄膜表面にプローブ核酸を配列してバイオチップを作製し、ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後のプローブを貴金属コロイドや金属粒子等の標識で修飾すると、末端を標識への接着部位で修飾したプローブは、ループ（ヘアピン）構造を取る場合は標識が全く接着できないことは前述したとおりであり、このループ構造を取るプローブはその立体的構造により選択的に目的検体とハイブリダイズすることで基本的な検出精度が向上する。
【００７６】
また、目的検体とのハイブリダイゼーション反応によってプローブ核酸のループが解消された状態になり、ハイブリダイズされたプローブ核酸に選択的に標識による修飾が行われることで、前述のＳＰＲ角のシフトを増幅でき、高精度の検出が可能になる。さらに、ハイブリダイゼーション後に２本鎖を形成した目的検体をＳＰＲ分光法にて検出する工程は、液中あるいは大気中のいずれも可能である。ＳＰＲ法の測定システムとしては、公知のいずれの構成も採用可能である。
【００７７】
化学発色法は、免疫組織染色方法が応用できる。これは予め４つの結合部位をもつアビジンと複数箇所でビオチン化されたペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を適当な割合で混合し、多数のＨＲＰを含み一部にアビジンのビオチン結合部位を残す複合体（ＡＢＣ）を形成させて、この複合体（ＡＢＣ）と予め組織中の標的抗原と結合したビオチン化抗体とを反応させて標的抗原を検出するもので、例えばプローブにビオチンで修飾した箇所を用意することで容易に適用できる。また、ＡＰＲ法など公知の免疫組織染色方法も応用できる。
【００７８】
蛍光検知法は、種々の蛍光色素自体をプローブ核酸又は標識の所要部位に着設したり、又は蛍光色素によりタグ化された染色体、糖鎖体、タンパク質、核酸、酵素、細胞、微粒子等を標識自体の性質を利用したり前述のごとく抗原−抗体反応を利用してプローブ核酸、生化学検体を修飾したものを検出するが、顕微鏡とＣＣＤカメラを組み合せた蛍光イメージング検出システム、共焦点顕微鏡システム等、また種々の光学装置やイメージング装置を併用した検出方法が提案されており、前記蛍光標識の種類やその蛍光自体の性状等、条件に応じて公知の検出方法や装置を適宜選定するとよい。また、蛍光でない色素も同様に検知できる。
【００７９】
顕微鏡観察法は、公知の蛍光や散乱光などの検出システムとして、顕微鏡とＣＣＤカメラを組み合せたイメージング検出システム、共焦点顕微鏡システム、金属顕微鏡等、また種々の光学装置やイメージング装置を併用した検出方法が提案されているが、これらをそのまま利用することが可能である。
【００８０】
イメージング処理法は、カメラ又は顕微鏡にてスキャニングした画像をディスプレイで目視で確認できるように拡大、鮮鋭化、着色化等、各種の公知の画像処理を施したり、あるいはコントラストや特定形状、寸法の粒子をソフトウェアー的に検出するために公知の画像処理を施すなどの方法である。
【００８１】
目視法は、この発明のバイオチップがハイブリダイゼーションにより２本鎖を形成したプローブ核酸と目的検体のみを粒子標識で修飾できることから可能になるものであり、詳述した各種の標識粒子の集合体を目視にて観察し、目的検体の有無を検出するものである。
【００８２】
この発明において、標識は上述のごとく独自の色や形を有しており、これらは集合して目視可能になるもので、検出に際しての第１の標識と第２の標識がそれぞれプローブ又は検体に設けられる場合はこれらを目視することになる。また、第１の標識をターゲットにして第２の標識で修飾する場合は、第１の標識と第２の標識の両方を目視することになるが、第１の標識が目視できないような場合は第２の標識のみを目視することになる。
【００８３】
また、上述の第１の標識で修飾してさらにそれを目標として第２の標識で修飾する２段階修飾、あるいは先に修飾した標識にさらに修飾を繰り返す多段修飾を行って、目視可能な標識粒子の集合体となすことが可能である。
【００８４】
この発明において、バイオチップ上のループ構造を形成して配列されているプローブ核酸を予め標識で修飾しておくことで、ハイブリダイゼーション操作などを行う前の各電極上のプローブの状態を定量的に把握することを可能とするが、このプローブを修飾する標識は、特に限定されることなく前述のいずれの標識でもよい。また、プローブ核酸が有しているループ構造のいずれの位置、例えば図示のループ部や脚部等の部位に設けられてもよく、さらにプローブ核酸の電極への配列と同時あるいは配列後に修飾するなど、バイオチップの作製工程のいずれの工程において修飾されてもよく、要するにハイブリダイゼーション操作前の状態にある当該バイオチップの各電極上に配列したプローブの状態を定量的に把握できればよい。
【００８５】
また、この発明においてより検出精度や定量性を向上させるために、例えば、バイオチップのプローブ核酸に予め修飾する標識とハイブリダイゼーション操作後の生化学検体に修飾する標識を、磁気的に検出可能な標識と光学的に検出可能な標識とするなど、別異の種類とすることが可能であり、これによりバイオチップの初期検知の際には磁気センサーを用いてプローブ核酸の量を把握し、ハイブリダイゼーション操作後は散乱光強度センサーを用いて生化学反応体を検出することができる。さらに、前記２種の標識にセラミックス粒子標識を用いた場合、例えば粒子外径を変えることで同じ散乱光強度を見るにも照射する光を複数種とすることで解析分解能を高めたり、プローブ核酸を修飾した標識又は生化学検体を修飾した標識などの目的標識のみを個別に検知することなどが可能となる。
【００８６】
さらに、予め標識で修飾したこの発明によるバイオチップは、上述の如く当該チップに配置した各電極上に固定化されたプローブ核酸の量比を前もって正確に把握することが可能で、各種の操作を行った後に行う前述の電気的、磁気的、光学的な各種手段で得られた各電極上の生化学検体からの測定信号に基づく対比や解析等の測定結果に対して、既知の各電極上のプローブ核酸の量比に応じて補正することで、生化学反応体の定量検出を極めて高精度に実施可能とする。
【００８７】
また、プローブに修飾する標識がハイブリダイゼーション操作後に修飾する標識等と明確に区別できるように標識の構成や寸法あるいは種類を適宜選定しておくことで、各電極上に配列したプローブの状態を定量的に把握するために、前述のようにハイブリダイゼーション操作前に所要の測定を実施することなく、ハイブリダイゼーション操作やその後に行う標識による修飾を完了した後、例えば電気的、磁気的、光学的な変化の１つ以上を測定することで各電極上のプローブを定量的に把握することが可能である。従って、例えばプローブ核酸のループ部や脚部等の部位を蛍光色素や微小な磁性体粒子で修飾して、２本鎖を形成した生化学反応体を比較的粒径の大きなセラミックス粒子で修飾するなどの場合、各種操作の完了後の一回の測定工程のみで各電極上のプローブの量比とともに、２本鎖を形成した生化学反応体の量比などの目的の検出、識別が可能となり、操作上の利便性が向上する。
【００８８】
この発明のバイオチップにおいて、各電極上のプローブ核酸の量比を求めるためにプローブ核酸を予め標識で修飾した例を以上に詳述したが、標識で修飾しない場合でも前述した電気的な変化を求める手段を用いてかかるプローブ核酸の量比を求めることが可能であることは言うまでもないこととである。プローブ核酸を予め標識で修飾しない場合、ハイブリダイゼーション操作前にかかる量比を電気的な変化を基に求めることも可能であり、またハイブリダイゼーションや修飾などの各種操作後にまとめて、電気的、磁気的、光学的な変化として測定してプローブ核酸の量比を求めることも可能である。
【００８９】
この発明において、バイオチップの形態は種々の構成を採用できることは前述したとおりであるが、以下に一構成例を説明する。ここではバイオチップに矩形のシリコン基板及びガラス基板を用い、これを図示しないキャリングケースに収納してハンドリングするが、ケースとしては通常の蓋つきの容器としてバイオチップを出し入れする構成と、例えば市販のＤＶＤ−ＲＡＭなどのキャリングケースの如く、検出のためのスキャニング装置に当該キャリングケースを挿入すると外装ケースから内蔵されたバイオチップのみを該装置内に露出させる構成を採用した。すなわち、ハンドリングを人手で行う場合、また機械による半自動化及び全自動化を行う場合を想定している。
【００９０】
図６Ａに示すバイオチップ３０は、キャリングケースより取り出して半自動化のための搬送アーム３２に保持させるが、ここではバイオチップ３０のリード端子３１ａ，３１ｂを搬送アーム３２のコ字型の保持部３３内の接続端子内に挿入させて通電可能にして保持する構成を採用している。図６Ｂに示す搬送アーム３２のコ字型の保持部３３の溝に保持されたバイオチップ３０は、このドライ状態で該アーム３２を通じて所要の電圧、電流を印加して該チップの各電極上に所要のプローブ核酸が配列された状態における、電流や抵抗値などの電気的な計測を行うことができる。
【００９１】
なお、リード端子３１ａ，３１ｂは詳細に図示しないが、ここでは基板表面に所要パターンのリード用膜を成膜してあり、リード端子３１ａは当該端子とは反対側のバイオチップ３０の半分の領域αにあるプローブを配列した複数の電極からリードしてあり、リード端子３１ｂは残り半分の領域βにあるプローブを配列した複数の電極からリードしてある。ここでバイオチップ３０の表面を領域α、領域βに分割するのは、ハイブリダイゼーション前後における所要の計測を確実に対比できるようにするためである。
【００９２】
すなわち、両方の領域に全く同じパターンで電極並びに所要の各種プローブ核酸が適宜配列されており、領域αは同部のみをバッファー液に浸漬して所要の生化学検体とのハイブリダイゼーションを実施し、あるいはさらに所要の標識による修飾を実施するが、領域βはハイブリダイゼーション、標識による修飾を実施せずにおき、前記ハイブリダイゼーションの完了後の領域αに洗浄、乾燥を施し、両方の領域がドライ状態で該アーム３２を通じて所要の電圧、電流を印加することで、ハイブリダイゼーション前の領域βとハイブリダイゼーション後の領域αの各状態における、電流や抵抗値などの電気的な計測を行うことができる。
【００９３】
また、図６Ｂに示すごとく、搬送アーム３２に保持したままスキャニング装置４０に挿入するが、装置内にはバイオチップ３０表面のプローブ核酸を載せた電極に対して、例えば上側から近接できる電極プローブ、ＣＣＤプローブ、磁気ヘッドなどの電気的、光学的、磁気的なプローブのいずれかを配置するか、あるいはこれらを組み合せて配置してあり、上記のごとく搬送アーム３２側からの通電による計測と併せて、ハイブリダイズ前後の電気的、光学的、磁気的な計測を実施することができる。こうしてハイブリダイズ前後の計測結果を比較することで、ハイブリダイゼーション後に２本鎖を形成したプローブ−生化学検体のとの複合体、すなわち生化学反応体の有無を容易に検出することができる。
【００９４】
上述の例では基板の一方主面を２分割するが、多数に分割したり、また両面を同様構成とするほか、スリットを設けて領域を分割したり、あるいは領域を分けることなく複数の短冊状板や棒材を用いることも可能であり、さらにハイブリダイゼーション時に前記領域β部分を蓋や容器部材などでシールしておく構成も採用できる。
【００９５】
なお、バイオチップの領域αに前記ハイブリダイゼーション操作を施す時に、先の例は領域βには何らの操作も施さないが、例えば同領域を生化学検体を含まない同種バッファー液に浸漬して同領域をネガティブコントロールとすることができ、これにより上述した操作において複合体の有無を容易に検出することができる。また、このバイオチップ３０を２枚使用することで、バッファー液に対して無操作領域、ネガティブコントロール領域、既知濃度の領域、そして検査のサンプル領域を設定することができる。
【００９６】
さらに、図７に示すバイオチップ５０は、板状のバイオチップ５０を３本のスリットで４分割してスティック状のチップ領域５１〜５４を作製し、各チップ領域５１〜５４には同じ電極パターンを成膜して、チップ５０の一方端にリード端子５５ａ〜５５ｄを設けてそれぞれチップ領域５１〜５４上に設けた電極群と接続する構成からなる。このバイオチップ５０に対して所要のプローブ核酸を所定の電極上に配置する操作を繰り返して各チップ領域５１〜５４上に同じ条件で同種の各プローブ核酸を配置する。次に、例えばチップ領域５１はバッファー液にも浸漬しない無操作領域、チップ領域５２は生化学検体を含まない同種バッファー液に浸漬するネガティブコントロール領域、チップ領域５３は既知濃度の生化学検体を含む同種バッファー液に浸漬する既知濃度の領域、そしてチップ領域５４は検査のサンプル領域として、同時に同条件の操作を可能にする。
【００９７】
なお、個別に同じ電極パターンを形成した複数のスティック状のバイオチップを用いることも可能であり、チップ表面の各電極に同時にプローブ核酸の配列を行った後、先の例と同様操作を行う他、例えば生化学検体の含有濃度がそれぞれ異なる複数種のハイブリダイゼーションを複数のバイオチップに施し、さらにこれらを所要の標識で修飾したものとしないものに分けた後、搬送アームにこれら複数のバイオチップを装着して前述の計測を実施することで、ハイブリダイゼーションをより正確に定量的に計測することが可能となる。
【００９８】
【実施例】
実施例１
検出目標を、キャンピロバクター・ジェミニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）Ｏ−１９血清型ｇｙｒＢ遺伝子変異部周辺の８５６ｂｐのＤＮＡとし、これとその中央部で相補的に結合する中央６０塩基のＲＮＡをプローブＲＮＡとして作製した。又、比較のために前記ＤＮＡと末端部で相補的に結合する末端３０塩基のＤＮＡ、中央部で相補的に結合する中央３０塩基のＤＮＡ、中央６０塩基のＤＮＡの３種類をプローブＤＮＡとして作製した。なお、３０塩基のものは同一鎖内でループを形成しないように、６０塩基のものは同一鎖内でループを形成するように構成した。
【００９９】
バイオチップ作製するための基板にガラス基板を用い、これをアセトン、メタノール、超純水中で超音波洗浄した後、１０％フッ酸で表面を２０秒間エッチングを行ない、さらに、アセトン、メタノール、超純水中で超音波洗浄した後、窒素ガスで乾燥させた。
【０１００】
その後、所要パターンでレジスト層を設けた後スパッタ装置（ＵＬＶＡＣ）を用いガラス基板にまず約１ｎｍ厚みのＣｒ層を設け、次いで約５０ｎｍ厚みのＡｕ層を設けた。次にレジスト層を除去して基板に所要パターンでＡｕ膜電極を配列しかつＡｕ膜線で結線した構成の電気回路を設けた。またさらに、プローブ核酸を配列する予定のＡｕ膜電極を除くＡｕ膜線等の回路パターン部分には絶縁マスク層を設けた。
【０１０１】
前記基板を濃硫酸中に１時間程度浸漬した後、超純水で洗浄した。その後、プローブＲＮＡ、ＤＮＡの３'端側をＳＨ（チオール）基で、５'端側をビオチン基で修飾したプローブＲＮＡ，ＤＮＡ−Ｄ−ＢＦＲ溶液（ＫＨ2ＰＯ4、Ｋ2ＨＰＯ4、ｐＨ ７．０）を基板上に滴下し、飽和水蒸気中に約１５時間放置し、プローブＲＮＡ、ＤＮＡをガラス基板のＡｕ膜電極上に付着させてこの発明によるバイオチップとなした。
【０１０２】
ハイブリダイゼーションは、Ｒ−ＢＦＲ溶液（ＮａＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ７．４）とＨ−ＢＦＲ溶液（ＮａＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．４）で洗浄後に、所要濃度からなる検体ＤＮＡのＨ−ＢＦＲ溶液を滴下し、約１６〜２４時間放置して実施した。
【０１０３】
この発明のプローブと比較のプローブの４種のスポットに対して、前記ＤＮＡ鎖を用いてハイブリダイゼーションを実施した後、アビジンをコートした蛍光微粒子をプローブに対して修飾した。その後、蛍光倒立顕微鏡とＣＣＤカメラを用いてハイブリダイゼーションの検出、すなわち蛍光の検出を実施した。
【０１０４】
また、同様の４種のプローブに対して、前記ハイブリダイゼーションを実施することなく、アビジンをコートした蛍光微粒子で蛍光標識による修飾処理を行い、その後蛍光の検出を実施した。
【０１０５】
塩基数３０のプローブＤＮＡにおいては、目的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションの有無にかかわらずいずれも蛍光発光が観測され、ループ構造を有していないため、常に蛍光標識による修飾が可能であること、すなわち目的ＤＮＡの検出が困難であることを確認した。
【０１０６】
一方、塩基数６０のプローブＤＮＡ及びプローブＲＮＡにおいては、目的ＤＮＡとのハイブリダイゼーション前では蛍光標識による修飾が全くできず、ハイブリダイゼーション後では二本鎖を形成したプローブからのみ強い蛍光を観測することができ、塩基数６０のプローブはループ構造を有しており、ハイブリダイズしたプローブにのみ、その先端を標識で修飾することが可能であり、目的ＤＮＡの検出が容易であることが確認できた。
【０１０７】
また、この発明のプローブＲＮＡの場合は、ＤＮＡ−ＲＮＡ結合の安定性がＤＮＡ−ＤＮＡ結合より強いため、比較の６０塩基のプローブＤＮＡに比較して検出感度がより高くなることを確認した。
【０１０８】
また、上述の蛍光標識による検出後に、バイオチップを洗浄して乾燥させた後、図６に示すごとく、搬送アームに装着して電極プローブを配置したスキャニング装置にセットして、電圧、電流、静電容量を測定した。この測定結果を、前記のハイブリダイゼーションと蛍光標識による修飾を行う前のドライ状態の場合、ハイブリダイゼーションなしで蛍光標識による修飾を行った場合の電圧、電流、静電容量の測定結果と対比し観察した。
【０１０９】
この発明と比較のスポットの対比において、ハイブリダイゼーションの有無、蛍光標識の有無による電気的変化が、先の蛍光標識による検出結果と一致することを確認し、ハイブリダイゼーションを電気的な変化として検出可能なバイオチップであることを確認した。前述の操作でハイブリダイズする際の目的ＤＮＡの量を種々換えた場合も実施した結果、目的ＤＮＡ量に相関した信号の変化が検出でき、定量的な検出が可能であることを確認した。
【０１１０】
さらに、上記のスキャニング装置に前述のＣＣＤカメラを用いた光学検出器を装着した構成となし、搬送アームに装着して電気的な計測とともに蛍光標識の光学的検知を同時に行うことで、ハイブリダイズしたプローブの定量的な検出がより正確に実施可能であることを確認した。
【０１１１】
実施例２
検出目標には、実施例１のＤＮＡに換えてＲＮＡを使用した。すなわち、ｇｙｒＢ遺伝子（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）より、イン・ビトロＲＮＡ合成法により作製し、精製した約８００塩基のＲＮＡを用いた。
【０１１２】
また、プローブＤＮＡには上記の合成ＲＮＡと中央で相補的に結合する６０塩基のＤＮＡを用いて、実施例１と同様のガラス基板に同様条件で配列してこの発明によるバイオチップを作製した。
【０１１３】
ここで標識による修飾方法として採用した金コロイド修飾方法は、上記のバイオチップをハイブリダイゼーション後にＲ−ＢＦＲ溶液で洗浄し、窒素ガスでおだやかに乾燥させ、アビジンをコートした金コロイド（粒径１０ｎｍ、ＳＩＧＭＡ製）を滴下し１〜３時間、飽和水蒸気中で放置することで、ビオチンとアビジンの特異的結合を利用して修飾した。
【０１１４】
また、金属微粒子修飾は、プローブの５'端側とビオチン−アビジン結合させるため、予めアビジンコートした平均粒径が１μｍ程度のＦｅ微粒子を用いて、ｐＨ ７．４のコロイダル液となして実施した。
【０１１５】
前記のＲＮＡ鎖を用いて実施例１と同様にハイブリダイゼーションを実施した後、金コロイド修飾又は金属微粒子修飾を行い、その後ＳＰＲ測定を行った。また比較のため、同時に目的ＲＮＡを有しないＨ−ＢＦＲ溶液をプローブＤＮＡと反応させた後、標識による修飾処理をしてからＳＰＲ測定を行った。なお、ＳＰＲ測定は、バイオチップをＲ−ＢＦＲ溶液で洗浄後に窒素ガスで穏かに乾燥し、その後速やかにＳＰＲ測定を行なった。ＳＰＲ測定はイメージングシステムを用いて行った。
【０１１６】
その結果、目的ＲＮＡとハイブリダイゼーションしたプローブＤＮＡのみに選択的に金コロイド修飾及び金属微粒子修飾が可能であり、従って、ＳＰＲ角度シフト増幅が可能で、ハイブリダイゼーションによる生化学反応体の検出が可能であることを確認した。さらに、前記金コロイド修飾と同様方法でストレプトアビジンで修飾した場合も同様に目的ＲＮＡとハイブリダイゼーションしたプローブＤＮＡのみに選択的に修飾することが可能であった。
【０１１７】
さらに、比較のため、前記ハイブリダイゼーションを実施することなく、アビジンをコートしたＦｅ微粒子標識による修飾処理を行った。しかし、目的ＲＮＡとのハイブリダイゼーション前ではＦｅ微粒子標識による修飾が全くできず、ハイブリダイゼーション後ではＦｅ微粒子標識による修飾が行われ、前記ＳＰＲ測定においてハイブリダイゼーション前後で明らかな差が見られた。
【０１１８】
また、上記のハイブリダイゼーションを実施する際に、目的ＲＮＡがある場合と、ない場合を設定して、Ｆｅ微粒子コロイダル修飾を行い、その後、微分干渉顕微鏡にて観察を行った。目的ＲＮＡがある場合には、Ｆｅ微粒子が多数観察されたが、目的ＲＮＡがない場合には、Ｆｅ微粒子はほとんど観察されなかった。なお、前記バイオチップのいずれの場合も、表面に粒状感のあるなしで明確に目的ＲＮＡの存在を目視で区別することができた。
【０１１９】
また、実施例１と同様に上述の金属粒子標識による検出後に、バイオチップを洗浄して乾燥させた後、図６に示すごとく、搬送アームに装着して電極プローブを配置したスキャニング装置にセットして、電圧、電流、静電容量を測定した。この測定結果を、前記のハイブリダイゼーションと金属粒子標識による修飾を行う前のドライ状態の場合、ハイブリダイゼーションなしで金属粒子標識による修飾を行った場合の電圧、電流、静電容量の測定結果と対比し観察した。
【０１２０】
前述の操作でハイブリダイズする際の目的ＲＮＡの量を種々換えた例を実施した結果、ハイブリダイゼーションの有無、金属粒子標識の有無による電気的変化の差異やその程度は、金属標識によるＳＰＲ検出と一致すること、すなわちＳＰＲ角のシフト量はハイブリダイゼ一ションした目的検体の量と対応するが、このＳＰＲ角のシフトと電気的測定の変化量が同傾向を示すことを確認し、ハイブリダイゼーションを定量的に電気的な変化として検出可能なバイオチップであることを確認した。
【０１２１】
実施例３
実施例２において、プローブＤＮＡの修飾に、前述の金又はＦｅ微粒子に換えて、ビオチン基で修飾したプローブの５'端側とシリカ粒子とをビオチン−アビジン結合させるため、予めアビジンコートしたシリカ粒子を用いて、ｐＨ ７．４のコロイダルシリカとなして実施した。コロイダルシリカとしては粒径が１００ｎｍ〜８００ｎｍの種々粒径のものを用いた。
【０１２２】
スキャニング装置におけるハイブリダイゼーションの検出機構には、検出チップをプリズム上に載置し、Ｈｅ−Ｎｅレーザー光をプリズムの一方側より基板裏面に入射してプリズムの他方側へこれを全反射させて、バイオチップの上面から観察するＣＣＤカメラで散乱光強度を検出する方法で実施した。
【０１２３】
また、比較のため、前記ハイブリダイゼーションを実施することなく、アビジンをコートしたシリカ微粒子標識による修飾処理を行った。その結果、目的ＲＮＡとのハイブリダイゼーション前では、シリカ微粒子標識による修飾が全く実施できず、散乱光を観測することができなかったが、ハイブリダイゼーション後では目的ＲＮＡとのハイブリダイゼーションが行われたプローブＤＮＡからのみ強い散乱光を観測することができた。また、いずれの粒径のシリカ粒子の場合も同様に目的ＲＮＡの検出が可能であった。
【０１２４】
次に、図７の表面領域を分割したバイオチップを実施例２のとおり作製し、チップ領域５１は検体を有しない実施例２と同種のバッファー液に浸漬しさらに上述のシリカ粒子標識による修飾を行い、チップ領域５２は既知の量の検体を有する該バッファー液を用いて実施例２と同様にハイブリダイゼーションを行い、チップ領域５３は既知の量の検体を有する該バッファー液を用いて実施例２と同様にハイブリダイゼーションを行いかつシリカ粒子標識による修飾を行い、チップ領域５４は実施例２と同様に検査対象のバッファー液を用いて目的ＲＮＡとのハイブリダイゼーションを行い、上述のシリカ粒子標識による修飾後に、各領域を洗浄して乾燥させた後、図６に示すごとく、搬送アームに装着して電極プローブとＣＣＤカメラを配置した前記スキャニング装置にセットして、散乱光強度の検出とともに電圧、電流、静電容量を測定した。
【０１２５】
前記測定の結果、予め測定したプローブＤＮＡを配列したままの状態の場合の測定結果とともに、ネガティブコントロールとして前記のハイブリダイゼーションとシリカ粒子標識による修飾を行った領域５１の場合、既知量の目的検体とハイブリダイゼーションを行った領域５２の場合、検査対象の目的検体とハイブリダイゼーションしてシリカ粒子標識による修飾を行った領域５３（既知量）及び領域５４（サンプル）の場合の４種の電圧、電流、静電容量を同時に測定するとともに、各領域の散乱光強度の検出結果も得られた。
【０１２６】
また、図７の各領域と同じ電極パターンを個別のスティック状基板にそれぞれ２か所を有する構成のバイオチップを作製し、先と同様の操作並びに目的ＲＮＡとのハイブリダイゼーションを行い、その後シリカ粒子標識による修飾後に、洗浄して乾燥させた後、前記スキャニング装置にセットして、散乱光強度の検出とともに電圧、電流、静電容量を測定した。この際、各チップは２領域を有するので前記操作を行った領域と該操作なしの領域となし、またハイブリダイゼーションには目的ＲＮＡの量を予め特定して種々の含有量となる５種のバッファー液を用意しておき、５枚のバイオチップに該バッファー液による５種のハイブリダイゼーションを実施した。
【０１２７】
これらの測定結果より、目的検体とのハイブリダイゼーションにより二本鎖を形成したプローブ、さらにシリカ粒子標識で修飾されたプローブが存在する場合の電圧、電流、静電容量の変化、散乱光強度の変化と目的ＲＮＡ濃度との間に一定の相関関係を見い出すことができ、先にハイブリダイゼーションを実施したバイオチップにおける測定結果と比較することにより定量的な測定が可能となることを確認した。
【０１２８】
実施例４
実施例１において、ガラス基板をシリコン基板とする以外は同様の構成のバイオチップを作製した。また実施例２において、プローブＤＮＡの修飾に、前述の金又はＦｅ微粒子コロイダル修飾に換えて、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体を用いるＡＢＣ法による化学発色（酵素）法を実施した。すなわち、前記複合体を滴下して室温で１ｈｒ放置した。その後、ＴＢＳ−Ｔ（Ｔｗｅｅｎ２０添加Ｔｒｉｓ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）で洗浄し、テトラメチルベンジン溶液を滴下し、５〜１５ｍｉｎ、室温で放置した。
【０１２９】
その後、超純水にて洗浄し、窒素ガスにて乾燥させた。その結果、目的ＲＮＡがある場合は発色したが、目的ＲＮＡがない場合は発色せず、明確に目視にて識別することができた。又、同じバイオチップを用い、上記のＡＢＣ法に換えてアビジンをコートした色素を滴下し、室温〜３７℃、飽和水蒸気中で１〜２時間の修飾を行った。その後、ＴＢＳで洗浄し、窒素ガスにて乾燥させたところ、目的ＲＮＡがある場合は着色したが、目的ＲＮＡがない場合は着色せず、明確に目視にて目的検体を検出できた。
【０１３０】
上記実施例において、実施例２と同等構成のバイオチップを用い、ハイブリダイゼーション後アビジンをコートした色素を滴下し、室温〜３７℃、飽和水蒸気中で１〜２時間の修飾を行った。その後、ＴＢＳで洗浄し、さらに、予め染色されたタンパクをビオチンで修飾した第２の標識を、上記条件と同様に滴下して、修飾処理した。その後ＴＢＳで洗浄し、乾燥させたところ、目的ＲＮＡがある場合は上記の色素のみに比較して強く着色し、また目的ＲＮＡがない場合は着色せず、明確に目視にて目的ＲＮＡを確認することができた。
【０１３１】
また、上述の化学発色標識及び色素標識による検出後に、図６に示すごとく、搬送アームに装着して電極プローブを配置したスキャニング装置にセットして、電圧、電流、静電容量を測定した。この測定結果を、前記のハイブリダイゼーションと標識による修飾を行う前のドライ状態の場合、ハイブリダイゼーションなしで標識による修飾を行った場合の電圧、電流、静電容量の測定結果と対比することにより、ハイブリダイゼーションを電気的な変化として補足でき、上述の目視による検出を補完することが可能となった。
【０１３２】
実施例５
実施例１と同様方法でバイオチップを作製した。目的検体には実施例１と同様のｇｙｒＢ遺伝子（８５６ｂｐ）を用いた。また、目的検体は粒径５０ｎｍのシリカ粒子で修飾しておき、バッファー液で既知の一定濃度となるようにして用いた。プローブは、前記ｇｙｒＢ遺伝子と相補的に結合する６０塩基のＤＮＡで、ループ構造を取る構成としかつ予め磁性材微粒子で修飾したものを用いた。
【０１３３】
バイオチップは、実施例１と同様方法にてガラス基板表面にａ〜ｆの電極部を設け、上記のプローブＤＮＡを実施例１と同様方法にて各電極に配列固定した。その後Ｒ−ＢＦＲ溶液で洗浄し、さらに窒素ガスでおだやかに乾燥させた。なお、プローブＤＮＡの配列には、電極面積とプローブＤＮＡを含むバッファー液濃度との関係を最適化して、各電極部で固定化される量ができるだけ均等になるようにした。
【０１３４】
得られたバイオチップを搬送アームに装着して磁気ヘッドプローブを配置したスキャニング装置にセットして、電極上の磁気を測定したところ表１の「磁気検出強度」の結果を得た。「磁気検出強度」は電極ａを基準として相対比で示す。
【０１３５】
次に、実施例１と同様方法にて、目的検体をバイオチップにハイブリダイゼーションして、Ｒ−ＢＦＲ溶液で洗浄し、さらに窒素ガスでおだやかに乾燥させた。ハイブリダイゼーション操作後のバイオチップに実施例３と同様方法にて散乱光強度の検出を施し、表１の「散乱光検出強度」の結果を得た。
【０１３６】
表１のハイブリダイゼーション操作後の各電極上における散乱光強度の測定結果を、ハイブリダイゼーション操作前の各電極上にあるプローブの状態を把握した表１の「磁気検出強度」の比、すなわちプローブ量比により補正したところ、表１の「補正後の検出強度」の結果を得た。すなわち、散乱光強度の検出値の偏差は、プローブ量比の補正により測定後の３７．４から補正後の６．０４へと著しく減少した。
【０１３７】
作製したバイオチップの各電極（スポット）上に配列したプローブに標識を施しておくことで、ハイブリダイゼーション操作前の各電極上のプローブの量比を測定することが可能であり、このプローブ量比を予め得ておくことで、ハイブリダイゼーション操作後の２本鎖を形成した目的検体量の測定値を正確に補正することが可能となり、生化学反応体の定量的な検出が極めて高い精度で実施できることを確認した。
【０１３８】
【表１】
【発明の効果】
この発明によるループ構造を有するプローブ核酸を基板に配列したバイオチップの構成は、生化学検体の検出操作において、生化学検体とのハイブリダイゼーションを行った後に、標識による修飾を行い、ハイブリダイズしたプローブにのみ、かつ所要の箇所を標識で修飾することが可能となり、ハイブリダイゼーション時並びに標識による修飾時と、各工程での精度が向上して目的検体の検出精度が著しく向上する。
【０１４０】
一般に、生体内現象を捉えるためには、ＤＮＡではなく、ｍ−ＲＮＡの発現量を調べる必要があるとされるが、上述のようにループ構造を利用したこの発明のプローブはバックグラウンドノイズが低く高感度のため、また検体を標識で修飾しておく必要がないため、ｍ−ＲＮＡの動向をｃ−ＤＮＡを作製することなく、直接検出可能となる。
【０１４１】
またＤＮＡを検出する場合、プローブにＲＮＡを用いることで、ＤＮＡ−ＲＮＡ結合の安定性はＤＮＡ−ＤＮＡ結合より強いため、プローブにＤＮＡを用いた場合より、検出感度が高く、安定した検出精度を維持できる利点がある。
【０１４２】
この発明によるバイオチップは、目的とするプローブ核酸と生化学検体とのハイブリダイゼーション並びに標識による修飾自体の精度が本来的に高いという特徴に加え、実施例に示すようにこれを電気的、電気磁気的、電気光学的あるいは電気磁気光学的な変化として補足することが可能であり、高精度な生化学検体の検出、さらに定量的な検出が実現できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ａ，Ｂはこの発明によるプローブＤＮＡのループ構造を示す説明図である。
【図２】 Ａ，Ｂはこの発明によるプローブＲＮＡのループ構造を示す説明図である。
【図３】 この発明によるプローブＲＮＡの他のループ構造を示す説明図である。
【図４】 この発明によるプローブＲＮＡの他のループ構造を示す説明図である。
【図５】 この発明によるプローブＲＮＡの他のループ構造を示す説明図である。
【図６】 Ａはこの発明によるバイオチップと搬送アームの構成を示す斜視説明図であり、Ｂは搬送アームとスキャニング装置の構成を示す斜視説明図である。
【図７】 この発明によるバイオチップの他の構成を示す斜視説明図である。
【符号の説明】
１ 基板
２ ビオチン基
３ 標識
１０ プローブＤＮＡ
２０ プローブＲＮＡ
１１，２１ 固定端
１２，２２ 解放端
１３，２３ 結合部
１４，２４ ループ
１５，２５ 主要部位
２６ 脚
３０，５０ バイオチップ
３１ａ，３１ｂ，５５ａ，５５ｂ，５５ｃ，５５ｄ リード端子
３２ 搬送アーム
３３ 保持部
４０ スキャニング装置
α，β 領域
５１，５２，５３，５４ チップ領域
５６ スリット
ｘ 隙間
Claims (19)
- 基板又はその類似物表面に設けられた１又は２以上の電極上に配列されループ構造を形成したプローブ核酸かあるいは前記構成に加え予め標識で修飾したプローブ核酸を有するバイオチップを用い、該チップのプローブ核酸に生化学検体をハイブリダイゼーションする工程、ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後に２本鎖を形成したプローブ核酸又は生化学検体あるいはその両方を標識で修飾する工程、２本鎖を形成したプローブ核酸と生化学検体との複合体を該バイオチップの表面における電気的、磁気的、光学的な変化の少なくとも１つにより検出・識別する工程を有する生化学反応体の検出方法。
- 基板又はその類似物表面に設けられた１又は２以上の電極上に配列されループ構造を形成したプローブ核酸かあるいは前記構成に加え予め標識で修飾したプローブ核酸を有するバイオチップを用い、該チップのプローブ核酸を予め標識で修飾した生化学検体をハイブリダイゼーションする工程、ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後に２本鎖を形成したプローブ核酸又は生化学検体あるいはその両方を標識で修飾する工程、２本鎖を形成したプローブ核酸と生化学検体との複合体を該バイオチップの表面における電気的、磁気的、光学的な変化の少なくとも１つにより検出・識別する工程を有する生化学反応体の検出方法。
- 検出・識別する工程で、ハイブリダイゼーション操作前にバイオチップ表面の電気的、磁気的、光学的な変化の少なくとも１つを捉える測定を行い得られた測定結果を基準として、各工程後のバイオチップのそれら測定結果と比較する請求項１又は２に記載の生化学反応体の検出方法。
- 検出・識別する工程で、ハイブリダイゼーション操作の前後又は標識修飾操作の前後における該バイオチップの表面における電気的、磁気的、光学的な変化の少なくとも１つを捉える測定を行いこれらを比較する請求項１又は２に記載の生化学反応体の検出方法。
- 検出・識別する工程で、ハイブリダイゼーション操作前に複数の電極を有するバイオチップ表面の電気的、磁気的、光学的な変化の少なくとも１つを捉える測定を行い各電極上のプローブ核酸の量比を予め求めて各工程後の測定値に対する補正基準として用いる請求項１又は２に記載の生化学反応体の検出方法。
- プローブ核酸又は生化学検体に予め修飾された標識が、第１の標識を目標として第２の標識で修飾する２段階あるいは３段階以上の多段修飾によるものである請求項１又は２に記載の生化学反応体の検出方法。
- プローブ核酸又は生化学検体を標識で修飾する方法が、先に第１の標識で修飾してさらにそれを目標として第２の標識で修飾する２段階あるいは３段階以上の多段修飾である請求項１又は２に記載の生化学反応体の検出方法。
- 標識が、金属微粒子（Ｓｉを含む）、磁性体粒子、セラミックス微粒子、蛍光標識、蛍光色素、色素、化学発色体のいずれかである請求項１又は２に記載の生化学反応体の検出方法。
- バイオチップの表面における電気的な変化として検出・識別する方法が、バイオチップ又は電極における電流値又は電圧値あるいは抵抗値の変化、バイオチップ表面の静電容量変化のうち少なくとも１つを検出・識別する方法である請求項１又は２に記載の生化学反応体の検出方法。
- バイオチップの表面における電気的、磁気的な変化として検出・識別する方法が、バイオチップ又は電極における電流値又は電圧値あるいは抵抗値の変化、バイオチップ表面の静電容量変化のうち少なくとも１つを検出・識別するとともに、２本鎖を形成した複合体からの信号を磁気的に検知・識別する請求項１又は２に記載の生化学反応体の検出方法。
- バイオチップの表面における電気的、光学的な変化として検出・識別する方法が、バイオチップ又は電極における電流値又は電圧値あるいは抵抗値の変化、バイオチップ表面の静電容量変化のうち少なくとも１つを検出・識別するとともに、２本鎖を形成した複合体からの信号を光学的に検知・識別する請求項１又は２に記載の生化学反応体の検出方法。
- バイオチップの表面における電気的、磁気的、光学的な変化として検出・識別する方法が、バイオチップ又は電極における電流値又は電圧値あるいは抵抗値の変化、バイオチップ表面の静電容量変化のうち少なくとも１つを検出・識別するとともに、２本鎖を形成した複合体からの信号を磁気的かつ光学的に検知・識別する請求項１又は２に記載の生化学反応体の検出方法。
- 表面に少なくとも１つの電極が形成された基板又はその類似物からなり、前記電極面上に配列されたプローブ核酸を有し、配列したプローブ核酸は生化学検体と相補的に結合する主要部位が基板又はその類似物側に位置するようループ構造を有するバイオチップ。
- 表面に少なくとも１つの電極が形成された基板又はその類似物からなり、前記電極面上に配列されたプローブ核酸を有し、配列したプローブ核酸はその電極表面に固定されない解放端側又はその標識による修飾を可能にした部位が基板又はその類似物側に位置するようループ構造を有するバイオチップ。
- 表面に少なくとも１つの電極が形成された基板又はその類似物からなり、前記電極面上に配列されたプローブ核酸を有し、配列したプローブ核酸は第２の標識で修飾可能な第１の標識で修飾された部位が基板又はその類似物側に位置するようループ構造を有するバイオチップ。
- 表面に少なくとも１つの電極が形成された基板又はその類似物からなり、前記電極面上に配列されたプローブ核酸を有し、配列したプローブ核酸は予め修飾された標識が基板又はその類似物側に位置するようループ構造を有するバイオチップ。
- 標識が、金属微粒子（Ｓｉを含む）、磁性体粒子、セラミックス微粒子、蛍光標識、蛍光色素、色素、化学発色体のいずれかである請求項１５又は１６に記載のバイオチップ。
- 基板又はその類似物材料がガラス又は半導体シリコンである請求項１３〜１６のいずれかに記載のバイオチップ。
- 基板又はその類似物を別途用意する電気的回路基板に組み込み可能とした請求項１３〜１６のいずれかに記載のバイオチップ。
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